CN107828654B - 基于无透镜衍射成像的细胞活性无标记监测装置与方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开一种基于无透镜衍射成像的细胞活性无标记监测装置与方法，上位机经下位机控制采集孔定位机构工作，驱动无透镜衍射成像机构移动，使无透镜衍射成像机构对准96孔细胞培养孔板的不同的培养孔，并控制CMOS传感模块拍摄采集到所有培养孔对应的衍射图像，对每幅图像进行处理，获得每幅图像里的单细胞衍射图案，计算出像素强度对比度和图案条纹分散度，将像素强度对比度和图案条纹分散度与预设的阈值相比较，判定该细胞是否为活细胞，通过样本组和对照组的活细胞数量相比而得出细胞活性指数，无需添加标记物，无需每隔一段时间进行生化反应操作，提高了细胞活性监测的准确度。

Description

基于无透镜衍射成像的细胞活性无标记监测装置与方法

技术领域

本发明涉及细胞活性检测技术，具体是采用无透镜衍射信息采集装置对细胞活性进行无标记监测的装置与方法。

背景技术

细胞活性是评价不同药物剂量对细胞活性影响的指标。在药物筛选、毒理学、营养学等研究领域，都需要通过检测细胞活性来评价药物或营养物对细胞活性抑制或促进的程度，因此，细胞活性检测是相关研究领域中的重要手段，是细胞实验中的常规和不可缺少的环节。

目前常用细胞活性检测方法是MTT法、台盼蓝、CCK-8法等生化方法。这些方法都属于有标记终点检测方法，需要在长达数十小时的时期内人工多次添加标记物进行生化反应处理，操作十分繁琐，无法实现自动化，劳动强度很大；而且，细胞一旦被标记，就不能够继续存活，如果要监测N个时间点处的细胞响应结果，就需要N个孔板和N组细胞培养，对细胞、培养孔板、培养液、试剂等样品和耗材的用量较大，成本很高；另外，这些终点检测方法所要求的复杂的操作步骤和多试剂，导致了很低的试验可再现性和精确性。因此，细胞活性无标记、实时在线检测技术成为本领域的需求。

目前细胞活性无标记在线检测的新方法是阻抗法。中国专利申请号为2004800402305、名称为“实时电子细胞传感系统及其在基于细胞的测定中的应用”的文献中公开的是使用细胞-基底阻抗监控来测定细胞，这种利用电化学法的装置需要特制的细胞培养孔板，在绝缘基底上加工了电极阵列，加工工艺复杂，且不能重复使用，高频阻抗分析设备也十分昂贵；另一方面，该装置的评估方法是利用细胞样品的阻抗值评估细胞活性，该阻抗值反映了细胞-培养基的整体阻抗，阻抗成分复杂，影响因素多，受培养环境影响大，检测准确度不高。

发明内容

本发明的目的是为了解决现有细胞活性无标记在线检测技术存在的问题，提出一种基于无透镜衍射成像的细胞活性无标记监测装置与方法，利用细胞形态特征以实现细胞活性无标记实时监测，细胞的形态特征通过其对应的无透镜图像的衍射特征所反映，监测装置简单，监测结果受培养环境影响小，准确度高。

本发明基于无透镜衍射成像的细胞活性无标记监测装置所采用的技术方案是：CO₂培养箱内部具有衍射信息采集装置、外部是上位机，衍射信息采集装置包括无透镜衍射成像机构、采集孔定位机构、96孔细胞培养孔板、下位机和wifi通信模块；96孔细胞培养孔板的培养孔中注有对照组细胞和样本组细胞，采集孔定位机构能带动无透镜衍射成像机构在同一水平面上沿相互垂直的横向和纵向移动使其能对准96孔细胞培养孔板的不同的培养孔；无透镜衍射成像机构具有部分相干光源和单色CMOS图像传感模块，96孔细胞培养孔板位于CMOS图像传感模块的正上方和部分相干光源的正下方；下位机分别与采集孔定位机构、CMOS图像传感模块、数据存储模块和wifi通信模块相连接，下位机通过wifi通信模块与上位机交互信息。

所述的基于无透镜衍射成像的细胞活性无标记监测装置的监测方法所采用的技术方案是包括以下步骤：

A、上位机经下位机控制采集孔定位机构工作，驱动无透镜衍射成像机构移动，使无透镜衍射成像机构对准96孔细胞培养孔板的不同的培养孔，并控制CMOS传感模块拍摄采集到所有培养孔对应的衍射图像，将衍射图像保存在数据存储模块中；

B、上位机通过下位机依次读取数据存储模块中的每幅图像，对每幅图像进行处理，获得每幅图像里的单细胞衍射图案；

C、根据公式和计算出像素强度对比度PIC和图案条纹分散度PFD，是单细胞衍射图案中第个像素的像素强度，是第个像素到中心像素的距离，是整个细胞图案的平均像素强度；是第个像素的标准化像素强度，是标准化后的图案中心最大像素强度；

D、将像素强度对比度PIC与预设的PIC阈值a相比较，将图案条纹分散度PFD与预设的PFD阈值b相比较，当满足PIC≥a且PFD≤b时，判定该细胞为活细胞，否则为死细胞。

进一步地，步骤D之后，统计出对照组和各样本组的活细胞数量，经式计算得到样本组的细胞活性指数，Sample NUM是样本组的活细胞数量，Control NUM是对照组活细胞数量。

与现有技术相比，本发明体现出的优点是：

1、由细胞形态学原理可知，细胞不同活性阶段具有不同的形态特点，找到能够有效反映细胞形态特点的衍射图像特征，就能进一步判别该细胞的活性状态。根据这一原理，本发明采集对照组和样本组细胞样品的衍射图像，通过对不同形态细胞对应的衍射图案进行分析，得到两个能够反映细胞形态特点的衍射特征参数，计算出每个细胞衍射图案所对应的衍射特征参数值，并通过与阈值相比较，判定该图案对应的细胞是否为活细胞，通过样本组和对照组的活细胞数量相比而得出细胞活性指数，提高了细胞活性监测的准确度。

2、本发明监测装置在整个细胞活性监测时期内，无需添加标记物，无需每隔一段时间进行生化反应操作，是一种无标记的、在线的、连续的细胞活性监测装置。

3、本发明监测装置采用无透镜衍射成像机构决定了细胞衍射图像质量的高低，光源要具有良好的相干性，且光源的波长也对成像质量的高低造成一定的影响，采用激光作为光源虽然能够获得较好的相干性，但衍射信号重叠和散斑噪声严重，不利于后期参数的提取。因此，本发明根据波阵面分割理论，采用微孔对单色LED光源进行调制，以获得较好的相干光，提高了细胞信息采集量。

4、本发明监测装置利用一个二维滑台驱动无透镜衍射成像机构在XY方向移动，根据上位机中设置的各组的孔编号，使成像机构分别对准所要采集的培养孔，完成指定信息的采集，保障了细胞活性检测所要求的大信息量。

5、本发明采用上下位机通过无线通信方式进行数据的传输，由于系统在时间节点处需采集的图片多达几十张，且图片保真要求为RAW格式，文件较大，要求无线传输速度快，由于wifi技术具有传输速度快，传输有效距离长，覆盖范围广的优点，选用wifi技术作为本系统的无线通信方式。

6、本发明在细胞活性监测时，只需要配制一组细胞样本，大大减少了样本和耗材的用量，降低了实验成本；大大降低了实验繁琐程度，减少劳动量；装置中避免了复杂的光学透镜，成本相对低廉，有利于大批量普及应用。

7、本发明监测装置直接利用现有的96孔细胞培养孔板，所采用的衍射信息采集装置易于小型化，可以整体放置于二氧化碳培养箱中，无需另外定制特殊的细胞培养工具和设备，能够一次性采集大面积的细胞样品信息，所获得的数据量具有统计学意义，能够满足细胞活性监测所要求的大样本数量要求，保证了检测结果的准确性。

附图说明

图1是本发明基于无透镜衍射成像的细胞活性无标记监测装置的整体结构示意图；

图2是图1中衍射信息采集装置1的结构放大图；

图3是图2中的无透镜衍射成像机构5的结构放大图；

图4是图3中的部分相干性光源19的结构放大图；

图5是图2中细胞衍射图像形成原理示意图；

图6是图1的控制框图；

图7是细胞衍射图像反映细胞形态的原理图。

附图中各部件的序号和名称：1、衍射信息采集装置，2、CO₂培养箱，3、上位机，4、下位机，5、无透镜衍射成像机构，6、采集孔定位机构，7、wifi通信模块，8、数据存储模块，9、电池供电模块，10、支架，11、横向滑轨，12、横向滑块，13、横向步进电机，14、纵向滑轨，15、纵向滑块，16、纵向步进电机，17、机箱，18、96孔细胞培养孔板，19、部分相干光源，20、支柱，21、CMOS传感模块，22、感光芯片，23、数据线，24、数据接口，25、密封盒，26、单色LED光源，27、光源套筒，28、微孔，29、培养孔，30、入射光，31、入射光波阵面，32、培养液，33、细胞体，34、物光波阵面。

具体实施方式

参见图1，本发明基于无透镜衍射成像的细胞活性无标记监测装置具有一个CO₂培养箱2，CO₂培养箱2内部具有一个衍射信息采集装置1，CO₂培养箱2外部是上位机3，衍射信息采集装置1通过无线通信方式与外部的上位机3进行指令和数据传输。

参见图2的衍射信息采集装置1结构，衍射信息采集装置1包括无透镜衍射成像机构5、采集孔定位机构6、96孔细胞培养孔板18，下位机4以及wifi通信模块7等。衍射信息采集装置1的最底部是支架10，支架10固定在CO₂培养箱2的内壁上。支架10上固定连接96孔细胞培养孔板18、无透镜衍射成像机构5、采集孔定位机构6和机箱17。无透镜衍射成像机构5的下方是水平布置的96孔细胞培养孔板18，96孔细胞培养孔板18的培养孔中注有对照组细胞和样本组细胞。采集孔定位机构6固定连接无透镜衍射成像机构5，能带动无透镜衍射成像机构5在同一水平面上沿相互垂直的横向和纵向移动到不同的位置，从而能使无透镜衍射成像机构5对准96孔细胞培养孔板18的不同的培养孔。机箱17内部封装有下位机4、wifi通信模块7和电池供电模块9。下位机4通过wifi通信模块7与上位机3交互信息。

采集孔定位机构6由横向滑轨11、横向滑块12、横向步进电机13和纵向滑轨14、纵向滑块15、纵向步进电机16组成。纵向滑轨14与横向滑轨11均水平布置且相互垂直，纵向滑轨14固定连接在支架10上，纵向滑轨14上表面通过纵向滑块15连接横向滑轨11，纵向滑块15由纵向步进电机16通过丝杠螺母机构带动在纵向移动，从而带动横向滑轨11纵向移动。横向滑轨11的侧面通过横向滑块12固定连接无透镜衍射成像机构5的中间，横向滑块12由横向步进电机13通过另一个丝杠螺母机构带动在横向移动。因此，通过横向步进电机13和纵向步进电机16工作，采集孔定位机构6能带动无透镜衍射成像机构5移动到不同的位置，从而对准不同的培养孔。

参见图3，无透镜衍射成像机构5具有一个上下垂直的支柱20，支柱20的上端固定连接部分相干光源19，支柱20下端设有单色CMOS图像传感模块21。单色CMOS图像传感模块21置放在由聚苯乙烯透明材料制作的透明的密封盒25内。单色CMOS图像传感模块21内部带有感光芯片22，感光芯片22通过数据线23与数据接口24相连接。96孔细胞培养孔板18在感光芯片22的正上方，位于感光芯片22和部分相干光源19之间，在部分相干光源19的正下方。96孔细胞培养孔板18和感光芯片22之间的上下垂直距离约为1mm左右。感光芯片22的感光面积为29.694mm²、像素为1400万、像元尺寸为2.2μm×2.2μm。感光芯片22位于部分相干光源19的正下方，两者的中心精确位于一条垂下载线上。

参见图4，部分相干光源19的外部是光源套筒27，光源套筒27为密封不透光。光源套筒27的顶面正中间安装一个单色LED光源26，光源套筒27的底面正中间开有一个微孔28。采用单色LED光源26发出的单色LED光穿过微孔28以产生近似相干光源。基于微孔对光源相干性影响和相干性对成像影响的原理，综合LED光源强度因素，微孔28直径设计为300um，单色LED光源26选择波长为470nm的蓝光LED，为保证足够的感光强度和光源完全覆盖感光芯片22，单色LED光源26选择亮度为20-30lm规格，且光源底部到感光芯片22的距离为3cm。

参见图5并结合图3-4，无透镜衍射成像机构5工作时，部分相干光源19发出的光从正上方照射96孔细胞培养孔板18的培养孔29时，穿过培养孔29中的细胞样品后形成的物光继续传播到距离细胞样品底面1mm处，在感光芯片22所在的平面上形成衍射图像，该图像被感光芯片22所采集。

参见图6并结合图2，下位机4通过不同端口分别与采集孔定位机构6中的横向步进电机13、纵向步进电机13、CMOS图像传感模块21、数据存储模块8、wifi通信模块7和电池供电模块9相连接。电池供电模块9采用锂离子充电电池提供电源，下位机4通过wifi通信模块7与上位机3进行数据和指令的传输，接受上位机3发送的指令和向上位机3返回数据。下位机4向横向步进电机13和纵向步进电机13发送信号，以驱动采集孔定位机构6移动到特定的位置。下位机4经与其相连接数据接口24和数据线23向CMOS传感模块21发送拍摄指令和从CMOS传感模块21中获取拍摄得到的图像数据。在获取图像过程中，下位机4将获取的图像送入数据存储模块8中待用。在获取图像结束后，下位机4从数据存储模块8中批量读取图像数据，并通过wifi通信模块7发送给上位机3。上位机3中安装有监测程序，其中的衍射图像批量处理和细胞活性指数计算子程序，对每一张图片进行处理和计算，获得活细胞个数数据，进而计算该监测时间节点处各样本组的细胞活性指数。

参见图1-6，本发明细胞活性无标记监测装置进行细胞活性监测时，先将对照组细胞和各不同剂量药物处理后的样本组细胞按顺序注入到96孔细胞培养孔板18的培养孔中，通常利用其中的若干个孔放置对照组和样本组，每一组取6个孔，一般采用6复孔取平均的方法以提高准确性。初试状态时，无透镜衍射成像机构5对准96孔细胞培养孔板18的A1孔，即感光芯片22对准的第一个培养孔。在上位机3中内置有细胞样品信息以及对照组和各样本组所对应的孔编号列表、时间节点间隔、时间节点个数等信息。

然后，上位机3向下位机4发出启动图像采集过程的指令，发送指令给CMOS传感模块21，CMOS传感模块21拍摄当前所对准的A1培养孔的图像，并将图像保存到数据存储单元8中，完成该孔的图像采集。

在 A1培养孔的图像采集后，上位机3根据保存的孔编号列表中读取下一个要采集的孔编号，根据下一个孔编号与当前孔编号计算要移动的距离，通过下位机4控制采集孔定位机构6的横向步进电机13和纵向步进电机13转动一定的步数，使采集孔定位机构6驱动无透镜衍射成像机构5移动，使无透镜衍射成像机构5对准第二个培养孔。然后，控制CMOS传感模块21拍摄第二个培养孔的图像并将图像保存到数据存储单元8中，完成第二个培养孔的图像采集。

如此重复采集，直至所有最后一个孔编号所对应的培养孔图像被采集完毕。这些图像是特定时间节点处的所有对照组和样本组所在的培养孔对应的衍射图像，每一幅图像包含的信息除了图像本身，还有其对应的时间节点、孔编号、细胞样品信息等，这些图像信息均保存在数据存储模块8中。

之后，上位机3通过下位机4依次读取数据存储模块8中的一幅图像，首先对该幅图像进行背景预处理，使整个图像均衡化，增强明暗条纹对比度；然后，取适当阈值对图像进行二值化，二值化后细胞中心亮斑处像素值为255，背景像素值为0；找到联通区域质心，以质心为圆心、半径为60um的圆形区域，生成感兴趣区掩膜；最后，提取感兴趣区，获得单细胞衍射图案。一幅图像里有多少个细胞就对应多少个单细胞衍射图案，如此能获得一幅图像里所有的单细胞衍射图案，单个细胞衍射图案是从整个CMOS传感模块21拍摄的图像中分离出来的。

根据细胞形态学原理，哺乳动物细胞在不同活性阶段具有不同的形态特点，当细胞活性较好时，细胞贴附在底物上贴壁生长，其形态伸展，细胞体中心部分扁平；当细胞受到药物或毒性刺激而活性变差时，将由原来的伸展良好的形状而变得边缘逐渐皱缩，覆盖面积变小，中心隆起，体积变小；当细胞活性进一步变差直至死亡，细胞形态进一步皱缩，整体缩为圆球状，进而完全从底物脱落。另一方面，无透镜衍射图案携带了细胞形态信息，由于细胞样品是几乎透明样品，穿过细胞样品的透射光主要受到相位调制。参见图7，由单色LED光源26发出光经过微孔28后产生具有良好相干性的部分相干光，即细胞样品入射光30，入射光波阵面31是一个平面，穿过细胞样品后，由于培养液32和细胞体33具有不同的折射率，穿过细胞-培养液部分和穿过纯培养液部分的透射光会产生不同的相移，即相移差，这使得物光波阵面34不再为一个平面。相比于无细胞的区域，细胞区域内某点处的相移差如（1）式所示：

其中为细胞区域内点处的细胞厚度，为该点处的细胞折射率，样品的整体厚度处处相同为，培养液折射率处处相同为。忽略细胞体内折射率的差异，则该物光波阵面34的形状就只取决于细胞的形态，该物光波继续传播至感光芯片22上形成的衍射图案中必然携带了物光波阵面34形状信息，从而携带了细胞形态信息。因此，利用式（1），模拟出不同形状细胞，结合瑞利-索末菲衍射公式，利用matlab仿真计算就能得到相干光照明下的细胞衍射图案。对这些图案进行分析发现，当细胞形态符合上述的从活性较好到死亡的变化过程时，其对应的衍射图案特征具有一致的变化规律：（a）衍射条纹的明暗对比度持续减小；（b）衍射条纹分散程度持续增大。

根据单细胞衍射图案，能得到单细胞衍射图案中第个像素的像素强度、第个像素到中心像素的距离以及整个细胞图案的平均像素强度。然后上位机3计算出用于定量描述条纹明暗对比对和条纹分散程度这两个衍射特征的像素强度对比度PIC和图案条纹分散度PFD：

其中是第个像素的标准化像素强度，是标准化后的图案中心最大像素强度，∑表示将所有像素求和。

由于不同活性的细胞衍射图案中，像素强度总是伴随条纹紧密程度的变化而变化，因此直接利用第个像素的像素强度来计算图案条纹分散度PFD值不能够准确的反映条纹紧密程度这一指标，所以需要将不同衍射图案中像素强度值标准化到一个相同的区间中。第个像素的标准化像素强度值由（4）式计算而得：

其中是衍射图案中心最大像素强度，是一个常值系数，根据衍射图案的像素强度情况进行设置，使得设置后的最大值接近255。

将得到的像素强度对比度PIC与预先设定的PIC阈值a相比较，同时将得到的图案条纹分散度PFD与预先设定的PFD阈值b相比较，当满足PIC≥a且PFD≤b时，判定该细胞为活细胞，否则即认定为死细胞，如此鉴别每一个单细胞衍射图案对应的细胞是否为活细胞。对一种具体的细胞系，需要预先通过实验来确定其对应的PIC阈值a和PFD阈值b，并将PIC阈值a和PFD阈值b预设在上位机3中。

最后，将每一组的6个复孔对应的衍射图像所得到的活细胞总数取平均值，将该平均值作为该组最终的活细胞数量，统计出其中的活细胞总数。将对照组和各样本组的活细胞数量分别代入式（5）中，

得到的结果就是该时间节点处该样本组的细胞活性指数。其中，Sample NUM是该样本组的活细胞数量，Control NUM是对照组活细胞数量。然后生成细胞活性-时间曲线。

Claims (7)

1.一种基于无透镜衍射成像的细胞活性无标记监测装置，CO₂培养箱（2）内部具有衍射信息采集装置（1）、外部是上位机（3），衍射信息采集装置（1）包括无透镜衍射成像机构（5）、采集孔定位机构（6）、96孔细胞培养孔板（18）、下位机（4）和wifi通信模块（7）；96孔细胞培养孔板（18）的培养孔中注有对照组细胞和样本组细胞，采集孔定位机构（6）能带动无透镜衍射成像机构（5）在同一水平面上沿相互垂直的横向和纵向移动使其能对准96孔细胞培养孔板（18）的不同的培养孔；无透镜衍射成像机构（5）具有部分相干光源（19）和单色CMOS图像传感模块（21），96孔细胞培养孔板（18）位于CMOS图像传感模块（21）的正上方和部分相干光源（19）的正下方；下位机（4）分别与采集孔定位机构（6）、CMOS图像传感模块（21）、数据存储模块（8）和wifi通信模块（7）相连接，下位机（4）通过wifi通信模块（7）与上位机（3）交互信息，其特征是：

所述的采集孔定位机构（6）由横向滑轨（11）、横向滑块（12）、横向步进电机（13）和纵向滑轨（14）、纵向滑块（15）、纵向步进电机（16）组成，下位机（4）与横向步进电机（13）和纵向步进电机（13）连接，纵向滑轨（14）与横向滑轨（11）均水平布置且相互垂直，纵向滑轨（14）上表面通过纵向滑块（15）连接横向滑轨（11），纵向滑块（15）由纵向步进电机（16）通过丝杠螺母机构带动纵向移动；横向滑轨（11）的侧面通过横向滑块（12）固定连接无透镜衍射成像机构（5）的中间，横向滑块（12）由横向步进电机（13）通过另一个丝杠螺母机构带动横向移动。

2.根据权利要求1所述的细胞活性无标记监测装置，其特征是：单色CMOS图像传感模块（21）包括感光芯片（22）且置放在透明的密封盒（25）内，96孔细胞培养孔板（18）在感光芯片（22）的正上方。

3.根据权利要求1所述的细胞活性无标记监测装置，其特征是：所述的部分相干光源（19）的外部是密封的光源套筒（27），光源套筒（27）的顶面正中间是单色LED光源（26）、底面正中间开有一个微孔（28）。

4.一种如权利要求1所述的基于无透镜衍射成像的细胞活性无标记监测装置的监测方法，其特征是包括以下步骤：

A、上位机（3）经下位机（4）控制采集孔定位机构（6）工作，驱动无透镜衍射成像机构（5）移动，使无透镜衍射成像机构（5）对准96孔细胞培养孔板（18）的不同的培养孔，并控制CMOS传感模块（21）拍摄采集到所有培养孔对应的衍射图像，将衍射图像保存在数据存储模块（8）中；

B、上位机（3）通过下位机（4）依次读取数据存储模块（8）中的每幅图像，对每幅图像进行处理，获得每幅图像里的单细胞衍射图案；

C、根据公式和计算出像素强度对比度PIC和图案条纹分散度PFD，是单细胞衍射图案中第个像素的像素强度，是第个像素到中心像素的距离，是整个细胞图案的平均像素强度；是第个像素的标准化像素强度，是标准化后的图案中心最大像素强度；

D、将像素强度对比度PIC与预设的PIC阈值a相比较，将图案条纹分散度PFD与预设的PFD阈值b相比较，当满足PIC≥a且PFD≤b时，判定该细胞为活细胞，否则为死细胞。

5.根据权利要求4所述的监测方法，其特征是：步骤D之后，统计出对照组和各样本组的活细胞数量，经式计算得到样本组的细胞活性指数，Sample NUM是样本组的活细胞数量，Control NUM是对照组活细胞数量。

6.根据权利要求5所述的监测方法，其特征是：对照组细胞和样本组细胞的每一组各取6个孔，取6个孔对应的衍射图像所得到的活细胞总数的平均值作为该组最终的活细胞数量。

7.根据权利要求4所述的监测方法，其特征是：步骤C中：第个像素的标准化像素强度值由式计算得到，是衍射图案中心最大像素强度，是常值系数，根据衍射图案的像素强度情况设置。