JP4740554B2 - 培養顕微鏡装置 - Google Patents

Description

本発明は、培養顕微鏡装置に関する。

生物は高度な複雑性を持つため、構造や機能を理解するのは容易なことではない。そのため、近年生命現象を再現できる最小単位である細胞、つまり培養細胞を用いた単純な実験系が用いられている。培養細胞を用いることによって、ホルモンの応答などの解析が生体内の他要因による影響を受けることのない実験が可能となる。

つまり遺伝子の導入や阻害により遺伝子の機能解析を行なうことが可能となる。細胞を培養するためには、生体内を真似た環境を用いる必要がある。そのため温度は体温の３７℃とし、また細胞間液を真似た培地が用いられる。培地にはアミノ酸などの栄養源の他に、ＰＨ調整のための炭酸バッファーが含まれる。炭酸バッファーは５％という高い分圧の炭酸ガスを含む空気の存在下で平衡状態になり、ディッシュなどの開放系の培養に利用される。また培地から水分の蒸発を防ぐため、高湿度の環境が要求される。

細胞の培養には上記環境条件を備えた炭酸ガスインキュベーターが用いられる。

また細胞の状態観察には位相差顕微鏡、ＧＦＰの発現観察には蛍光顕微鏡により、時系列の画像取得によるタイムラプス観察が行なわれている。

しかし一般に顕微鏡は、炭酸ガスインキュベーターの外に設置されるため、観察は細胞に温度やＰＨなどの変化を与え細胞へのストレスとなり、実験結果に影響する可能性がある。

そのため特開２００３−９３０４１号公報は、炭酸ガス・温度・湿度の制御が可能なインキュベーター内に可動装置と顕微鏡を配置した装置を提案している。この装置では、培養環境から培養細胞を取り出すことなく、培養環境下で細胞の観察が可能である。

また、特開平１０−２８５７６号公報は、顕微鏡上に設置する、炭酸ガス・温度・湿度の制御が可能な顕微鏡観察用透明恒温培養装置を提案している。
特開２００３−９３０４１号公報 特開平１０−２８５７６号公報

培養細胞は、細菌やカビなど増殖速度が速い微生物に汚染されると、栄養分が枯渇して死滅してしまう。汚染を防ぐ目的で培養器具は滅菌や消毒が行なわれるが、特開２００３−９３０４１号公報の装置は培養装置内部に移動手段を備えているため、装置内部の形状が複雑であり洗浄が困難である。これは、汚染に対する十分な予防を妨げる要因となる。

また特開１０−２８５７６号公報の装置は、顕微鏡上の限られた空間で容器を構成するため、外気環境によって温度設定が変化しやすい。

本発明は、このような実状を考慮して成されたものであり、その目的は、設置環境の温度変化が少なく、洗浄が容易な培養顕微鏡装置を提供することである。

本発明による培養顕微鏡装置は、標本である培養細胞の観察を可能とする顕微鏡装置の対物レンズと、標本と対物レンズ相対移動させる顕微鏡装置の移動装置と、顕微鏡装置の下側ベース部材に設置された、対物レンズによる培養細胞の拡大像を撮像する顕微鏡装置の撮像装置と、下側ベース部材と対をなす、対物レンズと移動装置が設置された顕微鏡装置の上側ベース部材と、培養細胞を培養する培養装置とを備えている。培養装置は、上側ベース部材と共に培養空間を規定する扉と、上側ベース部材と共に非培養空間を規定する基部と、培養空間の湿度を調整するための加湿ヒーターと、非培養空間の温度の調整するための加温ヒーターと、炭酸ガスボンベに接続された炭酸ガスを供給するための弁と、加温ヒーターと加湿ヒーターと弁を制御する制御部とを備えている。標本は培養空間内に配置される。対物レンズと移動装置は、培養空間と非培養空間の両方にまたがっている。撮像装置は培養装置の外に配置されている。制御部は、培養空間内の温度・湿度・炭酸ガス濃度を培養細胞に適切な値に制御する。制御部はまた、非培養空間の温度を制御する。培養顕微鏡装置はさらに、非培養空間を培養空間の湿気から隔離する隔離手段を備えている。

本発明によれば、設置環境の温度変化が少なく、洗浄が容易な培養顕微鏡装置が提供される。

以下、図面を参照しながら本発明の実施形態について説明する。

第一実施形態
図１は、本発明の第一実施形態の培養顕微鏡装置を概略的に示している。培養顕微鏡装置は、基本的に、培養細胞の観察するための顕微鏡装置と、温度・湿度・炭酸ガス濃度を培養細胞に適切な値に制御可能な培養装置１０１とから構成されている。

［顕微鏡装置概要］
図１において、顕微鏡装置は、標本１２３内の培養細胞の観察を可能とする対物レンズ１２５と、対物レンズ１２５による培養細胞の拡大像を撮像する撮像装置１５０と、標本１２３（すなわち培養細胞）と対物レンズ１２５を相対移動させる移動装置と、対物レンズ１２５と移動装置が設置される上側ベース部材１１４と、撮像装置１５０が設置される下側ベース部材１９１と、上側ベース部材１１４と下側ベース部材１９１とを連結している複数の支持支柱１１１とを備えている。

上側ベース部材１１４と下側ベース部材１９１と支持支柱１１１は共に、熱による膨張が少ない低膨張材料からなる。

移動装置は、直動ガイド１１５と水平移動部材１１６とボールネジ１１７とステッピングモーター１１８と回転軸１１９と回転軸受け１２０とステッピングモーター１２１とテーブル１２２と直動ガイド１２４と上下移動部材１２６とボールネジ１２７とステッピングモーター１２８とから構成されている。

直動ガイド１１５と水平移動部材１１６とボールネジ１１７とステッピングモーター１１８は共に上側ベース部材１１４の下側に設けられている。直動ガイド１１５は水平移動部材１１６を一方向に移動可能に支持し、ステッピングモーター１１８はボールネジ１１７を介して水平移動部材１１６を移動させる。水平移動部材１１６は回転軸受け１２０とステッピングモーター１２１を保持している。ステッピングモーター１２１は回転軸受け１２０に対して同軸に配置されている。回転軸受け１２０は、回転軸１１９を水平面に垂直に回転可能に支持するともに与圧を付加する。回転軸１１９と回転軸受け１２０の間には摩擦を軽減するために複数のボール１３５が設けられている（図２参照）。回転軸１１９の下側の端部はステッピングモーター１２１に接続されている。回転軸１１９の上側の端部は、上側ベース部材１１４に形成された開口を通って上側ベース部材１１４の上面から突出しており、標本１２３が装着されるテーブル１２２が固定されている。

対物レンズ１２５は、回転軸１１９から水平移動部材１１６の移動方向に伸ばした直線上に位置している。対物レンズ１２５は上下移動部材１２６によって支持されている。上下移動部材１２６は、上側ベース部材１１４に固定された直動ガイド１２４によって上下に移動可能に支持されている。また上下移動部材１２６は、ボールネジ１２７を介して、上側ベース部材１１４に固定されたステッピングモーター１２８と連結しており、ステッピングモーター１２８によって上下に移動される。直動ガイド１２４と上下移動部材１２６とボールネジ１２７とステッピングモーター１２８は共に上側ベース部材１１４の下側に設けられている。

このように構成された移動装置によって、テーブル１２２に装着された標本１２３と対物レンズ１２５との間の相対移動が可能になる。つまり、上側ベース部材１１４に対して水平面内の一方向に水平移動部材１１６の直線運動が可能となる。また水平移動部材１１６に対してテーブル１２２の揺動運動が可能となる。さらに上側ベース部材１１４に対して上下移動部材１２６の上下方向への直線移動が可能となる。つまり、標本１２３は対物レンズ１２５に対して一方向への直線移動と揺動が可能となり、対物レンズ１２５は標本１２３に対して上下方向への相対移動が可能となる。その結果、複数の標本１２３の観察が可能となる。また撮像装置１５０を培養装置１０１の外に配置したため、撮像装置１５０の温度に起因するノイズを低減することが可能となる。さらに培養装置１０１の内外で温度の異なる上側ベース部材１１４と下側ベース部材１９１を低膨張材料で構成することで、熱膨張による歪みを低減でき光学系の調整を乱すことがない。

［培養装置概要］
培養装置１０１は、上側ベース部材１１４の上側に位置する扉１０１ａと、上側ベース部材１１４の下側に位置する基部１０１ｂとからなる。扉１０１ａは、テーブル１２２への標本１２３の装着のために、上側ベース部材１１４に対して開閉可能である。扉１０１ａが閉じられたときに扉１０１ａと上側ベース部材１１４との間を気密に保つために、弾性を有するシール部材１１２が扉１０１ａと上側ベース部材１１４との間に設けられている。基部１０１ｂは支持支柱１１１によって保持されており、上側ベース部材１１４との間を気密に保つために、弾性を有するシール部材１１２が基部１０１ｂと上側ベース部材１１４との間に設けられている。

培養装置１０１は、断熱材１０２と、抗菌性と耐食性を有するステンレス鋼または抗菌コーティングされた金属材料の内装部１０３と、培養装置内部の温度・湿度・ＰＨを感知するセンサー１０４と、培養装置の内装に設けられた内部温度調整用の加温ヒーター１０５と、上側ベース部材１１４に設けられた培養装置内部湿度調整用の加湿ヒーター１０６と、炭酸ガス濃度を調整しＰＨ調整を行なうための炭酸ガスボンベに接続された炭酸ガス供給用の電磁弁１０７と、培養装置の内外を連結するための支持支柱１１１の温度調整用の支柱ヒーター１０８と、支持支柱１１１の温度測定用の支持支柱センサー１０９とを備えている。上側ベース部材１１４の上には、加湿ヒーター１０６の上方にあたる位置に、培養装置１０１の内部を加湿する水を入れた加湿パッド１１３が置かれる。培養装置１０１はさらに、センサー１０４からの信号に基づいて設定条件を維持するための演算を行なって加温ヒーター１０５と加湿ヒーター１０６と電磁弁１０７とを制御する制御部１１０を備えている。

このような構成により、断熱材１０２は、培養装置１０１から撮像装置１５０を熱的に隔離する。断熱材１０２とシール部材１１２によって培養装置１０１の内外での熱の出入りが少なくなる。このため、外気温度の変動を受けずらく、温度の安定化が可能となる。また熱の出入りが少ないため、加温ヒーター１０５と加湿ヒーター１０６の容量と加湿パッド１１３の水容量とを少なくできる。また、細胞を培養する培地には豊富な栄養分が備わるため、増殖能の高い微生物が浸入すると培養細胞に悪影響を与えてしまう。しかし抗菌性と耐食性を有する培養装置の内装部１０３により、微生物の浸入を抑え、培養細胞の活性を維持することが可能となる。

また培養装置は水分の蒸発による培地の乾燥を防ぐため高湿度に保たれている。そのため２３℃程度の室内で作業した標本を培養装置に持ち込むと容器外側に結露が生じ、顕微鏡による観察像の劣化を生じてしまう。そのため、制御部１１０は以下に述べる加湿制御を行なうとよい。培養装置１０１は、特に図示していないが、扉１０１ａの開閉を感知する扉センサーを有している。制御部１１０は、扉センサーの信号に基づいて、容器を含む培養細胞が培養装置１０１の内部の温度と同じになるための一定時間（例えば１０分後）から加湿ヒーター１０６により加湿パッド１１３を加温して加湿を開始する。この制御により、培養細胞は培養装置１０１の内部と同じ温度に達した後に加湿されるため、容器を含む培養細胞が結露することなく、良好な顕微鏡観察像を取得可能となる。また、扉センサーに代えて標本装着ボタンを制御部１１０に設け、標本装着ボタンによる指示に基づいて制御部１１０が同様の加湿制御を行なっても同様の効果を得ることが可能である。また加湿ヒーター１０６のオン・オフに代え、加湿パッド１１３に設けた扉の開閉を行なってもよい。

［顕微鏡装置のテーブル部と対物レンズ部の詳細］
図２は、図１に示されたテーブルの周辺部分を拡大して示している。テーブル１２２と上側ベース部材１１４の間には、水平移動部材１１６に固定された中間部材１２９が配置されている。テーブル１２２と中間部材１２９の間には、四フッ化エチレン（ＰＦＴＥ）からなるリング状の二枚のシートシール１９９と、弾性を有するＯリング１３０とが設けられている。Ｏリング１３０は押圧された状態で配置されている。また上側ベース部材１１４と中間部材１２９の間にも、同様に、二枚のシートシール１９９とＯリング１３０とが設けられ、Ｏリング１３０は押圧された状態で配置されている。

図３は、図１に示された対物レンズの周辺部分を拡大して示している。上側ベース部材１１４は、対物レンズ１２５を突出させるための開口１１４ｂを有し、開口１１４ｂの内周面には溝が形成されており、開口１１４ｂの溝内には弾性を有するＯリング１３４が収容されている。対物レンズ１２５が開口１１４ｂを通って上側ベース部材１１４の上面に突出している状態では、Ｏリング１３４は押圧されている。

図２において、ステッピングモーター１２１の回転はテーブル１２２を揺動させる。テーブル１２２の揺動によって、摩擦係数の小さいＰＴＦＥ材の二枚のシートシール１９９の間には主に滑りが生じる。また、シートシール１９９を介するテーブル１２２と中間部材１２９の間に間隔変動が生じても、Ｏリング１３０が弾性変形して間隔変動を吸収し常に隙間の発生を防止する。同様に、シートシール１９９を介する上側ベース部材１１４と中間部材１２９の間にも間隔変動が生じても、Ｏリング１３０が同様の作用により隙間の発生を防止する。またシートシール１９９は摩擦係数が小さいため、摺動抵抗は低く抑えられている。ガイドやステージを構成する部材の剛性を低くしても、精密な移動が可能となる。また摩擦力は小さいため部材の摩耗も抑えることが可能である。

また、図３において、対物レンズ１２５の上下移動においても、対物レンズ１２５と上側ベース部材１１４の開口１１４ｂの間に間隔変動が生じるが、Ｏリング１３４が弾性変形して間隔変動を吸収し常に隙間の発生を防止する。

また、図１において、扉１０１ａを閉めると、扉１０１ａと上側ベース部材１１４の間でシール部材１１２が押圧される。従って、扉１０１ａつまり培養装置１０１と上側ベース部材１１４の間に隙間は生じない。

この構成により、閉じられた扉１０１ａと上側ベース部材１１４とで規定される培養空間を外気と遮断することが可能である。さらに、培養空間の内部のテーブル１２２と対物レンズ１２５を培養空間の外部から移動させることが可能となる。そのため、培養空間の温度と湿度維持が容易なため、必要なヒーター容量と必要な水分量の削減が可能である。さらに、機構部（移動装置）と光学部への湿気の浸入を低減可能となり、錆と結露の発生を抑制できる。

また摩擦係数の小さいＰＴＦＥをシール面に用いたことによって、位置精度とシール性を兼ね備えた顕微鏡が実現可能である。

これまでに述べたシール構造（シール部材１１２とシートシール１９９とＯリング１３０とＯリング１３４）によっても、上側ベース部材１１４の下面側へ僅かではあるが湿気は侵入する。そのような湿気に対して機構部（移動装置）と光学部を湿気に曝さないため、図２において、上側ベース部材１１４の下面と水平移動部材１１６との隙間は０．１ｍｍ以下に設定され、また水平移動部材１１６には吸気管１３１と排気管１３２が接続されている。吸気管１３１と排気管１３２は外部に導かれ、吸気管１３１には吸気のために空圧源が接続されている。また吸気管１３１は培養装置１０１の内部での経路を長くするため、培養装置１０１の内部で数巻き巻かれている。吸気管１３１と排気管１３２は、顕微鏡装置の内部と培養顕微鏡装置の外気と接続する除湿手段を構成している。また中間部材１２９は、水平移動部材１１６に接続されている円筒部に、円筒部を貫通している連絡穴１２９ａを備えている。

また図３において、上側ベース部材１１４には、上側ベース部材１１４から対物レンズ１２５の軸方向に伸びた捕獲部材１３３が設けられている。捕獲部材１３３は、対物レンズ１２５が通る開口を有し、開口の内周面に形成された溝にはＯリング１３４が装着され、対物レンズ１２５を押圧している。捕獲部材１３３のＯリング１３４と上側ベース部材１１４のＯリング１３４の間にも、前述した吸気管１３１と排気管１３２が接続されている。

閉じられた扉１０１ａと上側ベース部材１１４とで規定された培養空間から二枚のシートシール１９９の間を通って侵入した湿気は、中間部材１２９と回転軸１１９の隙間から連絡穴１２９ａを通って、上側ベース部材１１４と水平移動部材１１６の間に拡散する。上側ベース部材１１４と水平移動部材１１６に拡散した湿気は吸気管１３１から導入される外気とともに排気管１３２から外部に排気される。吸気管から導入される外気は、培養装置１０１の内部での長い経路により暖められた空気となり水平移動部材１１６に達するため、部材の温度低下を生じさせることがない。対物レンズ１２５とＯリング１３４の間から侵入した湿気も同様に外部に排気される。

上記の構成により、それぞれのシール構造（シートシール１９９とＯリング１３０とＯリング１３４）から侵入した僅かな湿気も外部に強制的に排出される。このため、機構部（移動装置）や光学部に湿気が到ることがなく、錆や結露が生じる恐れがなくなる。また対物レンズ１２５の温度を一定にすることによって、温度変化による対物レンズ１２５の焦点移動を排除することが可能である。このため、長時間の観察でもピントズレのない観察が可能となる。

［マニュピレータ］
次に、培養細胞に遺伝子や薬剤を導入するマニュピレータ装置について図３を参照しながら説明する。マニュピレータ装置は、揺動と上下移動が可能なアーム１４２を有し、アーム１４２は端部にシリンジ１４３を保持している。アーム１４２は上下移動軸１３８に固定されている。上下移動軸１３８は、円筒状の回転軸１３６の中に収容されており、回転軸１３６に対して上下移動し得る。回転軸１３６は、軸受け１３７を介して上側ベース部材１１４に取り付けられており、上側ベース部材１１４に対して回転し得る。回転軸１３６は下端部に大歯車１９５を備えている。大歯車１９５は、上側ベース部材１１４に固定されたステッピングモーター１９４の出力軸に取り付けられた小歯車１９３とかみ合っている。上下移動軸１３８は下端部にメスネジを有している。上下移動軸１３８のメスネジは、ステッピングモーター１４０の出力軸に形成されたオスネジとかみ合っている。上下移動軸１３８は外周面に上下に延びる溝１３８ａを有している。溝１３８ａには、回転軸１３６に固定されたピン１３９が収容されている。ピン１３９は、回転軸１３６に対する上下移動軸１３８の上下移動の範囲を定めるとともに、回転軸１３６に対する上下移動軸１３８の回転を規制する。上下移動軸１３８に対するアーム１４２の固定位置は、シリンジ１４３と回転軸１３６の芯との間の距離が対物レンズ１２５の光軸と回転軸１３６の芯との間の距離と同じになるように調整されている。

以上の構成により、高湿度環境下でも、アーム１４２を移動して視野中心の細胞にシリンジ１４３を配置することが可能となり、例えば上側ベース部材１１４の上に設置した試薬を培養細胞に投与することが可能となる。

［水補給］
水浸対物レンズへの水補給装置について図３を参照しながら説明する。本実施形態の培養顕微鏡装置は、対物レンズ１２５が水浸対物レンズである場合も考慮して、水浸対物レンズへ水を補給する水補給装置を備えている。水補給装置は、培養装置１０１の設定温度とは異なる温度への設定が可能な冷却部を備えている。冷却部は、これに限らないが、本実施形態ではペルチェ素子１４４で構成されている。ペルチェ素子１４４は、テーブル１２２の下面で、テーブル１２２の移動の際に対物レンズ１２５の光軸上に位置し得る個所に固定されている。ペルチェ素子１４４は、対物レンズ１２５に対向し得る水補給面１４４ａを有している。培養空間は相対湿度１００％に近い飽和状態に維持されるため、ペルチェ素子１４４の水補給面１４４ａを数度冷却すると、水補給面１４４ａに水蒸気が結露する。前述した移動装置によってテーブル１２２を移動して、水補給面１４４ａを対物レンズ１２５の上方に配置した後に降下させることにより、水補給面１４４ａに結露した水を対物レンズ１２５に補給することができる。この構成によれば、ペルチェ素子１４４だけで、ほかに特別な部材を用いることなく、対物レンズ１２５への水の補給が可能となる。つまり、安価な水補給装置が提供される。

ペルチェ素子１４４をテーブル１２２に設ける代わりに上側ベース部材１１４の上面に設け、ペルチェ素子１４４の上面に結露した水を前述したマニュピレータを利用して対物レンズ１２５に供給することも可能である。この構成では、ペルチェ素子１４４をテーブル１２２に設けていないため、標本の温度変化を少なくすることが可能となる。

［暗視野］
顕微鏡装置は蛍光観察と暗視野観察とが可能である。蛍光観察は目的部位での蛍光蛋白の発現確認などに利用し、暗視野観察は細胞の核や輪郭を可視化し細胞の位置や培養の状態、または細菌汚染の確認などに利用する。

顕微鏡装置は、培養細胞を照明するための照明装置と、培養細胞を観察するための観察装置とを含んでいる。図４は、図１に示される顕微鏡装置に適用可能な照明装置を示している。図４に示されるように、照明装置は、発光波長が異なる複数の発光ダイオード１４５と、発光ダイオード１４５の前方にそれぞれ配置された複数の励起フィルター１４６と、屈折部材１４７とを備えている。発光ダイオード１４５と励起フィルター１４６と屈折部材１４７は共に対物レンズ１２５の外周部に配置されている。励起フィルター１４６は、発光ダイオード１４５から発せられる照明光のうち特定の波長の照明光だけを選択的に透過する。屈折部材１４７は、励起フィルター１４６を透過した照明光を屈折させて標本１２３に方向付ける。

観察装置は、図１に示されるように、対物レンズ１２５と、対物レンズ１２５と共働して結像光学系を構成する結像レンズ１４９と、結像光学系によって結像された光学像を撮る撮像装置１５０と、撮像装置１５０で取得された像を表示するモニター１９２とを備えている。さらに観察装置は、撮像装置１５０に向かう観察光のうち特定の波長の観察光だけを選択的に透過する吸収フィルター１４８と、吸収フィルター１４８を必要に応じて光軸上に配置するためのターレット１５１とを備えている。撮像装置１５０は、蛍光観察を考慮して冷却ＣＣＤであるとよい。

暗視野観察では、図１において、ターレット１５１を切り換えて空穴を光軸上に配置し、吸収フィルター１４８を光軸上から外す。図４において、発光ダイオード１４５が発した光は、励起フィルター１４６を透過し、屈折部材１４７により標本１２３を対物レンズ１２５のＮＡの外から照明する。そのため照明光や標本容器の下面で正反射した光は、対物レンズ１２５に捕獲されない。標本１２３内の培養細胞による反射光や散乱光だけが対物レンズ１２５に捕獲され、撮像装置１５０によって検出される。そのため透明な培養細胞でも染色することなく可視化が可能となる。また通常用いられている位相差観察で用いる透過照明部が不要なため、標本上部に空間が生じるため、培養装置１０１への標本１２３の出し入れや、標本１２３への試薬の投与などの操作が容易となる。

図５は、図１に示される顕微鏡装置に適用可能な別の照明装置を示している。対物レンズ１２５のＮＡが例えば０．８５とすると、対物レンズ１２５が捕獲する光の範囲は光軸から約６０度の範囲となる。標本容器底面の中央に向け、光軸から７０度の母線上には複数の照明光軸が設定され、照明光軸上には、励起フィルター１５２とコリメートレンズ１５３と発光ダイオード１５４とが配置される。励起フィルター１５２とコリメートレンズ１５３と発光ダイオード１５４は、上側ベース部材１１４上でテーブル１２２の移動範囲の外に設けた照明部材１５５の内部に防塵ガラス１５６によって封じられている。

言い換えれば、図５の照明装置は、照明光を発する発光ダイオード１５４と、発光ダイオード１５４から発せられる照明光を平行光にするコリメートレンズ１５３と、発光ダイオード１５４から発せられる照明光のうち特定の波長の照明光だけを選択的に透過する励起フィルター１５２と、発光ダイオード１５４とコリメートレンズ１５３と励起フィルター１５２を収容する照明部材１５５と、照明部材１５５に設けられた光学窓を構成する防塵ガラス１５６とを備えている。発光ダイオード１５４とコリメートレンズ１５３と励起フィルター１５２を通る照明光軸は、対物レンズ１２５の光軸に対して７０度傾いている。

発光ダイオード１５４が発した光は、コリメートレンズ１５３で平行光となり対物レンズ１２５での観察視野内を均一に照明する。標本１２３を透過した光は、対物レンズ１２５のＮＡの外からの光のため、対物レンズ１２５に捕獲されない。標本１２３による反射光や散乱光だけが対物レンズ１２５に捕獲され、撮像装置１５０によって検出される。そのため透明な培養細胞でも染色することなく可視化が可能となることや、透過照明部が不要になることなど、図４に示される照明装置による暗視野照明と同様の効果がある。蛍光観察を兼ねない場合または励起波長で狭帯域の波長が不要な場合は、励起フィルター１５２を取り除いた構成でもよい。

［蛍光］
図４の照明装置を用いて蛍光観察も可能である。蛍光観察では、図１において、ターレット１５１を切り換えて、標本１２３の蛍光波長に合わせた吸収フィルター１４８を光軸上に配置する。図４において、発光ダイオード１４５が発した光は、励起フィルター１４６によって標本励起に必要な波長の光だけが選択的に透過され、標本１２３を照明する。照明光により励起された標本１２３は、励起に用いた波長より長い波長の蛍光を発する。蛍光は対物レンズ１２５に捕獲され、平行光となり対物レンズ１２５を出て吸収フィルター１４８に到る。吸収フィルター１４８を透過した光は結像レンズ１４９により撮像装置１５０の受光面に結像され、モニター１９２上に物体像を表示する。暗視野照明のため、照明光が対物レンズ１２５で捕獲されないので、照明光による対物レンズ１２５での自家蛍光によるＳＮの低下が生じない。

図５の照明装置を用いて蛍光観察も可能である。図５において、発光ダイオード１５４が発した光は、コリメートレンズ１５３によって平行光となり、励起フィルター１５２によって標本励起に必要な光だけが選択的に透過され、標本を均一に照明する。結像までに到る作用は図４の照明装置の場合と同様である。

また発光ダイオード１５４に代えて、装置外部に設けた光源をファイバー伝達して用いることも可能である。ファイバーを用いる場合は、光源の大きさや光源の熱への配慮が不要となるため高輝度光源を用いることも可能となる。

［位相差］
図６は、本実施形態の変形例の培養顕微鏡装置を示している。具体的には、図１に示される顕微鏡装置を暗視野観察に適した構成から位相差観察に適した構成に変更した培養顕微鏡装置を示している。図６において、図１に示された部材と同一の参照符号で指示された部材は同様の部材であり、その詳しい説明は省略する。

本変形例の培養顕微鏡装置では、顕微鏡装置は、図６から分かるように、図１の対物レンズ１２５に代えて位相差対物レンズ１５７を備えており、また図４や図５の暗視野照明装置に代えて透過照明装置を備えている。

透過照明装置は、照明支柱１５８とリングスリット１５９と発光ダイオード１６０と反射ミラー１６１とコリメートレンズ１６２とを備えている。照明支柱１５８は、上側ベース部材１１４上でテーブル１２２の移動範囲の外に設置されている。照明支柱１５８は、リングスリット１５９と発光ダイオード１６０と反射ミラー１６１とを収容している。コリメートレンズ１６２は照明支柱１５８の開口部に挿入され、接着材によって隙間なく固定されている。リングスリット１５９はリング状の開口を有し、位相差対物レンズ１５７の後ろ側焦点面と共役な位置に配置されている。発光ダイオード１６０は、リングスリット１５９の近傍に配置されている。

位相差対物レンズ１５７は後ろ側焦点面に位相板１６３を備えている。位相板１６３の大きさは投影されるリングスリット１５９を含む大きさである。つまり、リングスリット１５９の像は位相板１６３の内側に投影される。また位相板１６３は、透過光の位相を１／４波長シフトする光学部材と透過光を減衰させるＮＤ膜とから構成されている。

発光ダイオード１６０を発した光は、リングスリット１５９の開口を透過し、反射ミラー１６１で方向転換され、コリメートレンズ１６２により平行光となり、標本１２３をムラなく照明する。

標本１２３を透過した０次光は、位相差対物レンズ１５７の位相板１６３上に集光し、位相シフトと光量減衰がなされる。また標本１２３で回折した一次光は、位相差対物レンズ１５７の後ろ側焦点面で位相板１６３上に集光しないため、位相シフトと光量減衰はなされない。

０次光と一次光は結像レンズ１４９によって撮像装置１５０の受光面に結像する。位相板１６３による０次光の位相シフトによって一次光との間で干渉が生じ、無染色標本でも観察が可能となる。また、コリメートレンズ１６２によって照明支柱１５８の内部と培養空間が遮断されるため、照明支柱内部の光学部材を結露させることがない。

＜第一実施形態の変形例＞
図７は、本発明の第一実施形態の別の変形例の培養顕微鏡装置を示している。

培養装置１０１内の上側ベース部材１１４には、複数の支持支柱２０１を介して固定した脚取付部２０２が設置され、脚取付部２０２の中央と下側ベース部材１９１は一本の支持支柱１１１によって接続されている。

また、対物レンズ１２５のシール部材２０３として以下の部材を用いる。シール部材２０３は弾性を有する肉薄形状のゴム材料であり、円筒部と二個所の平面部を持つ。二個所の平面部は対物レンズ１２５と上側ベース部材１１４に固定部材２０４を介して固定されている。

一本の支持支柱１１１により培養装置１０１の内外で設定温度の異なる脚取付部２０２と下側ベース部材１９１を接続することにより、温度による膨張差で生じる材料の歪みを低減可能であり、光学調整を狂わすことがない。

またシール部材２０３により摺動抵抗が低いシールが可能となり、位置再現性の向上が可能となる。

参考実施形態
図８は、参考実施形態の培養顕微鏡装置を概略的に示している。参考実施形態の培養顕微鏡装置は、温度・湿度・ＰＨの制御が可能で細胞培養に用いるインキュベーター１６４と、インキュベーター１６４の内部に収容される顕微鏡装置１６５と、顕微鏡装置１６５をインキュベーター１６４の内部と外部の間で移動させるスライド装置１６６とを備えている。スライド装置１６６はインキュベーター１６４の内部に設けられている。

顕微鏡装置１６５は、培養細胞を照明するための照明装置１６７と、培養細胞を観察するための観察装置１６８と、移動装置１６９と、顕微鏡容器１７０から構成される。照明装置１６７は、発光ダイオード１７１と、コリメートレンズ１７２と、励起フィルター１７３とを備えている。観察装置は１６８、対物レンズ１７４と、吸収フィルター１７５を備えたターレット１７６と、結像レンズ１７７と、撮像装置１７８とを備えている。移動装置は、顕微鏡容器１７０に設置された標本と対物レンズ１７４とを相対的に移動させるためのものであり、水平面内で二次元移動が可能な水平ステージ１７９と、水平ステージ１７９に設置された上下方向への移動が可能な上下ステージ１８０とを備えている。

対物レンズ１７４と照明装置１６７は上下ステージ１８０に一体的に固定されている。吸収フィルター１７５とターレット１７６と結像レンズ１７７と撮像装置１７８は水平ステージに一体的に固定されている。顕微鏡容器１７０は、実質的に、二つの開口を有する直方体形状の箱である。一方の開口は顕微鏡容器１７０の上面に位置し、他方の開口は顕微鏡容器１７０の側面に位置している。上面の開口近傍に設けた溝には弾性を有するＯリング１８１が装着され、光学的に透明なガラス板１８２がＯリング１８１を押圧した状態で顕微鏡容器１７０に固定されている。

顕微鏡容器１７０の側面の開口には連絡管１８３が固定されている。連絡管１８３は、伸縮が可能なベローズで、顕微鏡容器１７０の内部とインキュベーター１６４の外部を接続している。スライド装置１６６は、固定部１８４と移動部１８５と転動部１８６とからなり、固定部１８４はインキュベーター１６４に固定され、移動部１８５は顕微鏡容器１７０に固定されている。

インキュベーター１６４には内部の温度・湿度ムラをなくす目的でファンが設けられている。しかしファンによる振動は取得画像を劣化させる。そのため、制御部は、照明装置１６７の点灯と同時にファンを停止させるブレ防止制御を行なう。このブレ防止制御によって、ファンの振動による像ボケが生じることなく、高品位な画像取得が可能となる。

Ｏリング１８１を用いた密閉構造により、高湿度のインキュベーター１６４環境においても顕微鏡容器１７０内部への湿気の侵入が軽減されるとともに、侵入した僅かな湿気も連絡管１８３によって外部に排出されるため、顕微鏡部に錆や結露を生じることがない。また、スライド装置１６６を設けてインキュベーター１６４に対する顕微鏡容器１７０の出し入れを容易にすることにより洗浄しやすくしているため、細菌やカビなどへの汚染を嫌う細胞培養においても汚染予防が可能となる。またＯリングによるシール部では僅かな湿気の侵入があるため、二本の連絡管を設け、一方の連絡管で外気を導入し他方の連絡管で内部の湿気を強制的に除去してもよい。これにより、さらに湿気対策を完全なものとすることが可能となる。

これまで、図面を参照しながら本発明の実施形態を述べたが、本発明は、これらの実施形態に限定されるものではなく、その要旨を逸脱しない範囲において様々な変形や変更が施されてもよい。

本発明は培養顕微鏡装置に向けられており、以下の各項に列記する培養顕微鏡装置を含んでいる。

１． 本発明の培養顕微鏡装置は、培養細胞の観察を可能とする対物レンズと、対物レンズによる培養細胞の像を撮像する撮像装置と、培養細胞と対物レンズを相対的に移動させる移動装置とを備えた顕微鏡装置と、温度・湿度・炭酸ガス濃度を制御可能な培養装置と、培養装置の湿気から顕微鏡装置を隔離する隔離手段とを備えている。

２． 本発明の別の培養顕微鏡装置は、第１項において、顕微鏡装置は、培養細胞を照明するための照明装置と、照明装置から発せられる照明光のうち特定の波長の照明光だけを選択的に透過する励起フィルターと、撮像装置に向かう観察光のうち特定の波長の観察光だけを選択的に透過する吸収フィルターと、対物レンズの後ろ側焦点面と共役な位置に配置されたリングスリットと、対物レンズの後ろ側焦点面に配置されたリング状の位相板とをさらに備えている。

３． 本発明の別の培養顕微鏡装置は、第１項において、顕微鏡装置は、培養細胞を照明するための照明装置と、照明装置から発せられる照明光のうち特定の波長の照明光だけを選択的に透過する励起フィルターと、撮像装置に向かう観察光のうち特定の波長の観察光だけを選択的に透過する吸収フィルターとをさらに備え、照明装置は対物レンズの開口の外側から培養細胞を照明する。

４． 本発明の別の培養顕微鏡装置は、第１項〜第３項のいずれかにおいて、隔離手段は、光学的に透明なガラスからなる。

５． 本発明の別の培養顕微鏡装置は、第１項〜第３項のいずれかにおいて、顕微鏡装置は、顕微鏡装置の内部と培養装置の外気と接続する除湿手段を備えている。

６． 本発明の別の培養顕微鏡装置は、第１項〜第３項のいずれかにおいて、隔離手段は、金属の板状の隔離壁と、隔離壁に移動装置の一部であるテーブルを突出させる開口を有し、テーブルと隔離壁間には培養装置の湿気の侵入を防止するシール部が設けられている。

７． 本発明の別の培養顕微鏡装置は、第６項において、シール部は、四フッ化エチレンからなるシールシートと、シールシートを押圧する弾性部材とからなる。

８． 本発明の別の培養顕微鏡装置は、第１項〜第３項のいずれかにおいて、培養装置の空気循環用のファンを備えており、制御部は照明装置の点灯と同時に培養装置のファンを停止させる。

９． 本発明の別の培養顕微鏡装置は、第１項〜第３項のいずれかにおいて、顕微鏡装置は、対物レンズと移動装置が設置される上側ベース部材と、撮像装置が設置される下側ベース部材とを備え、培養装置は、培養装置から撮像装置を熱的に隔離する断熱材含む隔離壁を備え、上側ベース部材と下側ベース部材は共に低膨張部材で構成され、上側ベース部材と下側ベース部材は複数の支持支柱で連結されている。

１０． 本発明の別の培養顕微鏡装置は、第１項〜第３項のいずれかにおいて、顕微鏡装置は、対物レンズと移動装置が設置される上側ベース部材と、撮像装置が設置される下側ベース部材とを備え、培養装置は、培養装置から撮像装置を熱的に隔離する断熱材を含む隔離壁備え、上側ベース部材の中央に固定された脚部で下側ベース部材が連結されている。

１１． 本発明の別の培養顕微鏡装置は、第１０項において、対物レンズは水浸対物レンズであり、顕微鏡装置は、水浸対物レンズに水を補給する水補給装置をさらに備えており、水補給装置は、培養装置の設定温度とは異なる温度への設定が可能な冷却部と、冷却部に結露した水を水浸対物レンズに移動させる水移動機構とを備えている。

１２． 本発明の別の培養顕微鏡装置は、第１項〜第３項のいずれかにおいて、隔離手段は、培養装置の内部において顕微鏡装置の全体を囲う顕微鏡容器を備えている。

１３． 本発明の別の培養顕微鏡装置は、第１項〜第３項のいずれかにおいて、制御部は、培養細胞の装着指示に基づいて一定時間経過後に加湿を開始する。

本発明の第一実施形態の培養顕微鏡装置を概略的に示している。 図１に示されたテーブルの周辺部分を拡大して示している。 図１に示された対物レンズの周辺部分を拡大して示している。 図１に示される顕微鏡装置に適用可能な照明装置を示している。 図１に示される顕微鏡装置に適用可能な別の照明装置を示している。 本発明の第一実施形態の変形例の培養顕微鏡装置を示している。 本発明の第一実施形態の別の変形例の培養顕微鏡装置を示している。 参考実施形態の培養顕微鏡装置を概略的に示している。

符号の説明

１０１…培養装置、１０１ａ…扉、１０１ｂ…基部、１０２…断熱材、１０３…内装部、１０４…センサー、１０５…加温ヒーター、１０６…加湿ヒーター、１０７…電磁弁、１０８…支柱ヒーター、１０９…支持支柱センサー、１１０…制御部、１１１…支持支柱、１１２…シール部材、１１３…加湿パッド、１１４…上側ベース部材、１１４ｂ…開口、１１５…直動ガイド、１１６…水平移動部材、１１７…ボールネジ、１１８…ステッピングモーター、１１９…回転軸、１２０…回転軸受け、１２１…ステッピングモーター、１２２…テーブル、１２３…標本、１２４…直動ガイド、１２５…対物レンズ、１２６…上下移動部材、１２７…ボールネジ、１２８…ステッピングモーター、１２９…中間部材、１２９ａ…連絡穴、１３０…Ｏリング、１３１…吸気管、１３２…排気管、１３３…捕獲部材、１３４…Ｏリング、１３５…ボール、１３６…回転軸、１３７…軸受け、１３８…上下移動軸、１３８ａ…溝、１３９…ピン、１４０…ステッピングモーター、１４２…アーム、１４３…シリンジ、１４４…ペルチェ素子、１４４ａ…水補給面、１４５…発光ダイオード、１４６…励起フィルター、１４７…屈折部材、１４８…吸収フィルター、１４９…結像レンズ、１５０…撮像装置、１５１…ターレット、１５２…励起フィルター、１５３…コリメートレンズ、１５４…発光ダイオード、１５５…照明部材、１５６…防塵ガラス、１５７…位相差対物レンズ、１５８…照明支柱、１５９…リングスリット、１６０…発光ダイオード、１６１…反射ミラー、１６２…コリメートレンズ、１６３…位相板、１６４…インキュベーター、１６５…顕微鏡装置、１６６…スライド装置、１６７…照明装置、１６８…観察装置、１６９…移動装置、１７０…顕微鏡容器、１７１…発光ダイオード、１７２…コリメートレンズ、１７３…励起フィルター、１７４…対物レンズ、１７５…吸収フィルター、１７６…ターレット、１７７…結像レンズ、１７８…撮像装置、１７９…水平ステージ、１８０…上下ステージ、１８１…Ｏリング、１８２…ガラス板、１８３…連絡管、１８４…固定部、１８５…移動部、１８６…転動部、１９１…下側ベース部材、１９２…モニター、１９３…小歯車、１９４…ステッピングモーター、１９５…大歯車、１９９…シートシール、２０１…支持支柱、２０２…脚取付部、２０３…シール部材、２０４…固定部材。

Claims (11)

1. 標本である培養細胞の観察を可能とする顕微鏡装置の対物レンズと、
   前記標本と前記対物レンズ相対移動させる前記顕微鏡装置の移動装置と、
   前記顕微鏡装置の下側ベース部材に設置された、前記対物レンズによる前記培養細胞の拡大像を撮像する前記顕微鏡装置の撮像装置と、
   前記下側ベース部材と対をなす、前記対物レンズと前記移動装置が設置された前記顕微鏡装置の上側ベース部材と、
   前記培養細胞を培養する培養装置とを備えており、
   前記培養装置は、
   前記上側ベース部材と共に培養空間を規定する扉と、
   前記上側ベース部材と共に非培養空間を規定する基部と、
   前記培養空間の湿度を調整するための加湿ヒーターと、
   前記非培養空間の温度を調整するための加温ヒーターと、
   炭酸ガスボンベに接続された炭酸ガスを供給するための弁と、
   前記加温ヒーターと前記加湿ヒーターと前記弁を制御する制御部とを備えており、
   前記標本は前記培養空間内に配置され、
   前記対物レンズと前記移動装置は、前記培養空間と前記非培養空間の両方にまたがっており、
   前記撮像装置は前記培養装置の外に配置されており、
   前記制御部は、前記培養空間内の温度・湿度・炭酸ガス濃度を培養細胞に適切な値に制御し、
   前記制御部は、前記非培養空間の温度を制御し、
   さらに、前記非培養空間を前記培養空間の湿気から隔離する隔離手段を備えている、培養顕微鏡装置。
2. 請求項１に記載の培養顕微鏡装置であって、前記非培養空間を除湿する除湿手段をさらに備えている、培養顕微鏡装置。
3. 請求項１または２のいずれかひとつに記載の培養顕微鏡装置であって、前記扉は、前記上側ベース部材に対して開閉可能である、培養顕微鏡装置。
4. 請求項１〜３のいずれかひとつに記載の培養顕微鏡装置であって、前記培養装置は、前記撮像装置を前記培養装置から熱的に隔離する断熱材含む隔離壁を備えている、培養顕微鏡装置。
5. 請求項１〜４のいずれかひとつに記載の培養顕微鏡装置であって、前記上側ベース部材と前記下側ベース部材は共に低膨張部材で構成されている、培養顕微鏡装置。
6. 請求項１〜５のいずれかひとつに記載の培養顕微鏡装置であって、前記対物レンズは水浸対物レンズであり、前記顕微鏡装置は、前記水浸対物レンズに水を補給する水補給装置をさらに備えており、前記水補給装置は、前記培養装置の設定温度とは異なる温度への設定が可能な冷却部と、前記冷却部に結露した水を前記水浸対物レンズに移動させる水移動機構とを備えている、培養顕微鏡装置。
7. 請求項１〜６のいずれかひとつに記載の培養顕微鏡装置であって、前記培養装置は、前記培養細胞の装着指示に基づいて、前記培養細胞が前記培養装置の内部の温度と同じになるための一定時間経過後に加湿を開始する、培養顕微鏡装置。
8. 請求項１〜７のいずれかひとつに記載の培養顕微鏡装置であって、さらに、培養細胞を照明するための照明装置と、前記照明装置から発せられる照明光のうち特定の波長の照明光だけを選択的に透過する励起フィルターと、前記撮像装置に向かう観察光のうち特定の波長の観察光だけを選択的に透過する吸収フィルターと、前記対物レンズの後ろ側焦点面と共役な位置に配置されたリングスリットと、前記照明装置内で前記対物レンズの後ろ側焦点面に配置されたリング状の位相板とを備えている、培養顕微鏡装置。
9. 請求項１〜７のいずれかひとつに記載の培養顕微鏡装置であって、さらに、培養細胞を照明するための照明装置と、前記照明装置から発せられる照明光のうち特定の波長の照明光だけを選択的に透過する励起フィルターと、前記撮像装置に向かう観察光のうち特定の波長の観察光だけを選択的に透過する吸収フィルターとを備えており、前記照明装置は前記対物レンズの開口の外側から培養細胞を照明する、培養顕微鏡装置。
10. 請求項１〜９のいずれかひとつに記載の培養顕微鏡装置であって、前記顕微鏡装置はさらに、前記撮像装置が設置された下側ベース部材を備えており、前記上側ベース部材と前記下側ベース部材は支持支柱により連結されている、培養顕微鏡装置。
11. 請求項１〜１０のいずれかひとつに記載の培養顕微鏡装置であって、前記隔離手段はシール部材を備えている、培養顕微鏡装置。

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