JP6685148B2 - 撮像装置および撮像方法 - Google Patents

Description

この発明は、液体と共に試料容器に担持された生試料を撮像対象物として撮像する技術に関し、特にその照明に関するものである。

医療や生物科学の実験においては、例えばウェルとも称される窪部を多数配列して設けたプレート状の試料容器（例えばマイクロプレート、マイクロタイタープレート等と呼ばれる）の各ウェルに液体やゲル状の流動体（例えば培養液、培地等）を注入し、ここで細胞等を培養したものを試料として観察、計測することが行われる。近年では、ＣＣＤカメラ等で撮像してデータ化し、該画像データに種々の画像処理技術を適用して観察や分析に供することが行われるようになってきている。

このような撮像装置においては、液面のメニスカスにより照明光が屈折し、特にウェルの周縁部で画像の明るさが不足するという問題がある。この問題に対応するため、本願出願人が先に開示した特許文献１に記載の技術では、撮像光学系を物体側ハイパーセントリックな特性を有するものとすることで、屈折により進行方向が光軸から離れる方向に曲げられた光を効率よく集光することができるようにしている。

特開２０１５−１１８０３６号公報

より微細な構造を観察するために、撮像光学系の撮像倍率を高めることが考えられる。また、使用されるウェルのサイズも様々である。これらの場合において、特に撮像視野が１つのウェルのサイズよりも小さくなると、撮像視野内にメニスカスの影響が現れた領域が含まれる場合と含まれていない場合とが生じることになる。メニスカスの影響が含まれない領域を撮像するとき、上記した撮像光学系を用いた撮像では撮像視野の周縁部において光量の低下が発生し、実効的な撮像視野が狭くなるおそれがある。

この発明は上記課題に鑑みなされたものであり、液体と共に試料容器に担持された生試料を撮像する技術において、メニスカスの影響を抑えて画像品質の良好な画像を得ることのできる技術を提供することを目的とする。

この発明の一の態様は、底面が光透過性を有する試料容器に液体と共に担持された生試料を撮像対象物として撮像する撮像装置であって、上記目的を達成するため、前記試料容器を保持する保持手段と、前記保持手段により保持される前記試料容器に対向配置され、物体側ハイパーセントリック特性を有する撮像光学系と、前記撮像光学系により結像される前記撮像対象物の像を撮像する二次元撮像素子と、前記撮像光学系と前記二次元撮像素子とを一体的に、前記撮像対象物に対し前記撮像光学系の光軸と直交する方向に相対移動させる移動手段と、前記保持手段に保持される前記試料容器を挟んで前記撮像光学系とは反対側から、前記撮像対象物を照明する照明手段と、前記二次元撮像素子、前記移動手段および前記照明手段を制御する制御手段とを備え、前記照明手段は、射出瞳位置が互いに異なり、前記撮像対象物に向かう出射光が互いに同軸である複数の照明光学系を有し、前記照明光学系の１つは、前記撮像対象物に対し、主光線が前記撮像光学系の光軸に平行となる光を入射させるテレセントリック照明をなし、前記複数の照明光学系は、前記射出瞳位置が当該照明光学系から見て前記撮像対象物よりも近い側にあるものを含み、前記制御手段は、前記移動手段により前記撮像光学系および前記二次元撮像素子を前記撮像対象物に対し相対移動させながら、前記撮像対象物に対する前記撮像光学系の相対位置が予め定められた複数の撮像位置のいずれかとなった時に、前記複数の照明光学系の１つから光を出射させるとともに前記二次元撮像素子により前記撮像対象物を撮像させ、前記光を出射させる前記照明光学系を、前記撮像位置に応じて切り替える。

また、この発明の他の態様は、底面が光透過性を有する試料容器に液体と共に担持された生試料を撮像対象物として撮像する撮像方法であって、上記目的を達成するため、前記試料容器に対向させて、物体側ハイパーセントリック特性を有する撮像光学系および前記撮像光学系により結像される前記撮像対象物の像を撮像する二次元撮像素子を配置し、前記試料容器を挟んで前記撮像光学系とは反対側に前記撮像対象物を照明する照明手段を配置する配置工程と、前記撮像光学系および前記二次元撮像素子を前記撮像対象物に対し相対移動させながら、前記撮像対象物に対する前記撮像光学系の相対位置が予め定められた複数の撮像位置のいずれかとなった時に、前記照明手段から光を出射させるとともに前記二次元撮像素子により前記撮像対象物を撮像させる撮像工程とを備え、前記照明手段は、射出瞳位置が互いに異なり、前記撮像対象物に向かう出射光が互いに同軸である複数の照明光学系を有し、前記照明光学系の１つは、前記撮像対象物に対し、主光線が前記撮像光学系の光軸に平行となる光を入射させるテレセントリック照明をなし、前記複数の照明光学系は、前記射出瞳位置が当該照明光学系から見て前記撮像対象物よりも近い側にあるものを含み、前記撮像工程では、前記複数の照明光学系の１つから選択的に光を出射させ、しかも、前記光を出射させる前記照明光学系を、前記撮像位置に応じて切り替える。

このように構成された発明では、物体側ハイパーセントリック特性を有する撮像光学系を用いることで、特許文献１に記載の技術と同様に、撮像対象物のうちメニスカスの影響が現れた領域を含む領域の画像を良好な画像品質で撮像することができる。より微視的には、例えば試料容器の周縁部近傍でメニスカスによる屈折が強く現れる一方、例えば試料容器の中央部ではほとんどその影響がない。このように、メニスカスの影響の現れ方は位置によって異なる。射出瞳位置の異なる複数の照明光学系を設けそれらを切り替えることで、撮像対象物に入射する照明光の主光線の方向を変更することができる。したがって、撮像位置に応じて照明光学系を切り替えることで、メニスカスによる屈折の大きさの差異に対応してその影響を抑えた撮像を行うことが可能になる。

以上のように、本発明によれば、射出瞳位置が互いに異なり、したがって撮像対象物に入射する照明光の主光線の方向が互いに異なる複数の照明光学系を、撮像位置によって切り替えて撮像を行うことにより、メニスカスの影響を抑えて画像品質の良好な画像を得ることができる。

本発明にかかる撮像装置の一実施形態の概略構成を示す図である。 照明光学系の詳細な構成および光線図を示す図である。 第１および第２の照明光学系から出射される照明光を示す図である。 ウェル撮像時の様子を示す図である。 撮像視野よりも大きいウェルの撮像の様子を示す第１の図である。 撮像視野よりも大きいウェルの撮像の様子を示す第２の図である。 第２の照明光学系を用いた撮像を示す図である。 １つのウェルを複数画像に分割する方法を例示する図である。 この実施形態における撮像処理を示すフローチャートである。

図１は本発明にかかる撮像装置の一実施形態の概略構成を示す図である。この撮像装置１は、ウェルプレートＷＰの上面に形成されたウェルＷと称される窪部に注入された液体中で培養される細胞、細胞コロニー、細菌等（以下、「細胞等」と称する）の生試料を撮像する装置である。

ウェルプレートＷＰは、創薬や生物科学の分野において一般的に使用されているものである。ウェルプレートＷＰは平板状のプレート形状を有しており、該プレートの上面に開口を有する筒状のウェルＷが、ウェルプレートＷＰに複数配列されている。各ウェルＷは、例えば断面が略円形を有し、底面が透明かつ平坦となっている。ウェルＷの断面および底面の形状はこれに限定されない。例えば断面が矩形であってもよく、また底面が湾曲したものであってもよい。

１つのウェルプレートＷＰにおけるウェルＷの数は任意であるが、例えば９６個（１２×８のマトリクス配列）のものを用いることができる。各ウェルＷの直径および深さは代表的には数ｍｍ程度である。なお、この撮像装置１が対象とするウェルプレートのサイズやウェルの数はこれらに限定されるものではなく任意であり、例えば６ないし３８４穴のものが一般的に使用されている。また、複数ウェルを有するウェルプレートに限らず、例えばディッシュと呼ばれる平型の容器で培養された細胞等の撮像にも、この撮像装置１を使用することが可能である。

ウェルプレートＷＰの各ウェルＷには、培地Ｍとしての液体が所定量注入され、この液体中において所定の培養条件で培養された細胞等が、この撮像装置１の撮像対象物となる。培地Ｍは適宜の試薬が添加されたものでもよく、また液状でウェルＷに投入された後ゲル化するものであってもよい。後述するように、この撮像装置１では、例えばウェルＷの内底面で培養された細胞等を撮像対象物とすることができる。常用される一般的な液量は、５０ないし２００マイクロリットル程度である。

撮像装置１は、装置１の上部に配置される照明部１０と、照明部１０の下方でウェルプレートＷＰを保持するホルダ１２と、ホルダ１２の下方に配置される撮像部１３と、これら各部の動作を制御するＣＰＵ１４１を有する制御部１４とを備えている。ホルダ１２は、試料を培地Ｍとともに各ウェルＷに担持するウェルプレートＷＰの下面周縁部に当接してウェルプレートＷＰを略水平姿勢に保持する。

照明部１０は、２つの光源１０１，１１１を備えている。光源１０１，１１１として、例えば白色ＬＥＤ（Light Emitting Diode）を用いることができる。光源１１１から出射される光はコレクタレンズ１１２を介してビームスプリッター１０４に入射する。一方、光源１０１から出射される光は反射ミラー１０２により光路を折り返され、コレクタレンズ１０３を介してビームスプリッター１０４に入射する。ビームスプリッター１０４から出射される光線は反射ミラー１０５によって進行方向が（−Ｚ）方向、すなわち鉛直下向き方向に変えられ、コンデンサレンズ１０６を介して下向きに出射される。出射された光は、ホルダ１２に支持されたウェルプレートＷＰの上方から少なくとも１つのウェルＷに入射し、ウェルＷ内の撮像対象物を照明する。

このように、この実施形態の照明部１０は、光源１０１をその光源とし、反射ミラー１０２、コレクタレンズ１０３、ビームスプリッター１０４、反射ミラー１０５およびコンデンサレンズ１０６などからなる第１の照明光学系１００と、光源１１１をその光源とし、コレクタレンズ１１２、ビームスプリッター１０４、反射ミラー１０５およびコンデンサレンズ１０６などからなる第２の照明光学系１１０との２つの照明光学系が、一部の構成を共有した状態で併存している。

光源１０１，１１１は制御部１４に設けられた光源制御部１４６により点灯制御され、光源制御部１４６からの制御信号に応じて選択的に点灯する。したがって、照明部１０は、光源１０１を有する第１の照明光学系１００から出射される第１の照明光、および光源１１１を有する第２の照明光学系１１０から出射される第２の照明光を、選択的にウェルＷに入射させることができる。第１の照明光と第２の照明光とはビームスプリッター１０４によって合成され、これらは同軸に出射可能となっている。すなわち、コンデンサレンズ１０６から出射される第１の照明光の中心軸と第２の照明光の中心軸とが一致している。

図２は照明光学系の詳細な構成および光線図を示す図である。図２では、光路を明瞭に示すため、上記のように一部構成を共有する第１の照明光学系１００と第２の照明光学系１１０とを分離して記載している。また、同じ目的から、実機では反射ミラーおよびビームスプリッターで折り曲げられる光軸が直線となるように図示している。このため、光軸を折り曲げる機能を有する反射ミラー１０２，１０５およびビームスプリッター１０４の記載が省略されている。

第１の照明光学系１００では、光源１０１から出射される光がコレクタレンズ１０３によって集光され、コンデンサレンズ１０６を介して、撮像対象物である細胞等が存在する試料面に向け出射される。通常の使用においては試料面はウェル底面Ｗｂである。コレクタレンズ１０３は、コレクタレンズ１０３とコンデンサレンズ１０６との間に光源１０１の像を結像させる。すなわち、光源像Ｃ１がコレクタレンズ１０３とコンデンサレンズ１０６との間に作られる。また、光源像Ｃ１がコンデンサレンズ１０６の前側（光源側）焦点位置に位置し、コンデンサレンズ１０６から試料面に向かう主光線が鎖線で示される光軸と平行となるように、コレクタレンズ１０３およびコンデンサレンズ１０６が配置される。すなわち、第１の照明光学系１００はテレセントリック照明をなす。

光源１０１の光出射面には必要に応じて開口絞り１０７が配置され、コレクタレンズ１０３によって形成される光源像Ｃ１の大きさが規定される。開口絞り１０７により、照明のＮＡ（開口数）を調整することができる。また、コレクタレンズ１０３の後側で共役点よりも前側には、必要に応じて視野絞り１０８が配置される。これにより、撮像に必要な範囲のみを照明して、撮像光学系でのフレア発生を防止することができる。

第２の照明光学系１１０では、光源１１１から出射される光がコレクタレンズ１１２によって集光され、コンデンサレンズ１０６を介して試料面に向け出射される。コレクタレンズ１１２には、光源１１１の光源像Ｃ２がコンデンサレンズ１０６の後側で、試料面よりも前側に位置するような屈折特性が与えられる。

光源１１１の光出射面には必要に応じて開口絞り１１３が配置され、コレクタレンズ１１２およびコンデンサレンズ１０６によって形成される光源像Ｃ２の大きさが規定される。開口絞り１１３により、照明光のＮＡを調整することができる。また、コレクタレンズ１１２とコンデンサレンズ１０６との間には、必要に応じて視野絞り１１４が配置される。これにより、撮像に必要な範囲のみを照明して、撮像光学系でのフレア発生を防止することができる。

２つの照明光学系１００，１１０は、コンデンサレンズ１０６を共用する。これを可能とするためのビームスプリッター１０４は、それぞれのコレクタレンズとコンデンサレンズとの間に設けられる。より具体的には、第１の撮像光学系１００においてはコレクタレンズ１０３（視野絞り１０８が設けられる場合には視野絞り１０８）よりも後側でコンデンサレンズ１０６よりも前側、かつ第２の撮像光学系１１０においてはコレクタレンズ１１２（視野絞り１１４が設けられる場合には視野絞り１１４）よりも後側でコンデンサレンズ１０６よりも前側となる条件が満たされる位置に、ビームスプリッター１０４が配置される。

図１に戻って撮像装置１の説明を続ける。ホルダ１２により保持されたウェルプレートＷＰの下方に、ウェルＷ内の細胞等の撮像対象物を撮像する撮像部１３が設けられる。撮像部１３では、ウェルプレートＷＰの直下位置に対物レンズ１３１が配置されている。対物レンズ１３１の光軸は鉛直方向に向けられ、第１および第２の照明光学系１００，１１０の光軸と同軸となっている。照明部１０から出射されウェルＷの上方から液体に入射した光が撮像対象物を照明し、ウェルＷ底面から下方へ透過した光が対物レンズ１３１に入射する。対物レンズ１３１の下方には、低倍率用アフォーカル系１３２および高倍率用アフォーカル系１３３が切り替え可能に設けられている。

すなわち、低倍率用アフォーカル系１３２および高倍率用アフォーカル系１３３は、図示しない駆動機構により水平方向に一体的に移動可能となっており、その一方が対物レンズ１３１の直下位置に選択的に位置決めされる。図において実線で示すように、高倍率用アフォーカル系１３３が対物レンズ１３１の直下位置に位置決めされた状態では、対物レンズ１３１および高倍率用アフォーカル系１３３を含む高倍率の撮像光学系が構成される。このとき、撮像対象物の比較的狭い範囲を高倍率で撮像することができる。一方、図において点線で示すように、低倍率用アフォーカル系１３２が対物レンズ１３１の直下位置に位置決めされた状態では、対物レンズ１３１および低倍率用アフォーカル系１３２を含む低倍率の撮像光学系が構成され。このとき、撮像対象物の比較的広い範囲を低倍率で撮像することができる。

低倍率用アフォーカル系１３２または高倍率用アフォーカル系１３３から出射される光は、反射ミラー１３４により折り返され、結像レンズ１３５を介して撮像素子１３６に入射する。後述するように、対物レンズ１３１、低倍率用アフォーカル系１３２および結像レンズ１３５等からなる撮像光学系は、物体側ハイパーセントリックな光学特性を有している。一方、対物レンズ１３１、高倍率用アフォーカル系１３３および結像レンズ１３５等からなる撮像光学系は、物体側テレセントリックな光学特性を有している。

撮像素子１３６は二次元の受光面を有するエリアイメージセンサであり、例えばＣＣＤセンサまたはＣＭＯＳセンサを用いることができる。結像レンズ１３５により撮像素子１３６の受光面に結像する撮像対象物の像が、撮像素子により撮像される。撮像素子１３６は、受光した光学像を電気信号に変換し画像信号として出力する。このような撮像方法では、撮像対象である細胞等に対し非接触、非破壊かつ非侵襲で撮像を行うことができ、撮像による細胞等へのダメージを抑えることができる。撮像部１３の各部の動作は、制御部１４に設けられた撮像制御部１４３により制御される。

撮像素子１３６から出力される画像信号は、制御部１４に送られる。すなわち、画像信号は制御部１４に設けられたＡＤコンバータ（Ａ／Ｄ）１４４に入力されてデジタル画像データに変換される。ＣＰＵ１４１は、受信した画像データに基づき適宜の画像処理を実行する。制御部１４はさらに、画像データを記憶保存するための画像メモリ１４７と、ＣＰＵ１４１が実行すべきプログラムやＣＰＵ１４１により生成されるデータを記憶保存するためのメモリ１４８とを有しているが、これらは一体のものであってもよい。また、大容量ストレージと半導体メモリとの適宜の組み合わせにより、画像メモリ１４７およびメモリ１４８が実現されてもよい。ＣＰＵ１４１は、メモリ１４８に記憶された制御プログラムを実行して装置各部を動作させることにより、各種の撮像処理や演算処理を行う。

撮像部１３は、制御部１４に設けられたメカ制御部１４５により水平方向および鉛直方向に移動可能となっている。具体的には、メカ制御部１４５がＣＰＵ１４１からの制御指令に基づき駆動機構１５を作動させ、撮像部１３を水平方向に移動させることにより、撮像部１３がウェルＷに対し水平方向に移動する。また鉛直方向への移動によりフォーカス調整がなされる。撮像視野内に１つのウェルＷの全体が収められた状態で撮像されるときには、メカ制御部１４５は、対物レンズ１３１の光軸が当該ウェルＷの中心と一致するように、撮像部１３を水平方向に位置決めする。

また、駆動機構１５は、撮像部１３を水平方向に移動させる際、図において点線矢印で示すように照明部１０を撮像部１３と一体的に移動させる。すなわち、照明部１０は、出射光の中心が対物レンズ１３１の光軸と略一致するように配置されており、撮像部１３が水平方向に移動するとき、これと連動して移動する。これにより、どのウェルＷが撮像される場合でも、照明部１０からの光線束の中心が常に対物レンズ１３１の光軸上に位置することとなり、各ウェルＷに対する照明条件を一定にして、撮像条件を良好に維持することができる。

その他に、制御部１４には、インターフェース（ＩＦ）部１４２が設けられている。インターフェース部１４２は、ユーザからの操作入力の受け付けや、ユーザへの処理結果等の情報提示を行うユーザインターフェース機能のほか、通信回線を介して接続された外部装置との間でのデータ交換を行う機能を有する。図示を省略しているが、ユーザインターフェース機能を実現するために、インターフェース部１４２には、ユーザからの操作入力を受け付ける入力受付部と、ユーザへのメッセージや処理結果などを表示出力する表示部とが接続されている。

なお、ここに述べた制御部１４の構成は、一般的なコンピュータ装置のものと基本的に同じである。したがって、撮像装置１に備えられる制御部１４は、上記したハードウェアを備えた専用装置であってもよく、またパーソナルコンピュータやワークステーション等の汎用処理装置に、後述する処理機能を実現するための制御プログラムを組み込んだものであってもよい。すなわち、この撮像装置１の制御部１４として、汎用のコンピュータ装置を利用することが可能である。汎用処理装置を用いる場合、撮像装置１には、撮像部１３等の各部を動作させるために必要最小限の制御機能が備わっていれば足りる。

図３は第１および第２の照明光学系から出射される照明光を示す図である。より具体的には、図３（ａ）は第１の照明光学系１００から出射される第１の照明光Ｌ１を示し、図３（ｂ）は第２の照明光学系１１０から出射される第２の照明光Ｌ２を示している。図３（ａ）に示すように、光源１０１を光源とする第１の照明光学系１００においてコンデンサレンズ１０６から出射される第１の照明光Ｌ１は、撮像対象物が分布する試料面であるウェルＷの底面Ｗｂに対し主光線が平行な状態で入射する。すなわち、第１の照明光学系１００は、射出瞳位置が無限遠にあるテレセントリック照明をなす。

一方、図３（ｂ）に示すように、光源１１１を光源とする第２の照明光学系１１０においてコンデンサレンズ１０６から出射される第２の照明光Ｌ２は、第２の照明光学系１１０の光軸に向かう方向に進行し、ウェル底面Ｗｂよりも上方、つまり照明光学系から見て手前側で光軸と交差する。すなわち、第２の照明光Ｌ２の光路において光源１１１（より厳密には開口絞り１１３）の像が結像する射出瞳位置Ｐｐは、第２の照明光学系１１０から見て、撮像対象物が分布する試料面であるウェル底面Ｗｂよりも近い位置にある。

より詳しくは、第２の照明光学系１１０による照明下では、照明光Ｌ２を出射するコンデンサレンズ１０６の出力端と撮像光学系の対物レンズ１３１との間に光源１１１の像が結像する。つまり、この位置に光源１１１に対する共役点がある。そして、この共役点と対物レンズ１３１との間に、撮像対象物が分布する試料面であるウェル底面Ｗｂが位置するように、ホルダ１２はウェルプレートＷＰを保持する。このため、ウェル底面Ｗｂに入射する照明光の主光線は、第２の照明光学系１１０および対物レンズ１３１の光軸から遠ざかる方向の方向成分を有する。第２の照明光学系１１０において、射出瞳位置と、光源１１１の像の位置と、光源１１１に対する共役点の位置とは一致している。

このように、２つの照明光学系１００，１１０では射出瞳位置が互いに異なっており、後述するように、ウェルＷの撮像においてはこれらが必要に応じて使い分けられる。なお、撮像においてはストロボ照明が用いられる。つまり、照明光は撮像部１３による撮像が行われる時に短時間のみ出射される。したがって、光源制御部１４６は、２つの光源１０１，１１１のいずれを点灯させるかを選択することにより照明光の切り替えを実現することができる。以下、これらの照明光学系１００，１１０の使い分けの具体的態様について説明する。

図４はウェル撮像時の様子を示す図である。より具体的には、図４（ａ）はウェル撮像時の光の進路を示す図であり、図４（ｂ）はウェルと撮像視野との関係を示す図である。撮像対象物たる細胞等を担持するウェルＷには、液状で注入された培地Ｍが入っている。したがって、ウェルＷの上方から入射する照明光Ｌは培地Ｍの液面を介して撮像対象物のあるウェル底面Ｗｂ（試料面）に入射する。液面は一般に上に凹のメニスカスを形成しており、これにより照明光Ｌは屈折しウェルＷの中心から外向きに曲げられる。ウェルＷの中心付近では屈折は小さく、ウェルＷの周縁部に近いほど屈折も大きくなる。

対物レンズ１３１を含む撮像光学系は物体側ハイパーセントリック光学系をなしており、このように外向きに曲げられた光を効率よく集光し撮像素子１３６に導く機能を有している。すなわち、レンズの光軸から離れた位置において、斜め外向きに入射する光を撮像素子１３６に結像させることができる。このため、この撮像光学系は、図４（ｂ）に示すように１つのウェルＷ全体を撮像視野Ｖに収めて撮像する場合に好適なものである。この点は特許文献１にも開示されている通りである。

図４（ｂ）に示すように１つのウェルＷ全体を撮像視野Ｖに含めることができるのは、比較的口径の小さなウェルＷを低倍率で撮像する場合である。一方、例えばより口径の大きなウェル（例えば６ウェルプレートにおけるウェル）に担持された撮像対象物を撮像する場合などには、撮像対象とする領域のサイズが撮像視野のサイズに対して相対的に大きくなり、ウェルＷ全体を撮像視野Ｖに含めることができない場合もあり得る。

図５および図６は撮像視野のサイズよりもウェルサイズが大きい場合の撮像の様子を示す図である。より具体的には、図５はウェル周縁部を撮像視野に含まない場合の撮像を示し、図６はウェル周縁部を撮像視野に含む場合の撮像を示す。ここでは、これまで説明してきたよりも口径の大きなウェルＷを低倍率で撮像する場合について説明する。例えばディッシュと呼ばれる大口径の浅型容器に担持された撮像対象物を撮像する場合のように、撮像対象とする領域のサイズが撮像視野Ｖのサイズよりも大きくなる場合については同様の考え方を適用することができる。

撮像すべき領域が撮像視野Ｖよりも広いとき、当該領域を複数の画像に分割して撮像し、それらの画像を画像処理によって合成することで、撮像すべき領域の全体を表す画像を作成することが考えられる。この場合、作成された画像において所期の画像品質を確保するためには、合成前の個々の画像の品質をより良好なものとしておく必要がある。このために留意すべき事項について、次に説明する。

図５に示すように、撮像領域ＶがウェルＷの周縁部Ｗｐから離れた中央部の領域のみを含む場合、培地Ｍ表面のメニスカスが光路に及ぼす影響は十分小さい。このため、テレセントリック照明では、対物レンズ１３１の光軸付近に入射する光は集光されて撮像素子１３６に入射するのに対し、光軸から離れた位置では入射光と光学系との主光線の傾きの違いに起因するミスマッチが生じる。

すなわち、光軸から離れた位置では、対物レンズ１３１側では液面での屈折を前提として、図に点線で示すように主光線が外向きに傾いた光を受光する構成となっているのに対し、ウェルＷを通過した光はメニスカスによる屈折を受けず直進するため、入射光における主光線の傾きと、受光側での主光線の傾きとが一致していない。このことに起因して、特に撮像視野Ｖの周縁部で画質が劣化する、具体的には画像が暗くなったり対物レンズの集光範囲の一部方向からしか照明光が入らないことによる像の見え方の変化が生じたりすることがある。

一方、図６に示すように、撮像領域ＶがウェルＷの周縁部Ｗｐを含むあるいはこれにごく近い領域に設定されたとき、ウェル周縁部Ｗｐの近傍ではメニスカスにより屈折した光の主光線の傾きと受光側の主光線との傾きがほぼ一致し効率よく集光することができる。これに対して、対物レンズ１３１の光軸を挟んでウェル周縁部Ｗｐとは反対側のウェル中央部に近い部分では、図５の場合と同様に、メニスカスによる屈折を想定した主光線の傾きを有する対物レンズ１３１に対して直進した光が入射するため、やはり画質の劣化が生じる。

撮像部１３の物理的な撮像視野Ｖのうち必要な画像品質を確保することのできる領域を実効的な撮像視野と考えると、テレセントリック照明とハイパーセントリック撮像光学系との組み合わせでは、上記のように撮像視野Ｖ内の領域がメニスカスの影響を受けていないとき、実効的な撮像視野はより狭くなってしまうことになる。そこで、この実施形態では、テレセントリック照明をなす第１の照明光学系１００とは別に、メニスカスの影響がない場合に良好な画像品質を得られる第２の照明光学系１１０を設けている。

図７は第２の照明光学系を用いた撮像を示す図である。前記したように、第２の照明光学系１１０においてコンデンサレンズ１０６から出射される照明光Ｌ２は、主光線が光軸方向に向かう傾きを有している。このため、メニスカスの影響がないとき、ウェルＷの底面Ｗｂに入射する照明光の主光線は互いに平行なものとはならない。この実施形態では第２の照明光学系１１０の射出瞳位置Ｐｐが第２の照明光学系１１０から見てウェル底面Ｗｂよりも手前側にあるため、ウェル底面Ｗｂに入射する照明光Ｌ２では、その主光線は対物レンズ１３１の光軸から外へ向かって広がるものとなる。

このときの主光線の傾きが対物レンズ１３１側の主光線の傾きと一致するようにしておけば、図７に示すように、ウェル底面Ｗｂを透過した光は対物レンズ１３１により集光されて、最終的に撮像素子１３６に導かれる。したがって、撮像視野Ｖの全体において良好な画像品質で撮像を行うことができ、物理的な撮像視野Ｖの全体を実効的な撮像視野として利用することが可能となる。

照明光の入射方向を撮像光学系の特性に合わせるという観点では、例えば対物レンズ１３１の入射瞳位置に点光源を配置することによっても原理上は同様の効果を得ることは可能である。しかしながら、点光源を試料面の直上位置に配置する必要性から、光源とウェルプレートＷＰとの干渉や、光源が発する熱により試料を変質させる等の問題が生じるおそれがあり、現実的ではない。

上記実施形態のように、光源１１１から出射される光を複数レンズでリレーする照明光学系により上記照明を構成するようにすれば、レンズ、絞り等を適宜に組み合わせることにより、撮像光学系の特性に応じて最適化された照明光学系を実現することが可能である。例えば、照明光学系１１０における光源１１１の共役点と、対物レンズ１３１の入射瞳位置とが一致するようにすれば、共役点を超えて光軸から離れる方向に進む照明光を対物レンズ１３１で効率よく撮像素子１３６に導くことが可能となる。

このように、この実施形態の撮像装置１では、ハイパーセントリック特性を有する撮像光学系と組み合わせる照明光学系として、メニスカスの影響を受ける領域を撮像するのに適した第１の照明光学系１００と、メニスカスの影響がない領域を撮像するのに適した第２の照明光学系１１０とが装備されている。撮像部１３の撮像視野Ｖよりも広い領域を撮像する必要がある場合には、メニスカスの影響がある領域とない領域とで照明光学系を使い分けながら複数の画像を撮像することで、これらを合成した画像の品質を良好なものとすることが可能となる。

図８は１つのウェルを複数画像に分割する方法を例示する図である。より具体的には、図８（ａ）はウェルＷを複数画像に分割する際の画像の割り付けの例を示し、図８（ｂ）はそのような画像を得るための撮像部１３の走査経路を示す図である。図８（ａ）では、部分的に重なり合うことでウェルＷの全体をカバーする複数画像の各々を実線矩形で示し、複数の矩形を識別しやすくするために、各矩形の対角線を点線で示すとともに、その重心位置を黒丸印で示している。矩形の重心位置は、撮像時に対物レンズ１３１の光軸がウェル底面Ｗｂと交わる位置に相当する。

図８（ａ）に示す割り付け例では、ウェルＷ全体が１１枚の画像に分割される。ウェルＷの中央部では、撮像視野内にウェル周縁部Ｗｐを含まないように画像の配置が設定される。このようにウェル周縁部Ｗｐを含まない画像は、第２の照明光学系１１０を用いて撮像されるべきである。一方、撮像視野内にウェル周縁部Ｗｐを含んで撮像される画像では、少なくとも画像の重心がウェルＷの内部に位置するように画像が配置される。そして、撮像は第１の照明光学系１００を用いて行われるべきである。こうすることで、重心位置よりも外側（ウェル周縁部Ｗｐに近い側）で照明側と受光側との間での主光線の傾きの差を小さくすることができ、画質劣化を抑えることができる。

図８（ｂ）は、ウェルＷを複数の画像に分割して撮像する際の撮像部１３の移動経路の例を示している。この実施形態の撮像装置１では、ホルダ１１に載置されたウェルプレートＷＰに対し、撮像部１３と照明部１０とが一体的に水平移動する。ウェルプレートＷＰの底面に沿って撮像部１３をＸ方向およびＹ方向に移動させながら、適宜の位置で撮像を行うことにより、図８（ａ）に示す複数画像を取得することができる。図８（ｂ）はこのときの撮像部１３の走査移動経路、より正確には撮像部１３に設けられた対物レンズ１３１の光軸とウェル底面Ｗｂとの交点の軌跡を示している。

黒丸印で示される点Ｐ１〜Ｐ１１は、それぞれ図８（ａ）に示す複数画像の重心位置に対応している。また、各画像の重心位置は当該画像が撮像される際の対物レンズ１３１の光軸の位置でもあるから、対物レンズ１３１の光軸がこれらの点Ｐ１〜Ｐ１１を順に通過するように撮像部１３（および照明部１０）の走査移動レシピを作成し、対物レンズ１３１の光軸位置がこれらの点Ｐ１〜Ｐ１１に到達した時に撮像部１３による撮像を行うようにすれば、一連の走査移動により必要な画像を取得することができる。この意味から、点Ｐ１〜Ｐ１１に対応する撮像部１３の位置を「撮像位置」と称する。画像の割り付けが決まれば、それに応じて撮像位置を設定することができる。また、撮像部１３の走査移動における対物レンズ１３１の光軸位置の始点を符号Ｐｓ、終点を符号Ｐｅにより表す。

図９はこの実施形態における撮像処理を示すフローチャートである。ＣＰＵ１４１が予め作成された制御プログラムに基づいて装置各部に所定の動作を行わせ、図９に示す撮像処理を実行することにより、例えば図８（ａ）に示す複数の画像が取得される。最初に、メカ制御部１４５からの制御指令に応じて作動する駆動機構１５により、撮像部１３が所定のスタート位置に位置決めされる（ステップＳ１０１）。図８（ｂ）に示す始点Ｐｓは、このときの対物レンズ１３１の光軸位置に対応する。なお、ここでは撮像部１３の走査移動についてのみ説明するが、前記した通り、照明光の光中心と対物レンズ１３１の光軸とが常に一致するように、撮像部１３の移動に伴って照明部１０も移動する。

続いて、予め設定された走査移動レシピに基づき、ウェルＷに対する撮像部１３の走査移動が開始される（ステップＳ１０２）。撮像部１３が終点Ｐｓに対応する終了位置に到達すれば、処理は終了する（ステップＳ１０３）。終了位置に到達するまでの間は、撮像部１３が点Ｐ１〜Ｐ１１に対応する撮像位置のいずれかに到達する度に（ステップＳ１０４）、ステップＳ１０５〜Ｓ１０７が実行されて撮像が行われる。撮像部１３がどの位置にあるかについては、例えば撮像部１３に装着されたポジションセンサ（図示せず）からの出力信号に基づき検出することができる。

すなわち、現在撮像部１３が位置する撮像位置に応じて照明光学系が選択される（ステップＳ１０５）。具体的には、現在の撮像部１３の位置において撮像視野Ｖにウェル周縁部Ｗｐが含まれる場合には第１の照明光学系１００が、含まれない場合には第２の照明光学系１１０が選択される。図８に示す例では、点Ｐ５〜Ｐ７に対応する撮像位置では第２の照明光学系１１０が、それ以外の点Ｐ１〜Ｐ４、Ｐ８〜Ｐ１１に対応する撮像位置では第１の照明光学系１００が選択される。

続いて、選択された照明光学系の光源が所定時間点灯されることで撮像対象物がストロボ照明され、これと同期して撮像素子１３６が撮像を行うことで、１枚の画像が取得される（ステップＳ１０６）。撮像素子１３６から出力される画像信号をＡＤコンバータ１４４によりデジタル化して得られた画像データは画像メモリ１４７に記憶される（ステップＳ１０７）。撮像部１３が終了位置に到達するまで上記処理が繰り返されることで、点Ｐ１〜Ｐ１１の各々に対応する撮像位置での撮像が行われ、１１枚の画像が取得される。

ストロボ照明下で撮像が行われるため、撮像のために撮像部１３の走査移動を一時的に停止させる必要はなく、駆動機構１５は走査移動レシピにしたがい一定速度で撮像部１３を走査移動させればよい。各点Ｐ１〜Ｐ１１を結ぶ経路の長さが最小となるように走査移動レシピを最適化することで、撮像に要する時間を短縮することができる。

こうして得られた複数の画像のうち、ウェル周縁部Ｗｐを含むものは第１の照明光学系１００による照明下で、またウェル周縁部Ｗｐを含まないものは第２の照明光学系１１０による照明下で撮像されている。このため、それぞれの画像において、メニスカスの有無と照明光学系とのミスマッチに起因する画像品質の低下が抑えられる。そして、各画像から画像品質の良好な部分を抽出して合成することで、ウェルＷ全体の画像を良好な品質で作成することができる。複数の画像が重複する領域では、当該領域がウェルＷに対して占める位置と使用された照明光学系とに鑑みてより画像品質が優れている方の画像を採用するようにすればよい。

以上のように、この実施形態では、撮像部１３の撮像視野Ｖ内にメニスカスの影響が現れている場合、およびメニスカスの影響がない場合のそれぞれに対応する２つの照明光学系１００，１１０を設け、撮像位置に応じてそれらを切り替えながら撮像を行う。こうすることにより、撮像対象となる領域のうち、メニスカスの影響がある領域、ない領域のいずれにおいても、画像品質の良好な画像を取得することが可能である。

以上説明したように、この実施形態の撮像装置１においては、照明部１０が本発明の「照明手段」として、ホルダ１２が本発明の「保持手段」として、制御部１４が本発明の「制御手段」として、駆動機構１５が本発明の「移動手段」としてそれぞれ機能している。また、反射ミラー１０２、コレクタレンズ１０３、ビームスプリッター１０４、反射ミラー１０５およびコンデンサレンズ１０６が一体として本発明の「照明光学系」の１つとして機能している。また、コレクタレンズ１１１２、ビームスプリッター１０４、反射ミラー１０５およびコンデンサレンズ１０６が一体として本発明の「照明光学系」の他の１つとして機能している。

また、対物レンズ１３１、低倍率用アフォーカル系１３２、高倍率用アフォーカル系１３３、反射ミラー１３４、結像レンズ１３５が一体として本発明の「撮像光学系」として機能し、撮像素子１３６が本発明の「二次元撮像素子」として機能している。また、上記実施形態では、ウェルプレートＷＰが本発明の「試料容器」に相当している。

なお、本発明は上記した実施形態に限定されるものではなく、その趣旨を逸脱しない限りにおいて上述したもの以外に種々の変更を行うことが可能である。例えば、上記実施形態の照明部１０は、テレセントリック照明をなし射出瞳位置が無限遠である第１の照明光学系１００と、射出瞳位置Ｐｐがウェル底面Ｗｂよりも手前側にある第２の照明光学系１１０との２組の照明光学系を備えている。しかしながら、照明光学系における射出瞳位置はこれらに限定されず、射出瞳位置の異なる２組以上の照明光学系が設けられればよい。射出瞳位置の差が大きいほど効果は顕著である。また３組以上の照明光学系を備えていてもよい。例えば、高倍率撮像のために、より照射範囲が限定された照明光学系がさらに備えられてもよい。

また、上記実施形態では２組の照明光学系１００，１１０に対応して２つの光源１０１，１１１が設けられているが、単一の光源と２組の光学系とにより２組の照明光学系が構成されてもよい。また、上記実施形態では２つの照明光学系を構成する部材が一部共通となっているが、完全に独立した２組の照明光学系が設けられてもよい。

また、上記した撮像処理における画像の割り付けは単に説明のためのものであり、実際の配置はこれに限定されるものではない。また、上記の割り付け例では１つのウェルのみを撮像する場合を説明しているが、複数のウェルを一連の走査移動で一括して撮像できるように、走査移動レシピが構成されてもよい。

以上、具体的な実施形態を例示して説明してきたように、本発明において、照明光学系の１つは、撮像対象物に対し、主光線が撮像光学系の光軸に平行となる光を入射させるテレセントリック照明をなすものであってもよい。このような照明光学系では、液体表面での屈折により外向きに曲げられることにより、主光線の傾きがハイパーセントリック特性を有する撮像光学系の主光線の傾きに近づくことになるため、撮像視野内にメニスカスの影響が現れている場合に良好な画像品質を得ることができる。

この場合さらに、複数の照明光学系は、射出瞳位置が当該照明光学系から見て撮像対象物よりも近い側にあるものを含んでもよい。このような照明光学系では、メニスカスの影響を受けない場合に、ハイパーセントリック特性を有する撮像光学系の主光線の傾きと同等の傾きを有する照明光を撮像対象物に入射させることができる。

また例えば、複数の照明光学系からの出射光が撮像光学系の光軸と同軸であってもよい。出射光が撮像光学系の光軸と同軸となるようにすれば、光軸上およびその周囲の各位置で、照明光学系と撮像光学系との間で主光線の傾きを合わせやすくすることができる。

また例えば、試料容器の底面における撮像視野が、試料容器の底面よりも小さいものであってもよい。撮像視野が試料容器の底面より小さく、試料容器の底面全体を撮像視野に収めることができない場合でも、複数の画像に分割することで試料容器内の全体を撮像することが可能である。この場合、撮像位置によってメニスカスの影響が現れる場合とそうでない場合とがあり得る。本発明では、複数の照明光学系を切り替えて使用することでメニスカスの影響がある場合、ない場合のいずれにおいても画質の良好な画像を取得することができる。このため、このように撮像すべき領域を複数画像に分割して撮像する場合に、特に顕著な効果を奏するものである。

また例えば、保持手段は、試料容器を略水平姿勢に保持し、照明手段は保持手段に保持される試料容器の上方に配置されて、撮像対象物を上方から照明し、二次元撮像素子は、保持手段に保持される試料容器の下方に配置されて、液体の液面を介して照明手段から入射し試料容器の底面から出射される光を撮像光学系に入射させて撮像を行う構成であってもよい。このような構成によれば、略水平な液面に対して鉛直方向の光軸を設定することができ、装置各部の支持や位置合わせが行いやすくなる。

この発明は、細胞、細胞コロニー、スフェロイド、細菌、病変組織、微生物等、各種の生試料を撮像する撮像装置に好適に適用することができる。

１ 撮像装置
１０ 照明部（照明手段）
１２ ホルダ（保持手段）
１３ 撮像部
１４ 制御部（制御手段）
１５ 駆動機構（移動手段）
１０１，１１１ 光源
１０２，１０５ 反射ミラー（照明光学系）
１０３，１１２ コレクタレンズ（照明光学系）
１０４ ビームスプリッター（照明光学系）
１０６ コンデンサレンズ（照明光学系）
１３１ 対物レンズ（撮像光学系）
１３２ 低倍率用アフォーカル系（撮像光学系）
１３３ 高倍率用アフォーカル系（撮像光学系）
１３４ 反射ミラー（撮像光学系）
１３５ 結像レンズ（撮像光学系）
１３６ 撮像素子（二次元撮像素子）
Ｗ ウェル
ＷＰ ウェルプレート（試料容器）

Claims (5)

1. 底面が光透過性を有する試料容器に液体と共に担持された生試料を撮像対象物として撮像する撮像装置において、
   前記試料容器を保持する保持手段と、
   前記保持手段により保持される前記試料容器に対向配置され、物体側ハイパーセントリック特性を有する撮像光学系と、
   前記撮像光学系により結像される前記撮像対象物の像を撮像する二次元撮像素子と、
   前記撮像光学系と前記二次元撮像素子とを一体的に、前記撮像対象物に対し前記撮像光学系の光軸と直交する方向に相対移動させる移動手段と、
   前記保持手段に保持される前記試料容器を挟んで前記撮像光学系とは反対側から、前記撮像対象物を照明する照明手段と、
   前記二次元撮像素子、前記移動手段および前記照明手段を制御する制御手段と
   を備え、
   前記照明手段は、射出瞳位置が互いに異なり、前記撮像対象物に向かう出射光が互いに同軸である複数の照明光学系を有し、
   前記照明光学系の１つは、前記撮像対象物に対し、主光線が前記撮像光学系の光軸に平行となる光を入射させるテレセントリック照明をなし、
   前記複数の照明光学系は、前記射出瞳位置が当該照明光学系から見て前記撮像対象物よりも近い側にあるものを含み、
   前記制御手段は、
   前記移動手段により前記撮像光学系および前記二次元撮像素子を前記撮像対象物に対し相対移動させながら、前記撮像対象物に対する前記撮像光学系の相対位置が予め定められた複数の撮像位置のいずれかとなった時に、前記複数の照明光学系の１つから光を出射させるとともに前記二次元撮像素子により前記撮像対象物を撮像させ、
   前記光を出射させる前記照明光学系を、前記撮像位置に応じて切り替える撮像装置。
2. 前記複数の照明光学系からの出射光が前記撮像光学系の光軸と同軸である請求項１に記載の撮像装置。
3. 前記試料容器の底面における撮像視野が、前記試料容器の底面よりも小さい請求項１または２に記載の撮像装置。
4. 前記保持手段は、前記試料容器を略水平姿勢に保持し、
   前記照明手段は、前記保持手段に保持される前記試料容器の上方に配置されて、前記撮像対象物を上方から照明し、
   前記二次元撮像素子は、前記保持手段に保持される前記試料容器の下方に配置されて、前記液体の液面を介して前記照明手段から入射し前記試料容器の底面から出射される光を前記撮像光学系に入射させて撮像を行う請求項１ないし３のいずれかに記載の撮像装置。
5. 底面が光透過性を有する試料容器に液体と共に担持された生物試料を撮像対象物として撮像する撮像方法において、
   前記試料容器に対向させて、物体側ハイパーセントリック特性を有する撮像光学系および前記撮像光学系により結像される前記撮像対象物の像を撮像する二次元撮像素子を配置し、前記試料容器を挟んで前記撮像光学系とは反対側に前記撮像対象物を照明する照明手段を配置する配置工程と、
   前記撮像光学系および前記二次元撮像素子を前記撮像対象物に対し相対移動させながら、前記撮像対象物に対する前記撮像光学系の相対位置が予め定められた複数の撮像位置のいずれかとなった時に、前記照明手段から光を出射させるとともに前記二次元撮像素子により前記撮像対象物を撮像させる撮像工程と
   を備え、
   前記照明手段は、射出瞳位置が互いに異なり、前記撮像対象物に向かう出射光が互いに同軸である複数の照明光学系を有し、
   前記照明光学系の１つは、前記撮像対象物に対し、主光線が前記撮像光学系の光軸に平行となる光を入射させるテレセントリック照明をなし、
   前記複数の照明光学系は、前記射出瞳位置が当該照明光学系から見て前記撮像対象物よりも近い側にあるものを含み、
   前記撮像工程では、前記複数の照明光学系の１つから選択的に光を出射させ、しかも、前記光を出射させる前記照明光学系を、前記撮像位置に応じて切り替える撮像方法。

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