CN103308497B - 用于研究生物细胞或细胞培养物的方法和酶标仪 - Google Patents

用于研究生物细胞或细胞培养物的方法和酶标仪 Download PDF

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Abstract

一种用于研究酶标仪(1)中生物细胞或细胞培养物的方法包括：通过接收装置(4)接收孔(3)内含有生物细胞或细胞培养物的至少一个微孔板(2)；使所述孔(3)相对于所述酶标仪(1)的测量装置(5”，6，7，8)定位，并通过至少一个所述测量装置(5”，6，7，8)来检测积分测量信号。利用所述酶标仪(1)的照明光源(9)透照所述微孔板(2)的特定孔(3)内的生物细胞或细胞培养物，并利用成像相机(10)来成像。利用处理器(11’，11”)将检测到的每个积分信号与所述微孔板(2)的对应孔(3)内的生物细胞或细胞培养物的图像进行比较，并与这些生物细胞或细胞培养物的成像数目、附着、融合或形态进行关联。

Description

用于研究生物细胞或细胞培养物的方法和酶标仪
相关专利申请
本专利申请要求2012年3月14日提交的美国临时申请号为61/610,647和同样在2012年3月14日提交的瑞士专利申请号为00365/12的优先权。这两个建立优先权的申请的全部内容通过明确的参考全文纳入本申请。
技术领域
本发明涉及一种用于在酶标仪中研究生物细胞或细胞培养物的方法。这种方法典型地包括：通过酶标仪的接收装置来接收孔内含有生物细胞的至少一个微孔板；使所述接收装置和含有生物细胞的所述微孔板的孔相对于所述酶标仪的测量装置定位；通过至少一个所述测量装置来检测至少一个积分信号(例如微孔板的一个孔中所有样品的发光)。
另外，所述方法还包括：使所述接收装置和含有生物细胞的所述微孔板的孔相对于所述酶标仪的动作源定位；利用至少一个所述动作源在至少一个所述动作源和微孔板的特定孔内的生物细胞之间引起相互作用从而引起或产生可测信号；检测在所述微孔板的特定孔内的生物细胞内或其上由所述动作源引起或产生的至少一个积分信号(例如微孔板的一个孔中所有样品的荧光或吸光度)。
背景技术
细胞或它们的代谢产物的荧光的测量可以从现有技术中知道。因此，EP 2 253983 A2公开了一种用于样品的激发荧光的光谱检测的扫描显微镜，所述样品被激光激发，然后被供给到被分成不同波长范围的散射光栅和多阳极光电倍增管。文件ITMI 912510 A1公开了一种所谓的酶标仪，其中微孔板的孔内的样品被偏振光照射，由此引发的同样的偏振荧光由光电倍增管来检测。利用非偏振激发光来操作的酶标仪也长时间已知。
一些文件也是已知的(例如，JP 58 062 542 A或JP 11 037 923 A)，其公开了通过数码相机来获取微孔板的孔的底部上的颗粒或生物细胞的结合图案的图像，所述数码相机包括成像CCD(电荷耦合器件)或CMOS(互补金属氧化物半导体)传感器。
微孔板孔内细胞发光的测量可以从，例如，DE 102 36 029 A1中了解。公开了一种分配器和CCD相机，其中利用所述分配器通过在微孔板孔内的样品上添加液体来引发发光，利用所述CCD相机通过光学系统来给穿过微孔板孔的透明底部的发光拍照。
从WO 2006/031537 A2可以知道一种用于研究微孔板内的生物细胞的方法和装置。所述微孔板在目标区域内被照射，来自所述目标区域的光被引导至阵列检测器，所述阵列检测器将所述目标区域内微孔板孔内的分散目标检测为部分图像，并将所述部分图像合并形成微孔板孔的整个图像。在这种情况下，可以检测细胞微阵列或无序的生物细胞。
设置为计数室的特殊载玻片内的生物细胞的计数已经从利用光学显微镜计数血细胞的领域知道很长时间了。不同制造商的自动细胞计数系统或“细胞计数器”也是已知的。这些细胞计数器的特点尤其在于具有生物细胞的计数室可以被插入到计数系统，所述计数系统自动聚焦计数光学器件，计数所述生物细胞并显示计数结果。
典型地，在研究微孔板内的生物细胞或细胞培养物的实验室中，产生了由光或电引起的发光，所述发光利用光电倍增管或半导体光电倍增管来测量或利用成像相机来成像。为了解释测量结果或图像，通过光学显微镜来研究所述微孔板，并确定所述生物细胞是否还在正常生理状态，或者它们是否具有异常形态或者甚至已经死亡。
在市场上还可以得到一种细胞测量装置(IsoCyte激光扫描细胞仪，分子装置(Molecular Devices)公司，森尼韦尔，加利福尼亚州，美国)，其利用激光束扫描微孔板孔内的生物细胞，同时利用一个或多个光电倍增管来检测由所述激光束产生的荧光或散射信号，确认并计数孔内出现的生物细胞并产生扫描的孔的图像。通过图像处理，每个图像内的单个细胞得以确认，并列出它们的活性。孔内所有细胞的结果可以合并在一起。
发明目的和概述
本发明的目的是提出一种用于研究微孔板内生物细胞或细胞培养物的替代方法和一种用于进行所述方法的合适装置。
根据这里公开的特征的第一方面，该目的通过一种用于研究酶标仪内的生物细胞或细胞培养物的方法来解决。所述方法包括以下步骤：
a)通过酶标仪的接收装置来接收孔内含有生物细胞或细胞培养物的至少一个微孔板；
b)使所述接收装置和含有生物细胞或细胞培养物的所述微孔板的孔相对于所述酶标仪的测量装置定位；和
c)通过至少一个所述测量装置来检测所述微孔板的特定孔内的生物细胞或细胞培养物内或其上的至少一个积分信号。
根据本发明，所述方法的特征在于：利用所述酶标仪的照明光源来透照微孔板的特定孔内的生物细胞或细胞培养物，利用所述酶标仪的成像相机来生成微孔板的这些特定孔内的生物细胞或细胞培养物的透射图像，利用处理器来将检测到的每个积分信号与微孔板的对应孔内的生物细胞或细胞培养物的图像比较，并与这些生物细胞的成像数目、附着、融合或形态进行关联。
根据本文公开的特征的第二方面，该目的通过一种用于根据本发明用来研究生物细胞或细胞培养物的方法的酶标仪来解决。在这里，所述酶标仪包括：
a)接收装置，用于接收孔内含有生物细胞或细胞培养物的至少一个微孔板，并使孔内含有生物细胞或细胞培养物的所述微孔板相对于所述酶标仪的测量装置定位；和
b)至少一个检测装置，用于检测，在微孔板的特定孔内的生物细胞或细胞培养物内或其上存在或者引起或者产生的至少一个积分信号。
根据本发明，所述酶标仪的特征在于：还包括用于照明的照明光源，用于获取微孔板的这些特定孔内的细胞或细胞培养物的图像的成像相机，和处理器，所述处理器被设置用于将检测到的每个积分信号与微孔板的对应孔内的生物细胞或细胞培养物的图像进行比较并把这些积分信号与这些生物细胞或细胞培养物的成像数目、附着、融合或形态相关联。
根据本发明的所述方法或者根据本发明的所述酶标仪的进一步发展和根据本发明的进一步特征也在这里公开了。
根据本发明的方法或者根据本发明的装置的优点包括：
-迄今为止，需要两个不同装置，酶标仪和成像显微镜，来将在酶标仪中细胞参数的定量测量和用于这些细胞培养物的状态的定性检查的显微图像相结合。现在本发明使得在相同的装置内能够完成这两个互补研究。
-迄今为止，具有细胞培养物的微孔板必须从酶标仪中取出并转移到显微镜上。这个麻烦的步骤必需由操作者来完成，并且在这些研究方法之间额外地需要一定的时间延迟。现在本发明的研究能够在单个装置内自动结合这两个互补研究，并且是在特定微孔板孔内的积分信号的检测和微孔板孔的成像之间最短的可能时间差内。
-迄今为止，为了将微孔板从酶标仪转移到显微镜，敏感的细胞培养物频繁地暴露于当时的环境条件，或必须麻烦地与这些条件隔离。本发明可以更好地在含有细胞培养物的微孔板孔内维持受控气氛，而同时进行这些生物细胞的所有定量和定性研究。
-根据本发明，在适合进行根据本发明的所述方法的所述酶标仪中，集成了具有成像性能的模块，从而位于例如微孔板孔的底部上的生物细胞或细胞培养物可以利用显微分辨率来可视化。
-在一个优选的实施例中，根据本发明的所述酶标仪被设置为多模式读数计，允许将所选择的微孔板孔内的例如荧光、发光、吸光度、阻抗或阻抗变化等积分信号的检测与这些微孔板孔的显微成像几乎任意的和优选地自动的结合。
-通过测定微孔板孔内的细胞数目，可以测定平均细胞活性，从而测定所述微孔板孔内变化的细胞活性和变化的细胞数目的差别。
-通过测定微孔板孔的底部上的细胞或细胞培养物的附着或者固定以及形态，可以得到关于细胞的生理状态的结论。
-积分信号，例如荧光、发光、吸光度、阻抗或阻抗变化，用于细胞活性的测量。这些信号的强度变化取决于细胞活性的变化和细胞数目的变化(例如取决于细胞繁殖)。细胞数目的测定利用细胞数目提供积分信号的标准化，从而公正地、自动地得到细胞活性。
测定微孔板孔的底部上的细胞或细胞培养物的融合可以得到被细胞培养物覆盖的底部表面与微孔板孔的仍无覆盖底部表面的比例。该比例再次允许利用细胞生长将积分信号的标准化与具有粘附细胞的细胞培养物相关联，从而公正地、自动地得到细胞活性。
附图说明
根据本发明，用于研究酶标仪中的生物细胞或细胞培养物的方法和对应的酶标仪通过示意图来详细的解释，这些示意图表示所选择的实施例，而并不试图限定本发明的范围。
在附图中：
图1表示根据第一实施例将微孔板插入样品室时酶标仪的垂直剖面，所述样品室优选设置为可以以避光方式封闭的腔；
图2表示根据第二实施例检测所选择的微孔板孔内的积分信号时或样品室内的微孔板孔的显微成像时酶标仪的垂直剖面，所述样品室优选设置为可以以避光和气密方式封闭的隔离室；
图3表示根据第三实施例检测样品室中所选择的微孔板孔内的积分信号时酶标仪的垂直剖面，所述样品室优选设置为可以以避光和气密方式封闭的隔离室；
图4表示具有附着到孔底部的典型电极和附着到孔壁的典型电极接头的微孔板孔的平面图；
图5表示通过微孔板的孔的透照的光程的图示，其中：
图5A表示具有透射光线束的路径的常规透照；
图5B表示具有透射光线束的路径的本发明的透照；
图5C表示具有透射光线的路径的常规透照
图5D表示具有透射光线的路径的本发明的透照；
图6表示透照时孔的图片，其中：
图6A表示常规照射的结果；和
图6B表示本发明的照射的结果；和
图7表示图6的图片中贯穿所述孔的整个直径的强度的分布；其中
图7A表示常规照射时的强度分布；
图7B表示本发明照射时的强度分布；
图8表示图7A和图7B的两幅图在各自情况下照射的标准化后的比较；
本发明的详细说明
图1表示根据第一实施例将微孔板2插入样品室12时酶标仪1的垂直剖面，所述样品室12优选设置为可以以避光方式封闭的腔。所述酶标仪1，其尤其适用于根据本发明的所述方法，包括接收装置4，用于接收孔3内含有生物细胞或细胞培养物的至少一个微孔板2。所述接收装置4优选设置为可以从所述酶标仪的样品室12缩回到一定程度从而至少一个微孔板2可以用手或微孔板处理机器人(都没有画出)插入所述接收装置4或从那里取出。所述接收装置4已经部分插入这里，因为特别地一个微孔板2正在插入到所述酶标仪1中。在插入或取出微孔板时，翼片18优选打开，其在关闭状态优选以避光方式封闭所述样品室12，从而没有影响所述研究的光可以从周围通过所述样品室12。
除了接收至少一个微孔板2，所述接收装置4还用于将孔3内含有生物细胞或细胞培养物的微孔板2相对于所述酶标仪1的动作源5’，5”，5”’和测量装置6，7，8定位。
这里所描述的酶标仪1进一步包括至少一个动作源5’，5”，5”’，用于在至少一个所述动作源5’，5”，5”’和微孔板2的特定孔3内的生物细胞或细胞培养物之间引起相互作用，并引起或产生可测信号。这些动作源对于每个本领域技术人员来说都是已知的，并且优选地选自包含用于在这些微孔板2的孔3内的生物细胞内或其上激发荧光的光源5’的组。其它本身已知的动作源优选地选自包含用于透照所述微孔板(2)的孔(3)内的生物细胞或细胞培养物的光源5’的组中。这些光源选自，例如，包含弧光灯、闪光灯、白炽灯(例如卤素灯)、激光器、激光二极管和发光二极管(LEDs)的组。用于激发荧光的相应波长和相应荧光体和它们的发射特性对于本领域技术人员来说也是已知的，并根据应用来选择。用于检测吸光度的细胞或细胞培养物的非侵入性透照和所用的光源对于每个本领域技术人员来说也是熟知的。
其它的本身已知的动作源优选地选自包含电源5”和阻抗测量装置的组，所述阻抗测量装置用于测量阻抗或阻抗变化，所述阻抗或阻抗变化是所述微孔板2的孔3内的生物细胞或细胞培养物的附着或重排的函数。这些动作源，优选是电通量按照正弦函数在20到100,000Hz范围内变化的交流电源，所述交流电源包含初始电阻，对于本领域技术人员来说是已知的，例如，从Giaever和Keese的著作中(Micromotion of mammalian cellsmeasured electrically(“电测量哺乳动物细胞微动”)，PNAS 1991第88卷:7896-7900)，其全文纳入本发明。优选使用的是具有特定孔3的微孔板2，孔的底部16至少部分地设置有电极17’，17”，其中所述电极17’，17”优选设置为可以与所述酶标仪1的对应电源5”接触。为了所述接触，电极接头23’，23”可以附着到孔壁的内侧，电极17’，17”被设置为以这种方式与所述交流电源的接触传感器27，即所述阻抗测量装置5”，相接触。
本身已知的类似动作源优选地选自包含用于在所述微孔板2的孔3内的生物细胞或细胞培养物内或其上引起发光的液体源5”’的组。所述液体源5”’优选自包含用于例如向所述微孔板2的特定孔3内的细胞或细胞培养物注射引发剂的单注射器或多注射器。使用引起发光的试剂的这种液体源5”’或注射器和由例如细胞或它们的代谢产物所引起的发光的波长对于本领域技术人员来说是已知的。另外，例如终止剂或营养物质通过这些注射器可以加入到微孔板2的孔3内的生物细胞或细胞培养物上，从而影响细胞生长或细胞增殖。
根据本发明，所述微孔板1还包括至少一个测量装置5”,6,7,8，用于检测由所述动作源5’，5”，5”’在所述微孔板2的特定孔3内的生物细胞或细胞培养物内或其上引起或产生的至少一个积分信号。所述测量装置优选地选自下组：光电倍增管、光电二极管、光电二极管阵列、雪崩二极管(avalanche diode)和相敏锁相放大器(phase-sensitive lock-inamplifier)。所述测量装置6,8和光源5’或者其光学输入和/或输出优选地通过光导28例如光纤或光纤束耦合。图1中所示的样品室12设置为避光。
根据本发明，所述酶标仪1的特征尤其在于还包括用于照明的照明光源9和用于获取所述微孔板2的特定孔3内的细胞或细胞培养物的图像的成像相机10。尤其优选为，所述酶标仪1包括光学显微镜19和与其光学偶合、用于生成所述微孔板2的特定孔3内的生物细胞或细胞培养物的显微图像的成像相机10。根据本发明，尤其优选的是酶标仪1，其中集成了具有成像性能的模块，从而位于例如微孔板孔的底部的生物细胞和细胞培养物可以利用显微分辨率来可视化。所述成像模块包括照明单元，其允许使用不同照明和成像模式，例如亮场照明、暗场照明和斜射照明。允许记录相差或荧光图像的其它模式也是可行的。所述图像优选地由具有数码相机的光学显微镜19来记录，数码相机安装有CMOS或CCD传感器。
优选地成像系统还包括自动聚焦装置，其中在使用中等孔径来达到中等分辨率时，所述接收装置4可以在所述成像相机10的光轴20的方向上移动。单个细胞和细胞培养物的表示是优选的，即使更小的颗粒或细胞结构也可以成像。尤其优选的是这些生物细胞的数目的成像，特别注意的是单个细胞的附着，即细胞附着到孔3的内表面，和这些细胞的形态。特别优选的是微孔板2的孔3内的细胞培养物的附着、融合或形态的成像，其中在微孔板孔3的内表面上的细胞培养物的融合这一术语产生了被细胞培养物覆盖的表面与可以被细胞占据的这些微孔板孔的内表面的仍无覆盖表面的比例。
根据本发明，所述酶标仪1的特征还在于包括内部的或集成的处理器11’(参见图2和图3)，或者被设置为可以连接到外部处理器11”(参见图1)。因此，这样一种处理器11’可以是集成到所述酶标仪1的电子控制器内部的微处理器。可选的，还可以使用个人电脑提供的处理器11”。重要的是所述处理器11’,11”被设置用于将检测到的每个积分信号与微孔板2的相应孔3内的生物细胞的图像进行比较，并把这些积分信号与这些生物细胞或细胞培养物的成像数目、附着、融合或者形态进行关联。优选地，这种处理器11’,11”制成可以通过运行合适的图像处理软件和运行合适的信号处理软件来进行这项工作。
在所述酶标仪的帮助下进行的用于研究生物细胞的方法包括以下步骤：
利用所述酶标仪1的接收装置来接收孔3内含有生物细胞或细胞培养物的至少一个微孔板2。通常只在所述接收装置4中插入具有由生物分子科学学会(SBS)和美国国家标准协会(ANSI)指定的标准微孔板的尺寸的微孔板。然而，与附图中的图示不一样的是，可以利用所述酶标仪1的相同或不同的接收装置4来接收和传送或定位两个或更多的微孔板。在这种情况下，所述接收装置4优选设置为框，所述框包括通过安装了弹簧的加压装置来把接收的微孔板2保持在限定位置的止动部件。这里尤其优选的是可以由手或微孔板处理机器人的机械手带到用于插入或取出微孔板的开口位置的加压装置。优选地，所述接收装置4通过马达可以在X方向移动，即优选地水平且与所述翼片18呈直角。
使所述接收装置4和含有生物细胞或细胞培养物的所述微孔板2的孔3相对于酶标仪1的动作源5’,5”,5”’定位。由于所述微孔板2在所述接收装置4上的优选限定位置，每个孔3都可以特别地和单独地与所述动作源5’,5”,5”’的动作轴21对齐。优选地，所述接收装置4通过马达可以在X方向，即优选地水平且与所述翼片18呈直角(参见图1，其对于图1-3都是代表性的)，和Y方向，即优选地水平且与所述翼片18平行，移动，从而微孔板的每个孔3在每次定位时都可以在这两个方向预先确定的区域内定位。优选地，这些在X和Y方向上的移动由所述酶标仪1的中央控制单元22来监测和控制。
在至少一个所述动作源5’,5”,5”’和所述微孔板2的特定孔3内的生物细胞或细胞培养物之间引起相互作用来引起或产生可测信号。根据优选的预先指定的协议，当定位所述微孔板2的特定孔3时，所述酶标仪1的所述中央控制单元22启动相应的动作源5’,5”,5”’，这样相应动作源5’,5”,5”’的动作轴21遇到所述微孔板2的特定孔3。优选地，当执行根据本发明的所述方法时，至少一个动作源5’,5”,5”’选自下组：
-用于在这些微孔板2的孔3内的生物细胞或细胞培养物内或其上激发荧光的光源5’；
-用于透照这些微孔板2的孔3内的生物细胞或细胞培养物的光源5’；
-用于测量阻抗或阻抗变化的电源5”，所述阻抗或阻抗变化是这些微孔板2的孔3内的生物细胞或细胞培养物的附着或重排的函数；和
-用于在这些微孔板2的孔3内的生物细胞或细胞培养物内或其上引起发光的液体源5”’。
这种情况下，光源5’优选地选自包含弧光灯、闪光灯、白炽灯(例如卤素灯)、激光器、激光二极管和发光二极管(LED)的组，所述电源5”优选为电通量按照正弦函数在20到100,000Hz范围内变化的交流电源，其中所述交流电源包括输出电阻。所述液体源5”’优选地选自包括单注射器和多注射器以及相关的试剂池和输送泵的组。
在引起相互作用期间或者直接在其后，使所述接收装置4和含有生物细胞或细胞培养物的所述微孔板2的孔3相对于酶标仪1的测量装置6,7,8定位，在所述微孔板2的特定孔3内的生物细胞或细胞培养物内或其上由所述动作源5’,5”,5”’引起或产生的至少一个积分信号由至少一个所述测量装置5”,6,7,8来检测：
-在插进所述酶标仪1的至少一个微孔板2的特定孔3内测量荧光的情况下，优选用于检测荧光和记录积分信号的相应测量装置8选自包括光电倍增管，光电二极管，光电二极管阵列和雪崩二极管的组。优选地，所述测量装置8具有与用于激发荧光的所述光源5’的动作轴21相同的光轴21’；所述光源5’和所述测量装置8或者其光学输入和光学输出(参见图1)优选设置在插入的微孔板2的上方(顶部激发/顶部读出)或者所述光源5’和所述测量装置8设置在插入的微孔板2的下方(底部激发/底部读出)。动作轴21和光轴21’的微小偏差是允许的。
-在插进所述酶标仪1的至少一个微孔板2的特定孔3内测量发光的情况下，优选用于检测发光和记录积分信号的相应测量装置7选自包括光电倍增管，光电二极管，光电二极管阵列和雪崩二极管的组。优选地，所述测量装置7具有与用于引起发光的所述液体源5”’的动作轴21不同的光轴21”；所述液体源5”’优选设置在插入的微孔板2的上方，测量装置7也优选设置在插入的微孔板2的上方。
-在插进所述酶标仪1的至少一个微孔板2的特定孔3内测量吸光度的情况下，优选用于检测吸光度和记录积分信号的相应测量装置6选自包括光电倍增管，光电二极管，光电二极管阵列和雪崩二极管的组。优选地，所述测量装置6具有与用于激发荧光的所述光源5’的动作轴21相同的光轴21”’；所述光源5’优选设置在插入的微孔板2的上方，而所述测量装置6或其光学输入(参见图1)优选设置在插入的微孔板2的下方。
-在插进所述酶标仪1的至少一个微孔板2的特定孔内测量由生物细胞或细胞培养物的附着或重排引起的阻抗或阻抗变化和检测相应的积分信号的情况下，测量装置优选地集成在所述酶标仪1的电源5”内，并包括相敏锁相放大器。电源5”和阻抗测量装置5”优选设置在插入的微孔板2的上方。
用于研究酶标仪1中生物细胞或细胞培养物的本发明方法的特征一方面在于所述微孔板2的特定孔3内的生物细胞或细胞培养物利用所述酶标仪1的所述照明光源9来照明，其中这些特定孔3内的积分信号事先或此后由测量装置6,7,8来测量。用于研究酶标仪1中生物细胞或细胞培养物的根据本发明的方法的特征另一方面在于所述微孔板2的这些特定孔3内的生物细胞或细胞培养物的图像由所述酶标仪1的成像相机10来生成。然而，特别地，用于研究酶标仪1中生物细胞或细胞培养物的根据本发明的方法的特征在于通过处理器11’、11”来把每个检测到的积分信号与事先或随后记录的所述微孔板2的相应孔3内的生物细胞的图像进行比较，并与这些生物细胞或细胞培养物的成像数目、附着、融合或形态进行关联。
图2表示根据第二实施例检测微孔板2的所选孔3内的积分信号时或样品室12内的微孔板孔3的显微成像时酶标仪1的垂直剖面，所述样品室优选设置为可以以避光和气密方式封闭的隔离室。然而在图1的第一实施例中，只有避免干扰的环境光具有优先级，第二实施例除了避免干扰的环境光外，还特别为微孔板2的孔3内的细胞或细胞培养物提供一种特别合适的气氛。
所述酶标仪1优选包括控制器13，通过所述控制器可以在所述酶标仪1的设置为隔离室的样品室12中产生一种受控气氛，其中选自包括氧气、氮气、二氧化碳和一氧化碳的组的气体的浓度可以调节或维持在特定范围值内。所述控制器13可以集成在所述酶标仪1中，或提供有控制器，或者设置在酶标仪上。例如，在所述样品室12中设置用于检测和控制在插入所述酶标仪1的微孔板2上含有细胞或细胞培养物的孔3周围的气体氛围的氧含量的O2传感器和用于检测和控制该气体氛围的二氧化碳含量的CO2传感器。优选地，提供有气体入口24和气体出口25，其穿过样品室12的热绝缘壁或底部，并连接到或者可以连接到所述控制器13。可以在所述样品室12中设置风扇(未示出)或其它混合装置从而移动和混合和分布样品室中的气体。
在使用分开的控制器13时，其优选直接连接到所使用气体的所需压力缸。用于所需的气体连接的相应的阀门和节流阀安装在所述分开的控制器13中(未示出)。可选地，可以在气压缸上使用阀门和节流阀，其中这些阀门优选设置为电控磁阀(无电流的封闭式)。未在图2中示出的其它东西为控制器13的控制元件、显示元件和电源，所述控制器是分开的或设置在酶标仪1内或者是酶标仪1本身。
所述控制单元优选包括具有相应软件的计算机28；这种情况下，所述计算机28可以连接到所述酶标仪1的中央计算机29(参见图1)，是可以连接的(例如容纳在分开的外壳17’中)或者可以集成到所述酶标仪1的所述中央计算机29中(未示出)。
可以提供氮气(N2)和/或二氧化碳(CO2)用于置换所述样品室12中的环境空气，其中提供有合适的压力缸。这些压力缸通常安装有本身已知的控制阀和节流阀来为这些气体调节需要的输送压力。可选的，这些处理气体也可从其它来源获得(例如从服务线路)。除了氮气和二氧化碳(结合所述样品室12中对应的气体传感器)，其它气体也可以用于产生在所述样品室中通常普遍的气氛的限定组分。注意到可能适用的防范措施的话，其它气体，例如稀有气体或惰性气体(例如氩气)或者活性气体或有毒气体(例如氧气，一氧化碳，硫化氢或二氧化硫)，也可以通过至少一个进气口24引入到所述酶标仪1的所述样品室12中，从而在插入所述酶标仪1的微孔板2的孔3上或周围产生一种已知组分的气体氛围。优选地，所述控制器配置有足够的气体线路和控制阀从而可能产生具有多种气体成分的多种复杂气体组合物。
作为合适的CO2传感器的代表，需要提到来自位于瑞典代尔斯布SE-820 60的SenseAir AB公司的CO2传感器 CO2 ICB,产品型号:033-9-0001。作为合适的O2传感器的代表，需要提到来自位于瑞士苏黎世CH-8052的Pewatron AG公司的O2传感器Pewatron FCX-MEP2-F-CH氧气模块。
优选地，所述样品室12设置成配置有空气冷却系统的隔离室，所述空气冷却系统通过供给和排出线路连接到所述样品室12。额外的，所述控制器13也可以设置为这样一种空气冷却系统，包括冷却元件，例如以珀尔帖元件的形式。在尤其优选的酶标仪1中，可以在设置成隔离室的所述样品室12中产生一种受控气氛，其由包括温度，相对湿度和总压力的组中选择的每个参数可以调节或维持在特定范围值。优选地，相对湿度在末端湿区内维持或调节，这样在所述样品室的表面没有水蒸汽冷凝的风险，也没有细胞或细胞培养物变干的风险。
在本发明中，细胞培养物，生物细胞聚集物或从中分离或以其它方式得到的单个细胞都称为细胞，这些细胞包括微生物和真菌以及动物和植物真核细胞。
在图2中，一个孔3特定地位于用于发光测量的第二测量装置7的光轴21”的区域中。另一个孔3特定地位于所述成像相机10和照明光源9的光轴20的区域中。同一个微孔板2的另一个孔3特定地位于用于吸光度测量的第一测量装置6的光轴21”’的区域中。然而在图1中示出了具有附属光学显微镜19的两个成像相机10和照明光源9，第二实施例仅有一个合适安装的成像相机10。
图3表示根据第三实施例检测样品室12中所选择的微孔板孔3内的积分信号时酶标仪1的垂直剖面，所述样品室优选设置为可以以避光和气密方式封闭的隔离室。根据本发明的所述酶标仪1的第三实施例具有外壳14，整个酶标仪1和所有的动作源5’，5”，5”’和测量装置5”，6，7，8都安装在其中。另外，和设置为隔离室的所述样品室12一起，中央控制单元22也安装在外壳14内，前两个实施例也是如此。
在图3中，一个孔3特定地位于安装有双管注射器的液体源5”’(在图1和图2中也有)的动作轴21的区域中。另一个孔3特定地位于用于发光测量的第二测量装置7的光轴21”的区域中。液体源5”’的至少一个注射器的局部设置优选尽可能地接近所述第二测量装置7的光轴21”，这样以在注射(引起发光)和发光检测之间尽可能最小的时间差来测量发光。具有光学显微镜19的所述成像相机10和所述照明光源9的光轴20位于接近所述第二测量装置7的光轴21”。
所述酶标仪1优选地包括屏幕15，用于显示操作状态、测量结果、显微图像，并用于显示检测到的积分信号与所述微孔板(2)的各个孔3中的生物细胞或细胞培养物的相应图像相比较的结果以及这些生物细胞或细胞培养物的成像数目、附着、融合或者形态的比例。所述屏幕15优选设置为触敏屏幕或触屏，这样它还可以作为界面用于调整或改变所述酶标仪1的操作参数和处理和储存产生的结果。
图4表示具有附着到孔底部16的典型电极17’,17”和附着到孔壁的典型电极接头23’,23”的微孔板孔3的平面图。这些电极17’,17”和电极接头23’,23”优选地由金或金合金制成，可以通过溅射或其它合适的涂层方法施加到孔底部16或内表面和优选为孔边缘26。特别地，尽可能远地延伸到孔边缘26的电极接头23’,23”可以通过利用所述接收装置4向所述电源5”移动所述微孔板2来相对简单地连接到所述电源5”的所述接触传感器27，优选在垂直的Z方向(参见图1中的箭头，其代表了图1-3)使用相应的马达驱动，直到所述电源5”的所述接触传感器27与所述电极接头23’,23”接触。因此优选地，带有包含生物细胞或细胞培养物的微孔板2的接收装置4在至少一个移动方向上定位时移动，其中所述移动方向选自包括三维坐标系统中的X，Y和Z方向的组。为了在至少一个所述动作源5’,5”,5”’和微孔板2的孔3内的生物细胞或细胞培养物之间引起相互作用，同时也为了利用至少一个所述测量装置6,7,8或者所述电源5”来检测相应的积分信号，带有包含生物细胞或细胞培养物的微孔板2的接收装置4可优选在至少一个移动方向上移动，其中该移动方向选自包括三维坐标系统中的X，Y和Z方向的组。
图4表示典型电极17’,17”的选择，电极的材料对生物细胞或细胞培养物的附着，融合或形态的影响尽可能小，最好没有。例如，如图所示，电极17’,17”可以设置成相同的或不同的，完全覆盖表面或者仅覆盖区域或阵列。
相同的参考数字和标记表示类似的特征，即使没有对所有附图和所有参考数字进行描述。对已经描述和/或表示的特征的任何组合属于本发明的范围。
在本发明中，尤其优选的荧光测量是荧光强度的测量；时间分辨荧光测量；荧光偏振的测量和荧光寿命的测量。
除了测量发光强度，本发明尤其感兴趣的是通过发光对细胞和细胞培养物进行动力学测量和发光动力学的检测。
图5表示通过微孔板2的孔3的透照的光程的图示。图5A表示具有透射光线束29的路径的常规透照。这种用于亮视野显微术的典型照明被称为科勒照明。
LED作为光源5’使用，它的光29被集光透镜31收集并在聚光透镜32的焦面上成像。所述聚光透镜聚焦样品平面中的光29并用高亮度照射小的样品区域，样品区域在所述相机10的CCD或CMOS芯片35上成像，通过使用物镜34来提高放大率。光场光圈(luminous filedaperture)33限定所述孔3的所述样品平面内的照明区域，并实现将光和热辐射对样品的负荷减到最小以及将杂散光减到最小的功能。放置在所述光源5’之后的孔径光阑30限定所述聚光透镜32和所述孔3的所述样品平面之间的照明光锥29的数值孔径。由于孔径光阑30的小开口，所述照明光锥29显示出小的张角。然而，由于孔径光阑30的大开口，所述照明光锥29显示出大的张角。通常，所述孔径光阑30设置在聚光透镜32的焦面内。而在所示的实施例中，所述孔径光阑30设置在所述光源的平面内，这相对于光学图像来说被认为是等效的。所述孔径光阑30的所示设置使得采用机动光圈轮(未示出)成为可能，所述机动光圈轮包括具有不同尺寸和形状的多个孔径光阑30。
传统的显微样品薄且是二维的，并且位于两个玻璃板(显微载玻片和盖玻片)之间，与此相反，照明光29在到达位于孔3的底部的样品平面之前需要穿透整个液体体积。由于粘附效应，液体表面非常弯曲，即形成半月板，其作用像发散透镜。
图5C表示具有透射光线29的路径的常规透照。当使用小开口的孔径光阑30时(参见图5A)，通常照射由所述物镜34成像的样品区域的远离中心的区域的边界光束向外弯曲，不会照射到孔底部的远离中心的区域或者如图所示，不能被所述物镜34捕获并被所述成像芯片35记录。因此，在得到的图像中，产生了向外侧的较大强度的降低。这种强度降低只能部分地通过连续图像处理来在数学上补偿。造成的强度降低导致对在所述孔的远离中心的区域的细胞的融合的测定或计数不太可靠。
图5B表示具有透射光线束29的路径的本发明的透照。这种具有高数值孔径的透照的设置与用于常规照射的设置相同(参见图5A)，除了所述孔径光阑30的开口尺寸以外。这里，所述孔径光阑30的开口尺寸显著地增大从而增大所述照明光锥29的张角。
图5D表示具有透射光线的路径29的本发明的透照。所述照明光锥29的边界光束以较大角度照射在液体的弯曲表面上，它们经过向外侧的微弱偏差，因此它们也能稍稍照射孔底部的边界区域，这样光29可能进入所述相机10的物镜34并被所述成像芯片35检测。这导致相当弱的强度梯度。这种对照甚至在孔3的远离中心的区域中更好，现在，在所述孔的远离中心的区域中的细胞的融合的可靠测定或计数也成为可能。
图6表示透照时孔3的图片。这里，含有细胞培养物的一个孔的合在一起的图像显示为马赛克。其中，图像的亮度取决于曝光时间。每个图像的亮度通过使用图像软件在其对比度上进行了优化。在所述孔3的底部上的整体亮度分布导致在单个图像的接触位置有亮度梯度。
图6A表示常规照射的结果。单个图像利用小孔径光阑30记录(参见图5A和图5C)，朝向边界的亮度降低是明显的。
图6B表示本发明的照射的结果。相同的孔3利用大孔径光阑30照射(参见图5B和图5D)。明显的，直到孔边界仍有可评价的亮度值。
图7表示图6的图片中贯穿所述孔(参见亮线)的整个直径的强度的分布。其表示了贯穿两个马赛克的强度横截面。这些梯度是由于单个图像的曝光时间的差异造成的。
图7A表示利用小孔径光阑30(参见图5A和图5C)的常规照射时的强度分布。可以发现，在远离中心的区域的常规照射中，只能达到非常低的强度值，这位于相机噪声的范围内。
图7B表示具有大数值孔径30(参见图5B和图5D)的本发明照射时的强度分布。很明显看出，形成的梯度非常弱。一个图像与另一个图像的强度梯度非常小，这是因为通过补偿曝光时间，整体亮度差异比较弱。
图8表示图7A和图7B的两幅图在各自情况下照射的标准化后的比较。为了直接比较常规成像和本发明的成像的结果，曝光时间的差异已被标准化。在此图中，横坐标表示孔底部的位置，间隔为1mm，纵坐标为以对数刻度表示的强度值(灰度值)。虚线表示常规照射，粗线表示利用大孔径光阑的本发明的照射。在利用大孔径光阑的本发明的照射中，朝向孔边界的强度的下降接近约20倍。相反的，在正常的、常规的照射中，朝向孔边界的强度的下降接近约500倍。在利用大孔径光阑的照射中，这导致在边界区域也有可用的信号，而在正常照射时是不可能的，如图所示。具有1-3mm的开口的孔径光阑30被视为小数值孔径，而具有5-9mm的开口的孔径光阑30被视为大数值孔径。在大数值孔径中，尤其优选具有9mm的开口直径的孔径光阑30。
参考列表
1 酶标仪
2 微孔板
3 孔
4 接收装置
5’,5”,5”’ 动作源
5’ 光源
5” 电源；阻抗测量装置
5”’ 液体源
6 用于吸光度测量的第一测量装置
7 用于发光测量的第二测量装置
8 用于荧光测量的第二测量装置
9 照明光源
10 成像相机
11’ 内部处理器
11” 外部处理器
12 样品室
13 控制器
14 外壳
15 屏幕
16 孔底部
17’,17” 电极
18 翼片
19 光学显微镜
20 10的光轴
21 动作轴
21’ 8的光轴
21’ 7的光轴
21” 6的光轴
22 中央处理单元
23’,23” 电极接头
24 气体入口
25 气体出口
26 孔边缘
27 接触传感器
28 光导
29 光，光线，光线束
30 孔径光阑
31 集光透镜
32 聚光透镜
33 光场光圈
34 相机物镜
35 CCD，CMOS芯片

Claims (26)

1.一种用于研究酶标仪(1)中生物细胞或细胞培养物的方法，其中，所述方法包括：
a)通过所述酶标仪(1)的接收装置(4)接收孔(3)内含有粘附生物细胞或细胞培养物的至少一个微孔板(2)；
b)使所述接收装置(4)和含有生物细胞或细胞培养物的所述微孔板(2)的所述孔(3)中的特定孔相对于所述酶标仪(1)的测量装置(5”,6,7,8)的轴(21,21’,21”,21”’)定位；和
c)通过至少一个所述测量装置(5”,6,7,8)检测所述微孔板(2)的所述特定孔内的生物细胞或细胞培养物中或其上的至少一个积分信号；
其中：
d)使用所述接收装置(4)将所述微孔板(2)的所述特定孔相对于所述酶标仪(1)的照明光源(9)的轴(20)定位；
e)利用所述酶标仪(1)的照明光源(9)透照所述微孔板(2)的所述特定孔内的所述粘附生物细胞或细胞培养物；
f)利用所述酶标仪(1)的成像相机(10)生成由所述照明光源(9)透照的所述微孔板(2)的所述特定孔内的所述生物细胞或细胞培养物的亮场、暗场、或相差图像；和
g)利用处理器(11’,11”)将所检测到的每个积分信号与所述微孔板(2)的对应特定孔内的所述生物细胞或细胞培养物的图像进行比较，并与所述粘附生物细胞的成像融合进行关联。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述接收装置(4)和含有所述生物细胞或细胞培养物的所述微孔板(2)的所述特定孔相对于所述酶标仪(1)的动作源(5’,5”,5”’)的轴(21)定位，并在至少一个所述动作源(5’,5”,5”’)和所述微孔板(2)的所述特定孔内的生物细胞或细胞培养物之间引起相互作用从而引起或生成所述积分信号。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，
所述至少一个动作源(5’,5”,5”’)选自下组：
-用于在所述微孔板(2)的所述特定孔内的生物细胞或细胞培养物内或其上激发荧光的光源(5’)；
-用于透照所述微孔板(2)的所述特定孔内的生物细胞或细胞培养物的光源(5’)；
-用于测量阻抗或阻抗变化的电源(5”)，所述阻抗或阻抗变化是所述微孔板(2)的所述特定孔内的生物细胞或细胞培养物的附着或重排的函数；和
-用于在所述微孔板(2)的所述特定孔内的生物细胞或细胞培养物内或其上引起发光的液体源(5”’)。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，
所述积分信号选自下组：
-插进所述酶标仪(1)的所述微孔板(2)的所述特定孔内的生物细胞或细胞培养物内或其上激发的荧光；
-插进所述酶标仪(1)的所述微孔板(2)的所述特定孔内的生物细胞或细胞培养物内或其上引发或存在的发光；
-由插进所述酶标仪(1)的所述微孔板(2)的所述特定孔内的生物细胞或细胞培养物引起的吸光度；和
-由插进所述酶标仪(1)的所述微孔板(2)的所述特定孔内的生物细胞或细胞培养物的附着或重排引起的阻抗或阻抗变化。
5.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，
所述光源(5’)选自包含弧光灯、闪光灯、白炽灯、激光器、激光二极管和发光二极管(LED)的组。
6.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，
所述电源(5”)为电通量按照正弦函数在20到100,000Hz范围内变化的交流电源，其中所述交流电源包括输出电阻。
7.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，
所述液体源(5”’)选自包含单注射器和多注射器的组。
8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，
用于检测所述积分信号的所述测量装置(6,7,8)选自下组：光电倍增管、光电二极管、光电二极管阵列、雪崩二极管和相敏锁相放大器。
9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，
在定位时所述接收装置(4)在至少一个移动方向上移动，所述接收装置带有包含生物细胞或细胞培养物的所述微孔板(2)，其中所述移动方向选自包括三维坐标系统中的X、Y和Z方向的组。
10.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，
在所述处理器(11’,11”)中运行图像处理软件，从而检测单个生物细胞；
和其中，在所述处理器(11’,11”)中运行信号处理软件，从而用所述特定孔中检测到的所述积分信号的强度除以检测到的所述生物细胞的数目。
11.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，
含有生物细胞或细胞培养物并且被所述接收装置(4)接收的所述微孔板(2)的所述特定孔在所述酶标仪(1)的避光样品室(12)中研究。
12.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，
含有生物细胞或细胞培养物并且被所述接收装置(4)接收的所述微孔板(2)的所述特定孔暴露于所述酶标仪(1)的样品室(12)中的受控气氛中，所述样品室设置为隔离室。
13.根据权利要求11所述的方法，其特征在于，
所接收的具有含生物细胞或细胞培养物的所述特定孔的微孔板(2)至少在执行步骤b)到f)期间由所述接收装置(4)保持在所述酶标仪(1)的所述样品室(12)中。
14.根据权利要求12所述的方法，其特征在于，
所接收的具有含生物细胞或细胞培养物的所述特定孔的微孔板(2)至少在执行步骤b)到f)期间由所述接收装置(4)保持在所述酶标仪(1)的所述样品室(12)中。
15.根据权利要求13所述的方法，其特征在于，
在设置为隔离室的所述样品室(12)内利用所述酶标仪(1)的所述照明光源(9)透照所述微孔板(2)的所述特定孔内的所述生物细胞或细胞培养物，并且所述微孔板(2)的所述特定孔内的生物细胞或细胞培养物通过光学显微镜(19)由所述成像相机(10)来记录。
16.根据权利要求14所述的方法，其特征在于，
在设置为隔离室的所述样品室(12)内利用所述酶标仪(1)的所述照明光源(9)透照所述微孔板(2)的所述特定孔内的所述生物细胞或细胞培养物，并且所述微孔板(2)的所述特定孔内的生物细胞或细胞培养物通过光学显微镜(19)由所述成像相机(10)来记录。
17.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，
为了对用所述酶标仪(1)的所述照明光源(9)透照的所述生物细胞或细胞培养物成像，使用包含具有大数值孔径的孔径光阑(30)的光学显微镜(19)。
18.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，
a)到f)的所有步骤都在单个装置内自动进行。
19.一种酶标仪(1)，包括：
a)接收装置(4)，用于接收具有含粘附生物细胞或细胞培养物的孔(3)的至少一个微孔板(2)，并使所述具有含生物细胞或细胞培养物的所述孔(3)中的特定孔的所述微孔板(2)相对于所述酶标仪(1)的测量装置(5”,6,7,8)的轴(21,21’,21”,21”’)定位；和
b)至少一个测量装置(5”,6,7,8)，用于检测在所述微孔板(2)的所述特定孔内的生物细胞或细胞培养物内或其上存在或引起或产生的至少一个积分信号；
其中，所述酶标仪(1)还包括用于透照的具有轴(20)的照明光源(9)和用于对所述微孔板(2)的所述特定孔内的所述细胞或细胞培养物进行亮场、暗场或相差成像的成像相机(10)，
和其中，所述酶标仪(1)包括内部处理器(11’)或者设置为可以连接到外部处理器(11”)，所述处理器(11’,11”)被设置用于将所检测到的每个积分信号与所述微孔板(2)的对应特定孔内的生物细胞或细胞培养物的亮场、暗场或相差图像进行比较，和用于把所述积分信号与所述生物细胞的成像融合相关联。
20.根据权利要求19所述的酶标仪(1)，
包括至少一个动作源(5’,5”,5”’)，用于在至少一个所述动作源(5’,5”,5”’)和所述微孔板(2)的所述特定孔内的生物细胞或细胞培养物之间引起相互作用，和用于引起或产生可测信号。
21.根据权利要求19所述的酶标仪(1)，
包括设置为避光和气密，并被设置为隔离室的样品室(12)，
和包括控制装置(13)，用于控制被设置为隔离室的所述样品室(12)内的气体组分、温度和相对湿度中的至少一种。
22.根据权利要求20所述的酶标仪(1)，其特征在于，
所述至少一个动作源(5’,5”,5”’)选自下组：
-用于在所述微孔板(2)的所述特定孔内的生物细胞或细胞培养物内或其上激发荧光的光源(5’)；
-用于透照所述微孔板(2)的所述特定孔内的生物细胞或细胞培养物的光源(5’)；-用于测量阻抗或阻抗变化的电源(5”)，所述阻抗或阻抗变化是所述微孔板(2)的所述特定孔内的生物细胞或细胞培养物的附着或重排的函数；
-用于在所述微孔板(2)的所述特定孔内的生物细胞或细胞培养物内或其上引起发光的液体源(5”’)。
23.根据权利要求19所述的酶标仪(1)，其特征在于，
所述至少一个测量装置(6,7,8)选自下组：光电倍增管、光电二极管、光电二极管阵列、雪崩二极管和相敏锁相放大器。
24.根据权利要求23所述的酶标仪(1)，
包括至少一个具有特定孔的微孔板(2)，所述孔的孔底部(16)至少部分地由电极(17’,17”)覆盖，其中所述电极(17’,17”)被设置为可以与电源(5”)相接触。
25.根据权利要求19所述的酶标仪(1)，
包括光学显微镜(19)和与其光耦合的成像相机(10)，用于生成所述微孔板(2)的所述特定孔内的生物细胞或细胞培养物的显微亮场、暗场或相差图像。
26.根据权利要求25所述的酶标仪(1)，其特征在于，
所述光学显微镜(19)包含具有大数值孔径的孔径光阑(30)。
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