WO2017038155A1 - 撮像方法および光規制器具 - Google Patents

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小林　正嘉
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株式会社Ｓｃｒｅｅｎホールディングス
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Definitions

  • the present invention relates to a technique for imaging a raw sample carried on a sample container under illumination, and particularly to a technique for adjusting the illumination light.
  • Cross-reference of related applications The disclosures in the specification, drawings and claims of each of the following Japanese applications are incorporated herein by reference in their entirety: Japanese Patent Application No. 2015-168663 (filed Aug. 28, 2015).
  • an apparatus for imaging a living sample has been put into practical use for the purpose of observing or analyzing the living sample including cells and bacteria.
  • white diffused light as illumination light is incident on the spheroid (cell conglomerate) carried in a sample container called a well plate from above and transmitted downward.
  • the spheroid as a raw sample to be imaged is imaged.
  • the imaging object included in the raw sample may be, for example, a cell or cell colony that extends two-dimensionally along the bottom surface of the container.
  • the imaging object included in the raw sample may be, for example, a cell or cell colony that extends two-dimensionally along the bottom surface of the container.
  • the cells are nearly transparent, sufficient contrast may not be obtained under illumination with diffused light. It is known that the contrast of such a raw sample can be improved by imaging under illumination with parallel light.
  • the present invention has been made in view of the above problems, and provides a technique that allows an imaging apparatus to perform imaging more easily under parallel light illumination without requiring a function of generating parallel light. .
  • One aspect of the present invention horizontally supports a sample container carrying a raw sample, images an illumination light source above the sample container, and images a light regulating device between the illumination light source and the sample container below the sample container.
  • the light regulating device has a flat plate shape that can be placed on the sample container, and a plurality of through holes that penetrate from the one main surface side to the other main surface side are two-dimensionally arranged close to each other along the one main surface.
  • Each of the through holes is a light guide having a uniform cross-sectional shape along the normal direction of the one main surface, and the side wall surface of the through hole has light absorptivity. This is an imaging method.
  • a component having a relatively large incident angle among light incident from one main surface side of the light regulating device is absorbed by the light regulating device, and the traveling direction is regulated from the other main surface side.
  • Light close to parallel light is emitted. Therefore, the illumination light made into substantially parallel light enters the raw sample carried on the sample container through the light regulating device. Therefore, it is possible to image a live sample such as cells distributed two-dimensionally in the sample container with a good contrast.
  • the illumination light source may be a general diffuse light source, for example, and it is not necessary to modify the illumination light source or the imaging means. Therefore, an increase in imaging cost can be suppressed, and failure of imaging due to inappropriate lighting can be avoided.
  • a flat plate-like member having a flat plate shape and a plurality of through holes penetrating from one main surface side to the other main surface side in a two-dimensional proximity arrangement along the one main surface.
  • the light regulating device is characterized in that the side wall surface of the through hole has light absorptivity.
  • Another aspect of the present invention is a flat plate member having a flat plate shape, in which a plurality of through holes penetrating from one main surface side to the other main surface side are two-dimensionally arranged closely along the one main surface. And a transparent cover member covering at least one of the one main surface and the other main surface, and each of the through holes serves as a light guide having a uniform cross-sectional shape along the normal direction of the one main surface. And the side wall surface of a through-hole has a light absorptivity, It is a light control instrument characterized by the above-mentioned.
  • These light regulating devices have a configuration that can be suitably applied to the above-described imaging method. That is, the light regulating device having the above-described configuration is arranged between the illumination light source and the sample container, so that a raw sample is imaged under parallel light illumination without any change to the existing imaging device or sample container. It is possible.
  • the flat plate member in the configuration having a frame that covers the end face of the flat plate member, the flat plate member can be mechanically protected by the frame. Therefore, it is possible to use a member having low strength as the flat plate member. Further, in the configuration having the cover member that covers at least the other main surface side of the flat plate member, the flat plate member can be protected from damage and dust without impairing the optical effect exhibited by the flat plate member. . Thereby, handling of a light control instrument becomes easy.
  • the present invention it is possible to obtain illumination light in which the direction of the emitted light is restricted by using the light restricting device, so that the imaging device does not need a function of generating parallel light and can be more easily performed. Imaging under parallel light illumination can be performed.
  • FIG. 1 shows the example of the imaging device to which one Embodiment of the imaging method concerning this invention was applied. It is a 1st figure which illustrates the combination of an imaging target object and an illumination light source. It is a 2nd figure which illustrates the combination of an imaging target object and an illumination light source. It is a 3rd figure which illustrates the combination of an imaging target object and an illumination light source. It is a perspective view which shows the structure of a control plate. It is side surface sectional drawing of a control plate. It is side surface sectional drawing of a control plate. It is a 1st figure explaining the effect
  • FIG. 1 is a diagram showing an example of an imaging apparatus to which an embodiment of an imaging method according to the present invention is applied.
  • a living sample such as cells cultured in a liquid injected into a depression called a well W formed on the upper surface of the well plate WP is imaged by the imaging device 1.
  • the imaging device 1 one of the features of the imaging method according to the present invention is that imaging is performed in a state where the restriction plate 2 is placed on the upper portion of the well plate WP.
  • the XY plane represents a horizontal plane.
  • the Z axis represents the vertical axis, and more specifically, the (+ Z) direction represents the vertically upward direction.
  • the well plate WP is generally used in the fields of drug discovery and biological science.
  • a plurality of wells W having a substantially circular cross section and a transparent bottom surface are provided on the upper surface of a flat plate.
  • the number of wells W in one well plate WP is arbitrary, for example, 96 (12 ⁇ 8 matrix arrangement) can be used.
  • the diameter and depth of each well W is typically about several mm.
  • the size of the well plate and the number of wells targeted by the imaging apparatus 1 are not limited to these, and are arbitrary. For example, those having 12 to 384 holes are generally used.
  • the imaging apparatus 1 can be used not only for the well plate having a plurality of wells but also for imaging a raw sample cultured in, for example, a flat container called a dish.
  • a predetermined amount of liquid as the medium M is injected into each well W of the well plate WP, and cells cultured under predetermined culture conditions in the liquid are imaging targets of the imaging apparatus 1.
  • the medium M may be added with an appropriate reagent, or may be in a liquid state and gelled after being put into the well W.
  • cells or spheroids cultured on the inner bottom surface of the well W can be set as the imaging target.
  • Commonly used liquid volume is about 50 to 200 microliters.
  • the imaging apparatus 1 includes a holder 11 that holds a well plate WP that holds cells and the like in a well W together with a culture medium. More specifically, the holder 11 is in contact with the peripheral edge of the lower surface of the well plate WP and holds the well plate WP in a substantially horizontal posture. Moreover, the imaging device 1 includes an illumination unit 12 disposed above the holder 11, an imaging unit 13 disposed below the holder 11, and a control unit 14 having a CPU 141 that controls the operation of each unit. Yes.
  • the illumination unit 12 emits appropriate illumination light (for example, white light) toward the well plate WP held by the holder 11. More specifically, for example, a combination of a white LED (Light Emitting Diode) light source as a light source and a diffusion plate is used as the illumination unit 12.
  • the light emitting surface below the illumination unit 12 has a larger planar size than the upper surface of the well plate WP, and is provided so as to cover the entire region where the well W is formed on the upper surface of the well plate WP. In such a configuration, the cells and the like in each well W provided in the well plate WP are uniformly illuminated from above by the diffused light L1 emitted in various directions from the respective parts below the illumination part 12.
  • An imaging unit 13 is provided below the well plate WP held by the holder 11.
  • the imaging unit 13 is provided with an imaging optical system (not shown) at a position directly below the well plate WP.
  • the optical axis of the imaging optical system is oriented in the vertical direction (Z direction).
  • the raw sample in the well W is imaged by the imaging unit 13. Specifically, light emitted from the illumination unit 12 and incident on the culture medium M from above the well W illuminates a cell or the like as an imaging target. Light transmitted downward from the bottom surface of the well W is incident on a light receiving surface of an image pickup device (not shown) through the image pickup optical system. An image of the imaging target imaged on the light receiving surface of the imaging device by the imaging optical system is captured by the imaging device.
  • the image sensor for example, a CCD sensor or a CMOS sensor can be used, and either a two-dimensional image sensor or a one-dimensional image sensor may be used.
  • the imaging unit 13 can be moved in the XYZ directions by a mechanical control unit 146 provided in the control unit 14. Specifically, the mechanical control unit 146 moves the imaging unit 13 in the X direction and the Y direction based on a control command from the CPU 141. Thereby, the imaging unit 13 moves in the horizontal direction with respect to the well W. Further, focus adjustment is performed by movement in the Z direction.
  • the mechanical control unit 146 positions the imaging unit 13 in the horizontal direction so that the optical axis coincides with the center of the well W.
  • the imaging device of the imaging unit 13 is a one-dimensional image sensor, a two-dimensional image can be captured by scanning the imaging unit 13 in a direction orthogonal to the longitudinal direction of the image sensor. With such an imaging method, it is possible to perform non-contact, non-destructive and non-invasive imaging on cells or the like that are imaging targets, and suppress damage to cells or the like due to imaging.
  • the image signal output from the image sensor of the imaging unit 13 is sent to the control unit 14. That is, the image signal is input to an AD converter (A / D) 143 provided in the control unit 14 and converted into digital image data.
  • the CPU 141 executes image processing as appropriate based on the received image data.
  • the control unit 14 further includes an image memory 144 for storing and storing image data, and a memory 145 for storing and storing programs to be executed by the CPU 141 and data generated by the CPU 141. It may be integral.
  • the CPU 141 executes various control processes described later by executing a control program stored in the memory 145.
  • control unit 14 is provided with an interface (IF) unit 142.
  • the interface unit 142 accepts operation input from the user, presents information such as processing results to the user, and exchanges data with an external device connected via a communication line.
  • the control unit 14 may be a dedicated device equipped with the above hardware, or a control program for realizing the above processing functions in a general-purpose processing device such as a personal computer or a workstation. It may be. That is, a general-purpose computer device can be used as the control unit 14 of the imaging device 1. In the case of using a general-purpose processing device, it is sufficient that the imaging device 1 has a minimum control function for operating each unit such as the imaging unit 13.
  • FIG. 2A, 2B, and 2C are diagrams illustrating combinations of an imaging object and an illumination light source.
  • FIG. 2A shows a case where the imaging object in the well W is, for example, a spheroid S having a three-dimensional shape in the medium M.
  • the imaging object in the well W is, for example, a spheroid S having a three-dimensional shape in the medium M.
  • a wide range of the surface of the spheroid S is effectively illuminated when the diffused light L1 emitted from the illumination unit 12 is incident. For this reason, it is possible to capture an image with good contrast.
  • FIG. 2B shows a case where the imaging object is a cell (or cell colony) C that spreads thinly two-dimensionally in the medium M along the inner bottom surface Wb of the well W.
  • the imaging object is a cell (or cell colony) C that spreads thinly two-dimensionally in the medium M along the inner bottom surface Wb of the well W.
  • the cells themselves are nearly transparent, it is difficult to obtain high contrast.
  • the direction of outgoing light changes when the peripheral edge of the cell C acts like a lens, but it is difficult to selectively detect such light under illumination with diffused light. .
  • illumination light L2 close to parallel light is more preferable. Since the illumination light L2 is refracted at the peripheral edge of the cell C, the peripheral edge of the cell C has a lower brightness than other regions in the captured image, and the outline of the cell C appears more clearly.
  • imaging may be performed for the purpose of automatically measuring the size and number of cells distributed in the well W at high speed.
  • an image in which a contour portion of a cell or the like is clearly expressed with brightness different from a surrounding background portion is useful.
  • the imaging apparatus 1 can switch the illumination light emitted from the illumination unit 12 between the diffused light and the parallel light according to the imaging object.
  • providing the image pickup apparatus 1 with two types of light sources or providing a mechanism for generating pseudo parallel light from diffused light leads to an increase in the size and complexity of the apparatus configuration, which is also a cause of an increase in imaging cost. obtain.
  • the imaging apparatus 1 is provided with only the illumination unit 12 that emits diffused light.
  • the control plate 2 demonstrated below is mounted on the upper part of well plate WP.
  • the illumination light L2 which is substantially parallel light enters the imaging target in the well W. That is, the restriction plate 2 allows light components having an incident angle on the upper surface of the diffused light emitted from the illuminating unit 12 to pass through the lower surface, while absorbing light components having an incident angle larger than the predetermined angle. It has a function of restricting passage to the lower surface side.
  • the traveling direction is regulated, more specifically, substantially parallel light having a traveling direction whose inclination is equal to or smaller than a predetermined angle with respect to the imaging direction (Z direction) of the imaging unit 13 is emitted. , Enters each well W.
  • FIG. 3 is a perspective view showing the structure of the regulating plate.
  • 4A and 4B are side sectional views of the regulating plate. More specifically, FIG. 4A is an exploded view when the cross section of the restriction plate 2 is viewed on the cut surface A of FIG. 3, and FIG. 4B is a cross sectional view showing a state where the restriction plate 2 is placed on the well plate WP. It is.
  • the main part of the regulation plate 2 is a perforated panel 21 having a planar size that covers the entire region Rw in which the well W is disposed on the upper surface of the well plate WP.
  • the perforated panel 21 has a flat outer shape in which both main surfaces 21a and 21b are parallel.
  • the arrangement of the through holes 21c is two-dimensional and regular in the direction along the main surface.
  • 3 is a partially enlarged view of the one main surface 21a of the perforated panel 21.
  • each through-hole 21c has a hexagonal cross section, and the perforated panel 21 has a so-called honeycomb structure. With such a structure, light weight and high strength can be obtained.
  • the upper one main surface 21a that faces the illumination unit 12 when placed on the well plate WP is referred to as “upper surface”.
  • the lower other main surface 21b facing the upper surface of the well plate WP may be referred to as a “lower surface”.
  • the regulation plate 21 itself has a structure with no distinction between the front and the back, and functions in the same way even if the top and bottom are switched.
  • the perforated panel 21 is housed in a frame 22 having a rectangular outer shape and a rectangular opening provided inside, and the side surface of the perforated panel 21 is protected by the frame 22.
  • thin plate-like cover members 23 and 23 formed of a transparent material, for example, acrylic resin, are fitted into the frame 22 so as to sandwich the perforated panel 21 therebetween.
  • the upper surface 21 a and the lower surface 21 b of the perforated panel 21 are protected by being covered with these cover members 23 and 23.
  • the cover member may be provided only on one of the upper surface 21a side and the lower surface 21b side of the perforated panel 21.
  • the perforated panel 21 is protected by the cover members 23 and 23, and the side surface of the perforated panel 21 is protected by the frame 22. Due to such a structure, the perforated panel 21 itself does not require much mechanical strength. Therefore, as the perforated panel 21, for example, a honeycomb panel having a structure in which a large number of band-like metal foils (for example, aluminum foils) are stacked and partially joined and spread in the overlapping direction can be used. In this case, the width of the strip-shaped metal foil is the depth of the through hole 21c. Honeycomb panels having such a structure have already been commercialized in various sizes.
  • the regulation plate 2 having a structure in which the above members are combined has the upper surface 21 a of the perforated panel 21 in a state where the lower surface of the lower cover member 23 is in contact with the upper surface of the well plate WP. It is placed on the well plate WP in a horizontal posture facing upward. Therefore, the axial direction of each through-hole 21c provided in the perforated panel 21 is the vertical direction (Z direction).
  • the regulation plate 2 needs to be placed so that the entire region Rw where the well W is disposed on the upper surface of the well plate WP is covered with the perforated panel 21.
  • at least the lower surface side of the regulating plate 2 may be provided with an engaging portion that is positioned with respect to the well plate WP by engaging with the well plate WP.
  • FIG. 5A, FIG. 5B and FIG. 5C are diagrams for explaining the operation of the perforated panel.
  • the perforated panel 21 has a large number of through-holes 21c penetrating almost perpendicularly to both main surfaces from one main surface (upper surface) 21a to the other main surface (lower surface) 21b.
  • the cross-sectional shape of each through hole 21c is constant in the axial direction (Z direction) of the through hole from one main surface to the other main surface. Focusing on the action of the individual through holes 21c, as shown in FIG. 5A, the diffused light L1 having components La, Lb, and Lc in various directions from the illuminating unit 12 disposed to face the upper surface 21a. Is incident.
  • a light component La having a small incident angle that is incident on the axial direction (Z direction) of the through hole 21c indicated by the alternate long and short dash line goes straight through the through hole 21c and downward from the opening on the lower surface 21b side. Alternatively, the light is emitted substantially downward.
  • the light component Lc having a sufficiently large incident angle enters the inner wall surface of the through hole 21c from the opening on the upper surface 21a side of the through hole 21c.
  • the inner wall surface of the through hole 21c is blackened or painted black. Therefore, the inner wall surface of the through-hole 21c has light absorptivity, and the reflectance at the wall surface is extremely low. Therefore, light incident on the through-hole 21c at a large incident angle is absorbed by the inner wall surface and hardly emitted from the opening on the lower surface 21b side.
  • the incident angle ⁇ of the light component Lb having the largest inclination among the light components that are incident on the through hole 21c from the upper surface 21a side and are not absorbed by the side wall surface but emitted from the lower surface 21b side is the opening width of the through hole 21c.
  • D and the axial length (ie, the thickness of the perforated panel 21) L Depends on D and the axial length (ie, the thickness of the perforated panel 21) L.
  • the light emitted from the lower surface 21b of the perforated panel 21 includes only a component whose inclination angle from the Z direction, that is, the vertical direction of the through hole 21c, that is, the vertical direction is equal to or less than the angle ⁇ .
  • the regulation plate 2 is substantially parallel to the diffused light L1 irradiated from the illuminating unit 12. It is possible to illuminate the well plate WP by generating the illumination light L2.
  • the right side of (Expression 1) represents an approximate number of NA (numerical aperture) of the illumination system including the illumination unit 12 and the restriction plate 2.
  • NA D / ⁇ L 2 + (D / 2) 2 ⁇ 1/2 (Formula 2) If L >> D, it can be approximately expressed as (D / L).
  • the NA of the emitted light can be controlled by setting the opening width D and the axial length L of the through hole 21c.
  • a panel having a honeycomb structure is used for the purpose of controlling the traveling direction of light.
  • an illumination range is limited by arranging an instrument called “honeycomb grid” in front of an illumination light source.
  • Such an instrument is for concentrating illumination light emitted at a wide angle in a narrower range. Therefore, the inner wall surface of the through hole is reflective so that the optical power can be used effectively. Therefore, as shown in FIG. 5C as a comparative example, the light L3 incident at a relatively large incident angle on the opening on one main surface side of the through hole G1 of the honeycomb grid G is reflected inside the through hole and opened on the other main surface side. It is emitted from. That is, the purpose of such an instrument is different from that of the regulation plate 2 that removes light components non-parallel to the imaging direction from the diffused light and generates substantially parallel light.
  • FIG. 6A, FIG. 6B, FIG. 6C, FIG. 6D, FIG. 6E and FIG. 6F are diagrams showing various examples of the cross-sectional shape of the through hole.
  • the perforated panel 21 described above is a honeycomb panel, and the cross section and the opening shape of each through hole 21c are hexagonal as shown in FIG. 6A.
  • the cross-section does not need to be a regular hexagon, but the through holes 21c having the same shape can be arranged without gaps by using a hexagon with opposite sides parallel to each other. Since the light striking the upper surface of the partition wall part that separates the adjacent through holes 21c does not pass to the lower surface side and is lost, the partition wall is preferably as thin as possible. From this point, it can be said that a honeycomb structure formed of a strip-like foil is preferable.
  • band-shaped members may be combined in a lattice shape to form a through hole 21d having a rectangular cross section.
  • the through-hole 21e which has a triangular cross section may be formed by combining a strip
  • a flat belt-like member and a periodic corrugated belt-like member may be combined to form the through hole 21f having the shape shown in FIG. 6D.
  • the periodic corrugated belt-like members may be combined in opposite phases to form the through hole 21g having the shape shown in FIG. 6E.
  • a perforated panel having through holes having various cross-sectional shapes can be used.
  • a perforated panel in which the cross-sectional shape of the through hole is as described above is considered that industrial production is relatively easy.
  • a perforated panel having a structure in which a large number of through holes 21h are formed in a flat plate member may be used.
  • the interval between the adjacent through holes 21h be as small as possible. That is, it is desirable that the ratio (opening ratio) of the opening area to the surface area of the perforated panel is as close to 100% as possible.
  • the opening width D when the through hole has a circular cross-sectional shape, the diameter of the circle can be set as the opening width D.
  • the cross-sectional shape when the cross-sectional shape is not circular, the length of the line segment that can be drawn into the opening having the maximum length (for example, a diagonal line in the case of a rectangle) is regarded as the opening width D that gives the maximum illumination angle of illumination. be able to.
  • the cross-sectional shape and the cross-sectional size are not the same between the plurality of through holes, the above-described effect of restricting the direction of illumination light can be expected to some extent.
  • the cross-sectional shape and size of each through hole are the same.
  • FIG. 7A and FIG. 7B are explanatory views for considering the dimensional relationship of the restriction plate. More specifically, FIG. 7A is a diagram showing the relationship between NA of the illumination system and image contrast when imaging thin cells. Moreover, FIG. 7B is a figure for demonstrating the preferable dimensional relationship of each part of a control plate.
  • the contrast obtained is low if the reciprocal NA (1 / NA) of the illumination system is small. As the reciprocal of NA (1 / NA) increases, the contrast increases, but eventually the increase in contrast saturates.
  • FIG. 7B shows a dimensional relationship necessary for obtaining uniform illumination conditions in the well W.
  • a method for obtaining a relationship such that the illuminance distribution is constant on the inner bottom surface Wb of the well W to which cells or the like adhere will be described.
  • the light emitted from the illuminating unit 12 has an incident angle with respect to the upper surface 21a of the perforated panel 21 that is equal to or smaller than a predetermined angle ⁇ enters the well inner bottom surface Wb.
  • the light quantity distribution of the light passing through one through hole 21c has a mountain-shaped distribution centered on the central axis (shown by a one-dot chain line) of the through hole 21c.
  • the symbol T is the distance from the bottom surface 21b of the perforated panel 21 to the well bottom surface Wb where cells and the like are present.
  • the distance T corresponds to the depth of the well W plus the thickness of the lower surface side cover member 23. In the configuration without the lower surface side cover member, it is equal to the depth of the well W.
  • the distance T is small or the NA ( ⁇ D / L) of the illumination system is small, the overlap of the light amount distribution between the adjacent through holes 21c is small, and the uniformity of the illuminance distribution is impaired.
  • the array pitch P is the center-to-center distance between the eight rectangles surrounding one rectangle and the rectangle at the oblique position where the vertex contacts the vertex.
  • the opening width in the direction parallel to the line segment connecting the centers is the opening width D in (Expression 3).
  • the restriction plate 2 is not a component of the imaging device 1 but is configured as a small and lightweight portable member, thereby adjusting the NA of illumination with a simple configuration and obtaining an image with good image quality. It is possible.
  • FIG. 8 shows an example of the effect of the restriction plate.
  • the inventor used the imaging device 1 having a diffused light source as the illumination unit 12 to image the same raw sample in which cells and the like are thinly distributed on the inner bottom surface of the well W, and verified the difference in images depending on the presence or absence of the regulation plate 2.
  • the upper two images are images of the whole well W, and the lower two images are partially enlarged views.
  • the two images in the left column are images taken without using the restriction plate 2
  • the two images in the right column are images taken in a state where the restriction plate 2 is placed on the well plate WP. is there.
  • the regulation plate 2 used in the experiment is a porous panel 21 made of a honeycomb panel having a cell size (dimension Sc shown in FIG. 6A) of 0.7 mm and a thickness of 7 mm.
  • the direction of light passing between the illumination unit 12 and the well plate WP carrying the raw sample is regulated. Imaging is performed in a state where the restriction plate 2 is arranged.
  • the regulation plate 2 does not need to be a component of the imaging device 1 and is configured as a small and lightweight independent member having the same size as the well plate WP.
  • the regulating plate 2 has a function of selectively allowing only substantially parallel light components from the incident diffused light to pass therethrough. By simply placing the regulating plate 2 on the well plate WP, illumination light close to parallel light for obtaining a necessary contrast can be obtained. Therefore, it is possible to perform imaging under parallel light illumination with a simple configuration without adding a new configuration to the apparatus.
  • the regulation plate 2 is not attached to the image pickup apparatus 1 but is carried into and out of the image pickup apparatus 1 like the well plate WP. Therefore, imaging failure due to erroneous application of the restriction plate 2 to a sample that does not require the restriction plate 2 is avoided.
  • the restriction plate 2 corresponds to the “light restriction device” of the present invention
  • the perforated panel 21 functions as the “flat plate member” of the present invention.
  • the space of the hollow part surrounded by the side wall surface of the through hole 21 corresponds to the “light guide” of the present invention.
  • the frame 22 corresponds to the “frame” of the present invention
  • the cover member 23 corresponds to the “cover member” of the present invention.
  • the illumination unit 12 and the imaging unit 13 function as the “illumination light source” and the “imaging unit” of the present invention, respectively.
  • the well plate WP corresponds to the “sample container” of the present invention.
  • the present invention is not limited to the above-described embodiment, and various modifications other than those described above can be made without departing from the spirit of the present invention.
  • the perforated panel 21 is accommodated in a space surrounded by the frame 22 and the cover members 23 and 23 in order to protect the perforated panel 21 from breakage, dust intrusion, and the like.
  • the frame 22 and the cover member 23 are not essential components for the function of controlling illumination.
  • the inside of the through hole that is hollow in the above embodiment may be filled with a material that is transparent to illumination light (for example, acrylic resin or polycarbonate resin).
  • a material that is transparent to illumination light for example, acrylic resin or polycarbonate resin.
  • a honeycomb panel formed of metal foil is used as the perforated panel 21.
  • the material of the perforated panel is not limited to this, and for example, a honeycomb panel formed using paper, aramid resin, or the like as a raw material can be used. Even in this case, it is preferable that the light reflectance of the surface of the material is suppressed to be small, for example, by black coating or dyeing.
  • the regulation plate 2 of the above embodiment is placed on the upper part of the well plate WP.
  • a spacer member that is sandwiched between the regulation plate 2 and the well plate WP may be separately prepared. In such a configuration, it is possible to change the NA of the illumination system within a predetermined range by using the spacer member, and fine adjustment of the image quality is facilitated.
  • the maximum opening width in the cross section of the light guide is D
  • the length of the light guide in the normal direction is L.
  • a light regulating device may be placed on the upper surface of the sample container.
  • the light restricting tool by arranging the light restricting tool at a position far from the illumination light source and close to the raw sample, it is possible to prevent the light emitted from the through-hole from having the property of diffused light again due to reflection in the container. be able to.
  • the illumination light source may be configured to emit diffused light downward.
  • a diffuse light source can be realized with a relatively simple configuration and low cost, and the light regulating device of the present invention has an illumination light that is substantially parallel to diffuse light with a simple configuration. Can be generated. By combining these, it is possible to obtain an image of a desired quality while suppressing imaging costs.
  • the flat plate member has a plurality of strip members having the same width as the length of the through hole in the normal direction, the plurality of strip members are partially joined, and the plurality of strip members are separated from each other except at the joining portion.
  • the structure by which a through-hole is formed may be sufficient.
  • a technique for producing a flat plate-like member having an opening shape as described above by expanding a part in which a plurality of band-like members having the same width as the length of the through hole are partially joined in the stacking direction is practical. It can be used.
  • the cross-sectional shapes of the plurality of through holes may be the same.
  • the light passing through each through hole is uniform between the through holes, so that it is easy to obtain a uniform illuminance distribution.
  • the cross-sectional shape of the through-hole is arbitrary, but, for example, if it is a polygon, particularly a hexagon having parallel opposite sides, industrial production is easy, and thus manufacturing costs can be kept low. Obviously, if it is a polygon, particularly a hexagon having parallel opposite sides, industrial production is easy, and thus manufacturing costs can be kept low. Obviously, if it is a polygon, particularly a hexagon having parallel opposite sides, industrial production is easy, and thus manufacturing costs can be kept low. Become.
  • the belt-shaped member can be a metal foil whose surface is blackened, for example.
  • blackening the surface reflection of light on the side wall surface of the through hole is suppressed, and light incident at a large incident angle on one main surface side passes through the through hole and is emitted from the other main surface side. Can be suppressed.
  • a transparent solid may be filled in the through hole.
  • clogging due to mechanical damage or opaque dust or the like is prevented in advance, and handling of the light regulating device becomes easier.
  • a sample that cannot obtain sufficient contrast under diffused light illumination such as cells or cell colonies that are two-dimensionally cultured in a medium, is imaged with an imaging device having a diffused light source as illumination light. It is suitable for.

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Abstract

撮像装置に平行光を生成する機能を必要とせず、より簡便に平行光照明下で撮像を行うことを可能とする技術を提供する。拡散光Ｌ１を出射する照明部１２と、ウェルＷに撮像対象物である生試料を担持するウェルプレートＷＰとの間に、上下方向に貫通する多数の微小な貫通孔を有する規制プレート２を載置した状態で撮像を行う。貫通孔の内壁面は黒化処理されて光の反射率が低く抑えられており、規制プレート２に対し小さな入射角で入射した光のみがウェルＷに照射されることで、コントラストの良好な画像が得られる。

Description

撮像方法および光規制器具
　この発明は、試料容器に担持された生試料を照明下で撮像する技術に関するものであり、特にその照明光を調節する技術に関する。
関連出願の相互参照
　以下に示す各日本出願の明細書、図面および特許請求の範囲における開示内容は、参照によりその全内容が本書に組み入れられる：
　特願２０１５－１６８６６３（２０１５年８月２８日出願）。
　医療や生化学等の分野では、細胞や細菌等を含む生試料を観察し、または分析する目的のために、当該生試料を撮像するための装置が実用化されている。例えば特許文献１に記載の撮像装置では、ウェルプレートと称される試料容器に担持されるスフェロイド（細胞集塊）に対し照明光としての白色拡散光が上方から入射し、下方へ透過してくる光が受光されることで、撮像対象である生試料としてのスフェロイドの撮像が行われる。
特開２０１５－１１８０３６号公報
　生試料に含まれる撮像対象物が、例えば、容器の底面に沿って二次元的に広がる細胞または細胞コロニーである場合がある。この場合、細胞が透明に近いため、拡散光による照明下では十分なコントラストが得られないことがある。このような生試料については、平行光による照明下で撮像を行うことでコントラストの改善が図れることがわかっている。
　一方、このような撮像技術において、照明光として拡散光を必要とするケースも依然として多い。したがって、照明光源を拡散光と平行光とで切り替えることができれば便宜である。しかしながら、拡散光源と比較して平行光源は一般に装置構成が複雑である。また試料や目的に応じて適切な照明方法を選択するには光学的な知識が必要である。そのため、不慣れなユーザが、所望する画像品質を得るのに手間取ってしまうという問題も生じ得る。そこで、平行光を生成する機能を撮像装置に付加しなくても、より簡便に平行光照明下での撮像を行うことのできる技術が求められる。
　この発明は上記課題に鑑みなされたものであり、撮像装置に平行光を生成する機能を必要とせず、より簡便に平行光照明下で撮像を行うことを可能とする技術を提供するものである。
　この発明の一の態様は、生試料を担持する試料容器を水平に支持し、試料容器の上方に照明光源を、照明光源と試料容器との間に光規制器具を、試料容器の下方に撮像手段をそれぞれ配置する工程と、照明光源からの光を光規制器具を介して生試料に入射させ、試料容器の下方に透過する光を撮像手段で受光して生試料を撮像する工程とを備え、光規制器具は、試料容器に載置可能な平板形状で一方主面側から他方主面側に貫通する複数の貫通孔が一方主面に沿って二次元的に近接配列された平板状部材を有し、貫通孔の各々は、一方主面の法線方向に沿って一様な断面形状を有する導光路となっており、貫通孔の側壁面が光吸収性を有することを特徴とする撮像方法である。
　このように構成された発明では、光規制器具の一方主面側から入射する光のうち入射角が比較的大きい成分は光規制器具により吸収され、他方主面側からは、進行方向が規制された平行光に近い光が出射される。そのため、試料容器に担持された生試料に対し、光規制器具を介して略平行光とされた照明光が入射する。したがって、試料容器内で二次元的に分布する細胞等の生試料を良好なコントラストで撮像することが可能である。また、照明光源は例えば一般的な拡散光源であってもよく、照明光源や撮像手段に改変を加える必要がない。そのため、撮像コストの上昇を抑えることができ、不適切な照明による撮像の失敗も回避することができる。
　また、この発明の他の態様は、平板形状を有し一方主面側から他方主面側に貫通する複数の貫通孔が一方主面に沿って二次元的に近接配列された平板状部材と、一方主面および他方主面とは異なる平板状部材の端面を覆う枠体とを備え、貫通孔の各々は、一方主面の法線方向に沿って一様な断面形状を有する導光路となっており、貫通孔の側壁面が光吸収性を有することを特徴とする光規制器具である。
　また、この発明の他の態様は、平板形状を有し、一方主面側から他方主面側に貫通する複数の貫通孔が一方主面に沿って二次元的に近接配列された平板状部材と、一方主面および他方主面の少なくとも一方を覆う透明なカバー部材とを備え、貫通孔の各々は、一方主面の法線方向に沿って一様な断面形状を有する導光路となっており、貫通孔の側壁面が光吸収性を有することを特徴とする光規制器具である。
　これらの光規制器具は、上記した撮像方法に好適に適用可能な構成を有している。すなわち、上記構成の光規制器具が照明光源と試料容器との間に配置されることにより、既存の撮像装置や試料容器に何ら変更を加えることなく、平行光照明下で生試料の撮像を行うことが可能である。
　このうち平板状部材の端面を覆う枠体を有する構成では、枠体によって平板状部材を機械的に保護することが可能となる。そのため、平板状部材としては強度の低い部材を用いることも可能になる。また、平板状部材の少なくとも他方主面側を覆うカバー部材を有する構成では、平板状部材により奏される光学的効果を損なうことなく、平板状部材を損傷や埃から保護することが可能となる。これにより、光規制器具の取扱いが容易となる。
　上記のように、本発明によれば、光規制器具を用いることで出射光の方向が規制された照明光が得られるので、撮像装置に平行光を生成する機能を必要とせず、より簡便に平行光照明下での撮像を行うことができる。
　この発明の前記ならびにその他の目的と新規な特徴は、添付図面を参照しながら次の詳細な説明を読めば、より完全に明らかとなるであろう。ただし、図面は専ら解説のためのものであって、この発明の範囲を限定するものではない。
この発明にかかる撮像方法の一実施形態が適用された撮像装置の例を示す図である。 撮像対象物と照明光源との組み合わせを例示する第１の図である。 撮像対象物と照明光源との組み合わせを例示する第２の図である。 撮像対象物と照明光源との組み合わせを例示する第３の図である。 規制プレートの構造を示す斜視図である。 規制プレートの側面断面図である。 規制プレートの側面断面図である。 有孔パネルの作用を説明する第１の図である。 有孔パネルの作用を説明する第２の図である。 有孔パネルの比較例を示す図である。 貫通孔の断面形状の第１の例を示す図である。 貫通孔の断面形状の第２の例を示す図である。 貫通孔の断面形状の第３の例を示す図である。 貫通孔の断面形状の第４の例を示す図である。 貫通孔の断面形状の第５の例を示す図である。 貫通孔の断面形状の第６の例を示す図である。 規制プレートの寸法関係を考察するための第１の説明図である。 規制プレートの寸法関係を考察するための第２の説明図である。 規制プレートの効果の一例を示す図である。
　図１はこの発明にかかる撮像方法の一実施形態が適用された撮像装置の例を示す図である。この実施形態では、ウェルプレートＷＰの上面に形成されたウェルＷと称される窪部に注入された液体中で培養される細胞等の生試料が、撮像装置１により撮像される。このとき、ウェルプレートＷＰの上部に規制プレート２が載置された状態で撮像が行われることが、本発明にかかる撮像方法の特徴の１つである。ここではまず、規制プレート２を用いない一般的な撮像方法について説明する。図１において、ＸＹ平面は水平面を表す。また、Ｚ軸は鉛直軸を表し、より詳しくは（＋Ｚ）方向が鉛直上向き方向を表している。
　ウェルプレートＷＰは、創薬や生物科学の分野において一般的に使用されているものである。ウェルプレートＷＰでは、平板状のプレートの上面に、断面が略円形の筒状に形成され底面が透明で略平坦なウェルＷが複数設けられている。１つのウェルプレートＷＰにおけるウェルＷの数は任意であるが、例えば９６個（１２×８のマトリクス配列）のものを用いることができる。各ウェルＷの直径および深さは代表的には数ｍｍ程度である。なお、この撮像装置１が対象とするウェルプレートのサイズやウェルの数はこれらに限定されるものではなく任意であり、例えば１２ないし３８４穴のものが一般的に使用されている。また、複数ウェルを有するウェルプレートに限らず、例えばディッシュと呼ばれる平型の容器で培養された生試料の撮像にも、この撮像装置１を使用することが可能である。
　ウェルプレートＷＰの各ウェルＷには、培地Ｍとしての液体が所定量注入され、この液体中において所定の培養条件で培養された細胞が、この撮像装置１の撮像対象となる。培地Ｍは適宜の試薬が添加されたものでもよく、また液状でウェルＷに投入された後ゲル化するものであってもよい。後述するように、この撮像装置１では、例えばウェルＷの内底面で培養された細胞やスフェロイド等を撮像対象とすることができる。常用される一般的な液量は、５０ないし２００マイクロリットル程度である。
　なお、ウェルＷ内で培養され撮像対象となる生試料としては、孤立した細胞、多数の細胞が培地内で二次元的に広がるように分布した細胞コロニー、細胞が培地内で三次元的に集まってなるスフェロイド（細胞集塊）などを適用可能である。また、撮像装置１を用いて、細菌や生体組織などの生試料を撮像することも可能である。以下、撮像対象物となるこれらを総称して「細胞等」という。
　撮像装置１は、細胞等を培地とともに各ウェルＷに担持するウェルプレートＷＰを保持するホルダ１１を備える。より具体的には、ホルダ１１は、ウェルプレートＷＰの下面周縁部に当接してウェルプレートＷＰを略水平姿勢に保持する。また、撮像装置１は、ホルダ１１の上方に配置される照明部１２と、ホルダ１１の下方に配置される撮像部１３と、これら各部の動作を制御するＣＰＵ１４１を有する制御部１４とを備えている。
　照明部１２は、ホルダ１１により保持されたウェルプレートＷＰに向けて適宜の照明光（例えば白色光）を出射する。より具体的には、例えば光源としての白色ＬＥＤ（Light Emitting Diode）光源と拡散板とを組み合わせたものが、照明部１２として用いられる。照明部１２下部の光出射面は、ウェルプレートＷＰ上面よりも大きな平面サイズを有し、ウェルプレートＷＰ上面のうちウェルＷが形成された領域の全体を覆うように設けられる。このような構成では、照明部１２下部の各部から種々の方向に出射される拡散光Ｌ１により、ウェルプレートＷＰに設けられた各ウェルＷ内の細胞等が上方から均一に照明される。
　ホルダ１１により保持されたウェルプレートＷＰの下方に、撮像部１３が設けられる。撮像部１３には、ウェルプレートＷＰの直下位置に図示を省略する撮像光学系が配置されている。撮像光学系の光軸は鉛直方向（Ｚ方向）に向けられている。
　撮像部１３により、ウェルＷ内の生試料が撮像される。具体的には、照明部１２から出射されウェルＷの上方から培地Ｍに入射した光が撮像対象物である細胞等を照明する。ウェルＷ底面から下方へ透過した光が、撮像光学系を介して図示しない撮像素子の受光面に入射する。撮像光学系により撮像素子の受光面に結像する撮像対象物の像が、撮像素子により撮像される。撮像素子としては例えばＣＣＤセンサまたはＣＭＯＳセンサを用いることができ、二次元イメージセンサおよび一次元イメージセンサのいずれであってもよい。
　撮像部１３は、制御部１４に設けられたメカ制御部１４６によりＸＹＺ方向に移動可能となっている。具体的には、メカ制御部１４６が、ＣＰＵ１４１からの制御指令に基づき、撮像部１３をＸ方向およびＹ方向に移動させる。これにより、撮像部１３がウェルＷに対し水平方向に移動する。またＺ方向への移動によりフォーカス調整がなされる。１つのウェルＷ内の撮像対象物が撮像されるときには、メカ制御部１４６は、光軸が当該ウェルＷの中心と一致するように、撮像部１３を水平方向に位置決めする。撮像部１３の撮像素子が一次元イメージセンサである場合には、イメージセンサの長手方向と直交する方向に撮像部１３を走査させることにより二次元画像を撮像することができる。このような撮像方法では、撮像対象である細胞等に対し非接触、非破壊かつ非侵襲で撮像を行うことができ、撮像による細胞等へのダメージを抑えることができる。
　撮像部１３の撮像素子から出力される画像信号は、制御部１４に送られる。すなわち、画像信号は制御部１４に設けられたＡＤコンバータ（Ａ／Ｄ）１４３に入力されてデジタル画像データに変換される。ＣＰＵ１４１は、受信した画像データに基づき適宜画像処理を実行する。制御部１４はさらに、画像データを記憶保存するための画像メモリ１４４と、ＣＰＵ１４１が実行すべきプログラムやＣＰＵ１４１により生成されるデータを記憶保存するためのメモリ１４５とを有しているが、これらは一体のものであってもよい。ＣＰＵ１４１は、メモリ１４５に記憶された制御プログラムを実行することにより、後述する各種の演算処理を行う。
　その他に、制御部１４には、インターフェース（ＩＦ）部１４２が設けられている。インターフェース部１４２は、ユーザからの操作入力の受け付けや、ユーザへの処理結果等の情報提示を行うほか、通信回線を介して接続された外部装置との間でのデータ交換を行う。なお、制御部１４は、上記したハードウェアを備えた専用装置であってもよく、またパーソナルコンピュータやワークステーション等の汎用処理装置に、上記の処理機能を実現するための制御プログラムを組み込んだものであってもよい。すなわち、この撮像装置１の制御部１４として、汎用のコンピュータ装置を利用することが可能である。汎用処理装置を用いる場合、撮像装置１には、撮像部１３等の各部を動作させるために必要最小限の制御機能が備わっていれば足りる。
　図２Ａ、図２Ｂおよび図２Ｃは撮像対象物と照明光源との組み合わせを例示する図である。図２Ａは、ウェルＷ内の撮像対象物が培地Ｍ内で立体的な形状を有する例えばスフェロイドＳである場合を示す。この場合、照明部１２から出射される拡散光Ｌ１が入射することで、スフェロイドＳの表面の広い範囲が効果的に照明される。このため、コントラストの良好な画像を撮像することが可能である。
　一方、図２Ｂは、撮像対象物がウェルＷの内底面Ｗｂに沿って培地Ｍ内で二次元的に薄く広がる細胞（または細胞コロニー）Ｃである場合を示す。この場合、細胞自体が透明に近いことから、高いコントラストを得にくい。細胞Ｃの周縁部があたかもレンズのように作用することで出射光の方向が変化するという現象が知られているが、拡散光による照明下ではこのような光を選択的に検出することは難しい。このような場合には、図２Ｃに示すように平行光に近い照明光Ｌ２がより好ましい。照明光Ｌ２は細胞Ｃの周縁部で屈折するため、撮像された画像では細胞Ｃの周縁部が他の領域よりも低輝度となり、細胞Ｃの輪郭がより明瞭に現れる。
　細胞等の表面や内部のテクスチャを詳細に観察するという目的とは別に、ウェルＷ内に分布する細胞等のサイズや個数を高速に自動計測するという用途のために撮像が行われる場合がある。特にこのような用途においては、細胞等の輪郭部分が周囲の背景部分と明瞭に異なる輝度で表現された画像が有用である。
　このように、照明方法は撮像対象物や撮像の目的によって使い分ける必要がある。そのため、撮像装置１は、撮像対象物に応じて、照明部１２から出射される照明光を拡散光と平行光とで切り替え可能であることが望ましい。しかしながら、撮像装置１に２種類の光源を設ける、あるいは拡散光から擬似的に平行光を生成するための機構を設けることは装置構成の大型化・複雑化を招き、撮像コストの上昇理由ともなり得る。また、撮像対象物とのマッチングに適さない照明が使用された結果、所望の画像品質が得られないという失敗の原因にもなり得る。
　そこで、この発明にかかる撮像方法では、撮像装置１には拡散光を出射する照明部１２のみが設けられる。そして、照明光として平行光が必要な場合には、次に説明する規制プレート２がウェルプレートＷＰの上部に載置される。これにより、ウェルＷ内の撮像対象物に略平行光である照明光Ｌ２が入射するようになる。すなわち、規制プレート２は、照明部１２から出射される拡散光のうち上面への入射角が所定角度以下の光成分を下面側へ通過させる一方、入射角が所定角度より大きい光成分を吸収し下面側への通過を規制する機能を有する。規制プレート２の下面からは、進行方向が規制された、より具体的には、撮像部１３の撮像方向（Ｚ方向）に対し傾きが所定角度以下の進行方向を有する略平行な光が出射され、各ウェルＷに入射する。
　図３は規制プレートの構造を示す斜視図である。また、図４Ａおよび図４Ｂは規制プレートの側面断面図である。より詳しくは、図４Ａは図３の切断面Ａにおいて規制プレート２の断面を見たときの分解組立図であり、図４Ｂは規制プレート２がウェルプレートＷＰに載置された状態を示す断面図である。
　規制プレート２の主要部は、ウェルプレートＷＰの上面のうちウェルＷが配置された領域Ｒｗの全体を覆う平面サイズを有する有孔パネル２１である。有孔パネル２１は、両主面２１ａ，２１ｂが平行な平板状の外形を有している。一方主面２１ａ側から他方主面２１ｂ側へこれらの主面に対し垂直な、つまりこれらの主面の法線に平行な方向に貫通する貫通孔２１ｃが多数設けられている。貫通孔２１ｃの配列は、主面に沿った方向に二次元的かつ規則的となっている。図３右上の円内は有孔パネル２１の一方主面２１ａの部分拡大図である。同図に示すように各貫通孔２１ｃは六角形断面を有し、有孔パネル２１はいわゆるハニカム構造を有している。このような構造では、軽量で高い強度が得られる。
　なお、以下の説明では、有孔パネル２１の両主面２１ａ，２１ｂのうち、ウェルプレートＷＰ上に載置された時に照明部１２と対向することとなる上側の一方主面２１ａを「上面」、ウェルプレートＷＰの上面と対向する下側の他方主面２１ｂを「下面」と称することがある。規制プレート２１自体は、以下に説明するように表裏の区別のない構造となっており、上下を入れ替えても同じように機能する。
　有孔パネル２１は、外形が矩形で内部に矩形の開口が設けられたフレーム２２に収められており、フレーム２２により有孔パネル２１の側面が保護される。また、透明材料、例えばアクリル樹脂により形成された薄板状で互いに同一形状のカバー部材２３，２３が、有孔パネル２１を挟むようにフレーム２２にはめ込まれている。有孔パネル２１の上面２１ａおよび下面２１ｂは、これらのカバー部材２３，２３により覆われることで保護される。なお、カバー部材は有孔パネル２１の上面２１ａ側および下面２１ｂ側のいずれか一方のみに設けられてもよい。
　このように、有孔パネル２１の上面２１ａおよび下面２１ｂがカバー部材２３，２３によって保護され、有孔パネル２１の側面がフレーム２２によって保護される。このような構造であるため、有孔パネル２１自体には機械的強度がさほど必要とされない。したがって、有孔パネル２１としては、例えば帯状の金属箔（例えばアルミニウム箔）を多数重ねてそれらを部分的に接合し、それを重畳方向に広げてなる構造のハニカムパネルを用いることができる。この場合、帯状金属箔の幅が貫通孔２１ｃの深さとなる。このような構造のハニカムパネルは各種サイズのものが既に製品化されている。
　上記各部材が組み合わされた構造を有する規制プレート２は、図４Ｂに示すように、下側のカバー部材２３の下面がウェルプレートＷＰの上面に接した状態で、有孔パネル２１の上面２１ａを上向きにして水平姿勢でウェルプレートＷＰ上に載置される。したがって、有孔パネル２１に設けられた各貫通孔２１ｃの軸方向は鉛直方向（Ｚ方向）となる。
　ウェルプレートＷＰ上面のうちウェルＷが配置された領域Ｒｗの全体が有孔パネル２１に覆われるように、規制プレート２が載置される必要がある。この目的のために、規制プレート２の少なくとも下面側に、ウェルプレートＷＰと係合することでウェルプレートＷＰとの間で位置決めを行う係合部位が設けられてもよい。規制プレート２の上面側および下面側の両側に係合部位が設けられた場合、規制プレート２の上下の区別は不要である。
　図５Ａ、図５Ｂおよび図５Ｃは有孔パネルの作用を説明する図である。上記したように、有孔パネル２１は一方主面（上面）２１ａから他方主面（下面）２１ｂまで、両主面の双方にほぼ垂直に貫通する貫通孔２１ｃを多数有している。各貫通孔２１ｃの断面形状は、一方主面から他方主面に向かう貫通孔の軸方向（Ｚ方向）において一定である。個々の貫通孔２１ｃの作用に着目すると、図５Ａに示すように、貫通孔２１ｃには、上面２１ａに対向配置される照明部１２から種々の方向の成分Ｌａ，Ｌｂ，Ｌｃを有する拡散光Ｌ１が入射する。
　一点鎖線で示される貫通孔２１ｃの軸方向（Ｚ方向）に対し平行または極めて小さい傾きで入射する、入射角度の小さい光成分Ｌａは、貫通孔２１ｃ内を直進して下面２１ｂ側の開口から下向きまたは略下向きに出射される。一方、入射角が十分に大きい光成分Ｌｃは、貫通孔２１ｃの上面２１ａ側開口から貫通孔２１ｃの内壁面に入射する。
　このように入射角の大きい光成分を除去するために、有孔パネル２１では、貫通孔２１ｃの内壁面が黒化処理されまたは黒色に塗装されている。したがって、貫通孔２１ｃの内壁面は光吸収性を有し、壁面での反射率が極めて低くなっている。そのため、大きい入射角で貫通孔２１ｃに入射した光は内壁面によって吸収され、下面２１ｂ側開口からはほとんど出射されない。
　上面２１ａ側から貫通孔２１ｃに入射し、側壁面に吸収されることなく下面２１ｂ側から出射される光成分のうち最も大きな傾きを有する光成分Ｌｂの入射角θは、貫通孔２１ｃの開口幅Ｄと軸方向長さ（すなわち有孔パネル２１の厚さ）Ｌとに依存する。図５Ａから明らかなように、角度θは下式：
　　ｔａｎθ＝Ｄ／Ｌ　…　（式１）
により表される。すなわち、貫通孔２１ｃの開口幅Ｄおよび軸方向長さＬを適宜に選択することにより、貫通孔２１ｃ内で吸収されることなく規制プレート２の下面から出射される光の最大入射角θを調整することが可能である。
　有孔パネル２１の下面２１ｂから出射される光は、貫通孔２１ｃの軸方向であるＺ方向、つまり鉛直方向からの傾き角が上記角度θ以下である成分のみを含むものである。貫通孔２１ｃの開口幅Ｄを十分小さく、かつ軸方向長さＬを十分大きくすることにより、図５Ｂに示すように、規制プレート２は、照明部１２から照射される拡散光Ｌ１から略平行な照明光Ｌ２を生成してウェルプレートＷＰを照明することが可能となる。（式１）の右辺は、照明部１２および規制プレート２を含む照明系のＮＡ（開口数）の概数を表している。より厳密には、ＮＡは下式：
　　ＮＡ＝Ｄ／｛Ｌ２＋（Ｄ／２）２｝１/２　…　（式２）
により表され、Ｌ≫Ｄであれば近似的に（Ｄ／Ｌ）と表すことができる。このように、貫通孔２１ｃの開口幅Ｄおよび軸方向長さＬの設定により、出射光のＮＡを制御することが可能である。
　なお、光の進行方向を制御する目的でハニカム構造のパネルを使用する例は従来から知られている。例えば一般的な撮像技術においては、照明光源の前面に「ハニカムグリッド」と称される器具を配置することで照明範囲を制限することが行われている。このような器具は、広角に出射される照明光をより狭い範囲に集中させるためのものである。したがって、光パワーを有効に活用することができるように貫通孔の内壁面が反射性となっている。そのため、図５Ｃに比較例として示すように、ハニカムグリッドＧの貫通孔Ｇ１の一方主面側開口に比較的大きな入射角で入射した光Ｌ３は、貫通孔内部で反射して他方主面側開口から出射される。すなわち、このような器具と、拡散光から撮像方向に非平行な光成分を除去し略平行光を生成する規制プレート２とは目的が異なるものである。
　図６Ａ、図６Ｂ、図６Ｃ、図６Ｄ、図６Ｅおよび図６Ｆは貫通孔の断面形状の各種の例を示す図である。上記した有孔パネル２１はハニカムパネルであり、各貫通孔２１ｃの断面および開口形状は、図６Ａに示すように六角形である。この場合、断面は正六角形である必要はないが、対辺が平行な六角形とすることで、同一形状の貫通孔２１ｃを隙間なく配置することができる。隣接する貫通孔２１ｃを隔てる隔壁部分の上面に当たった光は下面側に通過せず損失となるため、隔壁はできるだけ薄いことが好ましい。この点からも、帯状の箔により形成されたハニカム構造が好適であると言える。
　この他に、例えば図６Ｂに示すように帯状部材が格子状に組み合わされて、矩形の断面を有する貫通孔２１ｄが形成されてもよい。また、図６Ｃに示すように帯状部材が互いに異なる３種類の角度で組み合わされて、三角形断面を有する貫通孔２１ｅが形成されてもよい。また、平らな帯状部材と周期的な波型の帯状部材とが組み合わされて、図６Ｄに示す形状の貫通孔２１ｆが形成されてもよい。また、周期的な波型の帯状部材同士が逆位相で組み合わされて、図６Ｅに示す形状の貫通孔２１ｇが形成されてもよい。このように、種々の断面形状を有する貫通孔を有する有孔パネルを使用可能である。貫通孔の断面形状が上記したものである有孔パネルは、工業的生産が比較的容易と考えられるものである。
　すなわち、貫通孔の長さと同じ幅を有する多数の帯状部材を、隣接する帯状部材間で局所的に接合し、当該接合部位を除く部分では帯状部材間が離間するような構造とすることで、帯状部材の表面を側壁面とする多数の貫通孔を実現することができる。例えば、幅方向位置を揃えて厚さ方向に重ねて隣接する帯状部材同士を複数箇所で局所的に接合した構造体を作成し、これを帯状部材の厚さ方向に広げることにより、図６Ａおよび図６Ｅに示す構造を実現することが可能である。
　また、図６Ｆに示すように、平板状の部材に多数の貫通孔２１ｈが穿設された構造の有孔パネルであってもよい。この場合、光の損失を抑えるために、隣接する貫通孔２１ｈ間の間隔はできるだけ小さいことが望ましい。すなわち、有孔パネルの表面積に対して開口面積の占める割合（開口率）が１００％にできるだけ近いことが望ましい。
　なお、（式１）への開口幅Ｄの適用に当たって、貫通孔の断面形状が円形である場合には当該円の直径を開口幅Ｄとすることができる。一方、断面形状が円形でない場合には、開口内に引ける線分のうち長さが最大となる（例えば矩形の場合は対角線）ものの長さを、照明の最大照明角度を与える開口幅Ｄと見なすことができる。
　また、複数の貫通孔の間において断面形状や断面サイズが互いに同一でなくても、上記した照明光の方向規制効果はある程度期待できる。しかしながら、ウェルＷの各部に均一な照明光を入射させるためには、各貫通孔の断面の形状およびサイズを互いに同一としておくことがより好ましい。
　図７Ａおよび図７Ｂは規制プレートの寸法関係を考察するための説明図である。より具体的には、図７Ａは、薄い細胞を撮像するときの照明系のＮＡと画像コントラストとの関係を示す図である。また、図７Ｂは規制プレート各部の好ましい寸法関係を説明するための図である。図２Ｂに示すように二次元的に広がる薄い細胞Ｃを撮像対象とするとき、図７Ａに示すように、照明系のＮＡの逆数（１／ＮＡ）が小さければ得られるコントラストが低い。ＮＡの逆数（１／ＮＡ）が大きくなるとコントラストは大きくなるが、最終的にはコントラストの上昇は飽和する。
　このことから、ＮＡの大きい拡散光での照明では高いコントラストが得られず、より平行光に近い照明が求められるが、極端に高精度な平行光を必要とするものでもないことがわかる。図７Ａに示すように、コントラストの上昇が鈍る点Ｑに対応するＮＡが得られるように、規制プレート２各部の寸法が設定されることが現実的である。あるいは、必要とされるコントラスト値に対応するＮＡとなるような寸法関係が採用されてもよい。
　図７Ｂには、ウェルＷにおいて均一な照明条件を得るために必要な寸法関係が示されている。ここでは、細胞等が付着するウェルＷの内底面Ｗｂにおいて照度分布が一定となるような関係を求める方法を説明する。図において点線で示されるように、照明部１２から出射された光のうち有孔パネル２１の上面２１ａに対する入射角が所定角度θ以下のものがウェル内底面Ｗｂに入射する。１つの貫通孔２１ｃを通過する光の光量分布は、当該貫通孔２１ｃの中心軸（一点鎖線で示される）を中心とする山型の分布を有する。近接配置された複数の貫通孔２１ｃによる光量分布が部分的に重なることにより、それらが合成されてなる照度分布は均一なものに近づく。
　符号Ｔは有孔パネル２１の下面２１ｂから細胞等が存在するウェル内底面Ｗｂまでの距離である。規制プレート２がウェルプレートＷＰに載置される場合には、距離ＴはウェルＷの深さに下面側カバー部材２３の厚さを加えたものに相当する。下面側カバー部材がない構成においては、ウェルＷの深さと等しい。この距離Ｔが小さい場合、あるいは照明系のＮＡ（≒Ｄ／Ｌ）が小さい場合には、近接する貫通孔２１ｃ間での光量分布の重なりが小さく、照度分布の均一性が損なわれる。
　例えば個々の貫通孔２１ｃからの出射光の光量分布が貫通孔２１ｃの配列ピッチＰの２倍以上であれば、光量分布の重なりによる照度分布をほぼ均一とすることができる。このための条件は、図７Ｂより、下式：
　　Ｐ≦Ｄ（１／２＋Ｔ／Ｌ）≒Ｌ・ＮＡ（１／２＋Ｔ／Ｌ）＝ＮＡ（Ｌ／２＋Ｔ）　…　（式３）
により表すことができる。１つの貫通孔と、それに隣接する貫通孔のうち中心間の距離が最大のものとの間の距離が、（式３）における配列ピッチＰとなる。六角形の貫通孔２１ｃでは、１つの貫通孔とこれに隣接する６つの六角形との中心間距離は同一であり、この距離が配列ピッチＰである。また、矩形の貫通孔２１ｄでは、１つの矩形を取り囲む８つの矩形のうち、当該矩形と頂点が接する斜め方向位置にある矩形との中心間距離が、配列ピッチＰである。それらの中心を結ぶ線分と平行な方向（すなわち対角線の方向）の開口幅が、（式３）における開口幅Ｄである。
　例えば、有孔パネル２１の厚さＬが７ｍｍ、ウェル内底面Ｗｂまでの距離Ｔが１０ｍｍである場合、ＮＡ＝０．１に相当する画像コントラストを得ようとすると、貫通孔２１ｃの開口幅Ｄを０．７ｍｍ、その配列ピッチＰを１．３５ｍｍ以下とすればよい。言い換えれば、このような寸法関係を有する規制プレート２を用いることで、ＮＡ＝０．１相当のコントラストを有する画像を、よりＮＡの大きい拡散光源を用いて撮像することが可能である。各部の寸法が異なる規制プレートを複数種用意しておけば、用途に応じて適宜選択して使用することが可能になる。
　また、既存の規制プレート２を用いて撮像対象物側から見た照明のＮＡを変化させたい場合には、規制プレート２とウェルプレートＷＰとの距離を調整すればよい。このように、規制プレート２を撮像装置１の構成部品とせず、小型かつ軽量な可般部材として構成することにより、簡単な構成で照明のＮＡを調節して、画像品質の良好な画像を得ることが可能である。
　図８は規制プレートの効果の一例を示す図である。発明者は、照明部１２として拡散光源を有する撮像装置１を用い、ウェルＷ内底面に細胞等が薄く分布する同一の生試料を撮像して規制プレート２の有無による画像の違いを検証した。図において上段の２つの画像はウェルＷの全体を撮像した画像であり、下段の２つの画像は部分拡大図である。また、左欄の２つの画像は規制プレート２を用いずに撮像された画像であり、右欄の２つの画像はウェルプレートＷＰ上に規制プレート２が載置された状態で撮像された画像である。
　実験に用いられた規制プレート２は、セルサイズ（図６Ａに示す寸法Ｓｃ）０．７ｍｍ、厚さ７ｍｍのハニカムパネルを有孔パネル２１としたものである。
　図８からわかるように、規制プレート２を用いずに撮像された画像では細胞等の存在する部分と背景部分とで濃淡の差が少なく、細胞等の輪郭が不明瞭である。これに対し、規制プレート２を用いて撮像された画像では、画像全体の明るさはやや低下しているものの、細胞等に対応する部分と背景部分とで濃淡の差がより顕著となっている。このことから、細胞等の個数、大きさ、位置等を計測するのに好適な画像となっていることがわかる。
　以上のように、照明光源として拡散光源を有する撮像装置１を用いるこの実施形態の撮像方法では、照明部１２と生試料を担持するウェルプレートＷＰとの間に、通過する光の方向を規制する規制プレート２を配置した状態で撮像が行われる。規制プレート２は撮像装置１の構成部品である必要はなく、ウェルプレートＷＰと同程度のサイズの小型かつ軽量な独立した部材として構成されている。そして、規制プレート２は入射する拡散光から略平行な光成分のみを選択的に通過させる機能を有している。規制プレート２をウェルプレートＷＰに載置するだけで、必要なコントラストを得るための平行光に近い照明光が得られる。そのため、装置に新たな構成を付加することなく、簡便な構成で平行光照明下での撮像を行うことが可能である。
　また、規制プレート２は撮像装置１に取り付けるものではなく、ウェルプレートＷＰと同様に撮像装置１に対し搬入・搬出されるものである。したがって、規制プレート２を必要としない試料に対し誤って規制プレート２が適用されることに起因する撮像の失敗が回避される。
　以上説明したように、上記実施形態においては、規制プレート２が本発明の「光規制器具」に相当しており、有孔パネル２１が本発明の「平板状部材」として機能している。また、貫通孔２１の側壁面により囲まれた中空部分の空間が本発明の「導光路」に相当している。また、フレーム２２が本発明の「枠体」に、カバー部材２３が本発明の「カバー部材」に、それぞれ相当している。また、上記した撮像装置１においては、照明部１２および撮像部１３がそれぞれ本発明の「照明光源」および「撮像手段」として機能している。また、上記実施形態では、ウェルプレートＷＰが本発明の「試料容器」に相当している。
　なお、本発明は上記した実施形態に限定されるものではなく、その趣旨を逸脱しない限りにおいて上述したもの以外に種々の変更を行うことが可能である。例えば、上記した規制プレート２では、有孔パネル２１を破損や埃の侵入等から保護するために、フレーム２２およびカバー部材２３，２３により囲まれた空間内に有孔パネル２１が収容されている。しかしながら、照明の制御という機能に対してはフレーム２２およびカバー部材２３は必須の構成というわけではない。
　例えば、上記実施形態では中空である貫通孔の内部を、照明光に対して透明な材料（例えばアクリル樹脂やポリカーボネート樹脂）で充填した構成とすることもできる。このような構成では、貫通孔が中実となることで有孔パネル自体に必要十分な強度を持たせることが可能となり、フレームおよびカバー部材のいずれかまたは両方を省くことが可能となる。
　また、上記実施形態では有孔パネル２１として金属箔により形成されたハニカムパネルが用いられている。しかしながら、有孔パネルの材料はこれに限定されず、例えば紙やアラミド樹脂などを素材として形成されたハニカムパネルを用いることが可能である。この場合でも、例えば黒色の塗装や染色等により、素材の表面は光の反射率が小さく抑えられていることが好ましい。
　また、上記実施形態の規制プレート２はウェルプレートＷＰの上部に載置されることが前提となっている。しかしながら、規制プレートからウェル内底面までの距離を調節するために、規制プレート２とウェルプレートＷＰとの間に挟み込むスペーサ部材が別途用意されていてもよい。このような構成では、スペーサ部材を使用することで照明系のＮＡを所定範囲内で変化させることが可能となり、画像品質の微調整が容易となる。
　以上、具体的な実施形態を例示して説明してきたように、本発明における光規制器具は、導光路の断面における最大の開口幅をＤ、導光路の法線方向の長さをＬとしたとき、下式：
　　ｔａｎθ＝Ｄ／Ｌ
の関係を満たす角度θ以下の入射角で一方主面に入射する光を通過させて試料容器に入射させ、角度θより大きい入射角の光を遮光する構成であってもよい。このような構成によれば、導光路の開口幅と長さとを調節することで、試料容器に入射する光の入射角の範囲を任意に規制することができる。
　また、本発明にかかる撮像方法においては、例えば光規制器具が、試料容器の上面に載置されてもよい。このような構成では、光規制器具を保持するための部材や機構を別途設ける必要がなく、また貫通孔から撮像対象物である生試料までの距離を容易に確定させることができる。また、照明光源から遠く、生試料に近い位置に光規制器具が配置されることで、貫通孔から出射された光が容器内での反射等により再び拡散光としての性質を帯びるのを抑制することができる。
　また例えば、光規制器具において複数の貫通孔が一定ピッチＰで配列されており、光規制器具の他方主面から試料容器の内底面までの距離をＴとするとき、下式：
　　Ｐ≦Ｄ・（１／２＋Ｔ／Ｌ）
の関係が満たされるような各部の寸法関係とされてもよい。このような構成では、近接配置された貫通孔から出射される光の分布が互いに重なり合うことで、均一に近い照明条件を実現することができる。
　また例えば、照明光源は、下向きに拡散光を出射するように構成されてもよい。生試料を撮像する装置における照明光源として、拡散光源は比較的簡単な構成および低コストで実現可能なものであり、本発明の光規制器具は、簡単な構成で拡散光から略平行な照明光を生成することができるものである。これらを組み合わせることで、撮像コストを抑えつつ、所望の品質の画像を得ることが可能となる。
　また例えば、平板状部材は、法線方向における貫通孔の長さと同じ幅の帯状部材を複数有し、複数の帯状部材が部分的に接合され、接合部位以外で複数の帯状部材が互いに離隔することで貫通孔が形成される構成であってもよい。例えば、貫通孔の長さと同じ幅を有する複数の帯状部材が部分的に接合されてなるものをその積層方向に広げることによって、上記のような開口形状を有する平板状部材を製造する技術が実用化されており、これを利用することができる。
　また例えば、複数の貫通孔におけるそれぞれの断面形状が互いに同一であってもよい。このような構成では、各貫通孔を通過する光が貫通孔間で一様となるため、均一な照度分布を得やすくなる。
　また、貫通孔の断面形状は任意であるが、例えば多角形、特に平行な対辺を有する六角形となるようにすると、工業的に生産が容易であるため、製造コストを低く抑えることが可能となる。
　この場合の帯状部材は、例えば表面を黒化された金属箔とすることができる。表面が黒化処理されることにより、貫通孔の側壁面での光の反射を抑え、一方主面側に大きな入射角で入射した光が貫通孔を通過し他方主面側から出射されるのを抑制することができる。
　また例えば、貫通孔の内部に透明な固体が充填されていてもよい。このような構成では、貫通孔の内部が中実となっていることで機械的損傷や不透明な埃等による目詰まりが未然に防止されており、光規制器具の取扱いがより簡単となる。
　以上、特定の実施例に沿って発明を説明したが、この説明は限定的な意味で解釈されることを意図したものではない。発明の説明を参照すれば、本発明のその他の実施形態と同様に、開示された実施形態の様々な変形例が、この技術に精通した者に明らかとなるであろう。故に、添付の特許請求の範囲は、発明の真の範囲を逸脱しない範囲内で、当該変形例または実施形態を含むものと考えられる。
　本発明は、例えば培地中で二次元培養された細胞または細胞コロニーのように、拡散光照明下では十分なコントラストを得ることができない試料を、照明光として拡散光源を有する撮像装置で撮像する場合に好適である。
　１　撮像装置
　２　規制プレート（光規制器具）
　１２　照明部（照明光源）
　１３　撮像部（撮像手段）
　２１　有孔パネル（平板状部材）
　２１ａ　（有孔パネルの）一方主面
　２１ｂ　（有孔パネルの）他方主面
　２１ｃ　貫通孔
　２２　フレーム（枠体）
　２３　カバー部材
　Ｗ　ウェル
　ＷＰ　ウェルプレート（試料容器）

Claims (14)

  1. 　生試料を担持する試料容器を水平に支持し、前記試料容器の上方に照明光源を、前記照明光源と前記試料容器との間に光規制器具を、前記試料容器の下方に撮像手段をそれぞれ配置する工程と、
    　前記照明光源からの光を前記光規制器具を介して前記生試料に入射させ、前記試料容器の下方に透過する光を前記撮像手段で受光して前記生試料を撮像する工程と
    を備え、
    　前記光規制器具は、前記試料容器に載置可能な平板形状で、一方主面側から他方主面側に貫通する複数の貫通孔が前記一方主面に沿って二次元的に近接配列された平板状部材を有し、
    　前記貫通孔の各々は、前記一方主面の法線方向に沿って一様な断面形状を有する導光路となっており、前記貫通孔の側壁面が光吸収性を有する
    ことを特徴とする撮像方法。
  2. 　前記光規制器具は、前記導光路の断面における最大の開口幅をＤ、前記導光路の前記法線方向の長さをＬとしたとき、下式：
    　　ｔａｎθ＝Ｄ／Ｌ
    の関係を満たす角度θ以下の入射角で前記一方主面に入射する光を通過させて前記試料容器に入射させ、前記角度θより大きい入射角の光を遮光する請求項１に記載の撮像方法。
  3. 　前記光規制器具が、前記試料容器の上面に載置される請求項１または２に記載の撮像方法。
  4. 　前記光規制器具において複数の前記貫通孔が一定ピッチＰで配列されており、前記平板状部材の前記他方主面から前記試料容器の内底面までの距離をＴとするとき、下式：
    　　Ｐ≦Ｄ・（１／２＋Ｔ／Ｌ）
    の関係が満たされる請求項１ないし３のいずれかに記載の撮像方法。
  5. 　前記照明光源が下向きに拡散光を出射する請求項１ないし４のいずれかに記載の撮像方法。
  6. 　平板形状を有し、一方主面側から他方主面側に貫通する複数の貫通孔が前記一方主面に沿って二次元的に近接配列された平板状部材と、
    　前記一方主面および前記他方主面とは異なる前記平板状部材の端面を覆う枠体と
    を備え、
    　前記貫通孔の各々は、前記一方主面の法線方向に沿って一様な断面形状を有する導光路となっており、前記貫通孔の側壁面が光吸収性を有する
    ことを特徴とする光規制器具。
  7. 　平板形状を有し、一方主面側から他方主面側に貫通する複数の貫通孔が前記一方主面に沿って二次元的に近接配列された平板状部材と、
    　前記一方主面および前記他方主面の少なくとも一方を覆う透明なカバー部材と
    を備え、
    　前記貫通孔の各々は、前記一方主面の法線方向に沿って一様な断面形状を有する導光路となっており、前記貫通孔の側壁面が光吸収性を有する
    ことを特徴とする光規制器具。
  8. 　前記平板状部材は、前記導光路の断面における最大の開口幅をＤ、前記導光路の前記法線方向の長さをＬとしたとき、下式：
    　　ｔａｎθ＝Ｄ／Ｌ
    の関係を満たす角度θ以下の入射角で前記一方主面に入射する光を通過させ、前記角度θより大きい入射角の光を遮光する請求項６または７に記載の光規制器具。
  9. 　前記平板状部材は、前記法線方向における前記貫通孔の長さと同じ幅の帯状部材を複数有し、前記複数の帯状部材が部分的に接合され、接合部位以外で前記複数の帯状部材が互いに離隔することで前記貫通孔が形成される請求項６ないし８のいずれかに記載の光規制器具。
  10. 　前記帯状部材は、表面が黒化された金属箔である請求項９に記載の光規制器具。
  11. 　複数の前記貫通孔におけるそれぞれの断面形状が互いに同一である請求項６ないし１０のいずれかに記載の光規制器具。
  12. 　前記貫通孔の断面形状が多角形である請求項１１に記載の光規制器具。
  13. 　前記貫通孔の断面形状が、平行な対辺を有する六角形である請求項１２に記載の光規制器具。
  14. 　前記貫通孔の内部に透明な固体が充填された請求項６ないし１３のいずれかに記載の光規制器具。
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