JP6251454B2 - 観察装置および観察方法 - Google Patents

Description

本発明は、観察装置および観察方法に関するものである。

従来、細胞等の被写体を標識せずに観察する装置として、位相差観察法や微分干渉観察法を用いた観察装置が知られている（例えば、特許文献１参照。）。

特開平７−２６１０８９号公報

しかしながら、特許文献１の観察装置は、被写体を挟んで撮影光学系と照明光学系とを配置する必要があり、装置が大型化、複雑化するという不都合がある。
本発明は、上述した事情に鑑みてなされたものであって、装置を大型化させることなく、細胞等の被写体を標識せずに観察することができる観察装置および観察方法を提供することを目的としている。

上記目的を達成するため、本発明は以下の手段を提供する。
本発明の一態様は、試料の下方から上方に向けて照明光を射出する光源部と、該光源部から射出された照明光が前記試料の上方で反射されて前記試料を透過した透過光を前記試料の下方において撮影する撮影光学系とを備える観察装置を提供する。

本態様によれば、光源部から発せられた照明光は試料の下方から上方に向けて射出された後、試料の上方において反射されて試料を上方から下方に透過させられる。試料を透過した透過光は、試料の下方に配置されている撮影光学系によって撮影される。光源部および撮影光学系の両方を試料の下方に配置したので、装置を大型化させることなく、透過光を撮影することにより細胞等の被写体を標識せずに観察することができる。

上記態様においては、前記撮影光学系が、前記試料を透過した透過光を集光する対物レンズを備え、前記光源部が、前記対物レンズの径方向外方から前記試料の上方に照明光を射出してもよい。
このようにすることで、試料の下方に配置された対物レンズの径方向外方に配置された光源部から試料の上方に向けて射出された照明光が、試料の上方においては反射されて、対物レンズの光軸に対して斜め上方から試料に入射し、試料を透過した透過光が撮影光学系により撮影される。試料への入射角度を適切に設定することにより、試料の像に明暗を形成することができ、細胞等の透明な被写体についても見やすい像を取得することができる。

上記態様においては、前記光源部が、前記対物レンズの径方向に異なる位置から独立して照明光を射出可能であってもよい。
このようにすることで、光源部から射出される照明光の径方向位置を異ならせることで、試料の上方に配置された同一の反射面によって反射された反射光の試料への入射角度を変化させることができる。すなわち、対物レンズの径方向の近い位置から射出された照明光の反射光は、光軸に対して小さい角度をなして試料に入射する一方、対物レンズの径方向に遠い位置から射出された照明光の反射光は、光軸に対して大きな角度をなして試料に入射する。これにより、対物レンズの取り込み角より小さい入射角の場合は、照明ムラの少ない明視野照明とし、また対物レンズの取り込み角より大きい入射角の場合は、微細構造が強調される暗視野照明とし、さらに対物レンズの取り込み角と同等の入射角の場合は、試料が立体的に見える偏斜照明とすることができる。

上記態様においては、前記光源部が、前記対物レンズの周方向に異なる位置から同時に照明光を射出可能であってもよい。
このようにすることで、対物レンズの周方向に複数位置から同時に照明光が照射され、照明ムラを低減することができる。

上記態様においては、前記光源部が、前記対物レンズの周囲に配列され、独立して点灯可能な複数の光源を備えていてもよい。
このようにすることで、複数の光源の内のいずれかを点灯させることにより、照明光の周方向位置を決定することができる。そして、点灯させる光源の周方向位置を切り替えることにより、異なる方向から照明された試料の像を撮影することができる。特に、上記偏斜照明の像においては、異なる陰影の付き方の像を撮影することができる。

上記態様においては、前記光源部が、前記試料の下方に配置される光源と、該光源からの照明光のうち、特定の径方向位置の照明光のみを透過させる開口部を有する遮光部材とを備えていてもよい。
このようにすることで、光源からの照明光が遮光部材によって遮られ、開口部を通過する照明光のみが、試料の上方において反射されて試料に入射させられる。したがって、光源の点灯位置を切り替えることなく、遮光部材の開口部の位置を調節することにより、試料に入射させる反射光の方向あるいは角度を変化させることができる。

上記態様においては、前記光源部が、照明光を拡散させる拡散板を備えていてもよい。
このようにすることで、拡散板によって均一に拡散された照明光を試料に照射させることができる。

上記態様においては、前記試料が、光学的に透明な材質からなる容器内に収容され、前記照明光が前記試料の上方に配置されている前記容器の天板内面によって反射されてもよい。
このようにすることで、内部に試料を収容した天板を有する容器を光源部および撮影光学系の上方に配置するだけで、光源部から射出された照明光を容器の天板内面において反射させ、容器内の試料に照射させることができる。

上記態様においては、前記照明光が、前記試料の上方に配置された反射部材によって反射されてもよい。
このようにすることで、シャーレ（蓋なし）のように天板を有しない容器や細胞培養バッグ内に収容された試料を観察する場合において、試料の上方に反射部材を配置することにより、光源部から射出された照明光を反射部材において反射させ、容器内の試料に照射させることができる。

上記態様においては、前記試料が、溶液内に浸されており、前記照明光が、前記溶液上方の液面によって反射されてもよい。
このようにすることで、天板を有しない容器や、反射部材を配置できない容器内に収容された試料を観察する場合において、光源部から射出された照明光を溶液の液面において反射させ、容器内の試料に照射させることができる。

本発明の他の態様は、試料の下方から上方に向けて照明光を射出する射出ステップと、該射出ステップにより射出された照明光を前記試料の上方において反射する反射ステップと、該反射ステップにより反射された照明光を前記試料に透過させる透過ステップと、該透過ステップにより前記試料を透過した透過光を前記試料の下方において撮影する撮影ステップとを含む観察方法を提供する。

本発明によれば、装置を大型化させることなく、細胞等の被写体を標識せずに観察することができるという効果を奏する。

本発明の一実施形態に係る観察装置を示す部分的な縦断面図である。 図１の観察装置の光源部におけるＬＥＤ光源の配置の一例を示す平面図である。 図１の観察装置の変形例であって、遮光部材により照明光を制限する場合を示す部分的な縦断面図である。 図３の遮光部材の例であって、円形の単一の開口部を有する場合を示す平面図である。 図３の遮光部材の例であって、開口部の径方向位置が図４Ａとは異なる場合を示す平面図である。 図３の遮光部材の例であって、開口部を２つ備える場合を示す平面図である。 図３の遮光部材の他の例であって、扇形状の開口部を有する場合を示す平面図である。 図３の遮光部材の他の例であって、円環状の開口部を有する場合を示す平面図である。 図１の観察装置の他の変形例を示す部分的な縦断面図である。 図１の観察装置の他の変形例を示す部分的な縦断面図である。 図１の観察装置の他の変形例を示す部分的な縦断面図である。 図１の観察装置の他の変形例を示す部分的な縦断面図である。

本発明の一実施形態に係る観察装置１について図面を参照して以下に説明する。
本実施形態に係る観察装置１は、図１に示されるように、試料Ｘを収容した容器２を載置するステージ３と、該ステージ３の下方に配置され、ステージ３を上方から透過して来る光を集光する対物レンズ４を備え、試料Ｘを透過した光を撮影する撮影光学系６と、対物レンズ４の径方向外方に配置され、ステージ３を透過して上方に照明光を射出する光源部５とを備えている。

ステージ３には、対物レンズ４および光源部５の上方を覆うように、光学的に透明な材質、例えば、ガラス板３ａが配置され、容器２はガラス板３ａの上面に載置されるようになっている。
容器２は、例えば、天板２ａを有する細胞培養フラスコであり、全体的に光学的に透明な樹脂により構成されている。

光源部５は、図１および図２に示されるように、対物レンズ４の周囲に、周方向および径方向に間隔をあけて複数配置されたＬＥＤ光源（光源）７と、各ＬＥＤ光源７に対応して配置され、各ＬＥＤ光源７において発生した照明光を集光する複数の集光レンズ８と、該集光レンズ８により集光された照明光を拡散させる拡散板９とを備えている。

光源部５は、特定のＬＥＤ光源７を独立して点灯させることができるようになっている（図１および図２は、点灯しているＬＥＤ光源７をハッチングによって示している。）。
すなわち、対物レンズ４の径方向に異なる位置のＬＥＤ光源７のみを点灯させることで、図１に実線で示されるように、ガラス板３ａおよび容器２の底面２ｂを下から上に向かって透過した後、容器２の天板２ａ内面において反射して、斜め上方から試料Ｘ、容器２の底面２ｂおよびガラス板３ａを透過して対物レンズ４に入射する照明光の角度を、破線で示されるように切り替えることができるようになっている。

対物レンズ４の周方向に特定位置のＬＥＤ光源７のみを点灯させることにより、試料Ｘに対して周方向の特定の方向からのみ照明することができるようになっている。図２に示されるように、対物レンズ４の周方向に２以上の方向、特に、対物レンズ４の光軸Ｓに対して軸対称の方向に配置されたＬＥＤ光源７を点灯させることにより、照明ムラを低減した照明光を試料Ｘに対して照射することができるようになっている。

このように構成された本実施形態に係る観察装置１を用いた観察方法について、以下に説明する。
本実施形態に係る観察装置１を用いて細胞のように透明な試料Ｘの観察を行うには、図１に示されるように、試料Ｘを容器２内に収容し、底面２ｂに接着させた状態で、容器２を底面２ｂが下側になるようにステージ３のガラス板３ａ上に載置する。

そして、この状態で、光源部５のいずれかのＬＥＤ光源７を作動させて照明光を発生させる。ＬＥＤ光源７において発生した照明光は、該ＬＥＤ光源７に対応して配置されている集光レンズ８によって集光され、拡散板９によって拡散された状態で、ガラス板３ａおよび容器２の底面２ｂを下から上に向かって透過し（射出ステップ）、容器２の天板２ａ内面において反射して試料Ｘに対して斜め上方から照射される（反射ステップ）。

試料Ｘに照射された照明光のうち、試料Ｘを透過した照明光の透過光が容器２の底面２ｂおよびガラス板３ａを上から下に向かって透過して、対物レンズ４に入射する（透過ステップ）。この際、照明光は試料Ｘの形状や屈折率によって屈折、散乱され、あるいは、試料Ｘの透過率によって減光されることで、試料Ｘの情報を載せた透過光となって対物レンズ４により集光され、図示しない撮像素子によって撮影される（撮影ステップ）。

このように、本実施形態に係る観察装置１によれば、試料Ｘの下方に光源部５および対物レンズ４を含む撮影光学系６を配置しているので、従来、試料を挟んだ両側に光源部と撮影光学系とを配置していた透過光の観察装置と比較すると、試料Ｘの片側のみに光源部５および撮影光学系６を集約し、装置を薄型化することができるという利点がある。そのように薄型化した観察装置１においても、透過光を撮影することにより細胞等の被写体を標識せずに観察することができるという利点がある。

光源部５からの照明光は、対物レンズ４の径方向外方から射出され容器２の天板２ａ内面において反射することにより、試料Ｘに対して斜め上方から照射されて対物レンズ４により集光されるので、試料Ｘへの入射角度を適切に設定することにより、試料Ｘの像に明暗を形成することができ、細胞等の透明な被写体についても見やすい像を取得することができるという利点がある。

本実施形態においては、光源部５が、対物レンズ４の周囲に径方向に配列され、独立して点灯可能な複数のＬＥＤ光源７を備えているので、図１に破線で示されるように、点灯するＬＥＤ光源７の径方向位置を異ならせることにより、試料Ｘに入射する照明光の照射角度を変化させることができる。これにより、対物レンズ４の取り込み角より小さい入射角の場合は、照明ムラの少ない明視野照明とし、また対物レンズ４の取り込み角より大きい入射角の場合は、微細構造が強調される暗視野照明とし、さらに対物レンズ４の取り込み角と同等の入射角の場合は、試料Ｘが立体的に見える偏斜照明とすることができる。

本実施形態においては、光源部５が、対物レンズ４の周囲に周方向に配列され、独立して点灯可能な複数のＬＥＤ光源７を備えているので、点灯するＬＥＤ光源７の周方向位置を異ならせることにより、試料Ｘに入射する照明光の照射方向を変化させることができる。これにより、形成される試料Ｘの像の陰影の方向を変化させ、見え方を変更することができる。

図２に示されるように、周方向に異なる位置の複数のＬＥＤ光源７を同時に点灯させることにより、特に、軸対称に配置される複数のＬＥＤ光源７を同時に点灯させることにより、照明ムラを低減してムラの少ない試料Ｘの画像を取得することができるという利点がある。

本実施形態においては、各ＬＥＤ光源７に対応して拡散板９が備えられているので、ＬＥＤ光源７から発せられた照明光が均一に拡散され，照明ムラの少ない均一な強度の照明光を試料Ｘに照射することができる。

本実施形態においては、複数のＬＥＤ光源７をアレイ状に配列し、独立して点灯させることで、照明光の照射角度や照射方向等を切り替えることとしたが、これに代えて、図３から図５Ｂに示されるように、光源部５が、対物レンズ４の周囲に配置される光源７と、該光源７の上方に配置され、光源７からの照明光を遮蔽する遮光部材１０とを備えることにしてもよい。

すなわち、遮光部材１０にはその周方向の一部あるいは径方向の一部に開口する開口部１１と、容器２の天板２ａ内面において反射して試料Ｘを透過した光を透過させる透過孔１２とが設けられており、遮光部材１０を入れ替えることで、開口部１１の位置を調節して、照明光の照射角度や照射方向を変更することができる。この場合には、光源部５としては、上記と同様にアレイ状に配列されたＬＥＤ光源７、集光レンズ８および拡散板９を備えるものでもよいが、照明光の発光位置を切り替える機能は不要であり、開口部１１より広い範囲から照明光を射出可能な光源であれば、任意の光源を備えるものを採用してもよい。

図４Ａから図４Ｃは円形の開口部１１を有する例であり、径方向や開口部１１の個数が異なる例を示している。図５Ａは開口部１１が扇形状の場合、図５Ｂは開口部１１が円環状の場合をそれぞれ示している。開口部１１の大きさ、位置および形状は任意のものを採用することができる。

本実施形態においては、細胞培養フラスコのような天板２ａを有する容器２内に試料Ｘを収容し、容器２の天板２ａ内面において照明光を反射させることとしたが、これに限定されるものではない。例えば、容器２として、シャーレ（蓋なし）のように天板２ａを有しない容器１３に試料Ｘを収容した場合には、図６に示されるように、シャーレの上部開口を閉塞する位置にミラーのような反射部材１４を配置し、反射部材１４によって底面１３ｂを下から上に向かって透過した照明光を反射することにしてもよい。反射部材１４は、直動によりあるいは揺動により試料Ｘの上方位置に挿脱可能に設けられていてもよい。

容器２として、シャーレ（蓋なし）のように天板２ａを有しない容器１３に試料Ｘを収容した場合には、図７に示されるように、容器１３内に溶液（例えば、培養培地やリン酸緩衝液等）Ｌを入れて試料Ｘを溶液内に浸し、溶液上方の液面によって底面１３ｂを下から上に向かって透過した照明光を反射することにしてもよい。天板２ａを有する容器２に試料Ｘを収容した場合も、容器２内に溶液（例えば、培養培地やリン酸緩衝液等）Ｌを入れて試料Ｘを溶液内に浸してもよい。

本実施形態においては、図８に示されるように、天板２ａの上方に光を遮蔽する材質からなる遮光部材１５を備えていてもよい。
このようにすることで、外部からの外光が遮光部材１５によって遮蔽されるため、外光が天板２ａから容器２内に入射することを抑制し、効率的に観察を行うことができる。

本実施形態においては、光源部５として、ＬＥＤ光源７、集光レンズ８および拡散板９をガラス板３ａに沿うように略水平に配置したものを例示したが、これに代えて、図９に示されるように、ＬＥＤ光源７、集光レンズ８および拡散板９を光軸Ｓに向けて傾けて配置してもよい。
このようにすることで、ＬＥＤ光源７から発せられる照明光のロスを抑制し、効率的に照明光を試料Ｘに照射することができる。

本実施形態においては、光源部５として、拡散板９を備えるものを例示したが、拡散板９を備えていなくてもよい。

１ 観察装置
２ 容器
２ａ 天板
４ 対物レンズ
５ 光源部
６ 撮影光学系
７ ＬＥＤ光源
９ 拡散板
１０ 遮光部材
１１ 開口部
１４ 反射部材
Ｘ 試料

Claims (8)

1. 試料の下方から上方に向けて照明光を射出する光源部と、
   該光源部から射出された照明光が前記試料の上方で反射されて前記試料を透過した透過光を前記試料の下方において撮影する撮影光学系とを備え、
   該撮影光学系が、前記試料を透過した透過光を集光する対物レンズを備え、
   前記試料が、光学的に透明な材質からなる容器内に収容され、
   前記光源部が、前記対物レンズの径方向外方から前記試料の上方に照明光を射出し、
   前記照明光が前記試料の上方に配置されている前記容器の天板内面によって反射される観察装置。
2. 前記光源部が、前記対物レンズの径方向に異なる位置から照明光を射出可能である請求項１に記載の観察装置。
3. 前記光源部が、前記対物レンズの周方向に異なる位置から照明光を射出可能である請求項１に記載の観察装置。
4. 前記光源部が、前記対物レンズの周囲に配列され、独立して点灯可能な複数の光源を備える請求項２または請求項３に記載の観察装置。
5. 前記光源部が、前記試料の下方に配置される光源と、該光源からの照明光のうち、特定の径方向位置の照明光のみを透過させる開口部を有する第１の遮光部材とを備える請求項１に記載の観察装置。
6. 前記光源部が、照明光を拡散させる拡散板を備える請求項１から請求項５のいずれかに記載の観察装置。
7. 前記天板の上方に、光を遮蔽する材質からなる第２の遮光部材を備える請求項１から６のいずれかに記載の観察装置。
8. 試料の下方から上方に向けて照明光を射出する射出ステップと、
   該射出ステップにより射出された照明光を前記試料の上方において反射する反射ステップと、
   該反射ステップにより反射された照明光を前記試料に透過させる透過ステップと、
   該透過ステップにより前記試料を透過した透過光を前記試料の下方において対物レンズにより集光する集光ステップと、
   該集光ステップにより集光された光を撮影する撮影ステップとを含み、
   前記試料が、光学的に透明な材質からなる容器内に収容され、
   前記射出ステップでは、前記対物レンズの径方向外方から前記試料の上方に前記照明光が射出され、
   前記照明光が前記試料の上方に配置されている前記容器の天板内面によって反射する観察方法。
   

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