JP7219390B2 - 細胞観察装置 - Google Patents

Description

本発明は細胞観察装置に関し、詳しくは培養容器に収容された細胞を撮影するカメラと、上記細胞に検査光を照射する照明とを備えた細胞観察装置に関する。

従来、培養中の細胞の培養状態をカメラを用いて観察する細胞観察装置が知られ、このとき細胞の画像を鮮明に得るため、細胞に検査光を照射することが行われているが、このときのカメラの撮影方向に対する検査光の照射方向については様々な試みがなされている。
例えば、培養容器の側方に照明を設けて、培養容器に収容された培養液の液面の下方に検査光を入射させ、これを培養容器の下方に設けたカメラによって撮影する細胞観察装置が知られている（特許文献１）。この細胞観察装置によれば培養容器が積み重ねられた多段式の場合にも対応できるようになっている。
多段式培養容器については他にも、カメラと照明とを同軸上に対向した位置に設け、これらカメラと照明との間に上記培養容器を位置させた細胞観察装置も知られている（特許文献２）。

国際公開第２０１５－１７４３５６号公報 特許第４０４９２６３号公報

ここで、再生医療等の治療に使用する細胞や組織については、無菌環境下で取り扱われるようになってきており、上記培養容器中の細胞を観察する作業も無菌環境が維持された無菌室で行うことが望ましい。
しかしながら、当該無菌室の無菌状態を維持するには定期的に過酸化水素蒸気等の除染媒体によって除染する必要があり、このため観察装置を構成する照明やカメラ等の光学系は熱や除染媒体から防護した構成としなければならないが、特許文献１、２の構成では無菌室での使用を考慮されていない。
また培養容器が多段式の場合には、各段の細胞を観察するために容器の高さ方向に沿ってカメラや照明を移動させる必要が生じ、装置が煩雑かつ大型化し、より無菌室に収容させることが困難になるという問題があった。
このような問題に鑑み、本発明はカメラおよび照明を無菌室の外部に設けることが可能で、かつ細胞を鮮明に撮影することが可能な細胞観察装置を提供するものである。

すなわち請求項１の発明にかかる細胞観察装置は、培養容器に収容された細胞を撮影するカメラと、上記細胞に検査光を照射する照明とを備えた細胞観察装置において、
内部が無菌状態に維持されて上記培養容器を収容する無菌室と、当該無菌室の底部に設けられるとともに上記培養容器がその上方に載置される透明な観察窓とを備え、
上記カメラおよび照明を上記観察窓の下方に設け、上記カメラの焦点を上記培養容器の底面に設定して、培養容器の細胞を上記観察窓を介して撮影し、
上記照明は上記検査光を光が拡散しないスポット光にして照射し、上記培養容器の底面において検査光の照射範囲の内側に上記カメラの撮影範囲が位置するようにし、
かつ、培養容器の底面に直交する軸に対して上記カメラの撮影方向を傾斜させるとともに、当該カメラの撮影方向と、照明の照射方向とが同じ角度とならないように設定したことを特徴としている。

上記発明によれば、上記カメラおよび照明を無菌室の外部に設けることが可能で、かつ細胞を鮮明に撮影することが可能な細胞観察装置を構成することができる。

本実施例にかかる観察装置の側面図

以下図示実施例について説明すると、図１は培養容器１の内部で培養される細胞を観察する細胞観察装置２の構成図を示している。
上記細胞観察装置２は、内部が無菌状態に維持されて上記培養容器１を収容する無菌室３と、上記無菌室３の下方に設けられたカメラ４と、同じく無菌室３の下方に設けられた照明５と、上記カメラ４と照明５とを移動させる移動手段６とを備えている。
上記培養容器１は透明な素材からなる箱状の容器となっており、その内部には５段の収容部１ａを備え、各段の収容部１ａには上記細胞が培養液Ｌに浸された状態で収容されている。
上記培養容器１における上記各収容部１ａに隣接した位置には、上下方向に貫通する通路１ｂが形成されており、当該通路１ｂの上部には開閉可能なキャップ１ｃが設けられている。
本実施例で観察する細胞および培養液は図２に示すように透明であり、細胞は各収容部１ａの底面１ｄに薄く接着した状態で培養されている。

上記無菌室３は、例えば細胞を扱うアイソレータや培養を行うインキュベータとして構成され、内部が無菌状態に維持されるとともに、定期的に当該無菌室３の内部を過酸化水素蒸気等の除染媒体によって除染することが可能となっている。
上記無菌室３の底部３ａには、その少なくとも一部分にガラスやポリカーボネートなどからなる無色透明な観察窓１１が形成されており、当該観察窓１１は水平に設けられている。
本実施例では、上記培養容器１を上記観察窓１１の上面に設けた位置決め支持部材１１ａに載置した状態で、無菌室３の外部から培養容器１に収容された細胞を観察することが可能となっている。
そして上記培養容器１を上記観察窓１１上に載置する作業は、上記無菌室３に設けた図示しないグローブを用いた手作業や、ロボットならびにその他の搬送手段によって自動的に行ってもよい。

上記カメラ４は、上記観察窓１１の下方に設けられており、上記観察窓１１を介して培養容器１の内部の細胞を撮影するよう、上記培養容器１の下面１ｅに向けられている。
具体的には、最も下方の収容部１ａの底面１ｄに接着した細胞を撮影するために、焦点を当該収容部１ａの底面１ｄに設定している。また、上記カメラ４は高倍率の短焦点レンズ４ａを備えており、このため当該カメラ４の撮影範囲は上記収容部１ａの底面１ｄに対して極めて狭い範囲、例えば２.１ｍｍ×１．７ｍｍの範囲で撮影されることとなる。
また上記カメラ４の撮影角度αは、上記培養容器１の下面１ｅに対して大きく傾けると、上記撮影範囲において、焦点が合う範囲が狭くなり、垂直すなわち０°に近づくと上記収容部１ａの底面１ｄに接着している透明な細胞の反射光が受光しづらくなることから、当該カメラ４の撮影角度αは上記培養容器１の下面１ｅに直交する仮想軸Ｎ（下面１ｅの法線）に対して１０～３０°の範囲、望ましくは２０°前後で設定するようになっている。

上記照明５は、ＬＥＤスポット照明からなり、本体部５ａと、本体部５ａから伸びるフレキシブルアーム部５ｂと、上記検査光Ｌを培養容器１の下面１ｅに向けて照射する照射部５ｃとから構成されている。
上記照射部５ｃが照射する検査光Ｌの照射角度βは、上記培養容器１の下面１ｅに直交する上記仮想軸Ｎに対して傾斜するように設定され、かつ上記照明５の照射端と、上記カメラ４の受光端は上記仮想軸Ｎを挟んで対向するように設けられている。
また照明５は光が拡散しないスポット状に検査光Ｌを照射し、収容部１ａの底面１ｄの一部となる狭い範囲に検査光Ｌを照射することで、例えば直径６ｍｍ程度の円形の範囲が検査光Ｌの照射範囲となるようになっている。
このとき、検査光Ｌの照射範囲の内側に上記カメラ４による撮影範囲が位置するよう、上記カメラ４の撮影方向と上記照明５の照射方向とが設定されており、これにより上記カメラ４は検査光Ｌが照射された細胞を撮影することが可能となっている。
ここで、上記照明５が照射した検査光Ｌは、上記収容部１ａの内部で主に透明な上記培養液と細胞の境界部分で反射して上記カメラ４に受光されるが、上記検査光Ｌを拡散しないスポット光にすることで、細胞に照射される検査光Ｌの方向を揃えることができ、またカメラ４に受光される反射光の方向も揃えられて明暗差が大きくなることから、培養液と細胞の境界すなわち細胞の輪郭を際立たせることが可能となる。
これに対し、検査光Ｌを拡散させて照射すると、培養液中で検査光Ｌが様々な方向に反射してしまい、カメラ４に様々な方向から反射光が入射してしまうことから、上述したような明暗差が得られず、全体的に明るい画像となって細胞の輪郭が不鮮明になってしまう。
上記照明５の照射角度βは、上記培養容器１の下面１ｅに対して大きく傾けると、検査光Ｌのスポット径が大きくなり拡散しながら入射されてしまう。また、垂直すなわち０°に近づくと、透明な細胞の上方に抜ける光が多くなって反射光量が低下してしまう。このため照明５の照射角度βについては、上記仮想軸Ｎに対して０～４０°の範囲、より望ましくは１０～３０°の範囲で設定するようになっている。

さらに本実施例では、上記培養容器の下面１ｅに直交する仮想軸Ｎに対する、上記カメラ４の撮影角度αおよび照明５の照射角度βを異ならせるように設定している。
これは、上記カメラ４の撮影角度αと照明５の照射角度βとを同じにしてしまうと、境界面としての培養容器１の下面１ｅの法線（仮想軸Ｎ）となす入射角と反射角が等しくなり、下面１ｅで反射した反射光が直接カメラ４で受光されてしまい、画像全体が真白になって白飛びしてしまうことから、細胞の画像を全く得ることができなくなってしまう。
そこで、上記カメラ４の撮影方向と、上記照明５の照射方向とが同じ角度とならないよう設定して、カメラ４の撮影角度αを照明５の照射角度βとは異ならせることで、培養容器１の下面１ｅで反射した反射光を直接カメラ４で受光しないようにしている。
具体的には、上記カメラ４の撮影角度αを上記仮想軸Ｎに対して２０°に設定した場合には、上記照明５の照射角度βを仮想軸Ｎに対して２０°以外で、かつ０～４０°の範囲で設定するようになっている。

上記移動手段６は、上記カメラ４の撮影角度αによる撮影方向および照明５の照射角度βによる照射方向が変化しないように維持したまま、上記カメラ４および照明５を一体的に上下方向および横方向に移動させるようになっている。
具体的には、上記カメラ４および照明５は移動テーブル２１に対してそれぞれ角度調節機構２２、２３を介して固定されており、当該角度調節機構２２、２３によって、上述したようにカメラ４の撮影角度αおよび照明５の照射角度βを調節することが可能となっている。
上記移動テーブル２１は、昇降手段２４によって上下動するとともに、横移動手段２５によって横移動可能に設けられている。
上記昇降手段２４は、上記移動テーブル２１を上下動させる上下駆動装置２４ａから構成されている。
上記横移動手段２５は、上記上下駆動装置２４ａを支持する左右移動テーブル２５ａを図示左右方向に往復動させる左右駆動装置２５ｂと、当該左右駆動装置２５ｂを図示前後方向に往復動させる前後駆動装置２５ｃとによって構成されている。
上述したように、上記カメラ４による撮影範囲は極めて狭く、培養容器１の収容部１ａの底面１ｄの一部であるため、培養容器１内の細胞をより正確に観察するためには、底面１ｄの複数の部分を撮影する必要がある。
そこで、上記カメラ４および照明５を上記移動手段６の横移動手段２５によって、撮影方向および検査光Ｌの照射方向を維持したまま一体的に横移動させることにより、収容部１ａの底面１ｄを複数の箇所で撮影することが可能となっている。

さらに本実施例では、上記移動手段６により撮影方向および検査光Ｌの照射方向を維持したまま、上記カメラ４と照明５とを一体的に上下方向に移動させることで、多段式の培養容器１対して、最下段の収容部１ａだけでなく、その上段の下から二段目の収容部１ａに収容された細胞も観察することが可能となっている。
すなわち、上記カメラ４および照明５を上記移動手段６の昇降手段２４によって、撮影方向および検査光Ｌの照射方向を維持したまま一体的に上方へ移動させて、上記カメラ４の焦点を最下段の収容部１ａの底面１ｄに設定した状態から、下から二段目の収容部１ａの底面１ｄに設定するように変更できるようになっている。
また照明５から照射される検査光Ｌは、最下段の収容部１ａを通過し、下から二段目の収容部１ａの収容部１ａの底面１ｄに接着している細胞にスポット状に照射され、上記カメラ４はその照射範囲の内側を撮影範囲として細胞を撮影する。
下から２段目の画像は最下段の画像に比べると鮮明ではないものの、細胞の状態（例えば増殖の度合）を確認するには十分なものであった。
なお本実施例の構成では、下から三段目の収容部１ａの細胞については、観察に十分な鮮明さで撮影することができなかったが、カメラ４の解像度や照明５の検査光Ｌの強度を調整することで、より上方に積層された収容部１ａの細胞についても観察することができると考えられる。
しかしながら、多段式の培養容器１に対する細胞の観察において、必ずしも全段の収容部１ａを対象に撮影を行う必要はなく、本実施例のように細胞の増殖の度合を確認する場合であれば、最下段と下から二段目を観察することで十分である。
なお、移動手段６は、無菌室３の内部に設けて、カメラ４および照明５を固定して培養容器１を保持して移動させる構成とすることも可能であり、またカメラ４および照明５と培養容器１とを相互に移動させても良く、カメラ４および照明５が培養容器１に対して、相対的に移動（上下動および横移動）するよう構成されていればよい。
また、多段式の培養容器１として、実施例のような内部に収容部１ａを多段に形成した構成に限らず、多段式でない収容部が一段の培養容器を複数段積層させた場合であっても同様に観察することは可能である。

１ 培養容器 ２ 観察装置
３ 無菌室 ４ カメラ
５ 照明 １１ 観察窓
Ｌ 検査光 α カメラの撮影角度
β 照明の照射角度

Claims (3)

1. 培養容器に収容された細胞を撮影するカメラと、上記細胞に検査光を照射する照明とを備えた細胞観察装置において、
   内部が無菌状態に維持されて上記培養容器を収容する無菌室と、当該無菌室の底部に設けられるとともに上記培養容器がその上方に載置される透明な観察窓とを備え、
   上記カメラおよび照明を上記観察窓の下方に設け、上記カメラの焦点を上記培養容器の底面に設定して、培養容器の細胞を上記観察窓を介して撮影し、
   上記照明は上記検査光を光が拡散しないスポット光にして照射し、上記培養容器の底面において検査光の照射範囲の内側に上記カメラの撮影範囲が位置するようにし、
   かつ、培養容器の底面に直交する軸に対して上記カメラの撮影方向を傾斜させるとともに、当該カメラの撮影方向と、照明の照射方向とが同じ角度とならないように設定したことを特徴とする細胞観察装置。
2. 上記カメラおよび照明を、当該カメラの撮影方向および照明の照射方向を維持したまま一体的に移動させる移動手段を備え、
   上記移動手段は、上記カメラおよび照明を上下動させて、積層された培養容器の各段の底面に上記カメラの焦点を合わせることを特徴とする請求項１に記載の細胞観察装置。
3. 上記カメラおよび照明を、当該カメラの撮影方向および照明の照射方向を維持したまま一体的に移動させる移動手段を備え、
   上記移動手段は、上記カメラおよび照明を横移動させて、上記培養容器の底面における検査光の照射範囲およびカメラの撮影範囲を変更することを特徴とする請求項１または請求項２のいずれかに記載の細胞観察装置。

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