WO2016158780A1 - 観察装置および観察方法 - Google Patents

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Abstract

 装置を大型化させることなく、細胞等の被写体を標識せずに観察することができる観察装置および観察方法を提供する。試料(X)の下方から上方に向けて照明光を射出する光源部(5)と、該光源部(5)から射出された照明光が試料(X)の上方で反射されて試料(X)を透過した透過光を集光する対物レンズ(4)を有し、該対物レンズ(4)によって集光された透過光を試料(X)の下方において撮影する撮影光学系(6)とを備える観察装置(1)を提供する。

Description

観察装置および観察方法
 本発明は、観察装置および観察方法に関するものである。
 従来、細胞等の被写体を標識せずに観察する装置として、位相差観察法や微分干渉観察法を用いた観察装置が知られている(例えば、特許文献1参照。)。
特開平7-261089号公報
 しかしながら、特許文献1の観察装置は、被写体を挟んで撮影光学系と照明光学系とを配置する必要があり、装置が大型化、複雑化するという不都合がある。
 本発明は、上述した事情に鑑みてなされたものであって、装置を大型化させることなく、細胞等の被写体を標識せずに観察することができる観察装置および観察方法を提供することを目的としている。
 上記目的を達成するため、本発明は以下の手段を提供する。
 本発明の一態様は、試料の下方から上方に向けて照明光を射出する光源部と、該光源部から射出された照明光が前記試料の上方で反射されて前記試料を透過した透過光を前記試料の下方において撮影する撮影光学系とを備える観察装置を提供する。
 本態様によれば、光源部から発せられた照明光は試料の下方から上方に向けて射出された後、試料の上方において反射されて試料を上方から下方に透過させられる。試料を透過した透過光は、試料の下方に配置されている撮影光学系によって撮影される。光源部および撮影光学系の両方を試料の下方に配置したので、装置を大型化させることなく、透過光を撮影することにより細胞等の被写体を標識せずに観察することができる。
 上記態様においては、前記撮影光学系が、前記試料を透過した透過光を集光する対物レンズを備え、前記光源部が、前記対物レンズの径方向外方から前記試料の上方に照明光を射出してもよい。
 このようにすることで、試料の下方に配置された対物レンズの径方向外方に配置された光源部から試料の上方に向けて射出された照明光が、試料の上方においては反射されて、対物レンズの光軸に対して斜め上方から試料に入射し、試料を透過した透過光が撮影光学系により撮影される。試料への入射角度を適切に設定することにより、試料の像に明暗を形成することができ、細胞等の透明な被写体についても見やすい像を取得することができる。
 上記態様においては、前記光源部が、前記対物レンズの径方向に異なる位置から独立して照明光を射出可能であってもよい。
 このようにすることで、光源部から射出される照明光の径方向位置を異ならせることで、試料の上方に配置された同一の反射面によって反射された反射光の試料への入射角度を変化させることができる。すなわち、対物レンズの径方向の近い位置から射出された照明光の反射光は、光軸に対して小さい角度をなして試料に入射する一方、対物レンズの径方向に遠い位置から射出された照明光の反射光は、光軸に対して大きな角度をなして試料に入射する。これにより、対物レンズの取り込み角より小さい入射角の場合は、照明ムラの少ない明視野照明とし、また対物レンズの取り込み角より大きい入射角の場合は、微細構造が強調される暗視野照明とし、さらに対物レンズの取り込み角と同等の入射角の場合は、試料が立体的に見える偏斜照明とすることができる。
 上記態様においては、前記光源部が、前記対物レンズの周方向に異なる位置から同時に照明光を射出可能であってもよい。
 このようにすることで、対物レンズの周方向に複数位置から同時に照明光が照射され、照明ムラを低減することができる。
 上記態様においては、前記光源部が、前記対物レンズの周囲に配列され、独立して点灯可能な複数の光源を備えていてもよい。
 このようにすることで、複数の光源の内のいずれかを点灯させることにより、照明光の周方向位置を決定することができる。そして、点灯させる光源の周方向位置を切り替えることにより、異なる方向から照明された試料の像を撮影することができる。特に、上記偏斜照明の像においては、異なる陰影の付き方の像を撮影することができる。
 上記態様においては、前記光源部が、前記試料の下方に配置される光源と、該光源からの照明光のうち、特定の径方向位置の照明光のみを透過させる開口部を有する遮光部材とを備えていてもよい。
 このようにすることで、光源からの照明光が遮光部材によって遮られ、開口部を通過する照明光のみが、試料の上方において反射されて試料に入射させられる。したがって、光源の点灯位置を切り替えることなく、遮光部材の開口部の位置を調節することにより、試料に入射させる反射光の方向あるいは角度を変化させることができる。
 上記態様においては、前記光源部が、照明光を拡散させる拡散板を備えていてもよい。
 このようにすることで、拡散板によって均一に拡散された照明光を試料に照射させることができる。
 上記態様においては、前記試料が、光学的に透明な材質からなる容器内に収容され、前記照明光が前記試料の上方に配置されている前記容器の天板内面によって反射されてもよい。
 このようにすることで、内部に試料を収容した天板を有する容器を光源部および撮影光学系の上方に配置するだけで、光源部から射出された照明光を容器の天板内面において反射させ、容器内の試料に照射させることができる。
 上記態様においては、前記照明光が、前記試料の上方に配置された反射部材によって反射されてもよい。
 このようにすることで、シャーレ(蓋なし)のように天板を有しない容器や細胞培養バッグ内に収容された試料を観察する場合において、試料の上方に反射部材を配置することにより、光源部から射出された照明光を反射部材において反射させ、容器内の試料に照射させることができる。
 上記態様においては、前記試料が、溶液内に浸されており、前記照明光が、前記溶液上方の液面によって反射されてもよい。
 このようにすることで、天板を有しない容器や、反射部材を配置できない容器内に収容された試料を観察する場合において、光源部から射出された照明光を溶液の液面において反射させ、容器内の試料に照射させることができる。
 本発明の他の態様は、試料の下方から上方に向けて照明光を射出する射出ステップと、該射出ステップにより射出された照明光を前記試料の上方において反射する反射ステップと、該反射ステップにより反射された照明光を前記試料に透過させる透過ステップと、該透過ステップにより前記試料を透過した透過光を前記試料の下方において撮影する撮影ステップとを含む観察方法を提供する。
 本発明によれば、装置を大型化させることなく、細胞等の被写体を標識せずに観察することができるという効果を奏する。
本発明の一実施形態に係る観察装置を示す部分的な縦断面図である。 図1の観察装置の光源部におけるLED光源の配置の一例を示す平面図である。 図1の観察装置の変形例であって、遮光部材により照明光を制限する場合を示す部分的な縦断面図である。 図3の遮光部材の例であって、円形の単一の開口部を有する場合を示す平面図である。 図3の遮光部材の例であって、開口部の径方向位置が図4Aとは異なる場合を示す平面図である。 図3の遮光部材の例であって、開口部を2つ備える場合を示す平面図である。 図3の遮光部材の他の例であって、扇形状の開口部を有する場合を示す平面図である。 図3の遮光部材の他の例であって、円環状の開口部を有する場合を示す平面図である。 図1の観察装置の他の変形例を示す部分的な縦断面図である。 図1の観察装置の他の変形例を示す部分的な縦断面図である。 図1の観察装置の他の変形例を示す部分的な縦断面図である。 図1の観察装置の他の変形例を示す部分的な縦断面図である。
 本発明の一実施形態に係る観察装置1について図面を参照して以下に説明する。
 本実施形態に係る観察装置1は、図1に示されるように、試料Xを収容した容器2を載置するステージ3と、該ステージ3の下方に配置され、ステージ3を上方から透過して来る光を集光する対物レンズ4を備え、試料Xを透過した光を撮影する撮影光学系6と、対物レンズ4の径方向外方に配置され、ステージ3を透過して上方に照明光を射出する光源部5とを備えている。
 ステージ3には、対物レンズ4および光源部5の上方を覆うように、光学的に透明な材質、例えば、ガラス板3aが配置され、容器2はガラス板3aの上面に載置されるようになっている。
 容器2は、例えば、天板2aを有する細胞培養フラスコであり、全体的に光学的に透明な樹脂により構成されている。
 光源部5は、図1および図2に示されるように、対物レンズ4の周囲に、周方向および径方向に間隔をあけて複数配置されたLED光源(光源)7と、各LED光源7に対応して配置され、各LED光源7において発生した照明光を集光する複数の集光レンズ8と、該集光レンズ8により集光された照明光を拡散させる拡散板9とを備えている。
 光源部5は、特定のLED光源7を独立して点灯させることができるようになっている(図1および図2は、点灯しているLED光源7をハッチングによって示している。)。
 すなわち、対物レンズ4の径方向に異なる位置のLED光源7のみを点灯させることで、図1に実線で示されるように、ガラス板3aおよび容器2の底面2bを下から上に向かって透過した後、容器2の天板2a内面において反射して、斜め上方から試料X、容器2の底面2bおよびガラス板3aを透過して対物レンズ4に入射する照明光の角度を、破線で示されるように切り替えることができるようになっている。
 対物レンズ4の周方向に特定位置のLED光源7のみを点灯させることにより、試料Xに対して周方向の特定の方向からのみ照明することができるようになっている。図2に示されるように、対物レンズ4の周方向に2以上の方向、特に、対物レンズ4の光軸Sに対して軸対称の方向に配置されたLED光源7を点灯させることにより、照明ムラを低減した照明光を試料Xに対して照射することができるようになっている。
 このように構成された本実施形態に係る観察装置1を用いた観察方法について、以下に説明する。
 本実施形態に係る観察装置1を用いて細胞のように透明な試料Xの観察を行うには、図1に示されるように、試料Xを容器2内に収容し、底面2bに接着させた状態で、容器2を底面2bが下側になるようにステージ3のガラス板3a上に載置する。
 そして、この状態で、光源部5のいずれかのLED光源7を作動させて照明光を発生させる。LED光源7において発生した照明光は、該LED光源7に対応して配置されている集光レンズ8によって集光され、拡散板9によって拡散された状態で、ガラス板3aおよび容器2の底面2bを下から上に向かって透過し(射出ステップ)、容器2の天板2a内面において反射して試料Xに対して斜め上方から照射される(反射ステップ)。
 試料Xに照射された照明光のうち、試料Xを透過した照明光の透過光が容器2の底面2bおよびガラス板3aを上から下に向かって透過して、対物レンズ4に入射する(透過ステップ)。この際、照明光は試料Xの形状や屈折率によって屈折、散乱され、あるいは、試料Xの透過率によって減光されることで、試料Xの情報を載せた透過光となって対物レンズ4により集光され、図示しない撮像素子によって撮影される(撮影ステップ)。
 このように、本実施形態に係る観察装置1によれば、試料Xの下方に光源部5および対物レンズ4を含む撮影光学系6を配置しているので、従来、試料を挟んだ両側に光源部と撮影光学系とを配置していた透過光の観察装置と比較すると、試料Xの片側のみに光源部5および撮影光学系6を集約し、装置を薄型化することができるという利点がある。そのように薄型化した観察装置1においても、透過光を撮影することにより細胞等の被写体を標識せずに観察することができるという利点がある。
 光源部5からの照明光は、対物レンズ4の径方向外方から射出され容器2の天板2a内面において反射することにより、試料Xに対して斜め上方から照射されて対物レンズ4により集光されるので、試料Xへの入射角度を適切に設定することにより、試料Xの像に明暗を形成することができ、細胞等の透明な被写体についても見やすい像を取得することができるという利点がある。
 本実施形態においては、光源部5が、対物レンズ4の周囲に径方向に配列され、独立して点灯可能な複数のLED光源7を備えているので、図1に破線で示されるように、点灯するLED光源7の径方向位置を異ならせることにより、試料Xに入射する照明光の照射角度を変化させることができる。これにより、対物レンズ4の取り込み角より小さい入射角の場合は、照明ムラの少ない明視野照明とし、また対物レンズ4の取り込み角より大きい入射角の場合は、微細構造が強調される暗視野照明とし、さらに対物レンズ4の取り込み角と同等の入射角の場合は、試料Xが立体的に見える偏斜照明とすることができる。
 本実施形態においては、光源部5が、対物レンズ4の周囲に周方向に配列され、独立して点灯可能な複数のLED光源7を備えているので、点灯するLED光源7の周方向位置を異ならせることにより、試料Xに入射する照明光の照射方向を変化させることができる。これにより、形成される試料Xの像の陰影の方向を変化させ、見え方を変更することができる。
 図2に示されるように、周方向に異なる位置の複数のLED光源7を同時に点灯させることにより、特に、軸対称に配置される複数のLED光源7を同時に点灯させることにより、照明ムラを低減してムラの少ない試料Xの画像を取得することができるという利点がある。
 本実施形態においては、各LED光源7に対応して拡散板9が備えられているので、LED光源7から発せられた照明光が均一に拡散され,照明ムラの少ない均一な強度の照明光を試料Xに照射することができる。
 本実施形態においては、複数のLED光源7をアレイ状に配列し、独立して点灯させることで、照明光の照射角度や照射方向等を切り替えることとしたが、これに代えて、図3から図5Bに示されるように、光源部5が、対物レンズ4の周囲に配置される光源7と、該光源7の上方に配置され、光源7からの照明光を遮蔽する遮光部材10とを備えることにしてもよい。
 すなわち、遮光部材10にはその周方向の一部あるいは径方向の一部に開口する開口部11と、容器2の天板2a内面において反射して試料Xを透過した光を透過させる透過孔12とが設けられており、遮光部材10を入れ替えることで、開口部11の位置を調節して、照明光の照射角度や照射方向を変更することができる。この場合には、光源部5としては、上記と同様にアレイ状に配列されたLED光源7、集光レンズ8および拡散板9を備えるものでもよいが、照明光の発光位置を切り替える機能は不要であり、開口部11より広い範囲から照明光を射出可能な光源であれば、任意の光源を備えるものを採用してもよい。
 図4Aから図4Cは円形の開口部11を有する例であり、径方向や開口部11の個数が異なる例を示している。図5Aは開口部11が扇形状の場合、図5Bは開口部11が円環状の場合をそれぞれ示している。開口部11の大きさ、位置および形状は任意のものを採用することができる。
 本実施形態においては、細胞培養フラスコのような天板2aを有する容器2内に試料Xを収容し、容器2の天板2a内面において照明光を反射させることとしたが、これに限定されるものではない。例えば、容器2として、シャーレ(蓋なし)のように天板2aを有しない容器13に試料Xを収容した場合には、図6に示されるように、シャーレの上部開口を閉塞する位置にミラーのような反射部材14を配置し、反射部材14によって底面13bを下から上に向かって透過した照明光を反射することにしてもよい。反射部材14は、直動によりあるいは揺動により試料Xの上方位置に挿脱可能に設けられていてもよい。
 容器2として、シャーレ(蓋なし)のように天板2aを有しない容器13に試料Xを収容した場合には、図7に示されるように、容器13内に溶液(例えば、培養培地やリン酸緩衝液等)Lを入れて試料Xを溶液内に浸し、溶液上方の液面によって底面13bを下から上に向かって透過した照明光を反射することにしてもよい。天板2aを有する容器2に試料Xを収容した場合も、容器2内に溶液(例えば、培養培地やリン酸緩衝液等)Lを入れて試料Xを溶液内に浸してもよい。
 本実施形態においては、図8に示されるように、天板2aの上方に光を遮蔽する材質からなる遮光部材15を備えていてもよい。
 このようにすることで、外部からの外光が遮光部材15によって遮蔽されるため、外光が天板2aから容器2内に入射することを抑制し、効率的に観察を行うことができる。
 本実施形態においては、光源部5として、LED光源7、集光レンズ8および拡散板9をガラス板3aに沿うように略水平に配置したものを例示したが、これに代えて、図9に示されるように、LED光源7、集光レンズ8および拡散板9を光軸Sに向けて傾けて配置してもよい。
 このようにすることで、LED光源7から発せられる照明光のロスを抑制し、効率的に照明光を試料Xに照射することができる。
 本実施形態においては、光源部5として、拡散板9を備えるものを例示したが、拡散板9を備えていなくてもよい。
 1 観察装置
 2 容器
 2a 天板
 4 対物レンズ
 5 光源部
 6 撮影光学系
 7 LED光源
 9 拡散板
 10 遮光部材
 11 開口部
 14 反射部材
 X 試料

Claims (11)

  1.  試料の下方から上方に向けて照明光を射出する光源部と、
     該光源部から射出された照明光が前記試料の上方で反射されて前記試料を透過した透過光を前記試料の下方において撮影する撮影光学系とを備える観察装置。
  2.  前記撮影光学系が、前記試料を透過した透過光を集光する対物レンズを備え、
     前記光源部が、前記対物レンズの径方向外方から前記試料の上方に照明光を射出する請求項1に記載の観察装置。
  3.  前記光源部が、前記対物レンズの径方向に異なる位置から独立して照明光を射出可能である請求項2に記載の観察装置。
  4.  前記光源部が、前記対物レンズの周方向に異なる位置から同時に照明光を射出可能である請求項2に記載の観察装置。
  5.  前記光源部が、前記対物レンズの周囲に配列され、独立して点灯可能な複数の光源を備える請求項3または請求項4に記載の観察装置。
  6.  前記光源部が、前記試料の下方に配置される光源と、該光源からの照明光のうち、特定の径方向位置の照明光のみを透過させる開口部を有する遮光部材とを備える請求項2に記載の観察装置。
  7.  前記光源部が、照明光を拡散させる拡散板を備える請求項1から請求項6のいずれかに記載の観察装置。
  8.  前記試料が、光学的に透明な材質からなる容器内に収容され、
     前記照明光が前記試料の上方に配置されている前記容器の天板内面によって反射される請求項1から請求項7のいずれかに記載の観察装置。
  9.  前記照明光が、前記試料の上方に配置された反射部材によって反射される請求項1から請求項7のいずれかに記載の観察装置。
  10.  前記試料が、溶液内に浸されており、
     前記照明光が、前記溶液の上方の液面によって反射される請求項1から請求項7のいずれかに記載の観察装置。
  11.  試料の下方から上方に向けて照明光を射出する射出ステップと、
     該射出ステップにより射出された照明光を前記試料の上方において反射する反射ステップと、
     該反射ステップにより反射された照明光を前記試料に透過させる透過ステップと、
     該透過ステップにより前記試料を透過した透過光を前記試料の下方において撮影する撮影ステップとを含む観察方法。
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