JP2011013483A

JP2011013483A - コンフォーカル顕微鏡

Info

Publication number: JP2011013483A
Application number: JP2009157921A
Authority: JP
Inventors: Atsushi Takeuchi; 淳竹内
Original assignee: Nikon Corp
Current assignee: Nikon Corp
Priority date: 2009-07-02
Filing date: 2009-07-02
Publication date: 2011-01-20

Abstract

【課題】検出感度の良いコンフォーカル顕微鏡を提供できるようにする。
【解決手段】光偏向素子１６は、試料Ｓと共役な位置であって、照明光学系と結像光学系の両方の光路上に配置され、その面上に２次元に配列された複数の微小ミラーの各々を個別に偏向制御して、それらの微小ミラーを順次駆動することにより、照明光学系の一部として試料Ｓ上の所望の箇所に光を導くとともに、結像光学系の一部としてその戻り光を検出器２４に導き、光減光部材１８は、複数の微小ミラーにより偏向された試料Ｓの走査に不要な光を減光する。このようにして、試料Ｓの走査が行われるので、不要な光が迷光となるのを防止し、観察対象からの光を感度良く検出することができる。本発明は、例えば、コンフォーカル顕微鏡に適用できる。
【選択図】図１

Description

本発明は、コンフォーカル顕微鏡に関する。

コンフォーカル顕微鏡は、その光学原理から焦点面近傍の限られた厚さの面情報のみを取得できる顕微鏡である。この原理を利用して、焦点面をＺ方向にずらしながら、各断面の画像データを取得することにより、観察対象となる試料の３次元画像データを取得することが可能となる。

この種のコンフォーカル顕微鏡としては、例えば、特許文献１に記載のものが知られている。

特表２００１−５２１２０５号公報

しかしながら、特許文献１に開示されているような、デジタルミラーデバイス（DMD：Digital Micromirror Device）などの光偏向素子を用いて、不要な領域の光束を照明光路から除外する光学系では、除外された光が迷光となり、観察対象からの光を感度良く検出できなくなってしまう。

本発明はこのような状況に鑑みてなされたものであり、検出感度の良いコンフォーカル顕微鏡を提供できるようにするものである。

本発明のコンフォーカル顕微鏡は、光源からの光を試料に照射するための照明光学系と、前記試料からの光を対物レンズにより集光して結像するための結像光学系と、前記試料と共役な位置であって、前記照明光学系と前記結像光学系の光路上に配置され、選択的に偏向制御可能な複数の微小ミラーを有した光偏向素子と、前記光源からの光を選択的に前記試料上の所望の箇所に導くように、前記微小ミラーを順次選択し、選択された前記微小ミラーの角度を変更するように前記光偏向素子の偏向制御を行う制御手段と、前記複数の微小ミラーにより偏向された前記試料の照明に不要な光を減光する光減光部材とを備える。

本発明によれば、検出感度の良いコンフォーカル顕微鏡を提供できる。

本発明を適用したコンフォーカル顕微鏡の一実施の形態を示す図である。光偏向素子の有する微小ミラーの動作を説明する図である。光偏向素子の有する微小ミラーによる走査の様子を示す図である。

以下、図面を参照しながら本発明の実施の形態について説明する。

図１は、本発明を適用したコンフォーカル顕微鏡の一実施の形態を示す図である。

なお、図１は、コンフォーカル顕微鏡１を側面から見た外観図を示しているが、その内部に配置される光学系の構成が分かるように一部を断面で表しており、その断面により示される部材には斜線が施されている。

図１に示すように、コンフォーカル顕微鏡１は、光源１１、コレクタレンズ１２、ハーフミラー１３、リレーレンズ１４、全反射ミラー１５、光偏向素子１６、フィールドレンズ１７、光減光部材１８、全反射ミラー１９、レボルバ２０、対物レンズ２１、ステージ２２、集光レンズ２３、検出器２４、及び制御部４０を含むようにして構成される。

光源１１は、例えば、ハロゲンランプ、水銀ランプ、又はLED（Light Emitting Diode）などから構成される。光源１１から出射された光束は、照明光学系に入射する。照明光学系は、コレクタレンズ１２、ハーフミラー１３、リレーレンズ１４、全反射ミラー１５、光偏向素子１６、フィールドレンズ１７、光減光部材１８、全反射ミラー１９、及び対物レンズ２１から構成されている。照明光学系に入射した光束は、コレクタレンズ１２により集光され、ハーフミラー１３に導かれる。

ハーフミラー１３に到達した光束は、図中左方向に偏向され、リレーレンズ１４を通過し、全反射ミラー１５によって、図中右上方向に偏向され、光偏向素子１６に到達する。

光偏向素子１６は、後述するステージ２２に載置された試料Ｓ（試料面）と共役な位置関係を有しており、視野絞りの配置位置に相当する位置に配置される。光偏向素子１６は、制御部４０からの制御にしたがって領域毎に選択的に偏向制御が可能な複数の微小な光偏向ミラー（以下、微小ミラーという）を有し、それらの微小ミラーにより、１方向から入射した光を領域毎に様々な方向に偏向することが可能である。この光偏向素子１６としては、例えば、微小なマイクロミラーが２次元に配列されたピクセル構造のユニットであるDMD（Digital Micromirror Device）が用いられる。

このDMDなどの光偏向素子１６では、図２に示すように、各微小ミラーを保持する保持部に印加する電圧のオン／オフ制御によって、２次元に配列された微小ミラー３１の各々の向きを、２方向に角度制御することが可能である。具体的には、ｉ×ｊ（ｉ，ｊ：自然数）の２次元に配列された複数の微小ミラー３１_i,jのうちの、微小ミラー３１_m,n（１≦ｍ≦ｉ，１≦ｎ≦ｊ）と、微小ミラー３１_p,q（１≦ｐ≦ｉ，１≦ｑ≦ｊ）を代表して説明すれば、全反射ミラー１５により反射された図中左下方向からの光は、微小ミラー３１_m,nと微小ミラー３１_p,qのそれぞれに入射する。このとき、微小ミラー３１_p,qはオン状態となっているので、入射してくる光を、図中左方向のフィールドレンズ１７側に偏向する。一方、微小ミラー３１_m,nはオフ状態となっているので、入射してくる光を、図中左上方向の光減光部材１８側に偏向する。すなわち、微小ミラー３１_i,jのオン／オフの電圧制御を行うことにより、微小ミラー３１_i,jの各々によって、１方向から入射してくる光を、図中左方向のフィールドレンズ１７と、図中左上方向の光減光部材１８との２方向に導くことが可能となる。

すなわち、光偏向素子１６は試料Ｓ（試料面）と共役な位置に配置されているので、光偏向素子１６に到達した光を、試料Ｓ上の所望の箇所に導くためには、その試料Ｓ上の箇所に対応する領域に配列された微小ミラー３１_i,jをオン状態にして、入射した光をフィールドレンズ１７側に導く必要がある。そこで、本実施の形態では、光偏向素子１６を制御部４０で制御することにより、光偏向素子１６の微小ミラー３１_i,jの各々を個別に電圧制御して、試料Ｓ上の所望の箇所に光（照明光）を導くようにしている。

また、光偏向素子１６により光減光部材１８側に偏向された光は、像に寄与しない不要な光となるため、光減光部材１８により減光される。この光減光部材１８としては、例えば、減光（ＮＤ：Neutral Density）フィルタや植毛紙などの光を吸収するものが用いられる。このような光減光部材１８を配設することにより、不要な光が迷光となって観察に影響することを防止している。なお、光減光部材１８を配置する代わりに、その領域を黒色で塗装することでも同様の効果を得られるが、光減光部材１８を配するほうがよりコントラストの良い像を得ることができる。

フィールドレンズ１７を通過した光は、全反射ミラー１９により図中下方向に偏向され、レボルバ２０に保持された対物レンズ２１へと入射し、ステージ２２上に載置された試料Ｓのうち、光偏向素子１６の微小ミラーがオン状態となっている箇所のみを照明する。この全反射ミラー１９を備えることで、照明光学系の殆どの部材を水平方向に配置することができ、本コンフォーカル顕微鏡の高さを抑制することができる。また、光偏向素子１６と全反射ミラー１５とで照明光路の一部を折り返している。そのため、水平方向への寸法も抑制することができる。

ステージ２２には、駆動装置（不図示）が接続されており、対物レンズ２１とステージ２２とをＺ方向に相対移動させる。また、ステージ２２自体は、ＸＹ方向に自由に移動可能に構成されており、検鏡者は試料Ｓの所望の部位を観察可能である。さらに、レボルバ２０は、手動又は電動により回転可能に構成されており、レボルバ２０に取り付けられた複数の対物レンズ２１の中から、所望の対物レンズ２１を選択的に使用することが可能である。

ここで、図３を参照して、制御部４０により行われる、光偏向素子１６の微小ミラー３１_i,jの制御について説明する。図３は、光偏向素子１６の微小ミラー３１_i,jの２次元の配列を簡素化して表したものであって、格子状のマス目のそれぞれが微小ミラー３１_i,jを表している。本実施の形態では、説明を簡略化するために、２次元の配列の例として、７×９個の微小ミラー３１_i,jが配列されている場合を説明する。

上述したように、光偏向素子１６と、ステージ２２に載置された試料Ｓ（試料面）とは、共役の関係になっているため、光偏向素子１６の有する複数の微小ミラー３１_i,jのうち、オン状態とされた微小ミラー３１_i,jに対応する試料面のみが照明される。図３ａは、光偏向素子１６の微小ミラー３１_i,jのうち、最上段の左から１番目の微小ミラー３１_1,1のみをオン状態としたときを表しており、この場合、同時に試料Ｓの対応する箇所のみが照明されることを意味する。図３ａと同様にして、図３ｂは微小ミラー３１_1,2のみがオン状態、図３ｃは微小ミラー３１_1,3のみがオン状態となったときの様子を表している。これらの図３ｂ，図３ｃの場合についても、図３ａと同様に、試料Ｓの対応する箇所のみが同時に照明されていることになる。制御部４０では、光偏向素子１６の微小ミラー３１_i,jのうち、オン状態となる微小ミラー３１を、図３ａに示した状態から、図３ｂ，図３ｃ，・・・，図３ｄと逐次遷移させゆく。このようにして、試料Ｓが照射される領域を走査してゆく。

制御部４０では、最上段の微小ミラー３１_1,4ないし３１_1,9までを同様に順次オン状態とし、さらに、２段目以降についても同様に、微小ミラー３１_2,1ないし３１_2,9，・・・，微小ミラー３１_7,1ないし３１_7,9を順次オン状態とすることにより、最終的に、最下段（７段目）の左から９番目の微小ミラー３１_7,9がオン状態となる。

すなわち、図３ａ，図３ｂ，図３ｃ，・・・，図３ｄに示したように、光偏向素子１６の微小ミラー３１_i,jを１つずつ順次駆動させて、試料Ｓの全範囲を走査することにより、試料Ｓの観察部位をくまなく走査することが可能となる。

なお、図３に示したように、１つの微小ミラー３１_i,j（１個のピクセル）を１つずつ順次駆動させて走査するだけでなく、例えば隣接する複数の微小ミラー３１_i,j（複数個のピクセル）のまとまりを１つの単位にして、その複数個のピクセルごとに微小ミラー３１_i,jを順次駆動させて走査するようにしてもよい。

以上のようにして、コンフォーカル顕微鏡１の照明光学系は構成される。

次に、コンフォーカル顕微鏡１の結像光学系について説明する。コンフォーカル顕微鏡１の結像光学系は、対物レンズ２１、全反射ミラー１９、フィールドレンズ１７、光偏向素子１６、全反射ミラー１５、リレーレンズ１４、集光レンズ２３、及び検出器２４から構成されている。ある領域だけ照明された試料Ｓからの光は、対物レンズ２１により集光された後、全反射ミラー１９によって、図中右方向に偏向され、フィールドレンズ１７を通過して、光偏向素子１６へと導かれる。このとき、対物レンズ２１とフィールドレンズ１７により、試料Ｓの像が光偏向素子１６に結ばれる。当然のことながら照明光を導いた微小ミラー３１_i,jに対し、試料Ｓの照明領域の像が形成されるので、オン状態となっている微小ミラー３１_i,jは、その像の光を全反射ミラー１５へと偏向する。例えば、図３ａに示した、微小ミラー３１_1,1は、オン状態にあるとき、照明光は試料Ｓの対応する箇所を照射するが、その照明領域の像の光も同じ光路をたどるように反射することになる。

そして、全反射ミラー１５によって図中右方向に反射された光は、リレーレンズ１４を通過してハーフミラー１３に到達し、このハーフミラー１３を通過した光が集光レンズ２３によって検出器２４に結像に到達する。このとき、リレーレンズ１４と集光レンズ２３によって、光偏向素子１６に結んだ試料Ｓの照明領域の光束が検出器２４に集光される。

このように、本発明は、照明光学系と結像光学系とを対物レンズ２１から光偏向素子１６まで共通に利用しているため、選択された試料Ｓへの照明位置と、選択された試料Ｓの観察位置とを同じ光偏向素子１６により選択できる。したがって、結像光学系と照明光学系とで、それぞれ別に照明位置選択用の光偏向素子と、観察位置選択用の光偏向素子とを備えているものよりも、それぞれの光偏向素子の微小ミラーの対応位置を調整することを不要とし、容易に光偏向素子で照明位置と観察位置を同期することができるコンフォーカル顕微鏡を製造することが可能となる。

検出器２４は、例えば、PMT（Photomultiplier：光電子増倍管）等のような光の強度を検出する機器である。検出器２４は、集光レンズ２３により集光された光の強度を検出して出力する。この出力された検出信号は、制御部４０に出力される。制御部４０は、光偏向素子１６の微小ミラーのうち、オン状態となっている微小ミラー３１の位置情報と、先の検出器２４からの検出信号値とを対応付けて、不図示の記憶部に記憶する。これを順次、オン状態となっている微小ミラー３１を変更しながら、そのときの検出器２４からの検出信号値を取得することで、試料Ｓの観察領域全ての検出信号を取得する。これにより、位置と光強度を示す信号が得られるので、それらの信号に対して、不図示のCPU（Central Processing Unit）等によって所定の画像処理を施すことにより、試料Ｓの２次元画像が得られ、不図示のモニタ等に表示される。さらに、焦点面をＺ方向にずらしながら、各焦点面の２次元画像を構築することで、高精細な３次元画像を取得することが可能となる。これにより、検鏡者は試料Ｓの所望の部位を観察することが可能である。

以上のようにして、コンフォーカル顕微鏡１の結像光学系は構成される。

すなわち、コンフォーカル顕微鏡１では、光源１１からの照明光を、試料Ｓに導光する照明光学系と、その照明光により照明された試料Ｓの像面を、検鏡側、すなわち、検出器２４側に導光する結像光学系とが設けられているが、それらの照明光学系と結像光学系の両方の光路上に光偏向素子１６が配置され、この光偏向素子１６の微小ミラー３１_i,jの偏向制御を行うことによって、試料Ｓの２次元走査を行っている。その際、試料Ｓの照明に不要な光は、光偏向素子１６により光減光部材１８側に偏向され、減光される。

以上のように、本発明によれば、光偏向素子１６の微小ミラー３１_i,jの偏向制御により２次元走査するに際し、光減光部材１８により不要な光を減光するので、不要な光が迷光となるのを防止し、観察対象からの光を感度良く検出することが可能となる。これにより、検出感度の良いコンフォーカル顕微鏡を提供することが可能となる。

また、本発明では、光偏向素子１６の微小ミラー３１_i,jの偏向制御により２次元走査を行っているので、ガルバノミラーなどの走査ミラーを使用する場合と比して、走査機構の部品点数を少なくすることができ、その構成を簡略化することができる。また、部品点数を減らすことができるので、故障の確率を低くして、製品の信頼性を向上させることができる。さらに、ガルバノミラーなどの走査ミラーを使用する場合と比して、製造コストを抑えることができる。

また、本発明によれば、微小ミラー３１_i,jがピンホールの役割を果たしているため、焦点深度の極めて浅いコンフォーカル像を取得できる。

なお、本実施の形態においては、便宜的に、光源１１は顕微鏡内に内蔵されている構成で説明したが、通常は、光源１１による熱の影響などを考慮し、ランプハウス内に配置され、コンフォーカル顕微鏡１に対して着脱可能となっていることが多い。また、本実施の形態では、照明方式として、落射照明を採用した場合を例に説明したが、本発明は、試料Ｓの背後から照明光を照射する透過照明にも適用できる。

また、本実施の形態においては、検出器２４は、PMTであるとして説明したが、光の強度さえ検出できればよいのでPMTに限らず、CCD（Charge Coupled Device）等により構成してもよい。さらに、検出器２４の前方に、集光レンズ２３を配置するとして説明したが、検出器２４側では戻り光の強度のみを検出できればよいので、必ずしも必要はない。

さらに、本実施の形態では、照明光学系と結像光学系の両方の光路上に１つの光偏向素子１６が配置される構成について説明したが、勿論、照明光学系と結像光学系のそれぞれに別々の光偏向素子を配置することも可能である。この場合、それらの光偏向素子の光学系に寄与する微小ミラーの選択は対応関係を持っていることになる。その際には、照明光学系の光偏向素子と、結像光学系の光偏向素子とは、各々対応関係を持っている微小ミラーが光学的に一致した位置に配置されていて、かつ微小ミラーを変位させるときは、同期して変位するように制御すればよい。

また、本実施の形態では、光を全反射する光偏向素子１６の代わりに、例えば、ある状態では光を反射させ、ある状態では光を透過させる液晶素子などの、２次元的に光を所望の方向に反射させる分布を変えられる素子を用いることもできる。ただし、光を全反射するタイプのほうが、光の減衰を少なくすることができるので、本実施の形態の光偏向素子１６のような全反射タイプを用いるのが好適である。

なお、本発明の実施の形態は、上述した実施の形態に限定されるものではなく、本発明の要旨を逸脱しない範囲において種々の変更が可能である。

１コンフォーカル顕微鏡，１１光源，１２コレクタレンズ，１３ハーフミラー，１４リレーレンズ，１５，１９全反射ミラー，１６光偏向素子，１７フィールドレンズ，１８光減光部材，２０レボルバ，２１対物レンズ，２２ステージ，２３集光レンズ，２４検出器，３１微小ミラー，４０制御部，Ｓ試料

Claims

光源からの光を試料に照射するための照明光学系と、
前記試料からの光を対物レンズにより集光して結像するための結像光学系と、
前記試料と共役な位置であって、前記照明光学系と前記結像光学系の光路上に配置され、選択的に偏向制御可能な複数の微小ミラーを有した光偏向素子と、
前記光源からの光を選択的に前記試料上の所望の箇所に導くように、前記微小ミラーを順次選択し、選択された前記微小ミラーの角度を変更するように前記光偏向素子の偏向制御を行う制御手段と、
前記複数の微小ミラーにより偏向された前記試料の照明に不要な光を減光する光減光部材と
を備えることを特徴とするコンフォーカル顕微鏡。
前記照明光学系は、前記光源からの光で前記試料に落射照明するものであり、
前記光源と前記光偏向素子との間の光路上に配置され、前記照明光学系と前記結像光学系とを分離するための第１の光学素子をさらに備える
ことを特徴とする請求項１に記載のコンフォーカル顕微鏡。
前記照明光学系と前記結像光学系の光路上に配置される第２の光学素子をさらに備え、
前記光偏向素子及び前記第２の光学素子は、前記照明光学系と前記結像光学系の光路の一部を折り返す
ことを特徴とする請求項１又は２に記載のコンフォーカル顕微鏡。