JP6195373B2 - 撮像装置および撮像方法 - Google Patents

Description

この発明は、試料容器に液体とともに担持された生物試料を撮像する撮像装置および撮像方法に関するものである。

医療や生物科学の実験においては、例えばウェルとも称される窪部を多数配列して設けたプレート状の試料容器（例えばマイクロプレート、マイクロタイタープレート等と呼ばれる）の各ウェルに液体やゲル状の流動体（例えば培養液、培地等）を注入し、ここで細胞等を培養したものを試料として観察、計測することが行われる。近年では、ＣＣＤカメラ等で撮像してデータ化し、該画像データに種々の画像処理技術を適用して観察や分析に供することが行われるようになってきている。

このような撮像装置において、例えばウェルの上部から照明光を試料に入射させ、ウェル底面から透過してくる光を受光して撮像を行う場合、注入された液体表面のメニスカス作用により照明光が屈折することで特にウェル底面の周縁部に十分な照明光が入射せず、この部分で画像の明るさが低下するという問題が知られている。この問題に対応する技術として、例えば特許文献１には、照明光学系に設けた絞りによって、試料に対し照明光が斜め方向から入射するようにした構成が開示されている。

特開２０１２−１４７７３９号公報（例えば、図２）

特許文献１には試料を透過した光を受光する観察光学系の構成については詳しく記載されていないが、上記従来技術のように斜め方向から照明を行う照明光学系を用いる場合には、これを集光する観察光学系に開口数（ＮＡ）の大きなレンズが必要になると考えられる。このようなレンズは製造コストが高く、また被写界深度が浅くなるため、試料の立体的構造を観察する際、対象物の全体を合焦範囲に含めることができない場合がある。このため、より簡単な構成で、試料全体を十分な明るさで、しかも立体構造を有する撮像対象物も有効に撮像することのできる技術が求められている。

この発明は上記課題に鑑みなされたものであり、簡単な構成でありながら、試料容器の周縁部まで十分な明るさで撮像することができ、しかも立体構造を有する生物試料に対しても有効な撮像技術を提供することを目的とする。

この発明の一の態様は、試料容器に設けられ底面が平坦な窪部に液体と共に担持された生物試料を撮像する撮像装置であって、上記目的を達成するため、前記窪部の前記底面が水平となるように前記試料容器を保持する保持手段と、前記試料容器の上方から前記窪部の開口面に照明光を入射させる照明手段と、前記窪部の前記底面から透過する光を受光して前記生物試料を撮像する撮像手段と、前記保持手段に保持される前記試料容器と前記撮像手段との間に設けられ、前記窪部の前記底面から出射される光を前記撮像手段に入射させる観察光学系とを備え、前記観察光学系は、前記保持手段と前記撮像手段との間の光路上に設けられた対物レンズと、前記対物レンズと前記撮像手段との間の光路上に設けられた開口絞りとを有し、前記開口絞りは、前記対物レンズの焦点位置よりも前記撮像手段側に配置されることを特徴としている。

また、この発明の他の態様は、底面が平坦な窪部に液体と共に生物試料を担持する試料容器を、前記窪部の前記底面が水平となるように保持する工程と、前記窪部の前記底面から透過する光を受光する撮像手段を配置するとともに、前記試料容器と前記撮像手段との間に観察光学系を配置する工程と、前記試料容器の上方から前記窪部の開口面に照明光を入射させる工程と、前記窪部の前記底面から透過する光を前記観察光学系により前記撮像手段に入射させて前記生物試料を撮像する工程とを備え、前記観察光学系が、前記保持手段と前記撮像手段との間の光路上に配置される対物レンズと、前記対物レンズと前記撮像手段との間の光路上に配置される開口絞りとを有し、前記開口絞りを、前記対物レンズの焦点位置よりも前記撮像手段側に配置することを特徴としている。

詳しくは後述するが、このように構成された発明では、液面のメニスカス効果により進路が曲げられて窪部底面の周縁部から外側へ向かって進む光を、対物レンズおよび開口絞りを通過させて撮像手段に入射させることができる。そのため、周縁部からの光についても中心部からの光と同様に効率よく集光して明るい画像を得ることができる。また、このような作用効果を開口絞りの配置によって得ているので、光学系の開口数（ＮＡ）を大きくする必要がない。このため、比較的深い被写界深度を得ることができるので、立体的な試料の撮像にも好適である。

このように、本発明によれば、簡単な構成で、試料容器の底面周縁部まで十分な明るさで撮像することができ、しかも立体構造を有する試料であっても良好な画像品質で撮像することが可能である。

この発明の撮像装置は、例えば、開口絞りを対物レンズの光軸に沿った方向に移動させる位置変更手段を備える構成であってもよい。このような構成によれば、試料に応じて開口絞りの位置を調整することが可能であり、種々の試料に対して撮像条件の最適化を図ることができる。また例えば、開口絞りは、窪部の開口面の中心に入射し底面の周縁部を通過する光の光路と、観察光学系の光軸とが交わる位置に設けられる構成であってもよい。こうすることで、窪部底面の周縁部から出射される光を効率よく撮像手段に導くことができる。

また例えば、観察光学系は、開口絞りと撮像手段との間の光路上に、開口絞りを通過した光を撮像手段に収束させる結像レンズを備える構成であってもよい。このような構成によれば、撮像手段に結像する光の入射方向を調整することで画像品質を向上させることができる。

また例えば、照明手段は、窪部の開口面に拡散光を入射させる構成であってもよい。本願発明者らの知見では、特に撮像される生物試料が立体的な構造を有している場合、このように照明光として拡散光を用いた場合に良好な撮像結果が得られる。

あるいは例えば、照明手段は、光源と、該光源から窪部の開口面に入射する光の拡散度を低減させる低減部とを備える構成であってもよい。特に撮像される生物試料が例えば窪部の底面に沿って平面的に分布している場合には、拡散度の抑制された照明光を用いることで良好な撮像結果が得られる。

また例えば、撮像手段は受光素子としてのリニアイメージセンサを備え、観察光学系およびリニアイメージセンサが一体的に、保持手段に保持された試料容器に対し相対的に走査移動する構成であってもよい。この発明における撮像手段としては、受光素子として、二次元画像を撮像するエリアイメージセンサ（エリアセンサともいう）、一次元画像を撮像するリニアイメージセンサ（リニアセンサ、ラインセンサともいう）のいずれであっても適用可能である。リニアイメージセンサを用いる場合には、観察光学系とともにリニアイメージセンサを走査させることで、観察光学系の光軸とリニアイメージセンサの中心とを一致させた状態で撮像を行うことができる。

一方で、この場合、観察光学系の移動に伴って、窪部底面から出射される光と、開口絞りとの位置関係が変動するため、例えば円形の開口を有する開口絞りでは、特にリニアイメージセンサの水平方向位置が窪部底面の中央直下位置から離れるにつれて、リニアイメージセンサに入射する光量が少なくなり、画像の明るさが低下する。これを解消するためには、例えば、開口絞りが、リニアイメージセンサの走査方向を長手方向とするスリット状の開口を有する構成とすることができる。

後述するように、この発明においては、窪部の開口面の中心に入射して底面の周縁部から出射される光が、対物レンズを介して開口絞りの中心に入射する状態が最も好ましい。すなわち、窪部の開口面の中心に入射して窪部の底面の周縁部を通過する光の光路が対物レンズの光軸と交わる位置に、開口絞りが配置されることが望ましい。

この点から、厳密には試料に応じて、すなわち窪部の寸法や注入される液体の量等に応じて開口絞りの位置が調整されることが望ましいが、最適位置からある程度の範囲内に開口絞りが配置されていれば、十分に良好な撮像結果が得られることがわかっている。この種の目的に使用される代表的な複数種の試料容器を用いて評価した結果、例えば、窪部の開口面の中心に入射して窪部の底面周縁部を通過する光の光路が対物レンズの光軸方向に対してなす角が、５度ないし３０度であれば、各種の試料に対して概ね良好な撮像結果を得ることができる。

この発明によれば、対物レンズと撮像手段との間に設ける開口絞りを、対物レンズの焦点位置よりも撮像手段側に配置する。これにより、簡単な構成でありながら、試料容器の辺縁部まで明るく撮像することができる。また、観察光学系の開口数を大きくする必要がないので、生物試料が立体的な構造を有している場合でも良好な画像品質を得ることができる。

本発明にかかる撮像装置の第１実施形態の概略構成を示す図である。 ウェルを透過する光を模式的に示す図である。 ウェルを透過して撮像デバイスに受光される光を模式的に示す図である。 観察光学系の位置関係を示す図である。 比較例としての従来技術の観察光学系を示す図である。 撮像された画像の例を示す図である。 この発明にかかる撮像装置の第２実施形態を示す図である。 この発明にかかる撮像装置の第３実施形態を示す図である。 走査移動に伴う問題点を説明するための図である。 第３実施形態における開口絞りの開口形状を示す分解斜視図である。 撮像された画像の例を示す図である。 この発明にかかる撮像装置の第４実施形態を示す図である。 撮像された画像の例を示す図である。

＜第１実施形態＞
図１は本発明にかかる撮像装置の第１実施形態の概略構成を示す図である。この撮像装置１は、ウェルプレートＷＰの上面に形成されたウェルＷと称される窪部に注入された液体中の生物試料を撮像する装置である。以下、各図における方向を統一的に示すために、図１に示すようにＸＹＺ直交座標軸を設定する。ここでＸＹ平面が水平面、Ｚ軸が鉛直軸を表す。より詳しくは、（＋Ｚ）方向が鉛直上向き方向を表している。

ウェルプレートＷＰは、創薬や生物科学の分野において一般的に使用されているものであり、平板状のプレートの上面に、断面が略円形の筒状に形成され底面が透明で平坦なウェルＷが複数設けられている。１つのウェルプレートＷＰにおけるウェルＷの数は任意であるが、例えば９６個（１２×８のマトリクス配列）のものを用いることができる。各ウェルＷの直径および深さは代表的には数ｍｍ程度である。なお、この撮像装置１が対象とするウェルプレートのサイズやウェルの数はこれらに限定されるものではなく任意であり、例えば３８４穴のものであってもよい。

ウェルプレートＷＰの各ウェルＷには、培地としての液体が所定量注入され、この液体中において所定の培養条件で培養された細胞、細菌等の生物試料が、この撮像装置１の撮像対象となる。培地は適宜の試薬が添加されたものでもよく、また液状でウェルＷに投入された後ゲル化するものであってもよい。後述するように、この撮像装置１０では、例えばウェルＷの内底面で培養されたスフェロイド（細胞集塊）を撮像対象とすることができる。常用される一般的な液量は、５０ないし２００マイクロリットル程度である。

撮像装置１は、生物試料を液体とともに各ウェルＷに担持するウェルプレートＷＰの下面周縁部に当接して、ウェルプレートＷＰを略水平姿勢に保持するホルダ１１と、ホルダ１１の上方に配置される照明部１２と、ホルダ１１の下方に配置される撮像部１３と、これら各部の動作を制御するＣＰＵ１４１を有する制御部１４とを備えている。

照明部１２は、ホルダ１１により保持されたウェルプレートＷＰに向けて適宜の拡散光（例えば白色光）を出射する。より具体的には、例えば光源としての白色ＬＥＤ（Light Emitting Diode）光源１２１と拡散板１２２とを組み合わせたものを、照明部１２として用いることができる。照明部１２により、ウェルプレートＷＰに設けられたウェルＷ内の生物試料が上方から照明される。

ホルダ１１により保持されたウェルプレートＷＰの下方に、撮像部１３が設けられる。撮像部１３には、ウェルプレートＷＰの直下位置に対物レンズ１３１が配置されている。対物レンズ１３１の光軸は鉛直方向（Ｚ方向）に向けられており、対物レンズ１３１の光軸に沿って上から下に向かって順に、開口絞り１３２、結像レンズ１３３および撮像デバイス１３４がさらに設けられている。対物レンズ１３１、開口絞り１３２および結像レンズ１３３は、それぞれの中心が鉛直方向（Ｚ方向）に沿って一列に並ぶように配置されて、これらが一体として観察光学系１３０を構成している。なお、この例では撮像部１３を構成する各部が鉛直方向に一列に配列されているが、各部間の距離（光路長）が後述する関係を満たす限りにおいて、反射鏡等により光路が折り返されていてもよい。

撮像部１３は、制御部１４に設けられたメカ駆動部１４６によりＸＹＺ方向に移動可能となっている。具体的には、メカ駆動部１４６が、ＣＰＵ１４１からの制御指令に基づき、撮像部１３を構成する対物レンズ１３１、開口絞り１３２、結像レンズ１３３および撮像デバイス１３４を一体的にＸ方向およびＹ方向に移動させることにより、撮像部１３がウェルＷに対し水平方向に移動する。１つのウェルＷ内の撮像対象物が撮像されるときには、メカ駆動部１４６は、観察光学系１３０の光軸が当該ウェルＷの中心と一致するように、撮像部１３を水平方向に位置決めする。

また、メカ駆動部１４６は、撮像部１３をＺ方向に移動させることにより、撮像対象物に対する撮像部のフォーカス合わせを行う。具体的には、撮像対象物たる生物試料が存在するウェルＷの内底面に対物レンズ１３１の焦点が合うように、メカ駆動部１４６が、対物レンズ１３１、開口絞り１３２、結像レンズ１３３および撮像デバイス１３４を一体的に上下動させる。

また、メカ駆動部１４６は、撮像部１３をＸＹ方向に移動させる際、照明部１２を撮像部１３と一体的にＸＹ方向に移動させる。すなわち、照明部１２は、その光中心が観察光学系１３０の光軸と略一致するように配置されており、対物レンズ１３１を含む撮像部１３がＸＹ方向に移動するとき、これと連動してＸＹ方向に移動する。これにより、どのウェルＷが撮像される場合でも、当該ウェルＷの中心および照明部１２の光中心が常に観察光学系１３０の光軸上に位置することとなり、各ウェルＷに対する照明条件を一定にして、撮像条件を良好に維持することができる。

撮像部１３により、ウェルＷ内の生物試料が撮像される。具体的には、照明部１２から出射されウェルＷの上方から液体に入射した光が撮像対象物を照明し、ウェルＷ底面から下方へ透過した光が対物レンズ１３１により集光され、開口絞り１３２、結像レンズ１３３を介して最終的に撮像デバイス１３４の受光面に撮像対象物の像が結像し、これが撮像デバイス１３４の受光素子１３４１により受光される。受光素子１３４１は二次元イメージセンサであり、その表面に結像した撮像対象物の二次元画像を電気信号に変換する。受光素子１３４１としては、例えばＣＣＤセンサまたはＣＭＯＳセンサを用いることができる。

ウェルＷ底面（より厳密には内底面）と対物レンズ１３１との距離は、対物レンズ１３１の焦点距離ｆ１である一方、対物レンズ１３１と開口絞り１３２との距離ｄは、対物レンズ１３１の焦点距離ｆ１よりも長くなるように配置される。また、開口絞り１３２と結像レンズ１３３との距離および結像レンズ１３３と撮像デバイス１３４との距離は、いずれも結像レンズ１３３の焦点距離ｆ２とされている。このような配置とする理由については後に詳述する。

受光素子１３４１から出力される画像信号は、制御部１４に送られる。すなわち、画像信号は制御部１４に設けられたＡＤコンバータ（Ａ／Ｄ）１４３に入力されてデジタル画像データに変換される。ＣＰＵ１４１は、受信した画像データに基づき適宜画像処理を実行する。制御部１４はさらに、画像データを記憶保存するための画像メモリ１４４と、ＣＰＵ１４１が実行すべきプログラムやＣＰＵ１４１により生成されるデータを記憶保存するためのメモリ１４５とを有しているが、これらは一体のものであってもよい。

その他に、制御部１４には、インターフェース（Ｉ／Ｆ）１４２が設けられている。インターフェース１４２は、ユーザからの操作入力を受け付けたり、ユーザへの処理結果等の情報提示を行うほか、通信回線を介して接続された外部装置との間でのデータ交換を行う。

図２はウェルを透過する光を模式的に示す図である。また、図３はウェルを透過して撮像デバイスに受光される光を模式的に示す図である。図２（ａ）に示すように、ウェルプレートＷＰに設けられた円筒形状のウェルＷは、円筒の中心軸が鉛直軸と一致するように、つまり開口面Ｓｔおよび底面Ｓｂが略水平となるように、ホルダ１１により保持される。このときウェルＷの開口面Ｓｔと底面Ｓｂとは、鉛直方向において同心となっている。なお、ウェルＷの開口面Ｓｔと底面Ｓｂとは完全に同一サイズである必要はなく、例えばウェル側壁面が倒立円錐台形状であって、開口面Ｓｔに対し底面Ｓｂが少し小さくなっていてもよい。

撮像されるウェルＷには液体Ｌが注入されており、その液面には一般的に下に凸のメニスカスが形成されている。仮に液体が注入されていない、あるいは液面が平坦である場合を想定すると、図２（ａ）に実線矢印で示すように、ウェルＷの開口面Ｓｔから入射した光はそのままウェルＷ内を進んでウェルＷの底面Ｓｂから下方へ透過し、対物レンズ１３１により集光されて撮像デバイス１３４へ向かう。

しかしながら、点線矢印で示すように、液面のメニスカスにより光が屈折するため、特にウェル底面Ｓｂの周縁部（以下、「ウェル周縁部」と称する）Ｗｅを通過する照明光は、一点鎖線で示される対物レンズ１３１の光軸から離れる方向に進む。そのため、この点を考慮していない観察光学系を用いた従来の撮像装置では、ウェル周縁部Ｗｅから出射する光を十分に撮像デバイスに入射させることができず、結果的にウェル周縁部Ｗｅにおいて画像が暗くなる。

本実施形態の観察光学系１３０は、この問題を解消することを可能にする構成となっている。以下、その考え方を説明する。図２（ｂ）はウェルＷを通過する光の代表的な進路を示す光路図である。また、図３はこれらの光が最終的に撮像デバイス１３４に受光されるまでの進路を示す光路図である。これらの図において実線および点線で示すように、照明部１２の各所から出射された光がウェル周縁部Ｗｅを通過する。このうち、実線で示されるウェルＷの開口面Ｓｔの中心を通る光線に着目する。この光線は、ウェルＷの開口面Ｓｔを一種の絞りとみなした場合の当該絞りの主光線に相当する。

照明部１２の点Ｐから出射されてウェル開口面Ｓｔの中心を通り、ウェル周縁部Ｗｅを通過してする光Ｌｅを考えたとき、ウェル底面Ｓｂから出射されるこの光Ｌｅの方向が図に一点鎖線で示される観察光学系１３０の光軸方向となす角を符号θにより表す。液面での屈折により、この角θは開口面Ｓｔに入射するときの入射角θ1より大きくなる。

市販されている一般的な９６ウェル、ウェル直径７ｍｍのウェルプレートＷＰを用いて、ウェルＷに注入する液量を種々に変更設定して配光シミュレーションを行ったところ、配光重心が観察光学系の光軸に対してなす角θの値は１４度ないし１８度の範囲となった。また、３８４ウェル、１辺３．５ｍｍの角型ウェルでは、角θの値は８度ないし１５度の範囲となった。その他の各種のウェルプレートにおいても、角θの値は概ね１０度前後の値を示すと推定される。

本願発明者らの知見では、図３に示すように、この光Ｌｅが開口絞り１３２の中心を通る位置に開口絞り１３２を設置することで、ウェル周縁部Ｗｅから出射される光を効率よく撮像デバイス１３４に導くことが可能である、つまり、光Ｌｅの光路が観察光学系１３０の光軸と交わる位置に、開口絞り１３２を設置すればよい。このとき、ウェル周縁部Ｗｅから出射され対物レンズ１３１を介して開口絞り１３２に入射する光の主光線が、ウェルＷの開口面Ｓｔから入射してウェル周縁部Ｗｅを通過する光の主光線と一致することになり、ウェル周縁部Ｗｅから出射される光を有効に撮像デバイス１３４に導くことができる。このような状態とするために、開口絞り１３２は、対物レンズ１３１に対しその焦点距離ｆ１よりも遠くに、つまり対物レンズ１３１の焦点位置よりも撮像デバイス１３４側に寄った位置に設けられる。すなわち、図３において、ｄ＞ｆ１の関係が成立する。

また、開口絞り１３２の開口サイズについては、照明部１２からウェル開口面Ｓｔに入射してウェル周縁部Ｗｅから出射される光のうちウェル開口面Ｓｔへの入射角が最も大きい光Ｌ１、Ｌ２を通過させることができるサイズとされる。こうすることで、ウェル周縁部Ｗｅを照明する光が全て開口絞り１３２を通過して撮像デバイス１３４に到達することになり、ウェル周縁部Ｗｅにおける画像の明るさを最大化することができる。ただし、開口絞り１３２の開口サイズを大きくすると被写界深度が浅くなったり結像状態が悪化することもあるため、実際には画像の明るさと画像品質とのバランスも考慮する必要がある。

図４は観察光学系の位置関係を示す図である。対物レンズ１３１の焦点距離を符号ｆ１、対物レンズ１３１と開口絞り１３２との距離を符号ｄ、対物レンズ１３１の後側焦点から開口絞り１３２までの距離を符号ｄ２、結像レンズ１３３の焦点距離を符号ｆ２により表す。また、対物レンズ１３１側からウェルＷ内の液体Ｌの液面を介して見たときの見かけ上のウェル開口面Ｓｔの位置からウェル底面Ｓｂまでの距離を符号ｄ１に表す。また、ウェル底面Ｓｂの半径を符号Ｒにより表す。

光Ｌｅが開口絞り１３２の中心を通るための関係として、図４に示される各部の距離およびニュートンの結像式から、次式：
ｄ２＝ｆ１×ｆ１／ｄ１＝ｆ１×ｆ１／（Ｒ／ｔａｎθ） … （式１）
が得られる。したがって、対物レンズ１３１と開口絞り１３２との距離ｄは、次式：
ｄ＝ｆ１＋ｄ２＝ｆ１＋ｆ１×ｆ１／（Ｒ／ｔａｎθ） … （式２）
により表される。ここで、各部の代表的な寸法として、例えば、
ｆ１＝４５ｍｍ
２Ｒ＝６．５ｍｍ
θ＝１８度
とすると、距離ｄは約２４７ｍｍとなる。

開口絞り１３２から結像レンズ１３３までの距離、および結像レンズ１３３から撮像デバイス１３４までの距離については任意であるが、例えばこれらをいずれも結像レンズ１３３の焦点距離ｆ２と一致させるようにすることができる。こうすることにより、開口絞り１３２から撮像デバイス１３４までの間でテレセントリック光学系を構成することができ、撮像デバイス１３４に結像する撮像対象物の像を鮮明にして、画像品質を良好なものとすることができる。

図５は比較例としての従来技術の観察光学系を示す図である。この観察光学系は、ウェルＷの上方に照明部ＬＳが設けられる一方、ウェルＷの下方に配置されたカメラレンズＣＬにより、ウェル底面Ｓｂの像を撮像デバイスＩＭの受光面に等倍で結像させるものである。このような観察光学系では、ウェル底面ＳｂからカメラレンズＣＬまでの距離、およびカメラレンズＣＬから撮像デバイスＩＭまでの距離が、それぞれカメラレンズＣＬの焦点距離ｆ０の２倍に設定される。

図６は撮像された画像の例を示す図である。図６（ａ）は図５に示す従来技術の観察光学系を用いて撮像された画像の例であり、ウェル周縁部に対応する領域で画像が暗くなっている。これに対して、図６（ｂ）は本実施形態の観察光学系１３０を用いて撮像された画像の例であり、ウェル周縁部まで明るい画像が得られていることがわかる。

以上のように、この実施形態では、撮像対象物である生物試料が分布するウェル底面Ｓｂから見て対物レンズ１３１の後方に配置される開口絞り１３２が、対物レンズ１３１の焦点よりもさらに後方（撮像デバイス側）に配置されている。これにより、ウェルＷ内の液面での屈折により観察光学系１３０の光軸から離れる方向に広がる光を、より効率よく集光して撮像デバイス１３４に導くことができる。そのため、この実施形態では、ウェル周縁部においてもウェル中心部と同等の明るさを有する画像を撮像することができる。

また、観察光学系１３０の開口数（ＮＡ）については、前記した特許文献１に記載された、照明光を斜めから入射させる従来技術のように大きくする必要はないので、結像性能のよい特別なレンズ設計を要しない。また、観察光学系の被写界深度が大きく取れるので、スフェロイドＳｐのように立体的構造を有する撮像対象物であっても鮮明に撮像することができる。特に、画像における撮像対象物の陰影の現れ方が視野全体で同程度になることから、立体的構造を有する生物試料の観察を目的とする撮像に好適である。

なお、前記したように、ウェル開口面Ｓｔの中心に入射してウェル周縁部Ｗｅを通過する光Ｌｅが開口絞り１３２の中心を通る、上記（式２）の関係が満たされた状態が最も好ましい。したがって、厳密にはウェルのサイズや注入される液体の種類、量等に応じて開口絞り１３２の位置を調整する必要がある。しかしながら、この種の培養実験において実際に使用されるウェルプレートＷＰの種類や培養液の量の範囲についてはある程度限定されており、標準的な培養条件に合わせて開口絞り１３２の位置を設定しておけば、少なくとも従来技術に対して十分な画像品質の改善効果を得ることが可能である。

前記したように、実用的な培養条件ではウェル周縁部Ｗｅから出射される光Ｌｅの広がり角θは８度ないし１８度程度である。本願発明者らの実験によれば、ウェル周縁部Ｗｅから出射されて開口絞りに入射する光の入射角φ（図４）が５度ないし３０度程度となるように開口絞り１３２を配置すれば、これらの一般的な培養条件で作成された生物試料について、ウェル周縁部まで十分な明るさで撮像を行うことが可能である。当然に、より好ましくは入射角φは８度ないし１８度の範囲であり、さらに理想的には、試料に応じた角度を得るために、開口絞り１３２の位置が調整されることが望ましい。

＜第２実施形態＞
次に、この発明にかかる撮像装置の第２実施形態について説明する。上記したように、この発明にかかる撮像装置では、開口絞りを対物レンズの焦点位置よりも撮像デバイス側に寄った位置に設けることで、液面での屈折に起因して観察光学系の光軸から離れる方向に広がる光を効率よく集光して、ウェル周縁部まで明るい画像を得る。そして、最も良好な条件で撮像を行うためには、試料に応じて開口絞りの位置を調整することが望ましい。上記の第１実施形態では、標準的な試料に合わせて開口絞りの位置が設定されていたが、次に説明する第２実施形態では、開口絞りの位置を可変として、試料に応じた撮像条件の最適化を行えるようにしている。

図７はこの発明にかかる撮像装置の第２実施形態を示す図である。この実施形態の撮像装置２は、撮像部の構成が第１実施形態のものと一部異なっている。より具体的には、この実施形態の撮像部２３では、観察光学系において対物レンズと開口絞りとの距離を変更可能に構成されている。この点を除く装置構成および動作は第１実施形態と同じである。そこで、ここでは第１実施形態と同一の機能を有する構成には同一符号を付して説明を省略し、第１実施形態と相違する部分を中心に説明する。

この実施形態では、撮像部２３を構成する対物レンズ２３１、開口絞り２３２、結像レンズ２３３および撮像デバイス２３４が、メカ駆動部１４６により一体的に昇降することでウェル底面Ｓｂへのフォーカス調整を実行可能となっていることに加えて、対物レンズ２３１を固定したまま、開口絞り２３２、結像レンズ２３３および撮像デバイス２３４のみが一体的にメカ駆動部１４６により昇降可能に構成されている。

したがって、この実施形態では、開口絞り２３２、結像レンズ２３３および撮像デバイス２３４によるテレセントリック光学系を維持したまま、対物レンズ２３１と開口絞り２３２との距離を変更することが可能となっている。これにより、試料に応じた開口絞り２３２の位置調整が可能となり、異なる試料の間でもウェル周縁部での画像の明るさを同等に維持することができる。なお、開口絞り２３２の昇降はユーザによる手動操作により行われてもよい。このとき、撮像デバイス２３４により撮像される画像をリアルタイムで表示するようにすれば、ユーザは画像の明るさを確認しながら調整作業を効率的に行うことが可能となる。

＜第３実施形態＞
次に、この発明にかかる撮像装置の第３実施形態について説明する。上記した第１および第２実施形態の撮像装置では、撮像デバイスとして二次元イメージセンサが用いられていた。これに代えて、一次元画像を撮像するリニアイメージセンサを用いて撮像を行うことも可能である。すなわち、リニアイメージセンサをその長手方向と交わる方向に走査移動させることで、二次元画像を取得することができる。

この場合において、上記した第１または第２実施形態の撮像装置において撮像デバイスのみを二次元イメージセンサからリニアイメージセンサに置き換えることも可能である。その場合には、観察光学系を撮像対象となるウェルＷの下方に位置決めしたままリニアイメージセンサを走査移動させることになるため、観察光学系と撮像デバイスとが水平方向において個別に移動することが可能となっている必要がある。

一方、次に説明する第３実施形態の撮像装置は、水平方向において観察光学系と撮像デバイスとを一体的に走査移動させて撮像を行うことが可能な構成となっている。すなわち、観察光学系とは独立に撮像デバイスを移動させるための機構を要しない。

図８はこの発明にかかる撮像装置の第３実施形態を示す図である。なお、この実施形態においても、第１実施形態と共通の構成には同一符号を付して説明を省略する。第３実施形態の撮像装置３の撮像部３３では、撮像デバイス３３４がリニアイメージセンサを有している。より具体的には、撮像デバイス３３４は、Ｘ方向を長手方向とし、同方向に沿った一次元画像を撮像するリニアイメージセンサ３３４１を備えている。そして、撮像部３３では、制御部１４のメカ駆動部１４６により、対物レンズ３３１、開口絞り３３２、結像レンズ３３３および撮像デバイス３３４が一体的に、ウェルプレートＷＰに対してＹ方向に走査移動する。したがって、この実施形態では、観察光学系３３０の光軸自体の位置が撮像されるウェルＷに対して刻々と変化する。

図９は走査移動に伴う問題点を説明するための図である。上記した第１および第２実施形態では、開口絞りの開口形状を例えば円形とすることができるが、第３実施形態において開口絞り３３２の開口を同様に円形とした場合、次のような問題がある。すなわち、図９（ａ）に示すように、観察光学系３３０の光軸（一点鎖線で示す）がウェルＷの中心付近を通る場合には、ウェル底面Ｓｂから出射される光はほとんどが対物レンズ３３１を介して開口絞り３３２を通過することができる。なお、ウェル周縁部Ｗｅから出射される光もこのとき開口絞り３３２を通過するが、リニアイメージセンサ３３４１の受光面には入射しない。

一方、図９（ｂ）に示すように、観察光学系３３０の光軸がウェル周縁部Ｗｅに近づくにつれて、ウェル底面Ｓｂから出射される光の対物レンズ３３１への入射方向が図９（ａ）の場合とは異なってくるため、ウェル周縁部Ｗｅからの光が開口絞り３３２によって遮蔽されることになる。つまり、ウェル周縁部Ｗｅにおいて画像が暗くなる。

図１０は第３実施形態における開口絞りの開口形状を示す分解斜視図である。ここでは理解を容易にするために、ウェルプレートＷＰとしては仮想的に１つのウェルＷのみが形成されたものを図示している。図１０（ａ）に示されるように、対物レンズ３３１、開口絞り３３２および結像レンズ３３３を含む観察光学系３３０と、撮像デバイス３３４とが一体的に、所定の走査方向Ｄｓ（ここではＹ方向に一致）に移動する。図示していないが、照明部１２についても同様である。撮像デバイス３３４は走査方向Ｄｓ（すなわちＹ方向）と直交するＸ方向を長手方向とするリニアイメージセンサ３３４１を有し、撮像対象物に対してＹ方向に走査移動することで二次元画像を撮像する。

ここで、開口絞り３３２は、リニアイメージセンサ３３４１の走査方向Ｄｓ、すなわちＹ方向を長手方向として細く延びるスリット状の開口を有している。したがって、図１０（ｂ）に示すように、観察光学系３３０の光軸（一点鎖線）がウェル周縁部Ｗｅに近づいた状態でも、ウェル周縁部Ｗｅから出射される光が開口絞り３３４を通過して撮像デバイス３３４に導かれる。これにより、ウェル周縁部で画像が暗くなるという問題が改善される。

図１１は撮像された画像の例を示す図である。図１１（ａ）は図９（ａ）に示す開口サイズの小さい開口絞りを用いて撮像した画像を比較例として示すものであり、撮像デバイス３３４の走査方向Ｄｓにおける両端部で中央部に比べて画像が暗くなっている。これに対し、本実施形態のスリット状に開口した開口絞り３３２を用いた撮像結果では、図１１（ｂ）に示すように、走査方向Ｄｓの両端部でも十分な明るさが得られている。

＜第４実施形態＞
図１２はこの発明にかかる撮像装置の第４実施形態を示す図である。上記した第１ないし第３実施形態では、ウェルプレートＷＰのウェルＷに注入された液体内、より具体的にはウェルＷの内底面で三次元培養されたスフェロイドＳｐを撮像対象としている。スフェロイドＳｐは立体的構造を有しているため、照明光として拡散光を用いるとともに、観察光学系の開口数（ＮＡ）を比較的小さくして被写界深度が大きくなるようにしている。一方、この種の撮像装置を用いて撮像すべき撮像対象物としては、図１２（ａ）に示すように、細胞ＣがウェルＷの内底面に沿って薄く広がるように平面培養されたものもある。

本願発明者らの実験によれば、このように平面培養された生物試料の撮像においては、拡散光による照明よりも平行光に近い光による照明の方が鮮明な画像が得られるケースがある。図１２（ｂ）に示す第４実施形態の撮像装置４は、このようなケースに好適に適用可能なものである。図１２（ｂ）において、第１実施形態と同一の構成には同一符号を付して説明を省略する。

この撮像装置４では、照明部４２がウェルプレートＷＰの上面から上方に大きく離れた位置に配置されており、しかも、光源４２１とウェルプレートＷＰとの間に照明絞り４２２が設けられている。このため、図１２（ｂ）に示す光路図のように、ウェルＷに入射する光は絞り４２２により拡散度が低減されて平行光に近いものとなっている。撮像部１３の構成は、第１実施形態のものと同一である。

図１３は撮像された画像の例を示す図である。図１３（ａ）は、底面で二次元培養された細胞を生物試料として含むウェルＷを第１実施形態の撮像装置１により撮像した画像の例とその部分拡大図であり、画像の中央部および周縁部のいずれにおいても十分な明るさが得られているが、生物試料の画像コントラストが低く、試料の観察には必ずしも向いていないことがわかる。一方、図１３（ｂ）は、同様のウェルＷを第４実施形態の撮像装置４により撮像した画像の例とその部分拡大図であり、二次元培養された細胞がより高い画像コントラストで撮像された画像が得られている。

＜その他＞
以上説明したように、上記各実施形態では、ウェルプレートＷＰが本発明の「試料容器」に相当し、各ウェルＷの内部が本発明の「窪部」に相当している。そして、これらの実施形態では、ホルダ１１が本発明の「保持手段」として機能している。また、照明部１２、４２がいずれも本発明の「照明手段」として、また撮像デバイス１３４、２３４、３３４がいずれも本発明の「撮像手段」として機能している。そして、対物レンズ１３１、開口絞り１３２および結像レンズ１３３が一体として、本発明の「観察光学系」として機能している。また、第２実施形態においては、メカ駆動部１４６が本発明の「位置変更手段」として機能している。

なお、本発明は上記した実施形態に限定されるものではなく、その趣旨を逸脱しない限りにおいて上述したもの以外に種々の変更を行うことが可能である。例えば、上記各実施形態では、観察光学系に結像レンズを設けているが、結像レンズを用いない観察光学系であっても、対物レンズと開口絞りとの配置に関して本発明を適用することで、上記実施形態と同様の作用効果を得ることが可能である。

また、上記第２実施形態における開口絞りの位置調整機構を、第３または第４実施形態に適用することも可能である。同様に、第３実施形態における撮像部３３と、第４実施形態における照明部４２とを組み合わせることも可能である。

また、第４実施形態の撮像装置４では、照明光を平行光に近づけるために照明部４２の光源４２１をウェルプレートＷＰから上方に離して配置しているが、光源４２１が拡散度の低い光を出射することが可能なものであれば、よりウェルプレートＷＰに近接させて配置してもよい。したがって例えば、第１実施形態の照明部１２を拡散度の低い光を出射する光源と拡散板との組み合わせにより構成することで、第１実施形態と第４実施形態とを切り替え可能とすることができる。すなわち、光源とウェルプレートとの間に拡散板を配置して照明部１２を拡散光源として使用すれば、スフェロイドのような立体的構造を有する生物試料の撮像に好適な撮像装置を構成することができる。一方、光源とウェルプレートとの間から拡散板を退避させることで照明部１２を平行光源として使用すれば、平面培養された生物試料の撮像に好適な撮像装置を構成することができる。

また、上記実施形態では、ウェルプレートＷＰに設けられたウェルＷに担持された試料を撮像するが、他の試料容器、例えばより大径で浅型の「ディッシュ」と呼ばれる試料容器に液体と共に担持された生物試料の撮像にも、本発明を適用することが可能である。

この発明は、例えば医療・生物科学分野で用いられるウェルプレート上のウェルのような、例えば生体物を含む試料の撮像を必要とする分野に特に好適に適用することができるが、その応用分野は医療・生物科学分野に限定されない。

１、２、３、４ 撮像装置
１１ ホルダ（保持手段）
１２、４２ 照明部（照明手段）
１３、２３、３３ 撮像部
１４ 制御部
１３１ 対物レンズ（観察光学系）
１３２ 開口絞り（観察光学系）
１３３ 結像レンズ（観察光学系）
１３４、２３４、３３４ 撮像デバイス（撮像手段）
１４６ メカ駆動部（位置変更手段）
４２１ 光源
４２２ 拡散板（低減部）
Ｗ ウェル（窪部）
ＷＰ ウェルプレート（試料容器）

Claims (11)

1. 試料容器に設けられ底面が平坦な窪部に液体と共に担持された生物試料を撮像する撮像装置において、
   前記窪部の前記底面が水平となるように前記試料容器を保持する保持手段と、
   前記試料容器の上方から前記窪部の開口面に照明光を入射させる照明手段と、
   前記窪部の前記底面から透過する光を受光して前記生物試料を撮像する撮像手段と、
   前記保持手段に保持される前記試料容器と前記撮像手段との間に設けられ、前記窪部の前記底面から出射される光を前記撮像手段に入射させる観察光学系と
   を備え、
   前記観察光学系は、前記保持手段と前記撮像手段との間の光路上に設けられた対物レンズと、前記対物レンズと前記撮像手段との間の光路上に設けられた開口絞りとを有し、
   前記開口絞りは、前記対物レンズの焦点位置よりも前記撮像手段側に配置されることを特徴とする撮像装置。
2. 前記開口絞りを前記対物レンズの光軸に沿った方向に移動させる位置変更手段を備える請求項１に記載の撮像装置。
3. 前記開口絞りは、前記窪部の前記開口面の中心に入射し前記底面の周縁部を通過する光の光路と、前記観察光学系の光軸とが交わる位置に設けられる請求項１に記載の撮像装置。
4. 前記観察光学系は、前記開口絞りと前記撮像手段との間の光路上に、前記開口絞りを通過した光を前記撮像手段に収束させる結像レンズを備える請求項１ないし３のいずれかに記載の撮像装置。
5. 前記照明手段は、前記窪部の前記開口面に拡散光を入射させる請求項１ないし４のいずれかに記載の撮像装置。
6. 前記照明手段は、光源と、該光源から前記窪部の前記開口面に入射する光の拡散度を低減させる低減部とを備える請求項１ないし４のいずれかに記載の撮像装置。
7. 前記撮像手段は受光素子としてのリニアイメージセンサを備え、前記観察光学系および前記リニアイメージセンサが一体的に、前記保持手段に保持された前記試料容器に対し相対的に走査移動する請求項１ないし６のいずれかに記載の撮像装置。
8. 前記開口絞りは、前記リニアイメージセンサの走査方向を長手方向とするスリット状の開口を有する請求項７に記載の撮像装置。
9. 前記窪部の前記開口面の中心に入射して前記窪部の前記底面の周縁部を通過する光の光路が前記対物レンズの光軸方向に対してなす角が、５度ないし３０度である請求項１ないし８のいずれかに記載の撮像装置。
10. 底面が平坦な窪部に液体と共に生物試料を担持する試料容器を、前記窪部の前記底面が水平となるように保持する工程と、
    前記窪部の前記底面から透過する光を受光する撮像手段を配置するとともに、前記試料容器と前記撮像手段との間に観察光学系を配置する工程と、
    前記試料容器の上方から前記窪部の開口面に照明光を入射させる工程と、
    前記窪部の前記底面から透過する光を前記観察光学系により前記撮像手段に入射させて前記生物試料を撮像する工程と
    を備え、
    前記観察光学系が、前記保持手段と前記撮像手段との間の光路上に配置される対物レンズと、前記対物レンズと前記撮像手段との間の光路上に配置される開口絞りとを有し、
    前記開口絞りを、前記対物レンズの焦点位置よりも前記撮像手段側に配置することを特徴とする撮像方法。
11. 前記窪部の前記開口面の中心に入射して前記窪部の前記底面の周縁部を通過する光の光路が前記対物レンズの光軸と交わる位置に、前記開口絞りを配置する請求項１０に記載の撮像方法。