JP2008203813A - 走査型顕微鏡 - Google Patents
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Abstract
【課題】光変調素子を共焦点ピンホールとして利用することにより試料の鮮明な共焦点画像を得ることができ、かつ、そのような鮮明な共焦点画像をリアルタイムに2次元的な画像を構築する。
【解決手段】光源1と、2次元配列された複数の微小光変調要素29を備え、オン状態に作動される該微小光変調要素29を一方向に切り替える微小光変調要素アレイ7と、微小光変調要素アレイ7を通過した照明光を集光して試料19に照射する一方、試料19からの光を集光する対物レンズ11と、2次元配列された複数の画素を有し、試料19からの光を検出する光検出器17と、微小光変調要素アレイ7と対物レンズ11との間に配置され、照明光を微小光変調要素29の切替方向と直交する方向に走査する第1のスキャン手段9と、光検出器17と微小光変調要素アレイ7との間に配置され、対物レンズ11により集光され、第1のスキャン手段と同じ方向に走査する第2のスキャン手段53とを備える走査型顕微鏡10Dを提供する。
【選択図】 図14
【解決手段】光源1と、2次元配列された複数の微小光変調要素29を備え、オン状態に作動される該微小光変調要素29を一方向に切り替える微小光変調要素アレイ7と、微小光変調要素アレイ7を通過した照明光を集光して試料19に照射する一方、試料19からの光を集光する対物レンズ11と、2次元配列された複数の画素を有し、試料19からの光を検出する光検出器17と、微小光変調要素アレイ7と対物レンズ11との間に配置され、照明光を微小光変調要素29の切替方向と直交する方向に走査する第1のスキャン手段9と、光検出器17と微小光変調要素アレイ7との間に配置され、対物レンズ11により集光され、第1のスキャン手段と同じ方向に走査する第2のスキャン手段53とを備える走査型顕微鏡10Dを提供する。
【選択図】 図14
Description
本発明は、走査型顕微鏡に関するものである。
一般に、試料を高速で走査および画像化する技術として、走査型顕微鏡や共焦点顕微鏡が知られている(特許文献1参照)。特許文献1による共焦点顕微鏡では、光源からの光が直線的に集束されてDMDまたは液晶などの光変調部材上に入射される。次に光変調部材により直線光がその光線の方向に沿って所定の明暗を有する光に変調されるのに伴い、光が試料体に照射される。そして、試料体から発生された光(反射光および蛍光等)は、この光変調部材へと戻され、その後、照明光路から分離され、ラインセンサによって検出されるようになっている。すなわち、DMDや液晶等の光変調部材を共焦点ピンホールとして利用して試料体の鮮明な共焦点画像を得ることができる。
しかしながら、上記特許文献1に開示されている技術によれば、ラインセンサによって検出した多数の直線状の画像を取得して記憶しておき、走査方向に全ての画像が取得された後に合成して2次元的な画像を構築する必要があり、画像構築に時間がかかるという不都合がある。
本発明は、このような事情に鑑みてなされたものであって、光変調素子を共焦点ピンホールとして利用することにより試料の鮮明な共焦点画像を得ることができ、かつ、そのような鮮明な共焦点画像をリアルタイムに2次元的な画像を構築することができる走査型顕微鏡を提供することを目的とする。
上記課題を解決するために、本発明は以下の手段を採用する。
本発明は、光源と、2次元配列された複数の微小光変調要素を備え、オン状態に作動される該微小光変調要素を一方向に切り替える微小光変調要素アレイと、前記光源から発せられ、前記微小光変調要素アレイを通過した照明光を集光して試料に照射する一方、試料からの光を集光する対物レンズと、2次元配列された複数の画素を有し、前記試料からの光を検出する光検出器と、前記微小光変調要素アレイと前記対物レンズとの間に配置され、前記光源からの照明光を前記微小光変調要素の切替方向と直交する方向に走査する第1のスキャン手段と、前記光検出器と前記微小光変調要素アレイとの間に配置され、前記対物レンズにより集光され、前記第1のスキャン手段および前記微小光変調要素アレイを介して戻る試料からの光を前記第1のスキャン手段と同じ方向に走査する第2のスキャン手段とを備える走査型顕微鏡を提供する。
本発明は、光源と、2次元配列された複数の微小光変調要素を備え、オン状態に作動される該微小光変調要素を一方向に切り替える微小光変調要素アレイと、前記光源から発せられ、前記微小光変調要素アレイを通過した照明光を集光して試料に照射する一方、試料からの光を集光する対物レンズと、2次元配列された複数の画素を有し、前記試料からの光を検出する光検出器と、前記微小光変調要素アレイと前記対物レンズとの間に配置され、前記光源からの照明光を前記微小光変調要素の切替方向と直交する方向に走査する第1のスキャン手段と、前記光検出器と前記微小光変調要素アレイとの間に配置され、前記対物レンズにより集光され、前記第1のスキャン手段および前記微小光変調要素アレイを介して戻る試料からの光を前記第1のスキャン手段と同じ方向に走査する第2のスキャン手段とを備える走査型顕微鏡を提供する。
本発明によれば、光源から発せられた照明光は、微小光変調要素アレイに入射されることにより、オン状態に作動された微小光変調要素に対応する位置に入射された照明光が、第1のスキャン手段により走査された後に、対物レンズによって試料に集光される。そして、試料から発せられた蛍光または反射光のような光は、対物レンズにより集光され、第1のスキャン手段および微小光変調要素アレイを介して戻り、第2のスキャン手段によって走査された後に光り検出器により検出される。
微小光変調要素アレイの作動により、オン状態に作動される微小光変調要素が一方向に切り替えられ、第1のスキャン手段により微小光変調要素の切替方向と直交する方向に走査されるので、試料に対して照明光を2次元的に走査させることができる。また、第2のスキャン手段を第1のスキャン手段と同一方向に走査させることにより、微小光変調要素の切替方向と併せて、光検出器に対して試料からの光を2次元的に走査させることができる。
そして、光検出器が、2次元配列された複数の画素を有しているので、2次元的に走査された試料からの光を一度に検出することができ、検出後に合成する作業が不要となってリアルタイムに2次元的な画像を構築することができる。なお、微小光変調要素アレイを対物レンズの試料側焦点位置と光学的に共役な位置とすることにより、オン状態に作動された微小光変調要素を共焦点ピンホールとして機能させることができ、対物レンズの試料側焦点面に沿う試料の鮮明な観察像を取得することができる。
上記発明において、前記第1のスキャン手段および第2のスキャン手段は、前記光検出器により取得される観察像が、前記試料の像を反転したものとならないように、第1のスキャン手段による試料上における照明光の走査の向きと、第2のスキャン手段による光検出器上における試料からの光の走査の向きとを対応させ、同期して駆動されることが好ましい。
このようにすることで、試料上に照明光を照射した順序で光検出器により取得される2次元的な観察像として、試料の像を反転させずに正しく取得することができる。各瞬間における試料からの光は、照明光の照射範囲と試料との重なりの重心を中心としたスポット光として微小光変調要素において反射され、その位置情報を保持したまま光検出器に入射されるので、光検出器においては複数画素に跨って分布を有する光として検出されることになる。
このため、試料上における照明光の走査の向きと、光検出器上における試料からの光の走査の向きとが対応しない場合には、取得される2次元的な観察像が単純な反転像とならないので、その後の画像処理によっても正しい観察像を取得することが困難となり、あるいは正しい観察像を取得するために複雑な画像処理を行わなればならないという不都合があるが、本発明によればそのような不都合はない。
また、上記発明においては、前記光源がレーザ光源であることが好ましい。レーザ光を用いることにより、光量を大きくすることが可能となるため、高速でスキャンを行う場合であっても、光検出器の各画素において検出される光量の低下を防ぐことができる。
また、上記発明においては、前記微小光変調要素が、マイクロミラーであることが好ましい。
また、上記発明においては、前記微小光変調要素が、マイクロミラーであることが好ましい。
本発明によれば、光変調素子を共焦点ピンホールとして利用することにより試料の鮮明な共焦点画像を得ることができ、かつ、そのような鮮明な共焦点画像をリアルタイムに2次元的な画像を構築することができるという効果を奏する。
〔第1の実施形態〕
以下、本発明の第1の実施形態に係る走査型顕微鏡10について、図面を参照して説明する。
本実施形態に係る走査型顕微鏡10は、図1に示すように、レーザ光源(光源)1と、該レーザ光源1から発せられたレーザ光(照明光)の照射幅を制限するシリンドリカルレンズ(異曲率レンズ)23と、該シリンドリカルレンズ23を有するアスペクト比変換光学系3と、該アスペクト比変換光学系3の前記シリンドリカルレンズ23を通過したレーザ光を反射するDMD(微小光変調要素アレイ,デジタルマイクロミラーアレイ)7と、該DMD7により反射されたレーザ光を一方向に走査するガルバノミラー(スキャン手段)9と、該ガルバノミラー9により反射されたレーザ光を集光して試料19に照射する一方、該試料19から発せられる蛍光を集光する対物レンズ11と、該対物レンズ11により集光された蛍光を結像させる第1の結像レンズ13および第2の結像レンズ15と、第2の結像レンズ15により結像された蛍光を検出する光検出器17とを備えている。
なお、図中、符号5は、ダイクロイックミラーである。
以下、本発明の第1の実施形態に係る走査型顕微鏡10について、図面を参照して説明する。
本実施形態に係る走査型顕微鏡10は、図1に示すように、レーザ光源(光源)1と、該レーザ光源1から発せられたレーザ光(照明光)の照射幅を制限するシリンドリカルレンズ(異曲率レンズ)23と、該シリンドリカルレンズ23を有するアスペクト比変換光学系3と、該アスペクト比変換光学系3の前記シリンドリカルレンズ23を通過したレーザ光を反射するDMD(微小光変調要素アレイ,デジタルマイクロミラーアレイ)7と、該DMD7により反射されたレーザ光を一方向に走査するガルバノミラー(スキャン手段)9と、該ガルバノミラー9により反射されたレーザ光を集光して試料19に照射する一方、該試料19から発せられる蛍光を集光する対物レンズ11と、該対物レンズ11により集光された蛍光を結像させる第1の結像レンズ13および第2の結像レンズ15と、第2の結像レンズ15により結像された蛍光を検出する光検出器17とを備えている。
なお、図中、符号5は、ダイクロイックミラーである。
レーザ光源1は、照明光として、例えば、断面略円形の略平行なレーザ光を出射するようになっている。
アスペクト比変換光学系3は、レーザ光源1とDMD7との間に配置され、レーザ光源1側に、該レーザ光源1から発せられたレーザ光の光束径を拡大して、大径の平行光束にするコリメータ21を備え、DMD7側に、光軸方向と直交する2軸方向に曲率が異なるとともに、レーザ光の照射幅、具体的には、マイクロミラー(微小光変調要素)29の切替方向と直交する方向の照射幅を制限するシリンドリカルレンズ23を備えている。
アスペクト比変換光学系3は、レーザ光源1とDMD7との間に配置され、レーザ光源1側に、該レーザ光源1から発せられたレーザ光の光束径を拡大して、大径の平行光束にするコリメータ21を備え、DMD7側に、光軸方向と直交する2軸方向に曲率が異なるとともに、レーザ光の照射幅、具体的には、マイクロミラー(微小光変調要素)29の切替方向と直交する方向の照射幅を制限するシリンドリカルレンズ23を備えている。
シリンドリカルレンズ23は、図示しない移動機構により、光軸に沿う方向に移動可能に設けられている。
また、シリンドリカルレンズ23は、図1に示すように、DMD7との間に集光作用を有する光学系を介在させないように配置されており、レーザ光の光束に含まれる軸外光線の光軸に対する角度を一定に保ちながらレーザ光をDMD7に照射するようになっている。
また、シリンドリカルレンズ23は、図1に示すように、DMD7との間に集光作用を有する光学系を介在させないように配置されており、レーザ光の光束に含まれる軸外光線の光軸に対する角度を一定に保ちながらレーザ光をDMD7に照射するようになっている。
アスペクト比変換光学系3に入射されたレーザ光は、コリメータ21によって所定の大きさの光束径に拡大された後、シリンドリカルレンズ23によって、一軸方向の光束径が維持されたまま、それに直交する軸方向のみに集光されるようになっている。これにより、レーザ光は、その光束の断面形状のアスペクト比が変換され、マイクロミラー29の切替方向と直交する方向の照射幅が制限される。その結果、シリンドリカルレンズ23が光軸方向に沿って移動させられることにより、DMD7へのレーザ光の入射範囲が変更されるようになっている。
すなわち、シリンドリカルレンズ23の焦点位置が、DMD7に一致したときには、レーザ光のDMD7への入射範囲が直線状になり、その位置からいずれかの光軸方向にずれた位置に配されたときには、それよりも幅の広い入射範囲で、DMD7に入射されるようになっている。
DMD7は、図2に示すように、2次元配列された複数のマイクロミラー29を備え、隣接する1以上(図2に示す例では、3×3=9)のマイクロミラー29′を同時にオン状態に作動させたオン領域を、一方向に移動させるように切り替えていくようになっている。これにより、DMD7に入射されたレーザ光の内、オン領域のマイクロミラー29′に照射されたレーザ光が反射されるようになっている。
DMD7のオン領域において反射されたレーザ光は、第1のリレーレンズ25を介して、ガルバノミラー9に入射されるので、DMD7のオン領域が一方向に移動するのに伴って、ガルバノミラー9へのレーザ光の入射位置も、一方向に移動していくようになっている。
また、DMD7は、対物レンズ11の試料側焦点位置と光学的に共役な位置に配置されている。これにより、DMD7のオン領域を共焦点ピンホールとして機能させることができるようになっている。
ガルバノミラー9は、DMD7のオン領域において反射されたレーザ光を、オン領域の移動方向に直交する一方向に走査するようになっている。ガルバノミラー9により反射されたレーザ光は、第2のリレーレンズ27および対物レンズ11を介して、試料19に集光されるようになっている。そして、DMD7におけるマイクロミラー29のオンオフの切替動作と、ガルバノミラー9の揺動動作とを同期させることにより、2次元的に走査されたレーザ光を試料19に照射することができるようになっている。
試料19にレーザ光が照射されることにより、試料19内に含まれる蛍光物質が励起されることで発生した蛍光は、対物レンズ11により集光された後、第1の結像レンズ13、第2のリレーレンズ27、ガルバノミラー9、第1のリレーレンズ25およびDMD7を介して、レーザ光とは逆向きに戻るようになっている。そして、蛍光は、ダイクロイックミラー5を通過することで、レーザ光から分離された後、第2の結像レンズ15により集光されて、光検出器17に入射されるようになっている。
光検出器17は、1次元配列された複数の画素を有するラインセンサであり、ガルバノミラー9の各揺動位置において、DMD7のオン領域を移動させることにより発生した1次元の蛍光像、すなわち、ラインスキャン画像を逐次取得するようになっている。取得されたラインスキャン画像は、ガルバノミラー9の揺動位置と対応付けて記憶されることにより、後に2次元の蛍光画像を構築することができるようになっている。
このように構成された本実施形態に係る走査型顕微鏡10の作用について、説明する。
レーザ光源1からレーザ光が発せられると、レーザ光は、アスペクト比変換光学系3において、まず、コリメータ21を通過することにより、その光束径が拡大されて、大径の平行光束となる。そして、レーザ光が、シリンドリカルレンズ23を通過することにより、マイクロミラー29の切替方向と直交する方向のレーザ光の照射幅が制限される。これにより、例えば、DMD7のオン領域をガルバノミラー9による走査方向に小さく制限した場合にも、その範囲に合わせてレーザ光の集光範囲を設定することが可能となる。
レーザ光源1からレーザ光が発せられると、レーザ光は、アスペクト比変換光学系3において、まず、コリメータ21を通過することにより、その光束径が拡大されて、大径の平行光束となる。そして、レーザ光が、シリンドリカルレンズ23を通過することにより、マイクロミラー29の切替方向と直交する方向のレーザ光の照射幅が制限される。これにより、例えば、DMD7のオン領域をガルバノミラー9による走査方向に小さく制限した場合にも、その範囲に合わせてレーザ光の集光範囲を設定することが可能となる。
また、アスペクト比変換光学系3は、シリンドリカルレンズ23を、その焦点位置をDMD7に一致させた状態から光軸方向に沿って移動させることにより、DMD7に対するレーザ光の入射範囲を変化させる。この場合において、シリンドリカルレンズ23は、上述のように、レーザ光の光束に含まれる軸外光線の光軸に対する角度を一定に保ちながらレーザ光をDMD7に照射するので、シリンドリカルレンズ23が光軸方向に移動しても、DMD7におけるレーザ光の入射範囲がマイクロミラー29の切替方向(例えば、図2参照)の配列長に対して大きく変化することがない。
これにより、例えば、DMD7のオン領域の大きさを変更して、ピンホールのピンホール径を変化させた場合等に、ピンホール径に合わせてレーザ光の入射範囲を変更するためにシリンドリカルレンズ23を光軸方向に移動させても、オン領域を含む最小限の領域にレーザ光の入射範囲が制限される。
このようにして、アスペクト比変換光学系3を通過したレーザ光は、ダイクロイックミラー5によって反射されて、DMD7に入射される。
このようにして、アスペクト比変換光学系3を通過したレーザ光は、ダイクロイックミラー5によって反射されて、DMD7に入射される。
DMD7は、隣接する1以上のマイクロミラー29′をオン領域とするので(図2参照)、このオン領域により反射されたレーザ光が、第1のリレーレンズ25を介してガルバノミラー9に入射される。
この場合において、DMD7は、オン領域を一方向に移動させるように切り替えていくので、ガルバノミラー9に対して、レーザ光がオン領域の切替方向に移動するように入射される。
この場合において、DMD7は、オン領域を一方向に移動させるように切り替えていくので、ガルバノミラー9に対して、レーザ光がオン領域の切替方向に移動するように入射される。
そして、ガルバノミラー9が揺動されることにより、入射されたレーザ光が、DMD7のオン領域の切替方向とは直交する一方向に走査される。したがって、DMD7のオン領域の切替動作とガルバノミラー9の揺動動作とが同期されることにより、ガルバノミラー9によって反射され、第2のリレーレンズ27および対物レンズ11を介して、試料19に集光されるレーザ光が、試料19において2次元的に走査される。
試料19に上記レーザ光が照射されることにより蛍光が発生すると、蛍光は、対物レンズ11によって集光された後、第1の結像レンズ13、第2のリレーレンズ27、ガルバノミラー9、第1のリレーレンズ25およびDMD7を介して、レーザ光とは逆向きに戻る。そして、蛍光は、ダイクロイックミラー5を通過してレーザ光から分離された後、第2の結像レンズ15により集光されて、光検出器17に入射される。
この場合において、DMD7が対物レンズ11の試料側焦点位置と光学的に共役な位置に配置されているので、蛍光は、レーザ光を反射したマイクロミラー29′と同じマイクロミラー29′によって反射されて、光検出器17に入射される。そして、DMD7のオン領域を十分に小さく設定しておくことにより、オン領域を共焦点ピンホールとして機能させ、対物レンズ11の試料側焦点面に沿う試料19の鮮明な蛍光画像、すなわち、DMD7のオン領域を一方向に移動させることによって生成されたラインスキャン画像が、光検出器17により取得される。
このようにして、ガルバノミラー9の揺動位置毎に光検出器17により取得されたラインスキャン画像が、ガルバノミラー9の揺動位置と対応付けて記憶される。これにより、記憶されたラインスキャン画像に基づいて、2次元の蛍光画像を構築することができる。
以上説明したように、本実施形態に係る走査型顕微鏡10によれば、アスペクト比変換光学系3におけるシリンドリカルレンズ23により、DMD7のオン領域の範囲に合わせてレーザ光の集光範囲を設定することができる。また、アスペクト比変換光学系3の作動により、シリンドリカルレンズ23を光軸方向に移動させた場合に、DMD7のオン領域を含む最小限の領域にレーザ光の入射範囲を制限することができる。その結果、光量のロスを低減することが可能となる。
なお、本実施形態は、以下のように変形することができる。
例えば、図1に示す走査型顕微鏡10が、対物レンズ11の瞳径に応じて、シリンドリカルレンズ23の位置を光軸方向に移動させる制御部(図示せず)を備えることとしてもよい。これにより、DMD7のオン領域の大きさを変更して観察したい場合にも、光量の低下を防ぐことが可能となる。例えば、対物レンズ11の瞳径が大きい場合には、対物レンズ11の持つ光軸方向の分解能を損なうことなく画像を得るために、DMD7のオン領域を小さくすることにより、共焦点ピンホールのピンホール径を小さくする必要がある。この場合、制御部の作動により、DMD7へのレーザ光の入射範囲を狭くする方向にシリンドリカルレンズ23を移動させる。その結果、DMD7のオン領域を小さくしても、対物レンズ11の持つ光軸方向の分解能を十分に保ちつつ、光量の低下を防ぐことができる。
例えば、図1に示す走査型顕微鏡10が、対物レンズ11の瞳径に応じて、シリンドリカルレンズ23の位置を光軸方向に移動させる制御部(図示せず)を備えることとしてもよい。これにより、DMD7のオン領域の大きさを変更して観察したい場合にも、光量の低下を防ぐことが可能となる。例えば、対物レンズ11の瞳径が大きい場合には、対物レンズ11の持つ光軸方向の分解能を損なうことなく画像を得るために、DMD7のオン領域を小さくすることにより、共焦点ピンホールのピンホール径を小さくする必要がある。この場合、制御部の作動により、DMD7へのレーザ光の入射範囲を狭くする方向にシリンドリカルレンズ23を移動させる。その結果、DMD7のオン領域を小さくしても、対物レンズ11の持つ光軸方向の分解能を十分に保ちつつ、光量の低下を防ぐことができる。
一方、対物レンズ11の瞳径が小さい場合には、共焦点ピンホールのピンホール径を大きくしても、対物レンズ11の持つ光軸方向の分解能を大きく損なうことがない。よって、制御部の作動により、DMD7へのレーザ光の入射範囲を広げる方向にシリンドリカルレンズ23を移動させる。これにより、DMD7のオン領域を大きくして、試料19から戻る光の量を増加させることができる。この結果、対物レンズ11の持つ光軸方向の分解能を保ちつつ、明るい画像を得ることできる。また、このようにすることで、走査の回数を減らして、画像の取得の高速化を図ることができる。
また、例えば、図3に示すように、走査型顕微鏡10Aが、ガルバノミラー9、すなわち、スキャン手段を備えない構成としてもよい。この場合には、試料19が、マイクロミラー29の切替方向と直交する方向に移動可能に設けられていることが望ましい。具体的には、試料19をステージ35上に設置して、ステージ移動部37の作動によりマイクロミラー29の切替方向と直交する方向(図3においてX方向参照)に試料19を往復動作させる。そして、DMD7によって反射されたレーザ光が、第1の結像レンズ13,対物レンズ11を介して試料19に照射され、該試料19から発せられた蛍光が、対物レンズ11,第1の結像レンズ13を通過した後、DMD7,ダイクロイックミラー5,第2の結像レンズ15を介して、光検出器17に入射されるように配置すればよい。この場合において、ステージ移動部37の作動により、DMD7におけるマイクロミラー29のオンオフの切替動作と、試料19の上記移動動作とを同期させることにより、2次元的に走査されたレーザ光を試料19に照射することができる。
また、図4に示すように、走査型顕微鏡10Bが、微小光変調要素アレイとして、DMD7に代えて、透過型の素子、例えば、液晶素子39を採用することとしてもよい。この場合には、液晶素子39が、対物レンズ11の試料側焦点位置と光学的に共役な位置に配置されていることが望ましい。具体的には、ダイクロイックミラー5によって反射されたレーザ光が、液晶素子39を透過した後、第1のリレーレンズ25,ガルバノミラー9,第2のリレーレンズ27,第1の結像レンズ13および対物レンズ11を介して試料19に照射される。そして、該試料19から発せられた蛍光が、対物レンズ11,第1の結像レンズ13,第2のリレーレンズ27,ガルバノミラー9および第1のリレーレンズ25を介して液晶素子39を透過した後、ダイクロイックミラー5および第2の結像レンズ15を通過して光検出器17に入射されるように配置すればよい。このようにすることで、液晶素子39を共焦点ピンホールとして機能させることができる。
また、例えば、図5に示すように、光源として、レーザ光源1に代えて、ハロゲンランプを採用することとしてもよい。この場合には、例えば、アスペクト比変換光学系3′との間にディフューザ41を介してハロゲンランプ43を設けることとしてもよい。また、ハロゲンランプ43に代えて、パルス光源(図示せず)を採用することとしてもよい。
また、例えば、図6に示すように、走査型顕微鏡10Cが、試料19から発生される蛍光がDMD7を通過しない構成としてもよい。この場合には、照明光としてパルスレーザを採用することが望ましい。具体的には、レーザ光源1′から出射されてアスペクト比変換光学系3を通過したパルスレーザが、DMD7,第1のリレーレンズ25,ガルバノミラー9,第2のリレーレンズ27および第1の結像レンズ13を介して、ダイクロイックミラー5′によって反射された後、対物レンズ11によって集光されて試料19に照射される。そして、該試料19から発せられた光が、対物レンズ11によって集光されてダイクロイックミラー5′を透過した後、第2の結像レンズ15により集光されてCCD45に入射されるように配置すればよい。このようにすることで、パルスレーザによる多光子励起効果を利用して、対物レンズ11の試料側焦点面における試料19の鮮明な蛍光画像を取得することができる。
〔第2の実施形態〕
次に、本発明の第2の実施形態に係る走査型顕微鏡20について、図7を参照して説明する。
本実施形態の説明において、上述した第1の実施形態に係る走査型顕微鏡1と構成を共通する箇所には、同一符号を付して説明を省略する。
次に、本発明の第2の実施形態に係る走査型顕微鏡20について、図7を参照して説明する。
本実施形態の説明において、上述した第1の実施形態に係る走査型顕微鏡1と構成を共通する箇所には、同一符号を付して説明を省略する。
本実施形態に係る走査型顕微鏡20は、アスペクト比変換光学系35のDMD7側に、マイクロミラー29の切替方向と直交する方向の照射幅を制限してレーザ光源1から発せられたレーザ光をDMD7に照射するシリンドリカルレンズ23と、該シリンドリカルレンズ23と上記照射幅の異なるシリンドリカルレンズ(異曲率レンズ)33,34を備えている。
各シリンドリカルレンズ23,33,34は、択一的に切替可能に設けられており、例えば、手動で交換可能なように、シリンドリカルレンズ23,33,34がU字型のレンズホルダ(図示せず)に設けられていてもよい。また、例えば、シリンドリカルレンズ23,33,34は、外部信号により、切替可能となっていてもよい。
このように構成された本実施形態に係る走査型顕微鏡20によれば、シリンドリカルレンズ23,33,34を相互に切り替えることにより(図8(a)および図8(b)参照)、DMD7へのレーザ光の照射範囲を変更することができる(図9(a)および図9(b)参照)。したがって、DMD7のオン領域を含む最小限の領域にレーザ光の入射範囲を制限し、光量のロスを低減することができる。
また、レーザ光の集光範囲を変えるためにシリンドリカルレンズ23の位置を光軸方向に調整する必要がないので、アスペクト比変換光学系35を光軸方向に小型化することができる。
また、レーザ光の集光範囲を変えるためにシリンドリカルレンズ23の位置を光軸方向に調整する必要がないので、アスペクト比変換光学系35を光軸方向に小型化することができる。
なお、本実施形態においては、以下のように変形することができる。
例えば、アスペクト比変換光学系35が、シリンドリカルレンズ23,33,34を配置したレンズホルダ(回転部)60(図10参照)を備えていることとしてもよい。
この場合に、レンズホルダ60は、レーザ光の光軸と平行な回転軸60aを有して、レーザ光の光軸周りに回転可能となっており、シリンドリカルレンズ23,33,34が、レンズホルダ60上に、回転軸60aから等しい距離に同心円状にそれぞれ配置されていればよい。
例えば、アスペクト比変換光学系35が、シリンドリカルレンズ23,33,34を配置したレンズホルダ(回転部)60(図10参照)を備えていることとしてもよい。
この場合に、レンズホルダ60は、レーザ光の光軸と平行な回転軸60aを有して、レーザ光の光軸周りに回転可能となっており、シリンドリカルレンズ23,33,34が、レンズホルダ60上に、回転軸60aから等しい距離に同心円状にそれぞれ配置されていればよい。
このようにすることで、レンズホルダ60を回転させて、シリンドリカルレンズ23,33,34の内のいずれかをレーザ光の光軸上に配置することにより、DMD7へのレーザ光の入射範囲を変更することができる。また、シリンドリカルレンズ23,33,34の切替を、レンズの入れ替え作業を伴うことなく、レンズホルダ60を回転させるだけの簡単な動作により実現させることができる。
さらに、例えば、シリンドリカルレンズ23,33,34が、対物レンズ11の瞳径に応じて、互いに異なる焦点距離を有しており、走査型顕微鏡20が、対物レンズ11の瞳径を検知するとともにその瞳径に応じてレンズホルダ60の回転角度を調節する回転制御部62(図11参照)を備えることとしてもよい。
この場合に、回転制御部62は、対物レンズ11が他の対物レンズ11に切り替えられると、対物レンズ11の瞳径を自動的に検知するとともに、レンズホルダ60に設けられたシリンドリカルレンズ23,33,34の中から、対物レンズ11の瞳径に対して十分な共焦点効果を得られるレンズがレーザ光の光軸上に配置されるように、レンズホルダ60の回転角度を調節すればよい。
これにより、シリンドリカルレンズ23,33,34の中から、対物レンズ11の瞳径に対して共焦点効果を得るのに適したレンズを自動的に選択することができる。
これにより、シリンドリカルレンズ23,33,34の中から、対物レンズ11の瞳径に対して共焦点効果を得るのに適したレンズを自動的に選択することができる。
また、本実施形態においては、シリンドリカルレンズ23,33,34を例示して説明したが、これに代えて、照射範囲の異なるシリンドリカルレンズを4以上設けることとしてもよい。
〔第3の実施形態〕
次に、本発明の第3の実施形態に係る走査型顕微鏡30について、図12を参照して説明する。
本実施形態に係る走査型顕微鏡30は、透過型の顕微鏡であり、パルスレーザを出射するレーザ光源1′と、試料19を挟んで対物レンズ11と対向して配置され、試料19から発せられる蛍光を集光する第2の対物レンズ47と、該第2の対物レンズ47により集光されて第2の結像レンズ15により結像された蛍光を検出するCCD45とを備えており、ダイクロイックミラー5を備えていない点で、第1の実施形態と異なる。
以下、本実施形態の説明において、第1の実施形態に係る走査型顕微鏡1と構成を共通する箇所には、同一符号を付して説明を省略する。
次に、本発明の第3の実施形態に係る走査型顕微鏡30について、図12を参照して説明する。
本実施形態に係る走査型顕微鏡30は、透過型の顕微鏡であり、パルスレーザを出射するレーザ光源1′と、試料19を挟んで対物レンズ11と対向して配置され、試料19から発せられる蛍光を集光する第2の対物レンズ47と、該第2の対物レンズ47により集光されて第2の結像レンズ15により結像された蛍光を検出するCCD45とを備えており、ダイクロイックミラー5を備えていない点で、第1の実施形態と異なる。
以下、本実施形態の説明において、第1の実施形態に係る走査型顕微鏡1と構成を共通する箇所には、同一符号を付して説明を省略する。
このような構成によれば、レーザ光源1′から出射されてアスペクト比変換光学系3を通過したパルスレーザは、DMD7,第1のリレーレンズ25,ガルバノミラー9,第2のリレーレンズ27および第1の結像レンズ13を介して、第1の対物レンズ11により集光されて試料19に照射される。そして、試料19にパルスレーザが照射されることにより、第1の対物レンズ11の試料側焦点面における多光子励起により発生した蛍光が、第2の対物レンズ47により集光されて第2の結像レンズ15を介してCCD45で撮影される。
以上説明したように、本実施形態に係る走査型顕微鏡30によれば、試料19を透過して得られる蛍光が検出される。したがって、例えば、試料19に厚みがあり、試料19のうち照明用の第1の対物レンズ11から離れた位置を観察したい場合等に適する。この場合において、多光子励起効果を利用して、第1の対物レンズ11の試料側焦点面における鮮明な蛍光画像を取得することができる。
〔第4の実施形態〕
次に、本発明の第4の実施形態に係る走査型顕微鏡40について、図13を参照して説明する。
本実施形態に係る走査型顕微鏡40は、レーザ光源1と、第3の実施形態におけるCCD45の位置に配置された第2のDMD49と、該第2のDMD49により反射された蛍光を結像させる第3の結像レンズ51とを備えている点で、第3の実施形態と異なる。
以下、本実施形態の説明において、上述した第3の実施形態に係る走査型顕微鏡30と構成を共通する箇所には、同一符号を付して説明を省略する。
次に、本発明の第4の実施形態に係る走査型顕微鏡40について、図13を参照して説明する。
本実施形態に係る走査型顕微鏡40は、レーザ光源1と、第3の実施形態におけるCCD45の位置に配置された第2のDMD49と、該第2のDMD49により反射された蛍光を結像させる第3の結像レンズ51とを備えている点で、第3の実施形態と異なる。
以下、本実施形態の説明において、上述した第3の実施形態に係る走査型顕微鏡30と構成を共通する箇所には、同一符号を付して説明を省略する。
第2のDMD49は、マイクロミラーが2次元配列されたものを用いることが望ましい。
また、第2のDMD49のマイクロミラー(図示せず)は、DMD7のマイクロミラー29の切替方向と同じ方向に切り替えられるようになっている。
また、第2のDMD49のマイクロミラー(図示せず)は、DMD7のマイクロミラー29の切替方向と同じ方向に切り替えられるようになっている。
このような構成によれば、試料19を透過して得られる蛍光は、第2の対物レンズ47により集光されて第2の結像レンズ15を介して第2のDMD49に入射される。この場合において、DMD7のマイクロミラー29と第2のDMD49のマイクロミラーとが同方向に切替えられるので、第2のDMD49を、DMD7およびガルバノミラー9と同期して走査することにより、第2のDMD49を共焦点ピンホールとして機能させることができる。これにより、本実施形態に係る走査型顕微鏡40によれば、透過型の顕微鏡であっても、通常のレーザ光を用いて、第1の対物レンズ11の試料側焦点面における鮮明な蛍光画像を取得することができる。
なお、第2のDMD49として、DMD7と同様に、マイクロミラーの切替方向の配列長が、切替方向と直交する方向の配列長よりも長いDMD(例えば、図2参照)を用いることとし、さらに、試料19を透過して得られる蛍光を第2のDMD49の切替方向と直交する方向に走査する第2のガルバノミラー(図示せず)を備えることにより、試料19の2次元的な画像を取得することとしてもよい。
以上、本発明の各実施形態について図面を参照して説明してきたが、具体的な構成はこの実施形態に限られるものではない。
例えば、光検出器17は、ラインセンサに代えて、CCD,CMOS等の2次元的な撮像手段を採用してもよい。
このようにすることで、例えば、DMD7のオン領域をガルバノミラーの走査方向に大きくした場合に、試料19の2次元的な画像を効果的に取得することができる。
例えば、光検出器17は、ラインセンサに代えて、CCD,CMOS等の2次元的な撮像手段を採用してもよい。
このようにすることで、例えば、DMD7のオン領域をガルバノミラーの走査方向に大きくした場合に、試料19の2次元的な画像を効果的に取得することができる。
また、図14に示すように、走査型顕微鏡10Dが、試料19から発せられDMD7を介して戻る蛍光を一方向に走査する他のガルバノミラー(他のスキャン手段)53と、その蛍光を結像させる第3の結像レンズ55とをさらに備え、ラインセンサに代えて、CCD等の2次元的な撮像手段からなる光検出器17′を採用することとしてもよい。
この場合において、ガルバノミラー53は、DMD7で反射され、第2の結像レンズ15を通過した蛍光をガルバノミラー9と同期して走査する。
また、第3の結像レンズ55は、ガルバノミラー53により走査された蛍光を集光して、光検出器17′に入射させる。これにより、試料19の蛍光像が、光検出器17′の2次元的な領域において走査される。
また、第3の結像レンズ55は、ガルバノミラー53により走査された蛍光を集光して、光検出器17′に入射させる。これにより、試料19の蛍光像が、光検出器17′の2次元的な領域において走査される。
ここで、ガルバノミラー53は、光検出器17′上における試料19からの蛍光の走査の向きが、ガルバノミラー9による試料19上における照明光の走査の向きと対応するように同期して駆動される。図16に示す例では、(a)の左から右に時系列に示されるように、ガルバノミラー9が、試料19に対して左向きに照明光を走査する場合、試料19から戻る蛍光は(b)に示されるように、DMD7に入射する。(b)はDMD7の一ラインと、該DMD7に入射する蛍光スポットとを示したものである。蛍光は、(a)における照明光と試料19との重複範囲の中心を中心とした位置に配置され、その強度は、照明光と試料19との重複範囲の面積に比例する。
すなわち、DMD7においては、蛍光は位置情報および強度情報を保持したまま反射されるので、図17(a)に示されるように、ガルバノミラー53による走査の向きが、ガルバノミラー9による走査の向きとは逆方向(右向き)となる場合には、各瞬間における分布を持った光が配列方向のみ反転して光検出器17′に入射される。その結果、光検出器17′により取得される2次元的な観察像は、単純な反転画像とはならず、事後的な画像処理によっては容易には正しい観察像を得ることができない。
これに対して、本実施形態によれば、図17(b)に示されるように、各瞬間における分布を持った光が、その配列方向についても試料19における光の照射方向と対応するように同期して光検出器17′に入射される。その結果、光検出器17′により正しい観察像を得取得することができる。
図16および図17においては、DMD7の1つのマイクロミラーに光検出器17′の4画素が対応している場合であって、マイクロミラーのオンオフを切り替えて観察視野を2回走査することにより1画像を得る場合を示している。
図16および図17においては、DMD7の1つのマイクロミラーに光検出器17′の4画素が対応している場合であって、マイクロミラーのオンオフを切り替えて観察視野を2回走査することにより1画像を得る場合を示している。
すなわち、試料19の2次元的な蛍光像が、2次元的な撮像手段からなる光検出器17′により撮像されるので、ラインスキャン画像を取得してから2次元的な画像を構築する場合に比べて、画像取得の高速化を図ることができる。
また、図15に示すように、走査型顕微鏡10Eが、例えば、ロッドレンズ57およびディフューザ59をアスペクト比変換光学系3の前段に配置してなる光量均一化手段61を備えていてもよい。
このようにすることで、レーザ光源1から発せられるレーザ光は、ロッドレンズ57およびディフューザ59を通過することにより分散され、光軸上と光軸外の光量の分布が均一な光束になるように補正される。
これにより、DMD7のオン領域に均一な光量分布を有するレーザ光が入射されるので、対物レンズ11の試料側焦点面に沿う試料19に対して、均一にレーザ光を照射することができ、ムラの少ない鮮明な画像を取得することができる。
また、上記各実施形態においては、ダイクロイックミラー5を例示して説明したが、これに代えて、例えば、ハーフミラーを採用することとしてもよい。このようにすることで、レーザ光が、対物レンズ11によって集光されて試料19に照射される一方、試料19において反射された反射光が、対物レンズ11によって集光され、ハーフミラーを透過して光検出器17,17′またはCCD45に導かれる。これにより、蛍光に代えて反射光を検出することができる。
また、上記各実施形態においては、シリンドリカルレンズ23を例示して説明したが、これに代えて、アナモフィックレンズを採用することとしてもよい。
また、上記各実施形態においては、シリンドリカルレンズ23を例示して説明したが、これに代えて、アナモフィックレンズを採用することとしてもよい。
1 レーザ光源(光源)
3 アスペクト比変換光学系
7 DMD(微小光変調要素アレイ,デジタルマイクロミラーアレイ)
9 ガルバノミラー(スキャン手段)
10 走査型顕微鏡
11 対物レンズ
17 光検出器
19 試料
23 シリンドリカルレンズ(異曲率レンズ)
29 マイクロミラー(微小光変調要素)
3 アスペクト比変換光学系
7 DMD(微小光変調要素アレイ,デジタルマイクロミラーアレイ)
9 ガルバノミラー(スキャン手段)
10 走査型顕微鏡
11 対物レンズ
17 光検出器
19 試料
23 シリンドリカルレンズ(異曲率レンズ)
29 マイクロミラー(微小光変調要素)
Claims (4)
- 光源と、
2次元配列された複数の微小光変調要素を備え、オン状態に作動される該微小光変調要素を一方向に切り替える微小光変調要素アレイと、
前記光源から発せられ、前記微小光変調要素アレイを通過した照明光を集光して試料に照射する一方、試料からの光を集光する対物レンズと、
2次元配列された複数の画素を有し、前記試料からの光を検出する光検出器と、
前記微小光変調要素アレイと前記対物レンズとの間に配置され、前記光源からの照明光を前記微小光変調要素の切替方向と直交する方向に走査する第1のスキャン手段と、
前記光検出器と前記微小光変調要素アレイとの間に配置され、前記対物レンズにより集光され、前記第1のスキャン手段および前記微小光変調要素アレイを介して戻る試料からの光を前記第1のスキャン手段と同じ方向に走査する第2のスキャン手段とを備える走査型顕微鏡。 - 前記第1のスキャン手段および第2のスキャン手段は、前記光検出器により取得される観察像が、前記試料の像を反転したものとならないように、第1のスキャン手段による試料上における照明光の走査の向きと、第2のスキャン手段による光検出器上における試料からの光の走査の向きとを対応させ、同期して駆動される請求項1に記載の走査型顕微鏡。
- 前記光源がレーザ光源である請求項1または請求項2に記載の走査型顕微鏡。
- 前記微小光変調要素が、マイクロミラーである請求項1から請求項3のいずれかに記載の走査型顕微鏡。
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