JP4411866B2

JP4411866B2 - 顕微鏡装置

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Publication number: JP4411866B2
Application number: JP2003156810A
Authority: JP
Inventors: 久奥川
Original assignee: Nikon Corp
Current assignee: Nikon Corp
Priority date: 2003-06-02
Filing date: 2003-06-02
Publication date: 2010-02-10
Anticipated expiration: 2023-06-02
Also published as: JP2004361485A

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、恒温加湿環境中の試料を顕微鏡観察するための装置に関する。
【０００２】
【従来の技術】
近年、バイオテクノロジーの著しい進展に伴い、生物試料をそのままの状態で長時間観察したり画像を記録したいという要望が高まっている。生物試料を入れた容器は、「培地」と呼ばれる生息に必要な成分を含んだ液体を充満し、３７℃程度の温度、１００％に近い高湿度に保持される。
【０００３】
従来、試料室の温度と湿度の両方を一定に保持し、観察窓を通して試料室内の試料を顕微鏡観察できるようにした恒温加湿槽が知られている（例えば、特許文献１参照）。この恒温加湿槽は、観察窓の結露防止のために発熱体を具備している。
【０００４】
【特許文献１】
特開平５−２６８０２号公報（第１頁、図１）
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
上述した装置では、恒温加湿槽と顕微鏡との間に温度差があるために、顕微鏡の構成部品に熱変形を生じ、時間経過と共に焦点面が変動するという問題があった。
【０００６】
本発明は、長時間の観察においても焦点面の変動が生じない光学顕微鏡装置を提供するものである。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
（１）請求項１の顕微鏡装置は、生物試料が置かれ、前記生物試料を出し入れする開閉蓋を有する気密構造の試料室と、前記試料室の前記開閉蓋以外の隔壁において前記試料室と結合され、前記生物試料を顕微観察するための無限遠光学系の対物レンズを収納し、かつ前記対物レンズをその光軸方向に駆動する垂直移動ステージを備え、また、前記対物レンズによって生成された平行光束を反射する反射鏡を備え、さらに前記反射鏡で反射された前記平行光束が透過する窓部材を備えた気密構造の筺体と、
前記筐体に取り付けられた前記窓部材を透過した前記平行光束を結像する前記無限遠光学系の一部である第二対物レンズおよび撮像装置を収納するケーシングと、前記試料室の温度および湿度を所望の温度、湿度に制御するとともに前記筺体の温度を前記試料室の温度と等温に制御する環境制御部と、を備えることを特徴とする。
【０００８】
（２）請求項２の発明は、請求項１に記載の顕微鏡装置において、前記試料室の生物試料を照明する透過照明装置と、前記試料室の生物試料を前記無限遠光学系を形成する前記対物レンズを介して照明する励起光照明装置と、を備えることを特徴とする。
（３）請求項３の発明は、請求項２に記載の顕微鏡装置において、前記透過照明装置は、前記開閉蓋に設けられたことを特徴とする。
（４）請求項４の発明は、請求項１に記載の顕微鏡装置において、前記筺体の気密性は、前記試料室の気密性よりも低いことを特徴とする。
（５）請求項５の発明は、請求項１に記載の顕微鏡装置において、前記第二対物レンズの口径は、前記対物レンズがその光軸に垂直方向に移動したとしても、その移動量を許容する分大きく形成されたことを特徴とする。
【０００９】
【発明の実施の形態】
以下、本発明による顕微鏡装置について、図面を参照して説明する。
（第１の実施の形態）
図１は、本発明の第１の実施の形態による光学顕微鏡装置の構成を模式的に示す全体構成図である。説明の便宜上、図示のようにＸ，Ｙ，Ｚ直交座標で方向を表す。
【００１０】
本実施の形態の光学顕微鏡装置は、試料室１０が筺体２０の上に積み重ねられた構成となっている。
試料室１０は、透明基板１が配設された底板１１と透過照明装置１３を載置する上板１２を有する気密容器である。透明基板１の上には生物試料Ｓを保持する培養容器１４が載置されている。
【００１１】
ここで、上板１２は、図４に示されるように、生物試料Ｓの交換等のために開閉できる構造になっている点を説明する。
図４は、試料室の構成図であり、試料室内が外界に対して開放された状態を表している。上板１２は、開閉板となり、リンク機構１２ａにより、図中、左側が開放される。この開放された所から生物試料Ｓを出し入れしたり、試料室１０内部のメンテナンスを行うことができる。試料室１０は、この開閉構造により、筺体２０とは独立に外界に対して開放できるので、生物試料Ｓの交換が任意且つ簡単にできる。また、開放空間が広いので、培養容器１４を傾けたり、試料室１０の壁に衝突させることなく試料の交換ができる。
もちろん、上板１２が閉鎖状態にあるときには、試料室１０内は完全に気密空間となる。
【００１２】
筺体２０は、顕微鏡の光学系２１、二次元移動ステージ３１、垂直移動ステージ３２および撮像装置３３を収納する容器であり、天井部分は開放されている。試料室１０が筺体２０に積載されると、底板１１が天井部分を閉塞するので、筺体２０は気密性を付与される。底板１１が隔壁となって、試料室１０の内部と筺体２０の内部とは完全に分離され、筺体２０は、試料室１０とは独立に気密性が保持されている。
【００１３】
光学系２１は、対物レンズ２２、励起光照明装置２３、調光フィルタ２４、蛍光フィルタ２５、反射鏡２６、第二対物レンズ２７を有する。
二次元移動ステージ３１は、光学系２１、垂直移動ステージ３２および撮像装置３３を載置して、水平面に沿ってＸ方向とＹ方向に移動する。垂直移動ステージ３２は、対物レンズ２２を保持してその光軸方向、すなわちＺ方向に移動する。
【００１４】
撮像装置３３は、第二対物レンズ２７の近傍に配置されている。
制御部４１は、光学系２１、二次元移動ステージ３１、垂直移動ステージ３２および撮像装置３３に接続されている。また、制御部４１は、パーソナルコンピュータ（ＰＣ）４２に接続されている。
【００１５】
以下、試料室１０内の環境調整方法および筺体２０内の温度調整方法について説明する。
図２は、本発明の第１の実施の形態による光学顕微鏡装置に環境制御装置を接続した状態を示す全体構成図である。図２において、図１と重複する構成部品については符号と説明を省略する。また、制御部４１とＰＣ４２は図示を省略する。
【００１６】
環境制御装置５０は、所望の温度、湿度および組成のガスを生成し、このガスを試料室１０内および筺体２０内へ循環させる装置である。環境制御装置５０は、加湿器５１、加熱器５２、循環ポンプ５３およびガス混合器５４を有する。
環境制御装置５０の内部では、加湿器５１は、ガス混合器５４を介して循環ポンプ５３に接続されている。加熱器５２は、循環ポンプ５３に直接に接続されている。また、加湿器５１内は、加熱器５２により加熱器５２内と同一温度に暖められている。ガス混合器５４は、不図示のガス供給部（例えば、ガスボンベ）へ配管されている。
【００１７】
環境制御装置５０の外部との接続に関しては、加湿器５１は、チューブ５５によって試料室１０に設けられたジョイント部５５ａに接続されている。加熱器５２は、チューブ５６によって筺体２０に設けられたジョイント部５６ａに接続されている。
【００１８】
循環ポンプ５３は、チューブ５５によって試料室１０に設けられたジョイント部５５ｂに接続されている。また、循環ポンプ５３は、チューブ５６によって筺体２０に設けられたジョイント部５６ｂに接続されている。各チューブおよび各ジョイント部には断熱処理が施されている。
【００１９】
試料室１０に関する循環系は、３箇所の矢印Ａで示される。ガス混合器５４で所定のガス組成に調整された空気は、加湿器５１に入り３７℃−１００％ＲＨの空気となり、循環ポンプ５３によりチューブ５５、ジョイント部５５ａを経て試料室１０内に送り込まれる。試料室１０内を循環した空気は、ジョイント部５５ｂから排出され、チューブ５５を経て循環ポンプ５３に戻る。そして、再び所定の温度、湿度およびガス組成の空気として試料室１０内に送り込まれる。これにより、試料室１０内は、所定の環境に維持される。
試料室１０内の温度を監視する温度センサ（不図示）は、観察に支障のない限り培養容器１４に近い場所に配置するのが望ましい。
【００２０】
筺体２０に関する循環系は、３箇所の矢印Ｂで示される。加熱器５２により３７℃に暖められた空気は、循環ポンプ５３によりチューブ５６、ジョイント部５６ａを経て筺体２０内に送り込まれる。筺体２０内を循環した空気は、ジョイント部５６ｂから排出され、チューブ５６を経て循環ポンプ５３に戻る。そして、再び所定温度の空気として筺体２０内に送り込まれる。これにより、筺体２０内は、所定の温度に維持される。
試料室１０に関する循環系と筺体２０に関する循環系は、互いに独立した経路をもっているので混じり合うことはない。
【００２１】
次に、顕微鏡観察について説明する。
透過像観察の場合は、透過照明装置１３によって生物試料Ｓが照明され、生物試料Ｓを透過した光は、透明基板１を通り、対物レンズ２２に入射する。対物レンズ２２に入射した光は、反射鏡２６で反射され、第二対物レンズ２７を通り、撮像装置３３の撮像素子３３ａ上に結像する。
【００２２】
蛍光像観察の場合は、励起光照明装置２３から射出した光は、調光フィルタ２４、蛍光フィルタ２５を通り、対物レンズ２２の下方から入射する。対物レンズ２２に入射した光は、透明基板１を通り、生物試料Ｓに照射される。この励起光によって生物試料Ｓから蛍光が発する。蛍光は、透明基板１、対物レンズ２２、蛍光フィルタ２５を通り、反射鏡２６で反射され、第二対物レンズ２７を通り、撮像装置３３の撮像素子３３ａ上に結像する。
なお、励起光照明装置２３の照明光射出側にシャッタ２８を設けて、蛍光像観察のときのみシャッタ２８を開放するようにすることができる。
【００２３】
制御部４１は、観察条件、ステージの移動条件、撮影条件等に関する各種のデータをＰＣ４２から取得し、制御信号として光学系２１、二次元移動ステージ３１、垂直移動ステージ３２および撮像装置３３に出力する。また、制御部４１は、各種の制御データや画像データをＰＣ４２に出力する。
光学系２１は、制御部４１からの制御信号を受けて、照明光源の輝度調整、各種フィルタの切り換え、観察倍率の切り換えおよび視野絞りの調整等を行う。
【００２４】
二次元移動ステージ３１は、不図示の駆動系を有し、制御部４１からの制御信号を受けて、光学系２１、垂直移動ステージ３２および撮像装置３３をＸ方向、Ｙ方向に移動させる。これにより、生物試料Ｓの別の部位を観察することができ、二次元移動ステージ３１の位置、言い換えれば、生物試料Ｓの観察部位が原点位置からどれだけの距離にあるかも確認できる。
同様に、垂直移動ステージ３２は、制御部４１からの制御信号を受けて、対物レンズ２２をＺ方向に移動させる。これにより、観察倍率を切り換えたときや生物試料Ｓを交換したときに、生物試料Ｓに対して焦点調整をすることができる。
以上の操作によって、生物試料Ｓの任意の部位を鮮明に観察することができる。
【００２５】
撮像装置３３は、制御部４１からの制御信号を受けて、ＣＣＤのゲイン、シャッタスピード、開口数等の撮影条件、照明装置との連動による撮影タイミングが設定される。生物試料Ｓの顕微鏡画像データは、制御部４１を経由してＰＣ４２に送られ、顕微鏡画像としてディスプレイ上に表示される。ＰＣ４２は、顕微鏡画像を画像処理して表示することもできる。また、ＰＣ４２は、上記の観察条件、ステージの移動条件、撮影条件等の制御データも必要に応じてディスプレイ上に表示することができる。
【００２６】
本実施の形態では、光学系２１、二次元移動ステージ３１、垂直移動ステージ３２および撮像装置３３は、筺体２０に収納されている。このうちで、筺体２０に収納すべき必要性を大きい順に並べると、光学系２１、垂直移動ステージ３２、二次元移動ステージ３１、撮像装置３３である。試料室１０に近いものほど筺体２０に収納すべき必要性が大きいとも言える。必要性が小さい撮像装置３３を筺体２０の外部に設置することにより、筺体２０の内容積は減少し、コンパクトになる。二次元移動ステージ３１および撮像装置３３を筺体２０の外部に設置すれば、筺体２０は、光学系２１および垂直移動ステージ３２を収納するだけなので、より一層のコンパクト化が可能になる。
【００２７】
さらに、光学系２１を構成する光学部材の一部を筺体２０の外部に設置することもできる。
図５は、本実施の形態の変形例であり、図１と同じ構成部品には同一符号を付す。対物レンズ２２から第二対物レンズ２７までの観察光学系は、無限遠光学系であり、この無限遠光学系によって生成する平行光束は、筺体２０に設けられた窓部材３４を透過して、筺体２０の外部に設置されている第二対物レンズ２７に入射する。第二対物レンズ２７と撮像装置３３は、ケーシング３５内に収納され、ケーシング３５は、筺体２０に取り付けられている。
【００２８】
無限遠光学系によって平行光束が生成するので、二次元移動ステージ３１に載置されている光学系２１がＸ方向に移動しても、結像性能は保持される。また、第二対物レンズ２７の口径は、光学系２１がＹ方向に移動しても、その分だけ大きくすればよい。光学系２１の移動量は、数ｍｍ程度であるので、第二対物レンズ２７の口径を数ｍｍ程度大きくすればよい。このようにすれば、移動部分が第二対物レンズ２７と撮像装置３３を含むことがないので、負荷が小さくなり、移動時のレスポンスが向上する。
【００２９】
以下、本実施の形態の光学顕微鏡装置の作用を説明する。
先ず、試料室１０内と筺体２０内の環境について説明する。図１に示されるように、試料室１０は、筺体２０の上に積み重ねられ、互いに独立した気密空間を形成している。
【００３０】
生物試料Ｓは、透明な培養容器１４内の培地に置かれる。生物試料Ｓは、動物や植物の細胞、細胞小器官等である。培地の蒸発を防ぎ、生物試料Ｓを生きたままで長時間観察するためには、試料室１０内の環境を所定温度、所定のガス組成で高湿度に維持する必要がある。例えば、試料室１０内の環境は、３７℃−１００％ＲＨ，ＣＯ_２濃度５％に保持されている。従って、培養容器１４内の環境も試料室１０内と同一になっている。また、湿気や培地からの蒸発物が外部に漏出するのを防止するために、試料室１０は気密構造を有している必要がある。この高い気密性を長時間維持するために、試料室１０は、気体流出入口を除き、完全に閉鎖されている。
【００３１】
一方、筺体２０内の温度は、試料室１０内とほぼ等しい温度、すなわち３７℃に保持される。筺体２０内のガス組成と湿度は、特にコントロールする必要はない。筺体２０内と試料室１０内とが等温に保持されることによって、透明基板１は、結露や曇りが発生することがなくなる。また、光学系２１は、筺体２０と試料室１０との温度差の影響を受けないので、光学部品の熱膨張変化による焦点変動も生じない。さらに、光学系２１は、生物試料Ｓの観察中でも、生物試料Ｓの交換のために上板１２を開いた時でも、試料室１０内の高湿度環境の影響を受けないので、光学部品や照明装置の損傷を生じることがない。
【００３２】
ところで、筺体２０の気密性は、試料室１０の気密性よりも低くてもよい。筺体２０内は、試料室１０内とほぼ等しい温度に保持され、外界の影響をほとんど受けない程度に閉鎖されていればよい。筺体２０には高い気密性は要求されないので、電気配線や気体流出入口の取り付けを簡便に行うことができる。
【００３３】
（第２の実施の形態）
図３は、本発明の第２の実施の形態による光学顕微鏡装置の構成を模式的に示す全体構成図である。図１と同じ構成部品には同一符号を付し、説明を省略する。
本実施の形態の光学顕微鏡装置が第１の実施の形態の光学顕微鏡装置に比べて大きく異なる点は、試料室１０と筺体が重ね合わされる結合部分である。
【００３４】
図１の第１の実施の形態では、筺体２０は、天井板を有していない。試料室１０が筺体２０に積載されると、試料室１０の底板１１が試料室１０の内部と筺体２０の内部とを分離する隔壁となって、試料室１０と筺体２０の気密が独立に保たれる。
一方、図３の本実施の形態では、筺体３０は、透明基板２が配設された天井板３を有している。天井板３も隔壁の作用を有している。積載の有無にかかわらず、最初から試料室１０と筺体３０の気密は独立に保たれる。従って、試料室１０全体を交換する場合でも筺体３０内の雰囲気は常に一定に保たれる。もちろん、試料室１０は、図４に示すような開閉構造により、筺体２０とは独立に外界に対して開放できるので、生物試料Ｓの交換が任意且つ簡単にできる。また、開放空間が広いので、培養容器１４を傾けたり、試料室１０の壁に衝突させることなく試料の交換ができる。
【００３５】
底板１１の下面と天井板３の上面は、接触しているか僅かな間隔で平行配置されている。同様に、透明基板１と２も、接触しているか僅かな間隔で平行配置されている。試料室１０と筺体３０の内部を等温に維持するためには、底板１１と天井板３も接触し、透明基板１と２も接触しているのが最も望ましい。
【００３６】
底板１１と天井板３とが離れていると、その隙間に室温の大気が流れ込んで、透明基板１の内面に結露や曇りを発生させたり、光学系２１に焦点変動、光軸ずれ等を発生させる恐れがある。これらの発生を防止するためには、底板１１と天井板３の外周付近にＯリングなどのシーリング部材を配置すればよい。
【００３７】
透明基板１と２とが離れている場合は、以上の問題点が解決されたとしても、光学的な問題が残されている。透明基板１と２の間には空気が存在するので、それぞれの対向面で合計２回の反射が生じ、光量損失を招くことになる。この発生を防止するためには、透明基板１と２とを光学的に一体とすればよい。例えば、透明基板１と２の間隔部分に、透明基板１、２と屈折率が等しい液浸油を充填すればよい。
なお、底板１１に配設された透明基板１と天井板３に配設された透明基板２は、少なくとも観察光路をカバーできる面積があればよい。また、底板１１全体を透明基板１で構成してもよく、天井板３全体を透明基板２で構成してもよい。
【００３８】
本実施の形態の光学顕微鏡装置に、前述した環境制御装置５０を組み合わせた構成も、第１の実施の形態のものと同じ作用、効果を有する。
また、本実施の形態の光学顕微鏡装置にも、図５に示したような筺体のコンパクト化を適用でき、第１の実施の形態のものと同じ作用、効果を有する。
【００３９】
第１および第２の実施の形態の光学顕微鏡装置は、基本的には同じ作用、効果を有する。すなわち、試料室１０と筺体２０または３０とは、独立の気密空間を形成しているので、筺体２０または３０は、試料室１０内の高湿度環境の影響を受けることがなく、光学部品や照明装置の損傷を生じることがない。試料室１０は、筺体２０または３０とは独立に外界に対して開放できるので、試料の交換が任意且つ簡単にできる。
また、試料室１０と筺体２０または３０が隣接して等温に保持されているので、透明基板１は結露したり曇ったりすることがなく、また、光学系２１の変動、経時変化は最小限に抑制される。従って、長時間安定して顕微鏡観察や記録ができる。
さらに、筺体２０または３０が光学系を収納することにより、顕微鏡を暗室内に設置したのと同様の状態となる。蛍光像観察には室内を暗くするのが望ましいが、その必要がなくなる。
【００４０】
以下、本発明の変形例について述べる。
第１および第２の実施の形態の光学顕微鏡装置は、二次元移動ステージ３１を設けて光学系２１を移動させることにより生物試料Ｓの異なる部位を観察できるように構成されていたが、光学系２１を固定とし、生物試料Ｓを収めた培養容器１４を移動させる構成にしてもよい。この構成は、単に培養容器１４を動かすだけで済むので、移動機構は小型となり、光学顕微鏡装置全体のコンパクト化を図ることができる。
【００４１】
第１および第２の実施の形態の光学顕微鏡装置は、試料室１０が筺体２０または３０上に積載された構成であったが、逆に筺体２０または３０を試料室１０上に積載する構成にしてもよい。この場合は、倒立型顕微鏡に代えて正立型顕微鏡が用いられる。この構成では、培養容器１４を通さなくても観察できるので、特に培地外に出ている生物試料に対しても観察可能である。但し、下方が開放された筺体２０の場合は、正立型顕微鏡の光学系を筺体２０の側板または上側の板に取り付ける必要がある。
【００４２】
【発明の効果】
以上説明したように、本発明によれば、試料室と筺体とが独立の気密空間を形成し、温度、湿度の制御を行っているので、長時間観察に適し、且つ焦点面の変動が生じない光学顕微鏡装置を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明の第１の実施の形態に係る光学顕微鏡装置の構成を模式的に示す全体構成図である。
【図２】本発明の第１の実施の形態に係る光学顕微鏡装置に環境制御装置を接続した状態を示す全体構成図である。
【図３】本発明の第２の実施の形態に係る光学顕微鏡装置の構成を模式的に示す全体構成図である。
【図４】本発明の実施の形態に係る光学顕微鏡装置の試料室の開閉構造を説明する部分構成図である。
【図５】本発明の実施の形態の変形例であり、光学顕微鏡装置の構成を模式的に示す全体構成図である。
【符号の説明】
１，２：透明基板
３：天井板
１０：試料室
１１：底板
１２：上板
１３：透過照明装置
１４：培養容器
２０，３０：筺体
２１：光学系
２２：対物レンズ
３１：二次元移動ステージ
３２：垂直移動ステージ
３３：撮像装置
４１：制御部
４２：ＰＣ
５０：環境制御装置
Ｓ：生物試料

Claims

生物試料が置かれ、前記生物試料を出し入れする開閉蓋を有する気密構造の試料室と、
前記試料室の前記開閉蓋以外の隔壁において前記試料室と結合され、前記生物試料を顕微観察するための無限遠光学系の対物レンズを収納し、かつ前記対物レンズをその光軸方向に駆動する垂直移動ステージを備え、また、前記対物レンズによって生成された平行光束を反射する反射鏡を備え、さらに前記反射鏡で反射された前記平行光束が透過する窓部材を備えた気密構造の筺体と、
前記筐体に取り付けられた前記窓部材を透過した前記平行光束を結像する前記無限遠光学系の一部である第二対物レンズおよび撮像装置を収納するケーシングと、
前記試料室の温度および湿度を所望の温度、湿度に制御するとともに前記筺体の温度を前記試料室の温度と等温に制御する環境制御部と、を備えることを特徴とする顕微鏡装置。
請求項１に記載の顕微鏡装置において、
前記試料室の生物試料を照明する透過照明装置と、
前記試料室の生物試料を前記無限遠光学系を形成する前記対物レンズを介して照明する励起光照明装置と、を備えることを特徴とする顕微鏡装置。
請求項２に記載の顕微鏡装置において、
前記透過照明装置は、前記開閉蓋に設けられたことを特徴とする顕微鏡装置。
請求項１に記載の顕微鏡装置において、
前記筺体の気密性は、前記試料室の気密性よりも低いことを特徴とする顕微鏡装置。
請求項１に記載の顕微鏡装置において、
前記第二対物レンズの口径は、前記対物レンズがその光軸に垂直方向に移動したとしても、その移動量を許容する分大きく形成されたことを特徴とする顕微鏡装置。