CN106056118A - 一种用于细胞的识别计数方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种用于细胞的识别计数方法，包括9个步骤：对微米级显微采集环境下的图像进行预处理；对预处理后获得的图像进行细胞孔洞提取；利用连通域的知识进行细胞的封闭孔洞填充；在步骤3中填充后的图像中提取细胞的轮廓线点序列；采用基于圆形度判定的不封闭孔洞填充方法对细胞的不封闭孔洞进行填充；将填充后的图像进行倒角变换；利用中的细胞孔洞位置进行极值唯一化标记；使用基于标记的分水岭方法对极值唯一化后的图像进行分割；将分割得到的结果进行量化、标记。有益的技术效果：本发明能够大大减少图像噪声的影响，改善过分割、分割线不连续现象，提高分割效果，增加细胞识别率。

Description

一种用于细胞的识别计数方法

技术领域

本发明涉及一种医学图像处理领域中关于医学图像特征提取、识别技术领域，具体涉及一种用于细胞的识别计数方法。

背景技术

现有技术的方法检验一个样本需要大量的时间。这种方法存在很多不足：首先检验工作量大，效率低，连续工作很容易因客观因素导致错误的识别；其次，对样本的识别分析容易受到视觉疲劳等的限制，掺杂了较强的主观因素而缺乏客观的标准。现有的半自动识别和检测的方式显得越来越不合适，当遇到检测高峰期时，不能及时、准确地得到检验结果，就会耽误病人就诊。因此实现粪便镜检图像自动识别与分析，是医院检测部门也是患者们的迫切需求。本技术方案提出的方法是对样本图像进行图像处理等过程实现样本的自动检测与分析。检测人员一般不参与分析识别过程，只有在有特殊需要时才参与分析。极大地缩短了检验一个样本所需的时间，而且有效地减少了检验结果对人工操作以及医生经验的依赖，快捷而且准确的得到具体的检验数据和结果。克服了细胞图像噪声多，细胞重叠和粘连程度大，图像质量差异变化明显等技术难点。

解决分水岭算法的过分割问题可以分为两大类，一类是在分割之后，基于某种方法对分割图像进行合并，但是这种方法十分耗时；另一类就是基于标记的提取,标记提取的好坏直接影响到最终分割效果的好坏。经对现有技术文献的检索发现：Aymen Mouelhi,Mounir Sayadi,Farhat Fnaiech Li等在《Automatic Segmentation of ClusteredBreast Cancer Cells Using Watershed and Concave Vertex Graph》中提出的基于分水岭和图形凹顶点的分割重叠细胞算法，算法步骤如下：首先，基于Chan-Vese能量函数使用修改后的几何活动轮廓检测细胞区域获得细胞轮廓。然后,从欲分割图像通过细胞轮廓检测高凹度的点提取细胞区域。接着，对图像颜色权值距离进行距离变换，对变换后获得的图像利用分水岭算法进行分割。分割结果存在过分割现象，需要对分割线进行筛选。首先去除那些不以高凹度点为顶点的分割线，然后在过高凹度的分割线中利用Dijkstra算法找到分割细胞的最短分割线，完成细胞分割。算法虽然取得了比较好的效果，但是未考虑不封闭孔洞填充，且由于算法最终选取的是最短分割线，并不能将准确区分细胞界限；Jingqi Ao等在《Ahybrid watershed method for cell image segmentation》一文中，使用基于分水岭算法的k均值聚类生成细胞轮廓将所有细胞相关内容(核和细胞质)与背景分离，接着利用全局直方图检测细胞核，细胞核与细胞质直接的对比度低，需要进行直方图拉伸和直方图均衡化，以增加细胞核和细胞质之间的对比,进一步改善直方图阈值的影响。这样就可以获得细胞间的边界和细胞内部细胞核和细胞质的边界，最后利用分水岭算法分别分割细胞核和细胞质。算法虽然能够明显的将背景，细胞质，细胞核区分出来，但是细胞质和背景之间并不能严格区分开来，而且分割线不光滑；高丽等在《一种基于标记的分水岭图像分割新算法》一文中，将分水岭算法直接应用分水岭在原始梯度图像而并非简化之后的图像进行分割，从而保证没有物体边缘信息的丢失。与此同时，新算法提出了一种新的标记提取方法，从图像的低频成份中提取与物体相关的局部极小值。在获得梯度图像过程中，先对图像进行腐蚀，膨胀处理，然后分别计算RGB空间中的3个彩色分量图像，取其中最大值作为该点梯度。然后利用彩色梯度图像的二阶Buttrewerth低通滤波来消除噪声。在提取标记过程中，根据图像的照度--反射模型(照度分量通常以空间域的慢变化为特征，反射分量通常引起突变)，这些特性导致图像的低频成份对应着图像的基本内容，而图像的高频成分与对应着图像的边缘、纹理细节和噪声。因此，图像的低频成份中，局部极小值与图像中的各个物体具有强烈的相关性。将局部极小值构成二值标记图像。然后，将提取的标记利用形态学极小值标定技术强制作为原始梯度图像的局部极小值，而屏蔽梯度图像中原有的所有局部极小值。最后基于这些标记进行分水岭分割。该算法在图像处理上取得了很好的效果，但是运用到分割重叠细胞中却得不到理想效果，甚至不能将重叠细胞严格分割开来。这些算法在对粘连细胞进行分割的过程中存在过分割和分割线不连续的情况并没有根本上解决，使得细胞识别的误识率较大。普通的细胞识别方法无法满足正常人体医学病理检测的要求，需要寻找一种消除过分割和提高分割线清晰度的方法，提高识别率。

发明内容

发明目的：本发明所要解决的技术问题是针对现有技术的不足，提供一种微米级显微采集环境下的细胞自动识别计数方法。

为了解决上述技术问题，本发明公开了一种用于细胞的识别计数方法，具体如下：

一种用于细胞的识别计数方法，按如下步骤进行：

步骤1，通过微米级显微设备获取细胞原始图像A。所述的细胞原始图像A由细胞图像区域和背景图像区域两部分构成。其中，细胞图像区域进一步分为2种：封闭孔洞的细胞图像区域(细胞轮廓线完整)、不封闭孔洞的细胞图像区域(细胞轮廓线不完整)。

对微米级显微采集环境下获得的原始图像A进行图像二值化预处理，获得经过二值化处理的图像B。其中数值较高的像素点的灰度值记为高值灰度，余下的记为低值灰度。

进一步说，使用自适应阈值的二值化方法进行图像二值化。并使用数学形态学方法去除噪声、杂质和凸显细胞轮廓特征，得到经过预处理的细胞图像B。

经过二值化处理的图像B，由封闭孔洞的二值化图像区域、不封闭孔洞的二值化图像区域、二值化背景图像区域3部分构成。其中，封闭孔洞的二值化图像区域、不封闭孔洞的二值化图像区域、二值化背景图像区域分别与构成细胞原始图像A的封闭孔洞的图像区域、不封闭孔洞的图像区域、背景图像区域相对应。

步骤2，采用基于连通域的孔洞分割方法对经过二值化处理的图像B进行细胞孔洞提取，即将封闭孔洞的二值化图像区域全部标记出来，将封闭孔洞的二值化图像区域简称为封闭孔洞区域，封闭孔洞区域内的像素点的所有位置坐标(i，j)组成封闭孔洞区域内像素点的位置集合Ω。

步骤3，将封闭孔洞区域内像素点的位置集合Ω中的所有像素点的位置坐标(i，j)所对应的灰度值记为f(i，j)，将该灰度值f(i，j)设为0，即对经过二值化处理的图像B中封闭孔洞的二值化图像区域进行填充，得到一次填充的图像C。

步骤4，对一次填充后的图像C提取细胞的轮廓，获得细胞轮廓的线点序列集合contours。

步骤5，采用基于圆形度判定法，对由步骤4获得的线点序列集合contours进行填充，即对不封闭孔洞的二值化图像区域进行填充，得到二次填充后的图像D。

步骤6，对图像D进行取反操作，取反操作即用最大亮度值减去现有像素值并赋值给图像像素，获得经过取反操作处理的图像E。

对经过取反操作处理的图像E进行倒角距离变换，获得经过倒角变换的图像T。

对经过倒角变换的图像T进行消除极小值、非线性变换、取反操作处理，获得经过取反操作处理的再次取反后的图像I。

所述消除极小值为对图像T中对应的每个像素点的值减去一个常数值，本发明中该常数值为50。

所述非线性变换为对经过消除极小值后的图像进行非线性变换，具体公式如下：

$K=INT(\frac{H}{g}+1)\×g,$

其中INT()函数是取整运算。g是非线性变换的尺度等级，它的取值是由各个区域中的灰度差异决定的，K是变换后的梯度图像。将图像K进行取反操作后最后得到处理好后的图像I。

所述取反操作为对经过非线性变换后的图像进行取反运算。

步骤7，根据封闭孔洞区域内像素点的坐标集合Ω，对再次取反后的图像I中进行细胞孔洞极值唯一化标记，将再次取反后的图像I中与封闭孔洞区域内像素点位置相对应的、再次取反后的图像I中的像素点值f(i，j)标记为MINIMUM，得到经过唯一化标记极值的图像J。

步骤8，使用分水岭方法对经过唯一化标记极值的图像J进行细胞分割，得到分割后的细胞图像R。

步骤9，对分割后的细胞图像R进行细胞标记和量化，得到细胞的数量和每个细胞的位置坐标，实现计数功能，得到结果。

本发明所述的细胞图像预处理包括：将细胞图像进行灰度化处理，根据细胞图像的不同亮度特征进行自适应分块二值化，对图像使用结构元进行腐蚀、膨胀操作去除杂质和噪声，填补阈值化不当产生的空隙，经过上述处理后的图像作为预处理后的图像。

本发明步骤2中的细胞孔洞提取包括以下步骤：已知得到的二值图像中只有两种灰度值的像素点，细胞边缘上的点的灰度值为0，背景和细胞孔洞的点的灰度值均为255。

1)首先，分别遍历二值图像中的四条边界线，i＝1,i＝I,j＝1,j＝J，取得四条边界线上轨的每个像素点(i，j)，如果灰度值f(i，j)等于255值(white背景)，那么以该点为种子点，利用八连通区域生长算法将连通区域内的所有像素点的灰度值设为0。

2)其次，遍历整图中每个像素点(i，j)，如果灰度值f(i，j)不等于0，即为细胞孔洞内的像素点，将这些点保存在集合Ω中。

本发明步骤3中细胞的封闭孔洞填充包括以下步骤：

1)取出步骤2中得到的孔洞区域集合Ω中的所有像素点(i，j)。

2)将每个像素点(i，j)对应在二值图像B上的灰度值f(i，j)设为0。

3)完成图像中封闭孔洞的填充，得到图像C。

本发明步骤4中在图像C上提取细胞的轮廓线点序列包括以下步骤：根据“探测准则”找到目标轮廓上的像素点，然后根据这些点找出目标物体上的其他像素点：

1)先按照从左到右、从下到上的探测准则顺序搜索图像的所有像素点，找到最左下方的边界点。

2)然后根据如下跟踪准则：从第一个边界点开始，定义初始的搜索方向为沿左上方。如果左上方的点是黑点，则为边界点，否则顺时针旋转45度，这样一直找到第一个黑点为止。

3)然后把这个黑点作为新的边界点，在当前搜索方向的基础上逆时针旋转90度，继续用同样的方法搜索下一个黑点，直到返回最初的边界点或直到找不到点为止。

本发明步骤5中不封闭孔洞区域填充包括以下步骤：

1)遍历步骤4中得到的轮廓点序列集合contours得到每个细胞的轮廓线i-contour，计算被轮廓线i-contour包围的面积值area以及轮廓线的长度length。

2)将1)中得到的轮廓线长度值length以及被轮廓线包围的面积值area代入下式e＝4π×area/(length×length)，得到判定参数值e，当判定参数即圆形度e为1时，图形即为圆形，1-e越大，图形越不规则，与圆形的差距越大。

3)如果1-e大于设定阈值t，则判定该轮廓线i-contour是不封闭的细胞孔洞的轮廓线j-contour，其中设定阈值t∈(0,1)。

4)取得不封闭孔洞的轮廓线j-contour，得到轮廓线j-contour的点序列points，通过points里任意两点连接画一条黑色的直线，得到对不封闭孔洞填充后的二值图像D。

本发明步骤6中细胞图像倒角距离变换包括以下步骤：

1)将填充后的二值细胞图像D作为输入图像，先进行取反操作。

2)用前向模板对目标图像进行从左到右、由顶至下的前向扫描。在扫描到某个位置时，模板中的每一个元素与其图像中对应的像素值相加而形成一个和集合。对应模板空白处定义为空操作，不计入和集合。位于模板中心的像素用这些和集合中的最小值取代。

3)用后向模板对第二步结果进行从右向左、由下至顶的后向扫描。处理方法和第二步相同，最终得到倒角距离变换后的图像T。

4)对图像T进行非线性处理，包括微小值的消除和非线性变换，最后得到处理好后的图像I作为输出。

本发明步骤7中细胞孔洞极值唯一化包括以下步骤：

1)根据步骤2中获得的细胞孔洞内像素点的位置集合Ω，得到集合Ω中每个像素点的位置信息(i，j)。

2)将步骤7.1中每个像素点的位置(i，j)对应图像I中的像素值f(i，j)设为MINIMUM即标记为极小值，其中MINIMUM为0。

3)输出唯一化标记极值后的图像J。

本发明步骤8中基于标记的分水岭分割方法包括以下步骤：

1)初始化标记图M(标记图是和灰度图等尺寸大小的二维数组)，初始化标记值为INIT。对灰度图进行遍历按灰度递增的次序给像素排序，确定具有某一灰度层h的像素集合Q(h)，其中灰度层号h∈[MINIMUM,255]。

2)得到灰度层h等于MINIMUM的像素集合Q(h＝MINIMUM)内的所有点。将该层的像素集合Q(h)中的每个点对应标记图上的灰度值赋予标记MASK，然后遍历该层的像素集合Q(h)，如果当前点的标记不是MASK那么执行空操作，继续该层的像素集合Q(h)的遍历。如果当前点的标记(即标记图上的灰度值)为MASK那么将该点记为盆地w,其中w是盆地的标记及细胞的序号。然后将当前点压入队列Q1中，按照广度优先的方式递归地找到当前点的所在的连通区域，将连通区域上的点全部标记为盆地w。

3)对剩下的像素集合{Q(h),h！＝minimum}对其每个点赋予标记值MASK。遍历该层的像素集合Q(h)，计算当前像素点p的八个领域点，如果领域点中存在点属于某个水盆(即对应标记图上的标记为w)，则将当前点压入队列Q2中。

4)如果FIFO先进先出队列Q2不空，则取出第一个元素，即当前像素点p，计算当前像素点p的八个邻域点，如果邻域点中存在的点只属于一个盆地i，则给点p打上该集水盆的标记i。如果邻域点中存在两个及两个以上的点属于不同的集水盆，则打上水坝的标记WSHED；如果邻域点中存在点属于水坝，则也打上水坝的标记WSHED。同时将当前像素点p的所有标记为MASK的领域点像素压入队列Q2中步骤4)所有灰度层均处理完毕及浸没过程结束后，将标记为WSHED水坝的像素点的灰度值设为背景值(255)，把集水盆地内的像素点的灰度值均设为前景目标的灰度值(0)，最终得到一幅分割后的二值图像。上一步骤中被标记为WSHED水坝的像素点组成了结果图像R中重叠细胞的连续分割线。

本发明步骤9中量化、计数过程包括以下步骤：

1)对返回的细胞特征向量组中的向量计数。

2)利用向量组中的位置信息，计算每个细胞的中心位置坐标和平均半径。

本发明公开了一种基于细胞孔洞极值唯一化的改进分水岭变换的细胞图像自动识别计数方法。包括以下步骤：步骤一、采集图像预处理。步骤二、对预处理后获得的图像进行细胞孔洞提取。步骤三、利用连通域的知识进行细胞的封闭孔洞填充。步骤四、在步骤3中填充后的图像中提取细胞的轮廓线点序列。步骤五、采用基于圆形度判定的不封闭孔洞填充方法对细胞的不封闭孔洞进行填充。步骤六、进行倒角距离变换获得变换后的图像。步骤七、进行细胞孔洞极值唯一化，得到标记图像。步骤八、对标记图像使用改进分水岭方法进行细胞分割。步骤九、对分割得到的细胞进行量化、计数。本发明在普通的细胞识别方法基础之上使用了不封闭孔洞的填充方法、细胞孔洞极值唯一化方法以及改进的分水岭方法，其优点在于可以自动、精确地定位粘连细胞的分割位置，克服了现有分割方法所产生的过分割和分割线不连续的情况，从而提高细胞识别的准确率。

有益的技术效果

本发明能够对微米级显微环境下采集到的细胞图像进行自动识别和计数，通过使用不封闭的细胞孔洞填充方式、细胞孔洞极值唯一化标定以及改进分水岭方法能够大大减少图像噪声的影响，改善过分割、分割线不连续现象，提高分割效果，增加细胞识别率。具体而言，本发明具有以下优点：

1、步骤5针对不封闭孔洞通过采用填充的方法有效地克服了不封闭细胞的识别问题。

2、步骤5通过增加对不封闭孔洞的识别提高了细胞图像的整体识别率。

3、步骤7和步骤8利用细胞孔洞特征标记极小区改进分水岭算法，能够消除由于图像中存在大量的伪极小值而导致的过分割现象。

4、步骤2和步骤7通过细胞孔洞特征的提取，对细胞图像极值实现了唯一化，有效地降低了细胞识别的误判率。

5、步骤8中通过重新定义算法中确定某像素点为水坝WSHED的判定标准解决了经典的分水岭算法会产生不连续分割线的问题，能够产生较为完整的分割线。

6、步骤7和步骤8对粘连程度较严重的细胞实现了较为精确的分割，具有较好的鲁棒性。

附图说明

下面结合附图和具体实施方式对本发明做出更进一步的具体说明，详细阐明本发明的各种优点。

图1为本发明系统流程图。

图2为本发明中步骤5细胞的不封闭孔洞填充方法的流程图。

图3为本发明改进分水岭算法中浸没过程流程图。

图4为细胞孔洞三级连通域示意图。

图5为倒角距离变换的前向模板图。

图6为倒角距离变换的后向模板图。图中，(a)为原始图像，(b)为二值图像，(c)为传统封闭孔洞填充结果，(d)为本发明填充算法结果。

图7为测试方法一中对图像1的填充结果对比图。图中，(a)为原始图像，(b)为本发明填充算法结果，(c)为传统形态梯度，(d)为本发明的形态梯度，(e)为传统算法结果，(f)为本发明算法结。

图8为测试方法一中对图像2的填充结果对比图。图中，(a)为原始图像，(b)为本发明填充算法结果，(c)为传统形态梯度，(d)为本发明的形态梯度，(e)为传统算法结果，(f)为本发明算法结。

图9为测试方法一中对图像1的填充结果对比图。图中，(a)为原始图像，(b)为本发明填充算法结果，(c)为传统形态梯度，(d)为本发明的形态梯度，(e)为传统算法结果，(f)为本发明算法结。

图10为测试方法二中的分割结果对比图。图中，(a)为原始图像，(b)为本发明填充算法结果，(c)为传统算法的分割线，(d)为本发明算法的分割线。

图11为测试方法三中的分割结果对比图。图中，(a)为原始图像，(b)为本发明填充算法结果，(c)为传统算法的分割线，(d)为本发明算法的分割线。

具体实施方式

现结合附图详细说明本发明的技术细节。

本发明公开了一种微米级显微环境下采集到的细胞图像进行自动识别和计数方法，包括以下步骤：

参见图1，一种用于细胞的识别计数方法，通过电脑按如下步骤进行：

步骤1，通过微米级显微设备，获取细胞原始图像A。优选的方案是，微米级显微设备为扫描电子显微镜。所述的原始图像A由含有孔洞的图像区域和背景图像区域2部分构成。其中，含有孔洞图像区域进一步分为2种：封闭孔洞的图像区域、不封闭孔洞的图像区域。

对微米级显微采集环境下获得的原始图像A进行图像二值化预处理，获得经过二值化处理的图像B。将其中数值较高的像素点的灰度值记为高值灰度，余下的记为低值灰度。

进一步说，使用自适应阈值的二值化方法进行图像二值化。并使用数学形态学方法去除噪声、杂质和凸显细胞轮廓特征，得到经过预处理的细胞图像B。

经过二值化处理的图像B，由封闭孔洞的二值化图像区域、不封闭孔洞的二值化图像区域、二值化背景图像区域3部分构成。其中，封闭孔洞的二值化图像区域、不封闭孔洞的二值化图像区域、二值化背景图像区域分别与原始图像A中的封闭孔洞的图像区域、不封闭孔洞的图像区域、背景图像区域相对应。

步骤2，采用基于连通域的孔洞分割方法对经过二值化处理的图像B进行细胞孔洞提取，即通过电脑将封闭孔洞的二值化图像区域全部标记出来，将封闭孔洞的二值化图像区域简称为封闭孔洞区域，将封闭孔洞区域内的所有像素点的位置坐标(i，j)组成封闭孔洞区域内像素点的位置集合Ω。

步骤3，将封闭孔洞区域内像素点的位置集合Ω中的所有像素点的位置坐标(i，j)所对应的灰度值记为f(i，j)，将该灰度值f(i，j)设为0，实现了图像B中封闭孔洞的二值化图像区域填充，得到一次填充后的图像C。

步骤4，对一次填充的图像C提取细胞的轮廓，获得细胞轮廓的线点序列集合contours。

步骤5，采用基于圆形度判定法，对由步骤4获得的线点序列集合contours进行填充，得到二次填充后的图像D，如图2所示。

步骤6，对二次填充后的图像D进行取取反操作获得经过取反处理的图像E取反操作为进行二值图像的取反运算。对经过取反操作处理的图像E进行倒角距离变换，获得经过倒角变换的图像T。

对经过倒角变换的图像T进行消除极小值、非线性变换、和取反操作处理，获得再次取反后的图像I。

所述消除极小值为对图像T中对应的每个像素点的值减去一个常数值，本发明中该常数值为50。

所述非线性变换为对经过消除极小值后的图像进行非线性变换，具体公式如下：

$K=INT(\frac{H}{g}+1)\×g,$

其中INT()函数是取整运算。g是非线性变换的尺度等级，它的取值是由各个区域中的灰度差异决定的，K是变换后的图像。将图像K进行取反操作后最后得到再次取反后的图像I。

步骤7，根据封闭孔洞区域内像素点的位置集合Ω，在再次取反后的图像I中进行细胞孔洞极值唯一化标记，即将与封闭孔洞区域内像素点的位置集合Ω相对应的图像I中的像素点的值f(i，j)标记为MINIMUM，得到经过唯一化标记极值的图像J。

步骤8，使用分水岭方法对经过唯一化标记极值的图像J进行图像分割，得到分割后的图像R，如图3所示。

步骤9，对分割后的图像R进行细胞进行标记和量化，得到细胞的数量和每个细胞的位置坐标。

进一步说，经过预处理的图像B中的像素点只有两种灰度值。将这两种灰度值分别记为高值灰度和低值灰度。其中，

经过预处理的图像B中的细胞边缘上的像素点有低灰度值低值灰度，经过预处理的图像B中的背景和细胞孔洞的像素点有高灰度值高值灰度。

优选的方案是，令高值灰度为255，低值灰度为0。

步骤2的具体方法为：首先，分别遍历经过二值化处理的图像B中的四条边界线，i＝1,i＝I,j＝1,j＝J，其中I是图像宽度值，J是图像高度值，i和j分别表示横坐标值和纵坐标值，取得四条边界线上轨的每个像素点(i，j)，随后进行如下的判断：

如果像素点的灰度值f(i，j)等于255值，即该像素点为背景图像(white背景)，那么以该像素点为种子点，利用八连通区域生长算法将连通区域内的所有像素点的灰度值设为0。

如果像素点的灰度值f(i，j)不等于0，即该像素点为细胞孔洞内的像素点，将该像素点点保存在封闭孔洞区域内像素点的位置集合Ω中。

即将像素点的灰度值f(i，j)不等于0的最后统一成255。

参见图2，进一步说，步骤5的具体方法如下：

首先，遍历步骤4的线点序列集合contours，得到每个细胞的轮廓线i-contour，计算被每一个细胞轮廓线i-contour包围的面积值area以及轮廓线的长度length。

将每一个细胞轮廓线i-contour的将轮廓线长度值length以及面积值area代入下式，获得判定参数值e。

e＝4π×area/(length×length)

随后，设定阈值t，并根据判定参数值e对每一个细胞轮廓线i-contour进行如下的判断：

如果1-e不大于设定阈值t，则判定该细胞轮廓线i-contour是封闭的。1-e，是一个减法运算。

如果1-e大于设定阈值t，则判定该细胞轮廓线i-contour是不封闭的。将不封闭的细胞轮廓线i-contour记为不封闭孔洞的的轮廓线j-contour。

阈值t的范围是(0,1]。

由不封闭孔洞的轮廓线j-contour的点序列points，通过点序列points里任意两点连接画一条直线。该直线灰度值为0，即为黑色的直线，得到填充后的二值图像D。

参见图2，进一步说，步骤5的具体过程为：

步骤5.1遍历步骤4中得到的细胞轮廓的线点序列集合contours，得到每个细胞的轮廓线i-contour，计算被细胞轮廓线i-contour包围的面积值area以及轮廓线的长度length。

步骤5.2将步骤51中得到的轮廓线长度值length以及被细胞轮廓线i-contour包围的面积值area代入下式e＝4π×area/(length×length)，得到判定参数值e。判定参数值e即为圆形度。当判定参数值e为1时，细胞轮廓线i-contour即为圆形，1-e越大，图形越不规则，与圆形的差距越大。1-e越小，图像越接近于圆形。

步骤5.3设定阈值t，其中阈值t∈(0,1)。如果1-e大于设定阈值t，则判定该轮廓线i-contour是不封闭，改用不封闭细胞孔洞的轮廓线j-contour标识。

如果1-e不大于阈值t，则说明是干扰目标，舍去不做处理。

步骤5.4由不封闭孔洞的轮廓线j-contour，得到点序列points。得到点序列points的具体方法为：

从点序列points里任意取两点，并连接该两点画出一条直线，该直线的灰度值为0，即为黑色的直线，直线宽度为2个单位像素，得到对细胞的不封闭孔洞填充后的二值图像D。

进一步说，步骤7的具体过程为：

步骤7.1根据步骤2中获得的封闭孔洞区域内像素点的位置集合Ω，得到该位置集合Ω中每个像素点的位置信息(i，j)。

步骤7.2将步骤7.1中每个像素点的位置(i，j)对应的再次取反后的图像I中的像素值f(i，j)设为MINIMUM，即标记为极小值，其中MINIMUM取值为0为。

步骤7.3输出步骤7中唯一化标记极值后的图像J。

参见图3，进一步说，步骤8的具体过程为：

步骤8.1设定标记图M，大小与图像J一致，标记值初始化为INIT，按灰度递增的次序对步骤7获得的经过唯一化标记极值的图像J中像素点进行排序，获得像素点集合Q(h)。其中，h为像素点集合的灰度层，层号h∈[MINIMUM,255]。

步骤8.2得到灰度层h等于MINIMUM的像素集合Q(h＝MINIMUM)内的所有点。将该层的像素集合Q(h)中的每个点对应标记图上的灰度值赋予标记MASK，然后遍历该层的像素集合Q(h)，如果当前点的标记不是MASK那么执行空操作，继续该层的像素集合Q(h)的遍历。如果当前点的标记(即标记图上的灰度值)为MASK那么将该点记为盆地w,其中w为盆地的标记及细胞的序号。然后将当前点压入队列Q1中，按照广度优先的方式递归地找到当前点的所在的连通区域，将连通区域上的点全部标记为盆地w。

步骤8.3将其余像素集合Q(h)中的每个点的灰度值赋予标记MASK。遍历该层的像素集合Q(h)，计算当前像素点p的八个领域点，如果领域点中存在点属于某个水盆(即对应标记图上的标记为i)，则将当前点压入队列Q2中。。

步骤8.4如果队列Q2不空，则取出第一个元素，即当前像素点p，计算当前像素点p的八个邻域点，如果邻域点中存在的点只属于一个盆地i，则给点p打上该集水盆的标记i。如果邻域点中存在两个及两个以上的点属于不同的集水盆，则打上水坝的标记WSHED；如果邻域点中存在点属于水坝，则也打上水坝的标记WSHED。同时将当前像素点p的所有标记为MASK的领域点像素压入FIFO先进先出队列Q2中。

步骤8.5所有灰度层均处理完毕及浸没过程结束后，将标记为WSHED水坝的像素点的灰度值设为背景值(255)，把集水盆地内的像素点的灰度值均设为前景目标的灰度值(0)，优选的方案是，将背景值设为255，前景目标的灰度值为0。最终得到一幅分割后的二值图像。上一步骤中被标记为WSHED水坝的像素点组成了结果图像R中重叠细胞的连续分割线。

实施例

更具体地说，如图1、图2和图3所示，本发明包括以下步骤：

一、采集图像的预处理阶段

将采集得到的图像进行灰度化，使用加权平均法，将三个分量以不同的权值进行加权平均，得到灰度化图像，本发明所使用的加权公式如下:

f(i,j)＝0.30R(i,j)+0.59G(i,j)+0.11B(i,j)

f(i,j)表示灰度化后的图像灰度值，R(i,j)，G(i,j)，B(i,j)表示灰度化之前的原图像素点所对应的三个通道的颜色灰度值。

对灰度化后的图像进行4等分，总共四块矩形ROI区域，分别是左上角一块img1，右上角一块img2，左下角一块img3，右下角一块img4。具体参数如下表：

矩形ROI名称	矩形的左上角顶点坐标	矩形宽度	矩形高度
				img1	(0,0)	width/2	height/2
img2	(width/2,0)	width-width/2	height/2
				img3	(0,height/2)	width/2	height-height/2
img4	(width/2,height/2)	width-width/2	height-height/2

注：在上表中width表示原图的宽度，height表示原图的高度。

获取四块感兴趣区域ROI后，分别对这四张图像进行二值化，二值化后将四张1/4图的对应坐标点上的灰度值赋值到目标图像上。

结合高倍镜下细胞图像的特点，本方案采用了一种自适应阈值的二值化方法，该方法对图像中的每一个像素点计算自适应阈值，算法如下描述。

首先定义集合{gray(i,j)},1<＝i<＝I,1<＝j<＝J表示待处理的灰度化图像，I表示该图像的width值，J表示该图像的height值。其中T(x,y)是为每一个像素点单独计算的阈值，mean(x,y)是为每一个像素点单独计算的均值，T(x,y)和mean(x,y)的计算公式如下：

$mean(x,y)=1/{(2p+1)}^2\underset{i-p}{\overset{i+p}{\&Sigma;}}\underset{j-p}{\overset{j+p}{\&Sigma;}}\left(src\right(i,j\left)\right),$

其中p*p是用来计算阈值的象素邻域大小，与它相关的参数block_size＝2*p+1。本方案中block_size取101，该值足够大时,能够很好的阈值化，且必须为奇数。T(x,y)的阈值计算公式如下：

T(x,y)＝mean(x,y)-param1,

其中param1是一个与方法有关的常量参数，本方案中取5，也可以是负数。

得到每一个像素点的自适应阈值后计算得到二值化的图像，定义集合{binary()}，1<＝i<＝I,1<＝j<＝J表示处理后的二值化图像，计算公式如下：

$binary(x,y)=\left\{\begin{array}{c}255,gray(x,y)>T(x,y)\\ 0,gray(x,y)<=T(x,y)\end{array}\right.$

其次，使用基于数学形态学的去噪方法进行图像去噪，采用的处理方式如下：

对于一副二值图像来说，图像腐蚀运算能够剔除图像中的边界点，而保留尺寸相对较大的目标，使得边界向内部收缩。在某种意义上，具有过滤小细节的作用。膨胀运算能够将与物体接触的背景结合，填充其中的小缺口，弥合图像中的小裂缝，加粗狭窄细长的部分。使得边界向外部扩大。下面介绍腐蚀和膨胀的基本概念和运算。

使用数学形态学处理图像时，需要一种搜索图像信息的“探针”，即结构元素，这些结构元素通常是一些小的简单集合，如正方形，圆形等集合。使用不同的结构元素和形态学算子可以获取关于目标的大小、形状、连通性和方向性等信息，其处理效果则取决于结构元的大小、内容、逻辑运算的性质。

1)腐蚀：

运用结构元素把连接成分的边界点向内收缩若干像素，去除小于结构元素物体的处理过程。其运算符为，A用B来腐蚀记作A B，其运算公式为：

$A\mathrm{\&Theta;}B=\left\{x\right|{\left(B\right)}_x\&SubsetEqual;A\}$

2)膨胀：

运用结构元素把连接成分的边界向外膨胀若干像素的处理。该运算能够有效的填补物体的空洞，断线等。膨胀的运算符为，图像集合A用结构元素B来膨胀，记作A B，其运算公式如式：

本方案采用的处理方式是先腐蚀后膨胀，使用3*3的正方形结构元素，先进行3次腐蚀运算，再进行3次膨胀运算。这样处理的目的是先把孤立点先清理干净，以及分隔开细胞之间狭窄的连通区域。然后再利用膨胀运算填补细胞孔洞的小缺口，弥合细胞中的小裂缝，加粗细胞的边缘厚度，同时将细胞边界向外部扩大到腐蚀运算之前的正常大小程度。

二、细胞孔洞提取

二值图像中存在三个部分，1.背景、2.细胞边缘、3.细胞孔洞，在这里分别用集合A、B、Q表示，U表示图像全集。其中细胞边缘集合B为细胞内径和外径之间区域的像素点集合，细胞孔洞集合Q为细胞内径以内区域的像素点集合。上述三者存在这样的关系：

三者均为图像上的连通域，背景为第一级连通域，细胞边缘为二级连通域，细胞孔洞恰好是三级连通域。示意图如图4：

分析以上存在的性质，可以用集合论的知识和连通域算法提取出细胞孔洞。

已知得到的二值图像中只有两种灰度值的像素点，细胞边缘上的点的灰度值为0，背景和细胞孔洞的点的灰度值均为255。首先，分四次遍历二值图像中的四条边界线，i＝1,i＝I,j＝1,j＝J，其中I是图像宽度值，J是图像高度值，i和j分别表示横坐标值和纵坐标值，取得四条边界线上轨的每个像素点(i，j)，如果灰度值f(i，j)等于255值(white背景)，那么以该点为种子点，利用八连通区域生长算法将连通区域内的所有像素点的灰度值设为0。其次，遍历整图中每个像素点(i，j)，如果灰度值f(i，j)不等于0，即为细胞孔洞内的像素点，将这些点保存在集合Ω中。

三、进行细胞的封闭孔洞填充

将步骤2中得到的孔洞区域集合Ω中的所有像素点(i，j)对应在二值图像B上的灰度值f(i，j)设为0，完成细胞图像中封闭孔洞的填充，得到图像C。

四、提取细胞的轮廓线点序列

在进行了封闭孔洞填充后的图像C中提取细胞的轮廓线点序列集合contours。

对获得的图像C逐像素点进行检测，如果该点为黑，且它的8个相邻点都是黑色时，则该点为内部点，将该点删除，最终得到图像的轮廓线。

对获得的轮廓进行轮廓跟踪，先根据“探测准则”找到目标轮廓上的像素点，然后根据这些点找出目标物体上的其他像素点。先按照从左到右、从下到上的探测准则顺序搜索图像的所有像素点，找到最左下方的边界点。然后根据如下跟踪准则：

从边界点开始，定义初始的搜索方向为左上方朝向。如果左上方的点是黑点，则为边界点，否则顺时针旋转45度，这样一直找到第一个黑点为止。然后把这个黑点作为新的边界点，在当前搜索方向的基础上逆时针旋转90度，继续用同样的方法搜索下一个黑点，直到返回最初的边界点或直到找不到点为止。

五、进行细胞的不封闭孔洞填充

首先，遍历轮廓点序列集合contours得到每个细胞的轮廓线i-contour，计算被轮廓线i-contour包围的面积值area以及轮廓线的长度length，具体方法如下：

通过依次计算轮廓线上的序列点之间的线段长度，并求和得到轮廓的长度。轮廓包围的面积值等于轮廓线内的像素点的个数加上轮廓线上的像素点的个数，即轮廓线以及被轮廓线包围的连通区域的像素点个数，计算方法如下：

以轮廓线上的任意一点作为种子点，使用八连通算法找到该点所在的连通区域，每找到一个新的未标记的像素点面积值就进行加一累计。

将计算得到的轮廓线长度值length以及被轮廓线包围的面积值area代入下式e＝4π×area/(length×length)，得到判定参数值e，当判定参数即圆形度e为1时，图形即为圆形，1-e越大，图形越不规则，与圆形的差距越大。

如果1-e大于设定阈值t，则判定该轮廓线i-contour是不封闭的细胞孔洞的轮廓线j-contour，其中设定阈值t∈(0,1)。

取得不封闭孔洞的轮廓线j-contour，得到轮廓线j-contour的点序列points，通过points里任意两点连接画一条黑色的直线，得到对细胞的不封闭孔洞填充后的二值图像D；

六、倒角距离变换求取图像T

首先，对二值图像进行取反操作后用前向模板对填充后的二值细胞图像D进行从左到右、由顶至下的前向扫描。在模板进行所到每一个位置，模板中的每一个元素与其对应的像素值相加而形成一个两项和的集合。对应模板空白处定义为空操作，不计入和集合。位于模板中心的像素用这些和集合中的最小值取代。前向模板如图5：

其次，用后向模板对第二步结果进行从右向左、由下至顶的后向扫描。处理方法和第二步相同。后向模板如图6：

对获得的图像T进行非线性增强处理，首先进行微小值的消除，将图像T中对应的每个像素点的值减去一个常数值，得到新的图像H，之后，对新的图像H进行非线性变换，具体公式如下：

$K=INT(\frac{H}{g}+1)\&times;g$

其中INT()函数是取整运算。g是非线性变换的尺度等级，它的取值是由各个区域中的灰度差异决定的，K是变换后的图像。将图像K进行取反操作后最后得到处理好后的图像I。七、细胞孔洞极值唯一化

根据步骤2中获得的细胞孔洞内像素点的位置集合Ω，得到集合Ω中每个像素点的位置信息(i，j)。

将得到的每个像素点的位置(i，j)对应图像I中的梯度值f(i，j)设为MINIMUM即标记为极小值，其中MINIMUM为梯度值0。

输出唯一化标记极值后的图像J。

八、使用基于标记的分水岭方法进行分割

初始化标记图M(标记图是和灰度图等尺寸大小的二维数组)初始化标记值为INIT。对灰度图进行遍历按灰度递增的次序排序，确定具有对应于灰度层h的像素集合Q(h)，其中灰度层号h∈[MINIMUM,255]。

得到像素集合Q(h＝MINIMUM)内的所有点。将该层的像素集合Q(h)中的每个点对应标记图上的灰度值赋予标记MASK，然后遍历该层的像素集合Q(h)，如果当前点的标记不是MASK那么执行空操作，继续该层的像素集合Q(h)的遍历。如果当前点的标记(即标记图上的灰度值)为MASK那么将该点记为盆地w,其中w是盆地的标记及细胞的序号。然后将当前点压入队列Q1中，按照广度优先的方式递归地找到当前点的所在的连通区域，将连通区域上的点全部标记为盆地w；

遍历其余像素集合Q(h)，将其中的每个点的灰度值赋予标记MASK。遍历该层的像素集合Q(h)，计算当前像素点p的八个领域点，如果领域点中存在点属于某个水盆(即对应标记图上的标记为w)，则将当前点压入队列Q2中。

如果队列Q2不空，则取出当前像素点p，计算p的八个邻域点，如果邻域点中存在的点只属于一个盆地w，则给点p打上该集水盆的标记w。如果邻域点中存在两个及两个以上的点属于不同的集水盆，则打上水坝的标记WSHED；如果邻域点中存在点属于水坝，则也打上水坝的标记WSHED。同时将当前像素点p的所有标记为MASK的领域点像素压入队列Q2中。

所有灰度层均处理完毕及浸没过程结束后，将标记为WSHED水坝的像素点的灰度值设为背景值(255)，把集水盆地内的像素点的灰度值均设为前景目标的灰度值(0)，最终得到一幅分割后的二值图像。上一步骤中被标记为WSHED水坝的像素点组成了结果图像R中重叠细胞的连续分割线。

九、对分割后的细胞进行量化、计数

计算返回的特征向量组中向量个数，细胞图像中细胞的数目等于向量个数。

通过特征向量组中细胞的外接矩形，计算外接矩形两个对角点连线的中点作为每个细胞的中心位置坐标的近似值；计算细胞外接矩形的相邻两边长的长度平均值近似作为细胞的半径。

十、测试图像

在测试细胞图像时，首先通过预处理样本图像得到二值图像，然后再通过细胞孔洞填充和细胞分割方法这两个步骤，最后定位每张图像上的细胞并进行计数统计。

本实施例的测试细胞样本图像库为目前各大医院临床检测中得到的微米级显微镜下的细胞图像，共400张高倍镜下的细胞图像。每张图像中的细胞个数平均在30个以上。图像的大小为2048*1536像素。实验运行平台为联想-Z400系列64位笔记本，Intel的i5处理器，CPU2.60GHz，4G安装内存。多组对比算法均在同一个硬件平台上检测。实验的统计结果如下：

(1)准确度高对1000多个细胞分割结果的统计显示：与目视鉴别结果一致的约占98％以上。

(2)重复性好、稳定性强对每张细胞图像进行多次处理测量，并统计细胞数目和分割效果，多次结果均保持一致。

(3)鲁棒性强对噪声比较大的图像的测量，其准确性、可重复性及稳定性同样令人满意。

测试方法一：(1)封闭孔洞填充方法，利用八连通算法标记背景，将剩下的未标记区域填充成目标细胞。(2)封闭孔洞填充方法+不封闭孔洞填充方法，先进行封闭孔洞的填充，然后查找到不封闭的细胞孔洞，利用轮廓线信息填充不封闭的细胞孔洞。其填充结果对比见图7、8和9。

实验结果表明，本发明填充算法可以在不影响传统填充结果的前提下对不封闭的孔洞进行有效地填充，对填充率做到了实质的提升。然后对所有图像分别进行两种方法处理后得到的填充率对比见表1。

表1

从表1中可以看出，(1)随着不封闭孔洞填充方法的加入，能更充分的填充图像二值化后产生的细胞孔洞，填充率会有所提高。(2)实际实验中，在细胞孔洞填充步骤中增加不封闭孔洞填充法后，被填充的细胞个数明显增加，填充率显著提高了。

测试方法二：识别每张细胞图像，统计分割方法的误判率，通过平均误判率来评测不同算法分割的精确性。(1)基于距离变换和非线性处理的重叠细胞分水岭分割方法，利用目前最新的改进分水岭分割方法对填充后的二值图像中粘连的细胞进行分割。(2)在方法(1)中增加利用细胞孔洞唯一化细胞极值操作后的分割方法，利用细胞孔洞标记细胞极小值，再利用基于标记的分水岭方法分割重叠细胞。其分割对比结果见图10。

对所有图像分别进行两种分割方法处理后计算平均误判率，对比结果见表2。

表2

从表2中可以看出，基于细胞孔洞的改进分水岭分割方法降低了误判率，消除了过分割现象，提高了分割结果的精确度。

测试方法三：识别每张细胞图像，比较两种分割算法产生的分割线的效果。(1)步骤84中用传统的算法代替，然后分割重叠细胞图像。(2)利用本发明的算法分割重叠细胞图像。其分割对比结果见图11。

从上图对比中可以看出，传统算法产生的分割线偶尔会出现不连续的情况，而本发明算法的分割线没有出现不连续现象，分割效果较完美。这个特点对所有测试图像均符合，可见本发明算法具有较好的鲁棒性。

本文中的医学图像处理是指，医学图像处理又称为医学图像的后处理，是指利用计算机的信息处理能力对获取的医学图像进行各种处理和分析，使之满足医疗需要的一系列技术的总称，包括有图像增强、图像分割和图像配准等。

本文中的自动细胞图像识别是指，将细胞图像数字化后，运用光学密度直方图、边界跟踪和轮廓跟踪、形状学分析、细胞纹理分析和空域频域分析等数字图像处理方面的技术，提取细胞各种特征参数，将分类误差减小到了人工误差接受的范围内，实现自动对细胞进行识别。

本文中的细胞分割处理是指，细胞分割处理是图像处理技术的基本方法之一。图像分割是将图像分成若干部分，其本质是将像素进行分类。分类的依据是像素的颜色、频谱特性、灰度值、空间特性或纹理特性等。

本文中的细胞图像识别是指，细胞图像识别过程实际上是图像分割区域的一个标记过程，即对已分割好的各个物体用识别算法来辨别景物，并给这个物体赋予特定的标记。最后对被标记的细胞图像进行统计以实现细胞计数目的。

本发明提供了微米级显微采集环境下的细胞自动识别计数的思路及方法，具体实现该技术方案的方法和途径很多，以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。本实施例中未明确的各组成部分均可用现有技术加以实现。

Claims (7)

1.一种用于细胞的识别计数方法，其特征在于：通过电脑按如下步骤进行：

步骤1，通过微米级显微设备获取细胞原始图像A；所述的细胞原始图像A由含有孔洞的细胞图像和背景图像2部分构成；其中，含有孔洞细胞图像进一步分为2种：封闭孔洞的细胞图像、不封闭孔洞的细胞图像；

对微米级显微镜采集环境下获得的原始图像A进行图像二值化预处理，获得经过二值化处理的图像B；经过二值化处理的图像B内的像素点的灰度值只有2种，将其中数值较高的像素点的灰度值记为高值灰度，余下的记为低值灰度；

经过二值化处理的图像B，由封闭孔洞的二值化图像区域、不封闭孔洞的二值化图像区域、二值化背景图像区域3部分构成；其中，封闭孔洞的二值化图像区域、不封闭孔洞的二值化图像区域、二值化背景图像分别与原始图像A中的封闭孔洞的图像区域、不封闭孔洞的图像区域、背景图像区域相对应；

步骤2，采用基于连通域的孔洞分割方法对经过二值化处理的图像B进行细胞孔洞提取，即将封闭孔洞的二值化细胞图像全部标记出来，将封闭孔洞的二值化图像所覆盖的区域简称为封闭孔洞区域，封闭孔洞区域内的像素点的所有位置坐标(i，j)组成封闭孔洞区域内像素点的位置集合Ω；

步骤3，将封闭孔洞区域内像素点的位置集合Ω中的所有像素点的位置坐标(i，j)所对应的灰度值记为f(i，j)，将该灰度值f(i，j)设为0，即对经过二值化处理的图像B中封闭孔洞的二值化图像区域进行填充，得到一次填充后的图像C；

步骤4，对一次填充后的图像C提取细胞的轮廓，获得细胞轮廓的线点序列集合contours；

步骤5，采用基于圆形度判定法，对由步骤4获得的线点序列集合contours进行填充，即对不封闭孔洞的二值化图像区域进行填充，得到二次填充后的图像D；

步骤6，对二次填充的图像D进行取反操作，获得经过取反处理的图像E；

对经过取反操作处理的图像E进行倒角距离变换，获得经过倒角变换的图像T；

对经过倒角变换的图像T进行消除极小值、非线性变换、和取反操作处理，获得再次取反后的图像I；

步骤7，根据封闭孔洞区域内像素点的位置集合Ω，在再次取反后的图像I中进行细胞孔洞极值唯一化标记，将与封闭孔洞区域内像素点的位置集合Ω中位置相对应的像素点的值f(i，j)标记为MINIMUM，得到经过唯一化标记极值的图像J；

步骤8，使用分水岭方法对经过唯一化标记极值的图像J上进行图像分割，得到分割后的细胞图像R；

步骤9，对分割后的图像R进行细胞进行标记和量化，得到细胞的数量和每个细胞的位置坐标，即得到结果。

2.根据权利要求1所述的一种用于细胞的识别计数方法，其特征在于：经过预处理的图像B中的像素点只有两种灰度值；将这两种灰度值分别记为高值灰度和低值灰度；其中，经过预处理的图像B中的细胞边缘上的像素点为低值灰度，经过预处理的图像B中的背景和细胞孔洞的像素点的灰度值为高值灰度。

3.根据权利要求1所述的一种用于细胞的识别计数方法，其特征在于：步骤2的具体方法为：首先，分别遍历经过二值化处理的图像B中的四条边界线，i＝1,i＝I,j＝1,j＝J，其中I是图像宽度值，J是图像高度值，i和j分别表示横坐标值和纵坐标值，取得四条边界线上轨的每个像素点(i，j)，随后进行如下的判断：

如果像素点的灰度值f(i，j)等于255值，即该像素点为背景图像，那么以该像素点为种子点，利用八连通区域生长算法将连通区域内的所有像素点的灰度值设为0；

如果像素点的灰度值f(i，j)不等于0，即该像素点为细胞孔洞内的像素点，将该像素点点保存在封闭孔洞区域内像素点的位置集合Ω中。

4.根据权利要求1所述的一种用于细胞的识别计数方法，其特征在于：步骤5的具体方法如下：首先，遍历步骤4的线点序列集合contours，得到每个细胞的轮廓线i-contour，计算被每一个细胞轮廓线i-contour包围的面积值area以及轮廓线的长度length；

将每一个细胞轮廓线i-contour的将轮廓线长度值length以及面积值area代入下式，获得判定参数值e；

e＝4π×area/(length×length)

随后，设定阈值t，并根据判定参数值e对每一个细胞轮廓线i-contour进行如下的判断：

如果1-e不大于设定阈值t，则判定该细胞轮廓线i-contour是封闭的；

如果1-e大于设定阈值t，则判定该细胞轮廓线i-contour是不封闭的；将不封闭的细胞轮廓线i-contour记为不封闭孔洞的的轮廓线j-contour；

阈值t的范围是(0,1]；

由不封闭孔洞的轮廓线j-contour的点序列points，通过点序列points里任意两点连接画一条直线；该直线灰度值为0，即为黑色的直线，得到第二次填充后的二值图像D。

5.根据权利要求1或4所述的一种用于细胞的识别计数方法，其特征在于：步骤5的具体过程为：步骤5.1遍历步骤4中得到的细胞轮廓的线点序列集合contours，得到每个细胞的轮廓线i-contour，计算被细胞轮廓线i-contour包围的面积值area以及轮廓线的长度length；

步骤5.2将步骤51中得到的轮廓线长度值length以及被细胞轮廓线i-contour包围的面积值area代入下式e＝4π×area/(length×length)，得到判定参数值e；判定参数值e即为圆形度；当判定参数值e为1时，细胞轮廓线i-contour即为圆形，1-e越大，图形越不规则，与圆形的差距越大；

步骤5.3设定阈值t，其中阈值t∈(0,1)；如果1-e大于设定阈值t，则判定该轮廓线i-contour是不封闭，改用不封闭孔洞的轮廓线j-contour标识；

步骤5.4由不封闭孔洞的轮廓线j-contour，得到点序列points；得到点序列points的具体方法为：从点序列points里任意取两点，并连接该两点画出一条直线，该直线的灰度值为0，即为黑色的直线，直线宽度为2个单位像素，得到对不封闭孔洞填充后的二值图像D。

6.根据权利要求1所述的一种用于细胞的识别计数方法，其特征在于：步骤7的具体过程为：

步骤7.1根据步骤2中获得的封闭孔洞区域内像素点的位置集合Ω，得到该位置集合Ω中每个像素点的位置信息(i，j)；

步骤7.2将步骤7.1中每个像素点的位置(i，j)对应的再次取反后的图像I中的值f(i，j)设为MINIMUM，即标记为极小值，MINIMUM取值为0；

步骤7.3输出唯一化标记极值后的图像J。

7.根据权利要求1所述的一种用于细胞的识别计数方法，其特征在于：步骤8的具体过程为：

步骤8.1建立标记图像M,将M中的所有像素点的值初始化为INIT，按灰度递增的次序给由步骤7获得的经过唯一化标记极值的图像J中像素点进行排序，获得像素点集合{Q(h)，h∈[MINIMUM,255]}，其中，称h为灰度层；

步骤8.2在标记图像M中找到坐标属于Q(h＝MINIMUM)的所有像素点，并将这些点的灰度值设置为MASK,然后遍历该层，如果当前点的标记不是MASK那么执行空操作，继续该层的遍历；如果当前点的标记为MASK，那么将该点记为盆地w，其中w是盆地的标记及细胞的序号；然后将当前点压入队列Q1中，按照广度优先的方式递归地找到当前点的所在的连通区域，将连通区域上的点全部标记为盆地w；

步骤8.3对于除minimun之外的灰度层h，遍历该层的像素集合Q(h)将每个对应像素点的值赋予标记MASK，且将全部插入队列Q2；

步骤8.4从队列Q2中取出像素点p，计算像素点p的八个邻域点，如果邻域点中存在的点只属于一个盆地w，则给点p打上该集水盆的标记w；如果邻域点中存在两个及两个以上的点属于不同的集水盆，则打上水坝的标记WSHED；如果邻域点中存在点属于水坝，则也打上水坝的标记WSHED；同时将当前像素点p的所有标记为MASK的邻域点像素压入Q2中，重复此步骤直到队列为空；步骤8.5所有灰度层均处理完毕及浸没过程结束后，将标记为WSHED水坝的像素点的灰度值设为背景值，把集水盆地内的像素点的灰度值均设为前景目标的灰度值，最终得到一幅分割后的二值图像。上一步骤中被标记为WSHED水坝的像素点组成了结果图像R中重叠细胞的连续分割线。