JP6894908B2 - 観察装置 - Google Patents

Description

本発明は、観察装置に関するものである。

従来、細胞等の被写体を標識せずに観察する装置として、位相差観察法や微分干渉観察法を用いた観察装置が知られている（例えば、特許文献１参照。）。

特開平７−２６１０８９号公報

しかしながら、特許文献１の観察装置は、被写体を挟んで撮影光学系と照明光学系とを配置する必要があり、装置が大型化、複雑化するという不都合がある。

本発明は、上述した事情に鑑みてなされたものであって、装置を大型化させることなく、偏射照明により細胞等の試料を立体的にコントラストよく観察することができる観察装置を提供することを目的としている。

上記目的を達成するため、本発明は以下の手段を提供する。
本発明の一態様は、試料の下方から上方に向けて照明光を射出する照明光学系と、該照明光学系から射出された照明光が前記試料の上方で反射されて前記試料を透過した透過光を前記試料の下方において撮影する撮影光学系とを備え、前記照明光学系が、特定の広さの射出領域から前記照明光を拡散させて射出する拡散部材を備え、前記撮影光学系が、前記透過光を集光する対物光学系を備え、前記照明光学系の前記射出領域が前記対物光学系の瞳に投影された場合に、該対物光学系の瞳の辺縁部において前記照明光の一部が遮られるように、以下の条件を満足する観察装置である。
ＮＡｍｉｎ＞（Ｄ＋ＦＯＶｙ）／（４Ｈｔｍｉｎ−４Ｈｂｍｉｎ＋２ＷＤ）
ＮＡｍｉｎ＞（ＦＯＶｙ＋Ｔ／２）／（２Ｈｔｍｉｎ−２Ｈｂｍｉｎ）
Ｙ２＞ＮＡ（２Ｈｔｍａｘ＋Ｈ´´−Ｈｂｍａｘ）＋（ＦＯＶｙ／２）
Ｙ１＞ＮＡ（２Ｈｔｍｉｎ＋Ｈ´´−Ｈｂｍｉｎ）＋（ＦＯＶｙ／２）
ここで、ＮＡｍｉｎ：偏射照明条件から要請される対物光学系の試料側の開口数の最低値、Ｄ：対物光学系の枠の試料に近い部分の直径、ＦＯＶｙ：対物光学系の実視野、Ｈｔｍｉｎ：試料の載置面を基準とした試料の上方における照明光の反射面の高さの最低値、Ｈｂｍｉｎ：試料の載置面を基準とした試料における照明光の入射面の高さの最低値、ＷＤ：対物光学系の作動距離、Ｔ：対物光学系の枠の試料に近い部分の直径とその部分での対物光学系の有効光束直径との差、Ｙ２：対物光学系の光軸を基準とした拡散部材の射出領域における対物光学系から遠い端までの距離、Ｈｔｍａｘ：試料の載置面を基準とした試料の上方における照明光の反射面の高さの最高値、Ｈ´´：拡散部材の射出領域を基準とした試料の載置面の高さ、Ｈｂｍａｘ：試料の載置面を基準とした試料における照明光の入射面の高さの最高値、Ｙ１：対物光学系の光軸を基準とした拡散部材の射出領域における対物光学系に近い端までの距離である。

本態様によれば、試料の下方において照明光学系から射出された照明光は、試料の上方において反射されて試料を上方から下方に透過させられる。試料を透過した透過光は、試料の下方に配置されている撮影光学系によって撮影される。照明光学系および撮影光学系の両方を試料の下方に配置したので、装置を大型化させることなく、透過光を撮影することにより試料を標識せずに観察することができる。この場合において、上記条件を満足することで、容器内の試料を偏射照明で立体的にコントラストよく観察することができる。

上記態様においては、前記拡散部材を前記対物光学系の光軸に沿う方向および該光軸に交差する方向の少なくとも一方に移動させる駆動部を備えることとしてもよい。

このように構成することで、駆動部により、試料の載置面を基準とした試料の上方における照明光の反射面の高さが低い場合は、拡散部材を対物光学系の光軸に沿って容器から離間させる方向に移動させ、試料の載置面を基準とした試料の上方における照明光の反射面の高さが高い場合は、拡散部材を対物光学系の光軸に沿って容器に近接させる方向に移動させることによって、容器内の試料を偏射照明でコントラストよく観察するための条件を満たすことができる。これにより、Ｙ２（対物光学系の光軸を基準とした拡散部材の射出領域における対物光学系から遠い端までの距離）を大きくしなくて済み、装置全体の設置面積を小さくすることができる。

また、駆動部により、試料の載置面を基準とした試料の上方における照明光の反射面の高さが低い場合は、拡散部材を対物光学系に近接させ、試料の載置面を基準とした試料の上方における照明光の反射面の高さが高い場合は、拡散部材を対物光学系から離間させることによって、容器内の試料を偏射照明でコントラストよく観察するための条件を満たすことができる。これにより、拡散部材の面積を小さくして、拡散部材と照明光を発生する光源との距離を短くすることができ、拡散部材での光密度を向上して明るい照明を実現することができる。

上記態様においては、前記反射面を有し前記試料の上方に配置可能な高さ補正具を備えることとしてもよい。
試料の上方、例えば、試料を収容する容器の上方に高さ補正具を配置することで、反射面の高さの最低値Ｈｔｍｉｎを大きくすることができる。

本発明によれば、装置を大型化させることなく、偏射照明により細胞等の試料を立体的にコントラストよく観察することができるという効果を奏する。

本発明の一実施形態に係る観察装置の縦断面図である。 図１の照明光学系から射出され容器の天板で反射されて対物光学系に入射する照明光の光線の軌跡の一例を示す縦断面図である。 視野周辺が暗くなった画像の一例を示す図である。 図１の拡散板における対物光学系から遠い射出領域端から射出された照明光の光線の軌跡の一例を示す縦断面図である。 視野の左端を通った光の瞳面での光束の位置の一例を示す図である。 視野の右端を通った光の瞳面での光束の位置の一例を示す図である。 視野の左端を通った光の瞳面での光束の位置の一例を示す図である。 視野の右端を通った光の瞳面での光束の位置の一例を示す図である。 図１の拡散板における対物光学系から遠い射出領域端から射出された照明光の光線の軌跡の他の一例を示す縦断面図である。 容器の天板が低い場合の瞳面での照明光の光束の位置の一例を示す図である。 容器の天板が高い場合の瞳面での照明光の光束の位置の一例を示す図である。 図１の拡散板における対物光学系に近い射出領域端から射出された照明光の光線の軌跡の一例を示す縦断面図である。 視野の左端を通った光の瞳面での光束の位置の一例を示す図である。 視野の右端を通った光の瞳面での光束の位置の一例を示す図である。 視野の左端を通った光の瞳面での光束の位置の一例を示す図である。 視野の右端を通った光の瞳面での光束の位置の一例を示す図である。 図１の拡散板における対物光学系に近い射出領域端から射出された照明光の光線の軌跡の他の一例を示す縦断面図である。 容器の天板が低い場合の瞳面での照明光の光束の位置の一例を示す図である。 容器の天板が高い場合の瞳面での照明光の光束の位置の一例を示す図である。 図１の対物光学系における照明光の通過位置ごとの軌跡の一例を示す図である。 偏射照明により立体的に見える試料の一例を示す図である。 本発明の一実施形態の第１実施例に係る観察装置の概略構成を示す縦断面図である。 図１６の観察装置を上方から対物光学系の光軸に沿って見た横断面図である。 図１６の観察装置において、条件式（５），（６），（７），（８）を満たす各種パラメータの一例を示す図である。 本発明の一実施形態の第２実施例に係る観察装置の概略構成を示す縦断面図である。 図１９の観察装置において、条件式（５），（６），（７），（８）を満たす各種パラメータの一例を示す図である。 本発明の一実施形態の第３実施例に係る観察装置の概略構成を示す縦断面図である。 図２１の観察装置において、条件式（５），（６），（７），（８）を満たす各種パラメータの一例を示す図である。 本発明の一実施形態の第４実施例に係る観察装置の概略構成を示す縦断面図である。 図２３の観察装置において、条件式（５），（６），（７），（８）を満たす各種パラメータの一例を示す図である。 図２３の観察装置の変形例の概略構成を示す縦断面図である。

本発明の一実施形態に係る観察装置１について図面を参照して以下に説明する。
本実施形態に係る観察装置１は、図１に示すように、試料Ｘを収容した容器２を載置するステージ３と、ステージ３の下方に配置され、ステージ３を上方から透過して来る光を集光する対物光学系（対物レンズ）４を備え、試料Ｘを透過して対物光学系４により集光された光を撮影する撮影光学系６と、対物光学系４の径方向外方に配置され、ステージ３を透過して上方に照明光を射出する照明光学系５とを備えている。

ステージ３には、対物光学系４および照明光学系５の上方を覆うように、光学的に透明な材質、例えば、ガラス板３ａが配置され、容器２はガラス板３ａの上面に載置されるようになっている。
容器２は、例えば、光を反射する天板（反射面）２ａおよび試料Ｘを載置する底面（試料載置面）２ｂを有する細胞培養フラスコであり、全体的に光学的に透明な樹脂により構成されている。

照明光学系５は、照明光を発生するＬＥＤ光源７と、ＬＥＤ光源７から発せられた照明光を拡散させる拡散板（拡散部材）８とを備えている。
拡散板８には、ＬＥＤ光源７からの照明光を射出させる射出領域９を制限する照明マスク１０が設けられている。

撮影光学系６は、対物光学系４の他、対物光学系４により集光された透過光を撮影する撮像素子１２と、撮像素子１２により撮影された透過光の情報から画像を生成するプロセッサ（図示略）等を備えている。

対物光学系４は、先端に配置された先端レンズ１３と、先端レンズ１３に対して基端側に光軸に沿う方向に間隔をあけて配置された基端レンズ１４と、先端レンズ１３と基端レンズ１４との間の光軸上に配された瞳（明るさ絞り）１５と、これらを収容する枠１６とを備えている。

このように構成された観察装置１において、ＬＥＤ光源７から容器２に入射される照明光の光束が対物光学系４の枠１６でけられない条件について説明する。
まず、図２に示すように、視野の右端（照明光学系５から遠い側の端）Ｘ１ａをＮＡの角度で通る照明光について、対物光学系４の先端４ｂでの光線の軌跡の水平方向の位置は、以下の式により求められる。
−ＦＯＶｙ／２＋ＮＡ（２Ｈ＋ＷＤ）
そして、照明光の光線が対物光学系４の枠１６でけられないためには、照明光が対物光学系４の枠１６よりも左側を通っている必要があり、以下の条件式を満たす必要がある。
−ＦＯＶｙ／２＋ＮＡ（２Ｈ＋ＷＤ）＞Ｄ／２
ここで、ＦＯＶｙ：対物光学系４の実視野（実視野は照明方向に関する最大値であり、対角でなくてもよい。）、ＮＡ：対物光学系４の試料Ｘ側の開口数、Ｈ：試料Ｘにおける照明光の入射面（フォーカス面、以下、「標本面」という。）Ｘ１を基準とした容器２の天板２ａの高さ、ＷＤ：対物光学系４の作動距離（対物光学系４の枠１６の試料Ｘに最も近い部分または対物光学系４の先端レンズ１３のどちらか高い方を基準とした標本面Ｘ１の高さである。

容器２の天板２ａの高さが決まっている場合は、対物光学系４に必要なＮＡの最小値ＮＡｍｉｎは、条件式（１´），（２´）を満たす。
ＮＡｍｉｎ＞（Ｄ＋ＦＯＶｙ）／（４Ｈ＋２ＷＤ）・・・（１´）
ＮＡｍｉｎ＞（Ｄ＋ＦＯＶｙ）／（４Ｈｔ−４Ｈｂ＋２ＷＤ）・・・（２´）
ここで、ＮＡｍｉｎ：偏射照明の条件から要請されるＮＡの最低値、Ｄ：対物光学系４の枠１６における試料Ｘに近い部分の直径、Ｈｔ：容器２の底面２ｂを基準とした天板２ａの高さ、Ｈｂ：容器２の底面２ｂを基準とした標本面Ｘ１の高さである。

容器２の天板２ａの高さが低いほど、ＮＡが高い対物光学系４が必要になる。このため、対物光学系４のＮＡは容器２の天板２ａの高さが１番低いものに合わせて条件式（１），（２）を満たすことが望ましい。
ＮＡｍｉｎ＞（Ｄ＋ＦＯＶｙ）／（４Ｈｍｉｎ＋２ＷＤ）・・・（１）
ＮＡｍｉｎ＞（Ｄ＋ＦＯＶｙ）／（４Ｈｔｍｉｎ−４Ｈｂｍｉｎ＋２ＷＤ）・・・（２）
ここで、Ｈｍｉｎ：標本面Ｘ１を基準とした容器２の天板２ａの高さの最低値、Ｈｔｍｉｎ：容器２の底面２ｂを基準とした天板２ａの高さの最低値、Ｈｂｍｉｎ：容器２の底面２ｂを基準とした標本面Ｘ１の高さの最低値である。

対物光学系４の枠１６における試料Ｘに近い部分での対物光学系４の有効光束直径ｄは、以下の式により求められる。
ｄ＝ＦＯＶｙ＋２ＷＤ・ＮＡｍｉｎ

また、偏射照明の条件から要請される対物光学系４の枠１６における試料Ｘに近い部分の直径の最小値Ｄｍｉｎは、照明光の光線が枠１６によってけられないように、ｄにさらに余裕量（対物光学系４の枠１６における試料Ｘに近い部分の直径とその部分での光束直径の差）Ｔが必要なため、以下の式（３）により求められる。
Ｄｍｉｎ＝ＦＯＶｙ＋２ＮＡｍｉｎ・ＷＤ＋Ｔ・・・（３）

式（３）を条件式（２）に適用すると、条件式（４）となる。
ＮＡｍｉｎ＞（ＦＯＶｙ＋Ｔ／２）／（２Ｈｔｍｉｎ−２Ｈｂｍｉｎ）・・・（４）

ＮＡが条件式（１），（２），（３），（４）を下回ると、図３に示すように、対物光学系４の視野周辺、特に視野の右側が暗くなり、試料Ｘを観察することができなくなる。

次に、照明光が対物光学系４の瞳面で瞳端にかかる条件について説明する。
対物光学系４に入射する角度が最大なのは、図４に示すように、拡散板８における対物光学系４から遠い射出領域端９ａから射出される照明光である。そして、観察の視野全体で偏射照明になる条件は、拡散板８の射出領域端９ａから射出されて視野の左端（照明光学系５に近い側の端）を通る照明光の像が対物光学系４の瞳１５の外側に形成されることである。

この場合、対物光学系４の光軸を基準とした拡散板８における対物光学系４から遠い射出領域端９ａまでの距離Ｙ２は、条件式（５´）を満たす必要がある。
Ｙ２＞ＮＡ（２Ｈ＋Ｈ´）＋（ＦＯＶｙ／２）・・・（５´）
ここで、Ｈ´：拡散板８の射出領域９を基準とした標本面Ｘ１の高さである。

図５Ａは、視野の左端を通った照明光の対物光学系４の瞳面での光束Ｗの位置を示し、図５Ｂは、視野の右端Ｘ１ａを通った照明光の対物光学系４の瞳面での光束Ｗの位置を示している。

Ｙ２が条件式（５´）を下回ると、対物光学系４における照明光の入射角が小さくなって光束Ｗすべてが瞳１５内を通過するため、偏射照明の条件から外れてしまい、コントラストが低下する。
図６Ａは、視野の左端を通った照明光の対物光学系４の瞳面での光束Ｗの位置を示し、図６Ｂは、視野の右端Ｘ１ａを通った照明光の対物光学系４の瞳面での光束Ｗの位置を示している。なお、図４において実線で示された光線が、図６Ａに示されている瞳面での光束Ｗにおける光軸から遠い側の端面になる。

図７に示すように、容器２の天板２ａの高さが変わると、対物光学系４に入射する照明光の角度が変わる。天板２ａの高さが高いほど照明光の入射角度が小さくなり、瞳面での照明光の像が瞳端よりも内側に入りやすくなる。したがって、天板２ａの高さが最も高い容器２（高さＨｍａｘ）に対して、条件式（１´）を満たすようにすることが望ましい。

この場合、対物光学系４の光軸を基準とした拡散板８における対物光学系４から遠い射出領域端９ａまでの距離Ｙ２が、条件式（５），（６）を満たす必要がある。
Ｙ２＞ＮＡ（２Ｈｍａｘ＋Ｈ´ｍａｘ）＋（ＦＯＶｙ／２）・・・（５）
Ｙ２＞ＮＡ（２Ｈｔｍａｘ＋Ｈ´´−Ｈｂｍａｘ）＋（ＦＯＶｙ／２）・・・（６）
ここで、Ｈｍａｘ：標本面Ｘ１を基準とした容器２の天板２ａの高さの最高値、Ｈ´ｍａｘ：拡散板８の射出領域９を基準とした標本面Ｘ１の高さの最高値、Ｈｔｍａｘ：容器２の底面２ｂを基準とした天板２ａの高さの最高値、Ｈ´´：拡散板８の射出領域９を基準とした容器２の底面２ｂの高さ、Ｈｂｍａｘ：容器２の底面２ｂを基準とした標本面Ｘ１の高さである。

図８Ａは、容器２の天板２ａが低い場合の瞳面での照明光の光束Ｗの位置を示し、図８Ｂは、容器２の天板２ａの高さが高い場合の瞳面での照明光の光束Ｗの位置を示している。

Ｙ２が条件式（５），（６）を下回ると、対物光学系４における照明光の入射角が小さくなり、光束Ｗすべてが瞳１５の内側を通過するため、偏射照明の条件から外れてしまい、コントラストが低下する。

次に、照明光の光束が対物光学系４の瞳１５の外に出ないための条件について説明する。
対物光学系４に入射する角度が最小なのは、図９に示すように、拡散板８における対物光学系４に近い射出領域端９ｂから射出される照明光である。そして、観察の視野全体で偏射照明になる条件は、拡散板８の射出領域端９ｂから射出されて視野の右端Ｘ１ａを通った照明光の像が対物光学系４の瞳１５の内側に形成されることである。

この場合、対物光学系４の光軸を基準とした拡散板８における対物光学系４に近い射出領域端９ｂまでの距離Ｙ１は、条件式（７´）を満たす。
Ｙ１＋（ＦＯＶｙ／２）＜ＮＡ（２Ｈ＋Ｈ´）・・・（７´）

図１０Ａは、視野の左端を通った照明光の対物光学系４の瞳面での光束Ｗの位置を示し、図１０Ｂは、視野の右端Ｘ１ａを通った照明光の対物光学系４の瞳面での光束Ｗの位置を示している。

Ｙ１が条件式（７´）を上回ると、図１１Ｂに示すように、照明光の光束Ｗすべてが瞳１５の外に出てしまうため像が暗くなる。
図１１Ａは、視野の左端を通った照明光の対物光学系４の瞳面での光束Ｗの位置を示し、図１１Ｂは、視野の右端Ｘ１ａを通った照明光の対物光学系４の瞳面での光束Ｗの位置を示している。なお、図９において点線で示された光線が、図１１Ｂに示されている瞳面での光束Ｗにおける光軸に近い側の端面になる。

図１２に示すように、容器２の天板２ａの高さが低いほど、対物光学系４に入射する照明光の角度が大きくなり、瞳面での照明光の像が瞳端よりも外側に外れやすくなる。したがって、天板２ａの高さが最も低い容器２（高さＨｍｉｎ）に対して、条件式（２´）を満たすことが望ましい。

この場合、対物光学系４の光軸を基準とした拡散板８における対物光学系４に近い射出領域端９ｂまでの距離Ｙ１は、条件式（７），（８）を満たす必要がある。
Ｙ１＜ＮＡ（２Ｈｍｉｎ＋Ｈ´ｍｉｎ）−（ＦＯＶｙ／２）・・・（７）
Ｙ１＜ＮＡ（２Ｈｔｍｉｎ＋Ｈ´´−Ｈｂｍｉｎ）−（ＦＯＶｙ／２）・・・（８）
ここで、Ｈ´ｍｉｎ：拡散板８の射出領域９を基準とした標本面Ｘ１の高さの最低値である。

図１３Ａは、容器２の天板２ａの高さが高い場合の瞳面での照明光の光束Ｗの位置を示し、図１３Ｂは、容器２の天板２ａの高さが低い場合の瞳面での照明光の光束Ｗの位置を示している。
Ｙ１が条件式（７），（８）を上回ると、図１３Ｂに示すように、照明光の光束Ｗすべてが瞳１５の外に出てしまうため、像が暗くなる。

本実施形態に係る観察装置１は、照明光学系５の射出領域９が対物光学系４の瞳１５に投影された場合に、対物光学系４の瞳１５の辺縁部１５ａにおいて照明光の一部が遮られるように、上記条件式（２），（４），（６），（８）を満足するようになっている。

このように構成された観察装置１の作用について説明する。
本実施形態に係る観察装置１により、容器２に収容した細胞のように透明な試料Ｘを観察する場合、図１に示すように、試料Ｘを容器２内に収容して底面２ｂに接着させた状態で、容器２を底面２ｂが下側になるようにステージ３のガラス板３ａ上に載置する。

この状態で、ＬＥＤ光源７を作動させて照明光を発生させる。ＬＥＤ光源７から発せられた照明光は、拡散板８によって拡散された状態で、ガラス板３ａおよび容器２の底面２ｂを下から上に向かって透過し、容器２の天板２ａ内面において反射して試料Ｘに対して斜め上方から照射される。

試料Ｘに照射された照明光のうち、試料Ｘを透過した透過光が容器２の底面２ｂおよびガラス板３ａを上から下に向かって透過して、対物光学系４に光軸に対して斜めに入射する。この際、照明光は試料Ｘの形状や屈折率によって屈折、散乱され、あるいは、試料Ｘの透過率によって減光されることで、試料Ｘの情報を載せた透過光となって対物光学系４により集光され、撮像素子１２によって撮影される。

ここで、対物光学系４内において、瞳１５よりも外側を通る透過光は遮られる。図１４に示すように、対物光学系４における照明光の入射角が対物光学系４の取り込み角と同等の場合は、試料Ｘを通らない照明光Ｌ１、Ｌ５は、瞳１５の辺縁部１５ａ近傍を通り、像面１２ａに達する。また、試料Ｘの左端を通った照明光Ｌ２は、試料Ｘにおいて屈折して瞳１５の外側に達してけられ、像面１２ａに達しない。また、試料Ｘの中央付近を通った照明光Ｌ３および試料Ｘの右側を通った照明光Ｌ４は、試料Ｘにおいて屈折され、瞳１５の辺縁部１５ａよりも内側を通って像面１２ａに達する。この結果、図１５に示すように、試料Ｘに影がついて立体的に見えるようになる。

このように、本実施形態に係る観察装置１によれば、試料Ｘの下方に照明光学系５および撮影光学系６の両方を配置したことで、従来、試料を挟んだ両側に照明光学系と撮影光学系とを配置していた透過光の観察装置と比較すると、試料Ｘの片側のみに照明光学系５および撮影光学系６を集約した分だけ、装置を薄型化することができるという利点がある。また、そのように薄型化した観察装置１においても、透過光を撮影することにより細胞等の被写体を標識せずに観察することができるという利点がある。

この場合において、上記条件式（２），（４），（６），（８）を満足することで、照明光学系５の射出領域９が対物光学系４の瞳１５に投影された場合に、対物光学系４の瞳１５の辺縁部１５ａにおいて照明光の一部が遮られることにより、試料Ｘの像に明暗を形成することができ、試料Ｘが立体的に見えるようになる。したがって、容器２内の試料Ｘを偏射照明で立体的にコントラストよく観察することができる。

また、本実施形態においては、拡散板８により、ＬＥＤ光源７から発せられた照明光を均一に拡散し、照明ムラの少ない均一な強度の照明光を試料Ｘに照射することができる。

本実施形態においては、反射面の高さの最低値Ｈｔｍｉｎを大きくするための高さ補正具をさらに備えていてもよい。
高さ補正具は、照明光を反射する反射面を有し容器２の上方に配置可能である。このような高さ補正具として、例えば、天板を有する空の容器または蓋付きの空の容器が用いられる。空の容器は、試料Ｘを収容する容器２と同一種類のものであってもよく、異なる種類のものであってもよい。シャーレやウェルプレートのような蓋付きの容器の蓋のみを高さ補正具として用いてもよい。
試料Ｘを収容した容器２の上に高さ補正具を載置することで、反射面の位置がより高くなる。これにより、条件式（３）および（４）によって規定されるＮＡｍｉｎの条件が緩和され、ＮＡがより低く視野がより広い対物光学系４の使用が可能となる。

＜第１実施例＞
次に、本発明の一実施形態に係る観察装置２１の第１実施例について以下に説明する。
本実施例に係る観察装置２１は、図１６および図１７に示すように、撮影光学系６の対物光学系４を挟んで対物光学系４の光軸に直交する方向に間隔をあけて配置された２つの照明光学系５Ａ，５Ｂを備えている。

また、これら照明光学系５Ａ，５Ｂと対物光学系４がＸＹステージ（図示略、駆動部）に搭載されており、ＸＹステージにより観察位置をＸＹ方向に移動することができるようになっている。撮影光学系６は、Ｚステージ（図示略）に搭載されており、フォーカスを合わせられるようになっている。なお、照明光学系５Ａ，５Ｂは、観察位置に応じて適当な方を使用することとすればよい。

容器２は、細胞培養用のフラスコやウェルプレートを想定しており、天板２ａの高さＨｔが空気換算長で１５ｍｍから４０ｍｍ程度を有している。容器２の底面２ｂを基準とした標本面Ｘ１（細胞接着面）の高さＨｂは、空気換算長で２ｍｍ程度を有している。

細胞のような試料Ｘの形状を判別でき、かつ容器２に収容されている細胞の数や密度を解析するのに適した対物光学系４の実視野ＦＯＶｙは、３ｍｍ程度である。
また、構造上の要請により、対物光学系４の作動距離ＷＤは５ｍｍ程度で、光束に対する対物光学系４の枠１６の余裕量Ｔは３ｍｍ程度である。

上記条件式（３），（４）より、偏射照明の条件から要請される対物光学系４の枠１６の試料Ｘに近い部分の直径の最小値Ｄｍｉｎは７．３３ｍｍであり、偏射照明の条件から要請される対物光学系４の試料Ｘ側の開口数（ＮＡ）の最低値ＮＡｍｉｎは０．１７である。

容器２の天板２ａの傾きのバラツキや製造誤差を考慮し、ＮＡは条件式（３）よりも少し大きくしてＮＡ＝０．２５とし、対物光学系４の枠１６の試料Ｘに近い部分の直径Ｄは８．５ｍｍとする。
これらＮＡおよびＤの値を用いたときに、照明光学系５の拡散板８の射出領域９を基準とした容器２の底面２ｂの高さＨ´´を変えて条件式（５），（６），（７），（８）を満たす条件を図１８に示す。

本実施例に係る観察装置２１によれば、対物光学系４の仕様および照明光学系５のレイアウトが条件をすべて満たしており、様々な容器２の細胞を偏射照明により立体的にコントラストよく観察することができる。

＜第２実施例＞
次に、本発明の一実施形態に係る観察装置２１の第２実施例について以下に説明する。
本実施例においては、図１９に示すように、拡散板８およびＬＥＤ光源７がＺステージ（図示略、駆動部）に搭載されており、Ｚステージにより拡散板８およびＬＥＤ光源７を対物光学系４の光軸に沿う方向に移動して、採用する容器２の天板２ａの高さに応じて拡散板８およびＬＥＤ光源７の位置を変更する。

拡散板８の射出領域９を基準とした容器２の底面２ｂの高さＨ´´は３ｍｍ〜８ｍｍの範囲で可変とし、対物光学系４の光軸を基準とした拡散板８における対物光学系４に近い射出領域端９ｂまでの距離Ｙ１を９．３ｍｍとし、対物光学系４の光軸を基準とした拡散部材８の射出領域９における対物光学系４から遠い射出領域端９ａまでの距離Ｙ２を２６ｍｍとする。

容器２は、デッシュのように天板２ａの高さが低いもの、例えば、容器２の底面２ｂを基準とした天板２ａの高さＨｔが１０ｍｍで、容器２の底面２ｂを基準とした標本面Ｘ１の高さＨｂが１ｍｍのものを用いることとしてもよい。

条件式（３），（４）より、偏射照明の条件から要請される対物光学系４の枠１６の試料Ｘに近い部分の直径の最小値Ｄｍｉｎは８．５ｍｍ、偏射照明の条件から要請される対物光学系４の試料Ｘ側の開口数（ＮＡ）の最低値ＮＡｍｉｎは０．２５よりも大きいものとする。

容器２の天板２ａの傾きのバラツキや製造誤差を考慮し、ＮＡは条件式（３）よりも少し大きくしてＮＡ＝０．３とし、対物光学系４の枠１６の試料Ｘに近い部分の直径Ｄは９．０ｍｍとする。
これらＮＡおよびＤの値を用いたときに、照明光学系５の拡散板８の射出領域９を基準とした容器２の底面２ｂの高さＨ´´を変えて、条件式（５），（６），（７），（８）を満たす条件を図２０に示す。

本実施例に係る観察装置２１によれば、容器２の天板２ａの高さが低い場合（Ｈｔが小さい場合）は、Ｚステージにより、拡散板８およびＬＥＤ光源７を対物光学系４の光軸に沿って容器２から離間させる方向に移動させる（Ｈ´´を大きくする）ことで、条件式（５），（６），（７），（８）が満たされる。また、容器２の天板２ａの高さが高い場合は、Ｚステージにより、拡散板８およびＬＥＤ光源７を対物光学系４の光軸に沿って容器２に近接させる方向に移動させる（Ｈ´´を小さくする）ことで、条件式（５），（６），（７），（８）が満たされる。

これにより、Ｙ２（対物光学系４の光軸を基準とした拡散部材８の射出領域９における対物光学系４から遠い射出領域端９ａまでの距離）を大きくしなくても容器２内の試料Ｘを偏射照明でコントラストよく観察するための条件を満たすことができ、装置全体の設置面積を小さくすることができる。

＜第３実施例＞
次に、本発明の一実施形態に係る観察装置２１の第３実施例について以下に説明する。
本実施例においては、図２１に示すように、ＸＹステージにより拡散板８およびＬＥＤ光源７を対物光学系４の光軸に直交する方向に移動し、採用する容器２の天板２ａの高さに応じて拡散板８およびＬＥＤ光源７の位置を変更する。

拡散板８の射出領域９を基準とした容器２の底面２ｂの高さＨ´´は１８ｍｍとする。また、対物光学系４の光軸を基準とした拡散板８における対物光学系４に近い射出領域端９ｂまでの距離Ｙ１を９．３ｍｍ〜１９ｍｍの範囲で可変とし、対物光学系４の光軸を基準とした拡散部材８の射出領域９における対物光学系４から遠い射出領域端９ａまでの距離Ｙ２を２１．３ｍｍ〜３１ｍｍの範囲で可変とし、Ｙ２−Ｙ１を１２ｍｍとする。
以下、第２実施例と異なる点について説明する。

ＮＡ＝０．３、Ｄ＝９．０ｍｍの値を用いたときに、照明光学系５の拡散板８の射出領域９を基準とした容器２の底面２ｂの高さＨ´´を変えて、条件式（５），（６），（７），（８）を満たす条件を図２２に示す。

本実施例に係る観察装置２１によれば、容器２の天板２ａの高さが低い場合（Ｈｔが小さい場合）は、ＸＹステージにより、拡散板８およびＬＥＤ光源７を対物光学系４に近接させることで、条件式（５），（６），（７），（８）が満たされる。また、容器２の天板２ａの高さが高い場合は、ＸＹステージにより、拡散板８およびＬＥＤ光源７を対物光学系４から離間させることで、条件式（５），（６），（７），（８）が満たされる。これにより、拡散板８の面積を小さくして、拡散板８とＬＥＤ光源７との距離を短くすることができ、拡散板８での光密度を向上して明るい照明を実現することができる。

＜第４実施例＞
次に、本発明の一実施形態に係る観察装置２１の第４実施例について以下に説明する。
本実施例においては、図２３に示すように、反射面の高さの最小値Ｈｔｍｉｎを大きくするための高さ補正具１７を備えている。
容器２は、蓋２ｃ付きのシャーレを想定しており、蓋２ｃの内面が反射面になっている。高さ補正具１７は、試料Ｘを収容する容器２とは別の空の容器２であり、蓋２ｃの内面が反射面１７ａとなっている。高さ補正具１７は、試料Ｘを収容する容器２の蓋２ｃの上に載置される。図２３の例では、高さ補正具１７として蓋２ｃのみを使用している。

本実施例に係る観察装置２１によれば、高さ補正具１７を用いることで、試料Ｘを収容する容器２のみを用いた場合と比べて反射面の高さの最小値Ｈｔｍｉｎが大きくなり、これにより、条件式（３）および（４）によって規定される開口数の最低値ＮＡｍｉｎの値が小さくなる。すなわち、試料Ｘを収容する容器２のみを用いた場合と比べて、ＮＡが低く実視野ＦＯＶｙが広い対物光学系４を使用することができる。
ＮＡ＝０．１６、Ｄ＝８．６ｍｍの値を用いたときに、照明光学系５の拡散板８の射出領域９を基準とした容器２の底面２ｂの高さＨ´´を変えて、条件式（５），（６），（７），（８）を満たす条件を図２４に示す。

図２５は、試料Ｘを収容する容器２として、蓋２ｃ付きのウェルプレートを使用した例を示している。高さ補正具１７としては、ウェルプレートの蓋２ｃが好適に用いられる。容器２と同一種類の空の蓋２ｃ付きのウェルプレートを高さ補正具１７として用いてもよい。
図２５の例において、各ウェル内の標本面Ｘ１は、隣のウェルに入射し高さ補正具１７の反射面１７ａで反射された照明光によって照明される。したがって、試料Ｘの観察に、ウェルの径が小さいウェルプレートを使用することができる。

以上、本発明の一実施形態について図面を参照して詳述してきたが、具体的な構成はこの実施形態に限られるものではなく、本発明の要旨を逸脱しない範囲の設計変更等も含まれる。例えば、本実施形態においては、細胞培養フラスコのような天板２ａを有する容器２内に試料Ｘを収容し、容器２の天板２ａ内面において照明光をフレネル反射させることとしたが、これに限定されるものではない。

例えば、容器として、天板２ａを有しないシャーレ（蓋なし）のようものに試料Ｘを収容した場合は、シャーレの上部開口を閉塞する位置にミラーのような反射部材を配置し、シャーレの底面を下から上に向かって透過した照明光をこの反射部材の一表面（反射面）によって反射することにしてもよい。反射部材は、直動によりあるいは揺動により試料Ｘの上方位置に挿脱可能に設けられていてもよい。

また、容器として、天板２ａを有しないシャーレ（蓋なし）のようなものに試料Ｘを収容した場合は、シャーレ内に溶液（例えば、培養培地やリン酸緩衝液等）を入れて試料Ｘを溶液内に浸し、シャーレの底面を下から上に向かって透過した照明光を溶液上方の液面（反射面）によって反射することにしてもよい。天板２ａを有する容器２に試料Ｘを収容した場合も、容器２内に溶液（例えば、培養培地やリン酸緩衝液等）を入れて試料Ｘを溶液内に浸してもよい。これらの変形例においては、容器２の天板２ａの高さに代えて、反射部材の一表面の高さや溶液上方の液面の高さを上記の各条件式に適用することとすればよい。

１，２１ 観察装置
２ 容器
２ａ 天板（反射面）
２ｂ 底面（載置面）
４ 対物光学系（対物レンズ）
５ 照明光学系
６ 撮影光学系
７ ＬＥＤ光源
８ 拡散板（拡散部材）
９ 射出領域
１５ 瞳（明るさ絞り）
１６ 枠
１７ 高さ補正具
１７ａ 反射面
Ｘ 試料

Claims (3)

1. 試料の下方から上方に向けて照明光を射出する照明光学系と、
   該照明光学系から射出された照明光が前記試料の上方で反射されて前記試料を透過した透過光を前記試料の下方において撮影する撮影光学系とを備え、
   前記照明光学系が、特定の広さの射出領域から前記照明光を拡散させて射出する拡散部材を備え、
   前記撮影光学系が、前記透過光を集光する対物光学系を備え、
   前記照明光学系の前記射出領域が前記対物光学系の瞳に投影された場合に、該対物光学系の瞳の辺縁部において前記照明光の一部が遮られるように、以下の条件を満足する観察装置。
   ＮＡｍｉｎ＞（Ｄ＋ＦＯＶｙ）／（４Ｈｔｍｉｎ−４Ｈｂｍｉｎ＋２ＷＤ）
   ＮＡｍｉｎ＞（ＦＯＶｙ＋Ｔ／２）／（２Ｈｔｍｉｎ−２Ｈｂｍｉｎ）
   Ｙ２＞ＮＡ（２Ｈｔｍａｘ＋Ｈ´´−Ｈｂｍａｘ）＋（ＦＯＶｙ／２）
   Ｙ１＞ＮＡ（２Ｈｔｍｉｎ＋Ｈ´´−Ｈｂｍｉｎ）＋（ＦＯＶｙ／２）
   ここで、ＮＡｍｉｎ：偏射照明条件から要請される対物光学系の試料側の開口数の最低値、Ｄ：対物光学系の枠の試料に近い部分の直径、ＦＯＶｙ：対物光学系の実視野、Ｈｔｍｉｎ：試料の載置面を基準とした試料の上方における照明光の反射面の高さの最低値、Ｈｂｍｉｎ：試料の載置面を基準とした試料における照明光の入射面の高さの最低値、ＷＤ：対物光学系の作動距離、Ｔ：対物光学系の枠の試料に近い部分の直径とその部分での対物光学系の有効光束直径との差、Ｙ２：対物光学系の光軸を基準とした拡散部材の射出領域における対物光学系から遠い端までの距離、Ｈｔｍａｘ：試料の載置面を基準とした試料の上方における照明光の反射面の高さの最高値、Ｈ´´：拡散部材の射出領域を基準とした試料の載置面の高さ、Ｈｂｍａｘ：試料の載置面を基準とした試料における照明光の入射面の高さの最高値、Ｙ１：対物光学系の光軸を基準とした拡散部材の射出領域における対物光学系に近い端までの距離、ＮＡ：前記対物光学系の前記試料側の開口数である。
2. 前記拡散部材を前記対物光学系の光軸に沿う方向および該光軸に交差する方向の少なくとも一方に移動させる駆動部を備える請求項１に記載の観察装置。
3. 前記反射面を有し前記試料の上方に配置可能な高さ補正具を備える請求項１または請求項２に記載の観察装置。

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