CN110132823A - 一种基于模板匹配与查找轮廓的细胞计数方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种基于模板匹配与查找轮廓的细胞计数方法，涉及细胞计数方法。本发明首先读取显微镜下细胞扫描图像，建立网格模板图像；然后利用模板匹配定位计数区域；对细胞计数区域进行灰度变换和局部亮度补偿；再依次进行对比度拉伸、自适应二值化处理、填充空洞；最后对填充结果图查找轮廓，并处理统计所有的细胞区域，得到显微镜下细胞扫描图像中细胞的数量。本发明解决了现有细胞计数技术效率较低、计数准确率不高的问题。本发明可用于细胞的准确计数。
Description
技术领域
本发明涉及细胞计数方法，具体涉及一种基于模板匹配与查找轮廓的细胞计数方法。
背景技术
在大量的细胞生物研究实验中，需要对细胞或其他生物微粒进行浓度检测(定量计数)，细胞悬液浓度(或数量)既是细胞培养的监测参数，也是很多实验项目中的必要参数，对于成功完成实验是非常基础但却很重要的过程条件。现有的计数手段主要包括采用细胞计数板的人工计数方法，基于图像分析技术的自动化计数仪器，以及利用电阻法(库尔特原理)的自动化计数仪器。其中，人工计数方法最为普遍，实验人员将悬浮细胞样品注入细胞计数板计数池，在显微镜下以肉眼观察并按规则进行人工计数。此方法的主要缺点是：(1)技术不够准确：由于计数池本身的深度数倍于细胞尺度，这样就会造成细胞样品注入后在其中分层悬浮，从而观察到的细胞形态会有所差别，造成计数结果的不准确和细胞活性判断错误；按规则注入细胞计数板的样品通常为10μL，但是在显微镜观察区域内的样品量仅仅是一小部分，不足1μL，这样细胞样品在计数池内分布是否均匀就会对结果造成很大的影响；计数时是按照一定规则来人工计数的，操作人员水平的差异以及肉眼观察导致的疲劳度就引入很大的人为误差；(2)使用效率低：细胞计数板使用时过程较为繁琐，需要定期进行校准以保证测量的精密度；且在细胞计数板上一次只能进行一种样品的测量，较为不便；一般一次细胞计数平均需要花费20分钟，细胞计数的效率较低。基于图像分析技术的自动化仪器虽避免了肉眼观察的困难，但是仍然存在以下不足：(1)引入了一次性计数片耗材的使用，增加了用户检测成本；(2)计数片在结构上与细胞计数板类似，所以也存在计数板上细胞分层悬浮导致结果不准确和活性误判的问题；(3)同人工计数一样，大部分基于图像法的仪器存在检测样品量少导致的结果偏差大的问题。传统的库尔特计数仪器整体的集成度都不高，操作起来不够简洁，另外就是传统库尔特计数仪不具备细胞样品活率评判的功能，在细胞群体中总有一些因各种原因而死亡的细胞，因此计数会不够准确。
发明内容
本发明为解决现有细胞计数技术效率较低、计数准确率不高的问题，提供了一种基于模板匹配与查找轮廓的细胞计数方法。
本发明所述一种基于模板匹配与查找轮廓的细胞计数方法，通过以下技术方案实现：
步骤一、读取显微镜下细胞扫描图像，根据已知横竖网格数量与间距，建立网格模板图像；
步骤二、利用模板匹配定位计数区域：根据步骤一中的得到的网格模板图像，利用带旋转角度和尺度缩放的模板匹配算法完成对细胞计数区域的定位，进而得到细胞计数区域；
步骤三、对细胞计数区域进行灰度变换和局部亮度补偿；
步骤四、对经过步骤三得到的补偿结果图进行对比度拉伸；
步骤五、自适应二值化处理经过步骤四得到的对比度拉伸结果图；
步骤六、填充经过步骤五得到的二值化结果图中的空洞；
步骤七、对经过步骤六得到的填充结果图查找轮廓，并处理统计所有的细胞区域，得到显微镜下细胞扫描图像中细胞的数量。
作为对上述技术方案的进一步阐述：
进一步的，步骤三具体包括以下过程：
对步骤二得到的细胞计数区域进行灰度变换，统计得到的灰度图像素点的灰度值，计算灰度平均值a；设定块大小，将灰度图分块，统计子块灰度值，去除最大灰度值与最小灰度值，计算子块的灰度平均值b和亮度矩阵M；将M中的每个元素与a作差，得到子块的亮度差值矩阵N，将所有子块的亮度差值矩阵N在对应位置拼接为与原灰度图大小相同的亮度分布矩阵P，则亮度补偿后的图像为原灰度图与P的差值。
进一步的，步骤四中使用两段式的分段线性变换函数进行对比度拉伸，具体为：
其中，(x1，y1)为分段线性变换函数中折点位置坐标，x为所述补偿结果图中的像素值，k1为y1/x1，k2为(255-y1)/(255-x1)。
进一步的，步骤五具体为：
利用大小为ew1、eh1的滤波核对所述对比度拉伸结果图进行均值滤波处理，若原图像素点值大于滤波后该像素点值与偏移量的和，则将该点像素值设为255，否则设为0。
进一步的，骤六具体为：延展所述二值化结果图，并利用漫水填充法，填充二值化结果图中的连通区域，然后裁剪延展图像并得到填充后的结果图。
进一步的，步骤七具体为：
对经过步骤六得到的填充结果图查找轮廓，计算轮廓的平均面积，设定面积阈值，对大于该阈值的轮廓，使用轮廓面积除以阈值的向下取整结果作为该细胞区域的个数，对小于等于该阈值的轮廓，直接将该轮廓区域计为一个细胞，统计所有细胞区域，得到显微镜下细胞扫描图像中细胞的数量。
进一步的，所述面积阈值设为轮廓的平均面积的3倍大小。
本发明最为突出的特点和显著的有益效果是：
本发明所涉及的一种基于模板匹配与查找轮廓的细胞计数方法，利用利用模板匹配定位计数区域，再结合查找轮廓完成对细胞的计数；并且对不同的细胞区域分别进行处理，对于细胞大小差异较大或者多细胞聚集的图像来说，准确性显著提升；本发明方法操作简便、实施效率较高，并且计数准确率高，相比现有技术，细胞计数准确率提高约10％。
附图说明
图1为本发明流程图；
图2为本发明步骤一中建立的网格模板图像；
图3为本发明中所述对比度拉伸结果图；
图4为本发明中所述填充结果图；
图5为本发明中经过查找轮廓后得到的大细胞或者多细胞聚集区域效果图。
具体实施方式
具体实施方式一：结合图1、图2、图3、图4对本实施方式进行说明，本实施方式给出的一种基于模板匹配与查找轮廓的细胞计数方法，具体包括以下步骤：
步骤一、读取显微镜下细胞扫描图像，建立网格模板图像：已知计数区域为网格结构，因此根据已知横竖网格数量与间距，建立网格模板图像(如图2所示)；
步骤二、利用模板匹配定位计数区域：根据步骤一中的得到的网格模板图像，利用带旋转角度和尺度缩放的模板匹配算法完成对细胞计数区域的定位，进而得到细胞计数区域；
步骤三、对细胞计数区域进行灰度变换和局部亮度补偿；
步骤四、对经过步骤三得到的补偿结果图进行对比度拉伸；
步骤五、自适应二值化处理经过步骤四得到的对比度拉伸结果图；
步骤六、填充经过步骤五得到的二值化结果图中的空洞；
步骤七、对经过步骤六得到的填充结果图查找轮廓，处理大细胞或者多细胞聚集区域，然后统计所有的细胞区域，得到显微镜下细胞扫描图像中细胞的数量。
具体实施方式二：本实施方式与具体实施方式一不同的是，步骤三具体包括以下过程：
对步骤二得到的细胞计数区域进行灰度变换，统计得到的灰度图像素点的灰度值，计算灰度平均值a；设定块大小，将灰度图分块，统计子块灰度值，去除最大灰度值与最小灰度值，计算子块的灰度平均值b和亮度矩阵M，M中像素值均为b；将M中的每个元素与a作差，得到子块的亮度差值矩阵N，将所有子块的亮度差值矩阵N在对应位置拼接为与原灰度图大小相同的亮度分布矩阵P，则亮度补偿后的图像为原灰度图与P的差值。
其他步骤及参数与具体实施方式一相同。
具体实施方式三：本实施方式与具体实施方式一或二不同的是，步骤四中使用两段式的分段线性变换函数进行对比度拉伸，具体为：
其中，(x1，y1)为分段线性函数中折点位置坐标，x1为横坐标，y1为纵坐标，x为所述补偿结果图中的像素值，k1为y1/x1，k2为(255-y1)/(255-x1)；最终扩展高灰度值像素的灰度动态范围，压制低灰度值像素的灰度动态范围，如图3所示。
其他步骤及参数与具体实施方式一或二相同。
具体实施方式四：本实施方式与具体实施方式三不同的是，所述步骤五具体为：
利用大小为ew1、eh1的滤波核对所述对比度拉伸结果图进行均值滤波处理，若原图像素点值大于滤波后该像素点值与偏移量的和，则将该点像素值设为255，否则设为0。
其他步骤及参数与具体实施方式三相同。
具体实施方式五：本实施方式与具体实施方式四不同的是，所述步骤六具体为：延展所述二值化结果图，并利用漫水填充法，填充二值化结果图中的连通区域，然后裁剪延展图像并得到如图4所示的填充后的结果图。
其他步骤及参数与具体实施方式四相同。
具体实施方式六：本实施方式与具体实施方式五不同的是，所述步骤七具体为：
对经过步骤六得到的填充结果图查找轮廓，如图5所示，计算轮廓的平均面积，设定面积阈值，对大于该阈值的轮廓，使用轮廓面积除以阈值的向下取整结果作为该细胞区域的个数，对小于等于该阈值的轮廓，直接将该轮廓区域计为一个细胞，统计所有细胞区域，得到显微镜下细胞扫描图像中细胞的数量。
其他步骤及参数与具体实施方式五相同。
具体实施方式七：本实施方式与具体实施方式六不同的是，所述面积阈值设为轮廓的平均面积的3倍大小。设置此面积阈值后，能够简单而准确的分辨出单个细胞区域与多个细胞区域，从而保证了结果的准确性。
其他步骤及参数与具体实施方式六相同。
本发明还可有其它多种实施例，在不背离本发明精神及其实质的情况下，本领域技术人员当可根据本发明作出各种相应的改变和变形，但这些相应的改变和变形都应属于本发明所附的权利要求的保护范围。
Claims (7)
1.一种基于模板匹配与查找轮廓的细胞计数方法，其特征在于，具体包括以下步骤：
步骤一、读取显微镜下细胞扫描图像，根据已知横竖网格数量与间距，建立网格模板图像；
步骤二、利用模板匹配定位计数区域：根据步骤一中的得到的网格模板图像，利用带旋转角度和尺度缩放的模板匹配算法完成对细胞计数区域的定位，进而得到细胞计数区域；
步骤三、对细胞计数区域进行灰度变换和局部亮度补偿；
步骤四、对经过步骤三得到的补偿结果图进行对比度拉伸；
步骤五、自适应二值化处理经过步骤四得到的对比度拉伸结果图；
步骤六、填充经过步骤五得到的二值化结果图中的空洞；
步骤七、对经过步骤六得到的填充结果图查找轮廓，并处理统计所有的细胞区域，得到显微镜下细胞扫描图像中细胞的数量。
2.根据权利要求1所述一种基于模板匹配与查找轮廓的细胞计数方法，其特征在于，步骤三具体包括以下过程：
对步骤二得到的细胞计数区域进行灰度变换，统计得到的灰度图像素点的灰度值，计算灰度平均值a；设定块大小，将灰度图分块，统计子块灰度值，去除最大灰度值与最小灰度值，计算子块的灰度平均值b和亮度矩阵M；将M中的每个元素与a作差，得到子块的亮度差值矩阵N，将所有子块的亮度差值矩阵N在对应位置拼接为与原灰度图大小相同的亮度分布矩阵P，则亮度补偿后的图像为原灰度图与P的差值。
3.根据权利要求1或2所述一种基于模板匹配与查找轮廓的细胞计数方法，其特征在于，步骤四中使用两段式的分段线性变换函数进行对比度拉伸，具体为：
其中，(x1,y1)为分段线性变换函数中折点位置坐标，x为所述补偿结果图中的像素值，k1为y1/x1，k2为(255-y1)/(255-x1)。
4.根据权利要求3所述一种基于模板匹配与查找轮廓的细胞计数方法，其特征在于，所述步骤五具体为：
利用大小为ew1、eh1的滤波核对所述对比度拉伸结果图进行均值滤波处理，若原图像素点值大于滤波后该像素点值与偏移量的和，则将该点像素值设为255，否则设为0。
5.根据权利要求4所述一种基于模板匹配与查找轮廓的细胞计数方法，其特征在于，所述步骤六具体为：延展所述二值化结果图，并利用漫水填充法，填充二值化结果图中的连通区域，然后裁剪延展图像并得到填充后的结果图。
6.根据权利要求5所述一种基于模板匹配与查找轮廓的细胞计数方法，其特征在于，所述步骤七具体为：
对经过步骤六得到的填充结果图查找轮廓，计算轮廓的平均面积，设定面积阈值，对大于该阈值的轮廓，使用轮廓面积除以阈值的向下取整结果作为该细胞区域的个数，对小于等于该阈值的轮廓，直接将该轮廓区域计为一个细胞，统计所有细胞区域，得到显微镜下细胞扫描图像中细胞的数量。
7.根据权利要求6所述一种基于模板匹配与查找轮廓的细胞计数方法，其特征在于，所述面积阈值设为轮廓的平均面积的3倍大小。
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