TWI401472B - 顯微鏡裝置及使用該顯微鏡裝置的螢光觀察方法 - Google Patents

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Description

顯微鏡裝置及使用該顯微鏡裝置的螢光觀察方法
本發明係有關使用於生物組織等的螢光觀察等的顯微鏡裝置及使用該顯微鏡裝置的被觀察物之螢光觀察方法。
在分子生物學領域中，生物組織與細胞內離子、分子等的觀察是不可或缺的技術。光學顯微鏡主要使用於觀察生物組織時。此外，雷射共焦顯微鏡是使用於將光照射至生物組織的一部分並移動其照射位置以觀察細胞的一部分時。
在光學顯微鏡的主要觀察技術中有一種螢光觀察法，係使生物組織的細胞內的離子、分子附著螢光色素，對該螢光色素照射激發光，觀察受激發的螢光色素所發出的螢光。
螢光與激發光的波長並不相同。是以，藉由解析螢光便能夠進行細胞內分子的檢測與濃度的量測。故螢光觀察具有下列的優點。
(1)連離子、分子的大小都能觀察。
(2)能夠只對特定的離子、分子進行觀察。
(3)由於螢光的亮度會相應離子、分子的濃度而變化，因此能夠測定離子、分子的濃度。
然而，一般而言螢光也具有下列的缺點。
(1)當激發光的波長帶屬於紫外線時，對細胞而言激發光是有毒的。
(2)若持續照射激發光，則螢光色素會褪色。此處的褪色是指螢光強度衰減。
若使用可進行螢光觀察的螢光顯微鏡觀察移動的細胞，則會有細胞跑出顯微鏡的視野外致使觀察中斷的情況。
就解決此問題的方法有：(1)降低對物透鏡的倍率，讓視野變廣；(2)以機械性或化學性的方式抑制細胞的移動；(3)移動載台，使細胞的位置位於視野中心。然而，(1)的方法會使空間解像度降低，(2)的方法則有可能對細胞造成不良影響。
關於上述(3)的方法，下記的專利文獻1及2揭示一種具備有追蹤被觀察物的機構以對微小觀察物進行觀察的光學顯微鏡。該些光學顯微鏡係能夠進行利用穿透光之細胞位置及觀察區域的控制和穿透光記錄。
下記的專利文獻3至5揭示能夠進行利用螢光之細胞位置及觀察區域的控制和螢光記錄的螢光顯微鏡。
下記之非專利文獻1至5中發表有以游動的草履蟲做為較大的被觀察物而予以固定於視野中進行觀察的方法。
有關能夠在培養液中自由移動的細胞之中在醫學及生物學領域中受到重視者，可例舉具有讓人體免於細菌和病毒破壞之功能的免疫細胞(請參照非專利文獻6)。
與免疫功能相關的細胞內分子雖數目繁多，但該些分子的檢測與量測分子濃度的時間變化仍必須利用螢光觀察。
在免疫細胞之中，不太附著於載玻片表面、處於浮游狀態的細胞係被分類為浮游細胞。培養皿中的浮游細胞的位置經常會因為培養液的對流、重力、培養皿的壁及底部、水面及細胞彼此間的相互作用等而改變。在進行浮游細胞的觀察時，亦可考慮使用例如由H. Oku等人所發表的非專利文獻1中的手法來追蹤一細胞的方法。
[專利文獻]
專利文獻1：日本特開平5-80255號公報
專利文獻2：日本特開平7-2535487號公報
專利文獻3：日本特開平7-261097號公報
專利文獻4：日本特開2005-214924號公報
專利文獻5：日本特開2006-292420號公報
專利文獻6：WO2003/102636號公報
[非專利文獻]
非專利文獻1：H. Oku,N. Ogawa,Ishikawa,K. Hashimoto,“Two-dimensional tracking of a motile micro-organism allowing high-resolution observation with various imaging techniques”,Review of Scientific Instruments,Vol. 76,No. 3,2005
非專利文獻2：H. Oku,M. Ishikawa,Theodorus,and K. Hashimoto,“High-speed autofocusing of a cell using diffraction patterns”,Optics Express,Vol. 14,No. 9,pp. 3952-3960,2006
非專利文獻3：奧寬雅，石井抱，石川正俊： (英文標題：Microscopic Visual Feedback System),電子情報通信學會誌D-II,Vol. J84-D-II,No. 6,pp. 994-1002,2001
非專利文獻4：奧寬雅，石川正俊： 応答可能高速用可変焦点構造(英文標題：Structure of Dynamic focusing Lens with kHz Order Response for High-Speed Vision System),光學,Vol. 31,No. 10,pp. 758-764,2002
非專利文獻5：橋本浩一：微生物用 (中譯：使用微生物之主動感測),SORST (中譯：SORST聯合研討會)(6)演講要旨集,pp. 23-26,2007年1月30日
非專利文獻6：D. M. Davis：会話免疫細胞(中譯：免疫細胞的對話),日経(中譯：日經科學雜誌),pp. 52-60,2006年5月號
非專利文獻7：谷村保明：白血球分類自動化(中譯：白血球分類的自動化),MEDICAL IMAGING TECHNOLOGY,Vol. 14,No. 1,pp. 14-22,1996
螢光觀察參數現今是由觀察者依據經驗法則來決定。亦即現狀中，螢光觀察參數並非是依據客觀性評價來決定。在此情形下，即使細胞的位置、分佈、種類等有變化，觀察者也難以臨機應變地調整螢光觀察參數。
當觀察者欲觀察大量的細胞而過度地擴大激發光的照射範圍與照射時間時，將會對細胞與螢光色素造成不必要的不良影響。此外，所取得的螢光圖像資料量會非常地多，需要花費很長的時間進行解析。
在習知的螢光顯微鏡中亦可藉由自動控制激發光的種類與強度來持續性地對細胞內的複數個離子、分子的活化狀態進行觀察，而將一次實驗中所發生之細胞內的複數個離子、分子的相互作用一起予以可視化。不過，該自動控制是依據預定的時間排程來進行者、或者是與自螢光圖像所得的細胞資訊連動來進行者。
當僅使用螢光圖像來進行控制時，因為螢光的光強度較弱，故用以獲得控制用的圖像所需的曝光時間會增長。亦即，控制所花費的時間會變長。是故，一旦細胞移動的最大速度很快，常常便會無法有效地發揮控制的功能。上述的控制法的主要目的在於對長時間觀察本來不會移動的細胞時發生的偏離進行修正。
本發明乃鑒於上述課題而研創者，其目的在於提供一種藉由將來自被觀察物的穿透光用於控制而能夠進行螢光觀察時的被觀察物的位置與觀察區域等的自動控制之顯微鏡裝置及使用該顯微鏡裝置的被觀察物的螢光觀察方法。
為了達成前述目的，本發明的顯微鏡裝置係具備：載台，用以載置被觀察物；第1光源，對被觀察物照射照明光；第2光源，對被觀察物照射用以激發螢光的激發光；圖像資訊檢測部，檢測藉由上述照明光而得的被觀察物的圖像資訊；螢光圖像資訊檢測部，檢測藉由因上述激發光而由被觀察物所發出的螢光所得到的圖像資訊；及控制部，根據被觀察物的運動模型(model)與輸入自圖像資訊檢測部的被觀察物的圖像資訊來決定被觀察物的螢光觀察區域，且就螢光觀察區域內的每預定間隔取得輸入自圖像資訊檢測部的被觀察物的圖像資訊與輸入自螢光圖像資訊檢測部的螢光圖像資訊。
運動模型係意指，針對在被觀察物所具有的物理學特性或化學特性中，針對特定維度(dimension)、或特定維度的組合、或特定維度的加權組合，而以預測該維度上的被觀察物的時間空間變化為目的的模型。例如，表示被觀察物的位置、速度、分佈、種類、形狀、離子濃度、分子濃度等任一者或該些的組合的時間空間變化的數理模型。
在上述構成中，控制部較佳為依循PID(比例積分微分)控制等古典控制；最佳控制、準最佳控制等現在控制、H∞控制、取樣控制、閒滯(deadbeat)控制、適應控制等後現代控制理論；類神經網路控制、模糊控制、遺傳基因演算法等智慧型控制，來決定螢光觀察。
PID控制係指，依循由比例於偏差的數項、偏差的積分項、及偏差的微分項中任一者或該些的組合而表現的控制法則來進行目標值與輸出值之偏差的最小化之控制手法。
最佳控制係指，作成表示螢光觀察的效率之評價函數，藉由進行該評價函數之最小化或最大化而導出最佳的控制法則之控制手法。
準最佳控制係指，作成表示螢光觀察的效率之評價函數，藉由進行該評價函數之局部性的最小化或最大化而導出局部性的最佳的控制法則之控制手法。
控制部較佳為，依循被觀察物的運動模型來決定螢光觀察區域的中心位置。控制部較佳為，具備用來控制第1光源的第1光源控制部、及用來控制第2光源的第2光源控制部。
載台較佳為使被觀察物的位置移動的三維載台。螢光圖像資訊檢測部較佳為，具備將至少1波長以上的螢光加以分離之波長選擇手段。
較佳為，具備配設在第2光源與被觀察物之間的第1針孔(pinhole)、及配置在螢光與螢光圖像資訊檢測部之間的第2針孔。較佳為，具備使第1針孔或第2針孔移動及/或旋轉的針孔驅動部。
較佳為，配設在第1光源與被觀察物之間的對物透鏡、及對物透鏡的驅動部。較佳為，具備配設在被觀察物發出的光與圖像資訊檢測部之間的成像透鏡、及成像透鏡的驅動部。較佳為，具備配設在螢光與螢光圖像資訊檢測部之間的成像透鏡、及成像透鏡的驅動部。
較佳為，具備收容被觀察物且充滿環境氣體的環境控制部。環境控制部係用以控制環境氣體的種類、環境氣體的溫度者。就環境氣體而言，可利用氮氣(單體)、氧氣(單體)、二氧化碳(單體)、空氣(混合物)、及該些的混合氣體。環境控制部較佳為，具備能夠收容複數個被觀察物的收容部。
較佳為，具備用以刺激被觀察物的被觀察物刺激手段。就給予被觀察物的刺激而言，可利用電性刺激、磁性刺激、力學性刺激、超音波刺激、溫度性刺激、化學性刺激、光刺激等。就被觀察物刺激手段而言，例如，可利用由電極、電流、電池、電阻器、電容器、磁鐵、線圈、超導體、理想導體、電性導體、半導體、絕緣體、介電體、壓電體、焦電體、強介電體、離子導體等所構成的電性刺激控制裝置，以給予被觀察物電性刺激或磁性刺激。又例如，可利用由短針、探頭(probe)、致動器、壓電體、離心機、砝碼、彈簧等所構成的力學性刺激控制裝置，以給予被觀察物力學性刺激。又例如，可利用電致伸縮振動器(electrostrictive vibrator)、磁致伸縮振動器(magnetostrictive vibrator)等超音波刺激控制裝置，以給予被觀察物超音波刺激。又例如，可利用由加熱器、冷卻器、熱傳導體、溫度計、溫度記錄術(thermography)等所構成的溫度性刺激控制裝置，以給予被觀察物溫度性刺激。又例如，可利用由使化學物質的濃度或狀態進行時間空間變化的由移液管、幫浦、注射器、螺旋漿、螺桿(screw)、微流體元件所構成的化學性刺激控制裝置，以給予被觀察物化學性刺激。又例如，可利用鏡、稜鏡、濾光器、燈、雷射、邁射(maser)等光刺激控制裝置，以給予被觀察物光刺激。
當然，該些刺激控制裝置及其零件可相互補缺。例如，光刺激控制裝置係能夠藉由將光照射至籠形化合物使之分解而使細胞內外的化學物質的濃度或狀態進行時間空間變化，從而亦能夠成為化學性刺激控制裝置。此外，光刺激控制裝置可利用光加熱測定液，從而亦能夠成為溫度性刺激控制裝置。
為了達成上述目的，本發明的螢光觀察方法係具有下述階段：第1階段，根據被觀察物的圖像資訊與被觀察物的運動模型來決定被觀察物的螢光觀察區域；及第2階段，在螢光觀察區域內的預定位置取得螢光圖像資訊。
在上述構成中，較佳為，係依循PID控制等古典控制；最佳控制、準最佳控制等現在控制、H∞控制、取樣控制、閒滯控制、適應控制等後現代控制理論；類神經網路控制、模糊控制、遺傳基因演算法等智慧型控制來決定第1階段的螢光觀察。
較佳為，在第1階段與第2階段之間，根據被觀察物的圖像資訊與被觀察物的運動模型的至少一方來決定螢光觀察區域的中心位置。較佳為，在第2階段，取得被觀察物的圖像資訊。較佳為，就螢光觀察區域內的每一預定位置反覆進行預定次數之各階段。
運動模型的參數較佳為，由被觀察物的位置、速度、分佈、種類、離子濃度、分子濃度等的任一者或該些的組合構成。
依據本發明的顯微鏡裝置，由於是根據來自被觀察物的圖像資訊與被觀察物的運動模型決定螢光觀察區域，因此能夠自動地進行螢光觀察。
依據使用本發明的顯微鏡裝置的螢光觀察方法，為了根據被觀察物的運動模型導出評價函數與自動控制法則而使用被觀察物的位置、分佈、種類、狀態、離子濃度、分子濃度等作為回饋資訊，藉此，即使是對被觀察物的動態變化亦能夠臨機應變且自動地調整螢光觀察參數。
以下，茲參照圖式對本發明實施形態進行詳細說明。各圖中同一或相對應的構件係使用同一符號。
(第1實施形態)
第1圖係本發明第1實施形態的顯微鏡裝置1的構成示意圖。第1實施形態的顯微鏡裝置1係具備：載台3，用以載置被觀察物2，且能夠自由移動被觀察物2的位置；光學系統10；以及控制部20，控制載台3的位置等。
光學系統10係具有：照明用光源4，對被觀察物2照射照明光以用於檢測被觀察物2的像與位置；激發用光源5，照射用以激發產生自被觀察物2的螢光的激發光；鏡筒部15，配置有用以形成下列光路的光學零件：照射照明光源4之光而自被觀察物2獲得的穿透光T的光路、將激發光5A引導至被觀察物2的光路、以及由被觀察物2所產生的螢光F的光路；圖像資訊檢測部16，檢測由自鏡筒部15射出的來自被觀察物2的穿透光所構成的圖像資訊；以及螢光圖像資訊檢測部17，檢測自鏡筒部15射出的被觀察物2的螢光圖像資訊。被觀察物2可為屬於例如生物試樣的細胞等。
於載台3係載置被觀察物2，並藉由後述的控制部20來控制被觀察物2的位置。該載台3係所謂的電動台，可為在載置被觀察物2的二維平面(X-Y平面)受驅動控制的XY台，亦可為受三維驅動控制的XYZ台。三維驅動亦可利用操縱器(manipulator)來進行(請參照非專利文獻3)。
在此，與觀察區域的XY軸方向相關的位置控制係可藉由控制照明用光源4與激發用光源5的照射位置、後述的針孔的配置位置來進行。與觀察區域的Z軸方向相關的位置控制係可藉由控制後述的對物透鏡、成像透鏡、針孔的配置位置來進行(請參照專利文獻6與非專利文獻2、4)。
當照明用光源4為穿透光用的光源時，則照明用光源4只要是發出含有被觀察物2所吸收或反射的波長的光的光源的話皆可。就如此的照明用光源4而言，可使用鹵素燈等各種燈、發光二極體、各種雷射。為了避免激發光5A與螢光F發生干涉，較佳為利用光學過濾器8等將輸出自照明用光源的光之中與激發光5A與螢光F為相同波長帶的光加以濾除。從照明用光源4照射至被觀察物2的照明光係成為來自的被觀察物2的穿透光T與反射光並由圖像資訊檢測部16所檢測。來自被觀察物2的圖像即所謂的明視野像或暗視野像等圖像資訊。
激發用光源5係只要是能夠激發被觀察物2本身或加入至被觀察物2的螢光體的光源的話皆可。就如此的激發光5A而言，可使用氙燈、水銀燈等燈、氬雷射等各種雷射來作為激發光5A。為了使激發光5A與穿透光T、螢光F不發生干涉，較佳為利用光學過濾器9等將不必要的波長帶加以濾除。亦可經由未圖示的投光管將激發用光源5導入至被觀察物2。
為了形成使因照明用光源4的光而由被觀察物2產生的光、激發光5A及螢光F通過的光路，鏡筒部15係構成為含有由第1及第2分束器(beam splitter)18、19、對物透鏡6及成像透鏡7所構成的光學零件。圖示中係顯示倒立型的顯微鏡裝置的一例。在此，因照明用光源4的光而由被觀察物2產生的光可不為穿透光T而為反射光。
第1及第2分束器18、19亦可配置於設置在鏡筒部15的未圖示之埠(port)。分束器18、19可使用能夠將照明用光源4的波長與產生自被觀察物2的螢光F的波長予以分離的分色鏡(dichroic mirror)等。在以下的說明中係以分束器18、19為分色鏡來進行說明。
第1分色鏡18的作用係反射短波長的光並使長波長的光穿透，因此，激發光5A會反射而入射至圖上方的的被觀察物2。另一方面，由於來自被觀察物2的穿透光T係使用比激發光5A的波長有更長波長的光，因此會穿透第1分色鏡18。
第2分色鏡19係配置在第1分色鏡18的下方。穿透第1分色鏡18的來自被觀察物2的穿透光T係通過第2分色鏡19與成像透鏡7，從鏡筒部15射出至圖像資訊檢測部16。亦可在成像透鏡7與圖像資訊檢測部16之間配置未圖示的過濾器，藉此使穿透光T與激發光5A、螢光F不發生干涉地入射至圖像資訊檢測部16。
穿透第1分色鏡18的來自被觀察物2的螢光F係在第2分色鏡19反射，通過成像透鏡12後射出至螢光圖像資訊檢測部17。亦可在成像透鏡12與螢光圖像資訊檢測部17之間配置未圖示的過濾器，藉此使螢光F與激發光5A、穿透光T不發生干涉地入射至螢光圖像資訊檢測部17。
圖像資訊檢測部16係具備偵測器，該偵測器能夠取得由來自照明用光源4的光因被觀察物2而產生的穿透光T與反射光所構成的圖像資訊。於穿透光T的光軸、且剛好在檢測穿透光T的圖像資訊檢測部16之前設置有成像透鏡7。偵測器可使用攝像元件，例如CCD型攝像元件與CMOS型攝像元件。此外，為了提高S/N比(信號雜訊比)減少雜訊，亦可藉由使用例如液化氮或帕耳帖裝置(Peltier device)的冷卻裝置來冷卻該些攝像元件。偵測器亦可具備進行圖像處理的計算機。此外，亦可具有接目透鏡作為目視觀察用。
螢光圖像資訊檢測部17係具有能夠取得來自被觀察物2的螢光圖像的偵測器。該偵測器係可依據目的而使用銀鹽攝像機或攝像元件。就攝像元件而言，與圖像資訊檢測部16同樣地可使用CCD型攝像元件與CMOS型攝像元件。此外，為了提高S/N比(信號雜訊比)以減少雜訊，亦可藉由使用液化氮或帕耳帖裝置的冷卻裝置來冷卻該些攝像元件。亦可於螢光F的光路上、且正好於檢測螢光F的螢光圖像資訊檢測部17之前設置有成像透鏡12。此外，亦可具有接目透鏡作為目視觀察用。
圖像資訊檢測部16用的成像透鏡17與螢光圖像資訊檢測部17用的成像透鏡12可為不同的透鏡。例如，可降低圖像資訊檢測部16用的成像透鏡7的倍率並提高螢光圖像資訊檢測部17用的成像透鏡12的倍率。此時，能夠擴大以圖像資訊檢測部16取得的穿透光T的圖像的視野，並且能夠於螢光圖像資訊檢測部17獲得被觀察物2的進一步放大之螢光圖像。
在第1圖中係為了說明而以沒有重疊之方式顯示穿透光T的光路與激發光5A及螢光F的光路，惟亦可使該些各光路一致。在圖像資訊檢測部16與螢光圖像資訊檢測部17之間會產生視野中心位置及焦點位置的偏移的情形。此情形中，亦可預先測定該些偏移而利用作為被觀察物2的位置控制及觀察區域控制中的偏移補償(offset)。藉由實施偏移補償，便能夠修正視野中心位置與焦點位置的偏移。
控制部20係經由圖像資訊檢測部16而接收由被觀察物2的穿透光T與反射光所得到的圖像資訊。控制部20係進行圖像資訊的處理、及以圖像資訊的處理結果為根據的載台3的控制。控制部20係由電子計算機所構成。就此種電子計算機而言，可使用個人電腦21。個人電腦21係具備用以顯示被觀察物2的圖像等的顯示裝置22。個人電腦21係控制圖像資訊檢測部16及螢光圖像資訊檢測部17的攝影啟動及結束、攝影速度、攝影像素數、箱化(benning)數、增益、位元數等。
控制部20係由光學系統10接收穿透被觀察物2的穿透光T的圖像資訊，控制部20係利用該圖像資訊來控制載台3上的被觀察物2的位置。
在顯微鏡裝置1中，係根據輸入自圖像資訊檢測部16的被觀察物2的圖像資訊與被觀察物2的運動模型(model)來決定被觀察物2的螢光觀察區域，以移動載台3，而於螢光觀察區域內的每預定間隔的位置，取得輸入自圖像資訊檢測部16的被觀察物2的圖像資訊與輸入自螢光圖像資訊檢測部17的螢光圖像資訊。
在此，運動模型的參數係由被觀察物2的位置、速度、分佈、種類、形狀、離子濃度、分子濃度的任一者或該些的組合構成。
具體而言，為了進行螢光觀察，控制部20進行含有下列3個階段的控制而能夠控制被觀察物2的螢光資訊的取得：第1階段，利用輸入自圖像資訊檢測部16的被觀察物2的穿透光的圖像資訊，決定被觀察物2的螢光觀察區域；第2階段，依據被觀察物2的運動模型決定螢光觀察區域的中心位置；第3階段，以預定間隔，進行螢光觀察區域內的螢光觀察與明視野觀察。在此，螢光區域係能夠依據後述的最佳控制法則等的智慧型控制來決定。
(位置控制演算法)
首先，針對利用第1階段的被觀察物2的穿透光的圖像資訊來控制被觀察物2的細胞位置的方法，亦即細胞位置控制演算法進行說明。
在圖像資訊檢測部16中，取得被觀察物2的穿透光的圖像，接著從圖像資訊抽出圖像特徵量。圖像特徵量係藉由圖像資訊的二值化將觀察對象的存在區域予以抽出，此時，藉由使用僅在直到剛才都一直存在有觀察對象的區域的附近進行抽出的自身定處理窗(self-windowing)法，便能夠不受制於障礙物地僅抽出觀察對象(請參照非專利文獻1)。
具體言之，從上述的二值資料計算0、1、2次矩(moment)以作為穿透光圖像特徵量。以控制部20的個人電腦讀出該圖像特徵量，求取被觀察物2的重心與方向。被觀察物2的運動亦能夠以卡爾曼濾波(Kalman filter)或粒子濾波(particle filter)等進行預測。
接著，以使被觀察物2的重心移動至視野中心的方式來決定載台3的馬達旋轉角的目標值，對該馬達進行回饋控制。例如，載台3可使用XYZ載台。該回饋控制係能夠使用由比例、積分、微分的任一種或該些的組合所構成的控制手法。
此外，亦可為了觀察被觀察物2的特定部位，或者為了取得被觀察物2的立體圖像，而故意以使自被觀察物2的重心偏離的特定位置移動至視野中心的方式來決定載台3的馬達旋轉角的目標值，對該馬達進行回饋控制。
穿透光圖像特徵量亦可使用上述self-windowing法以外的方法而抽出，例如，亦可從被觀察物2的繞射像抽出(請參照非專利文獻2)。
為了再度構成被觀察物2的軌跡，亦即為了重現被觀察物2的軌跡，而將上述XYZ載台3的移位資訊記錄至個人電腦21。藉此，更能夠獲得被觀察物2的軌跡。
使用穿透光T係為了以高亮度穩定地投射出作為追蹤對象的被觀察物2的全體像之故。除了穿透光T之外，亦能夠使用利用傾斜照明而從被觀察物2反射而來的反射光。反射光的光源係可使用與照明用光源4同樣的光源。此時，得自被觀察物2的圖像係反射光圖像。
另外，若對被觀察物2過度照射來自照明用光源4的穿透光T，則會有使被觀察物2的溫度上升之虞。故本實施形態的控制部20係設計為能夠調整來自照明用光源4的光的強度與照射時間等。
(螢光觀察方法)
接著，針對使用本發明的顯微鏡裝置1的螢光觀察方法進行說明。
將螢光試劑載持或注入於被觀察物2。當被觀察物2為細胞時，使用像是Indo-1(AM體，同仁化學研究所)的螢光試劑，以適度的濃度負載預定時間即可。Indo-1(AM體)不發出螢光F，但會通過微生物的細胞膜。
通過細胞膜的Indo-1(AM體)會因體內的酵素脂酶而轉變為脫AM體。亦即，Indo-1(AM體)一旦通過細胞膜，即轉變為發出螢光F但無法通過細胞膜的Indo-1。Indo-1在與Ca2+ 離子結合時及解離時係發出不同波長的螢光F。
處於結合與解離之個別狀態的Indo-1的量係依Ca2+ 濃度而變化。亦即，隨著Ca2+ 的上升，由結合狀態的Indo-1發出的螢光F增加，相反的，由解離狀態的Indo-1發出的螢光F減少。藉由此特性，比較在個別波長的螢光F的強度即可求得Ca2+ 濃度。具體而言，在使用後述的顯微鏡裝置40時，依各波長分割2波長螢光觀察像，將依各像素計算而得的螢光強度比代入預先制訂的檢量曲線，藉此便能夠求出Ca2+ 濃度。
並非僅限於Ca2+ 離子，藉由替換顯微鏡裝置1的過濾器9及分色鏡18、19、26，亦能夠利用以其他的離子、分子為對象的螢光色素。
(螢光觀察區域的控制演算法)
針對使用顯微鏡裝置1使螢光觀察張數減少及用以使可進行螢光觀察的細胞數目增加的控制進行說明。
在此控制中，為了進行螢光觀察而賦予載台3的Z軸方向、亦即成像透鏡7的位置的時間性變化，更具而言為賦予螢光觀察區域寬度的時間性變化。
關於螢光觀察的步驟，第一步為決定進行螢光觀察的區域。第2圖係螢光觀察區域的型示之圖。圖中以斜線表示的部位即為進行螢光觀察的區域。將該觀察區域予以等分割。分割的寬度d(在此，d>0)係依要觀察的對象來決定。接著，在觀察區域的各點進行螢光觀察。接著，間隔數十秒的時間後重新設定觀察區域，進行螢光觀察。反覆T次上述的觀察動作(在此，T>0)。
在1張螢光觀察照射激發光5A的時間e(>0)與觀察點個數N(k)(在此，k>0)的乘積eN(k)係成為在1次的螢光觀察照射激發光5A的總時間。e雖為可變且可擴張，惟在此為簡單起見故設定為固定值。第次的螢光觀察的區域寬度2x(k)係藉由下記式(1)而給定。
[數式1]
2x (k )=N (k )d 　(1)
在螢光觀察時間從第k次的試行移至第k+1次的螢光F時，將x(k)更新成x(k+1)。
就螢光觀察的評價函數而言，導入藉由下記式(2)而給定的J(T)。
[數式2]
其中，q(>0)、r(>0)分別為與進行螢光觀察所需時間及要進行觀察的細胞數相關的權重。y(k)係在螢光觀察區域寬度2x(k)內進行螢光觀察的細胞數。在式(2)中，螢光觀察張數N(k)愈少，右方的值愈小，進行螢光觀察的細胞數y(k)愈多，右方的值愈小。另一方面，當N(k)變少時，y(k)亦會變少。
因此，問題便可改為找尋將評價函數J(T)予以最小化的螢光觀察參數N(k)。由於N(k)與x(k)係具有式(1)的關係，因此以下係由式(1)求取x(k)的最佳控制法則。
藉由下記式(3)更新於時刻k的x(k)。
[數式3]
x (k +1)=x (k )+u (k )　(3)
其中，x(k)係正值。控制量u(k)係將細胞數的觀測值y(k)回饋者。式(3)表示下一時刻的x(k+1)為現在時刻的x(k)加上控制量u(k)者。
由上述總總，求取x(k)的問題能夠歸結於求取以下記式(4)定義的最佳控制量U*(T-1)=[u*(0),u*(1),…,u*(T-1)]。這變成控制理論中求取最佳之輸出回饋法則的問題。是以，求取滿足下記式(4)的最佳控制法則U*(T-1)的最佳控制法則U*(T-1)=[u*(0),u*(1),…,u*(T-1)]。
[數式4]
此時，求取控制量u(k)的問題在於，細胞2沿著顯微鏡裝置1的光軸方向的運動。這是由於細胞2因顯微鏡裝置1的光軸方向的運動而不再存在於螢光觀察區域會是個問題之故。是以使用用以預想細胞2於顯微鏡裝置1的光軸的運動之模型。接著，求取螢光觀察區域寬度2x(k)與存在於該區域內的細胞數y(k)的關係。
令全細胞數為M。令用以識別細胞2的號碼為i。令i的範圍為。令細胞2的顯微鏡裝置1的光軸方向的位置zi (k)(>0)為下記式(5)。
[數式5]
z i (k +1)=z i (k )+v 0 +ω i (k )　(5)
其中，v0 為表示細胞2的移動速度的集團平均之常數。wi (k)係加入細胞2的運動之項的白雜訊(white noise)。其特性為，平均E[wi (k)]=0，令分散藉由下記式(6)而給定。
[數式6]
其中，δkτ 及δij 係克氏符號(Kronecker delta)。T代表轉置。
令初期位置zi (0)為藉由下記式(7)而給定的平均和藉由下記式(8)而給定的分散為已知的機率變數。令vo 與wi (k)為獨立。在此，
[數式7]
[數式8]
zi (k)的分散Pi (k)的時間更新式係從上述式(5)藉由下記式(9)而給定。
[數式9]
P i (k +1)=P i (k )+W i 　(9)
就細胞2的運動模型而言，藉由提供細胞2的分佈，能夠求取各時刻的細胞位置的平均和分散。細胞位置的集團平均係藉由下記式(10)而給定，細胞位置的分散的集團平均P(k)係藉由下記式(11)而給定。
[數式10]
[數式11]
當細胞數足夠多時，依中心極限定理，細胞2的分佈能夠視為正規分佈。因此，令於k之細胞2的顯微鏡裝置1的光軸方向的位置的分布藉由下記式(12)的機率密度函數h(z(k))而給定。
[數式12]
此時，P(k)與的時間更新係利用上記式(9)至(12)而分別藉由下記式(13)及(14)而給定。螢光觀察區域的中心係以一致於式(14)的的方式進行控制。
[數式13]
[數式14]
令於k之顯微鏡裝置1的光軸方向的細胞數分佈f(k,n(k))如下記式(15)為機率密度函數h(n(k))的M倍。這是因為對屬於正規分佈的h(n(k))針對n(k)以-∞至+∞的區間進行積分的結果會為1，而f(k,n(k))的同區間的積分值則因其定義而為M之故。
[數式15]
f (k ,n (k ))=Mh (n (k ))　(15)
存在於顯微鏡裝置1的光軸方向的觀察區域寬度2x(k)內的細胞數y(k)係藉由下記式(16)而給定。
[數式16]
將與y(k)相關的上記式(16)相關於x(k)而進行線性近似，則獲得下記式(17)。
[數式17]
y (k )=c (k )x (k )+s (k )　(17)
在此，c(k)係相乘於x(k)的係數，係藉由下記式(18)而給定。
[數式18]
由式(18)，可知x(k-1)>0時，c(k)>0。這代表相對於觀察寬度，存在於該區域內的細胞數係單調遞增，物理上係屬妥當。
s(k)係不含x(k)的項，係藉由下記式(19)而給定。
[數式19]
s (k )=g (k ,x (k -1))-c (k )x (k -1)　(19)
接著，針對最佳控制量的導出進行說明。
將式(1)與式(17)代入式(2)中整理評價函數J(T)後，J(T)係藉由下記式(20)而給定。
[數式20]
其中，q2 (k)、α(k)及β(k)係藉由下記式(21)而給定。
[數式21]
並且，以下記式(22)來定義評價區間為第1(1為L的小寫)次至第T次之觀察的評價函數的總和。
[數式22]
其中，1的範圍為。
利用數學歸納法，1=m時的成為下記式(23)。
[數式23]
於式(23)應用最佳化原理，則最佳控制量u*(k)係藉由下記式(24)而給定。
[數式24]
並且，利用式(17)來重寫式(24)的最佳控制量u*(k)，則最佳控制量u*(k)係藉由下記式(25)而給定。
[數式25]
此表示最佳控制量u*(k)係將細胞數的觀察值y(k)回饋後者。
(圖像處理)
針對為了獲得最佳控制量，量測必要細胞數等所用的圖像處理進行說明。
為了鑑定細胞2的運動模型所必要者為，往顯微鏡裝置1的光軸方向的細胞2的移動速度的集團平均v0 和細胞位置的分散的時間變化Wi 。其中，被觀察物2為靜止物時，可將移動速度的集團平均v0 及位置的分散的時間變化Wi 視為0。
開始量測細胞數後，會有細胞2存在於偏離焦點的位置時亦予以計數之情形。此時，由於會量測為細胞2存在於實際上不存在細胞2的位置，因而導致測定誤差。因此，用來推定細胞位置的手法是不可或缺的，可應用貝克線法等。
當細胞2的位置比焦距更靠近對物透鏡6側時，細胞2的內側會產生亮條紋，外側會產生暗條紋。當細胞2的位置比焦距更遠離對物透鏡6側時，細胞2的外側會產生亮條紋，內側會產生暗條紋。這些條紋被稱為貝克線(Becke line)。其起因係，當觀察細胞2時，光的繞射以焦點面為界大幅變化之故。藉由將該貝克線應用至圖像處理，便能夠推定細胞2的顯微鏡裝置1的光軸方向位置(參照非專利文獻2)。
依據上述的圖像處理方法，由於使用貝克法來推定細胞位置，因此能夠縮小細胞2存在於偏離焦點的位置時的細胞數量測誤差。
穿透光圖像處理係可藉由下述的程序來進行。
(i)將浮游有細胞2的試驗溶液的觀察區域設定為顯微鏡裝置1的光軸方向，以設置在圖像資訊檢測部16的攝像機等對被觀察物2進行攝影。以其作為觀察圖像1。此時，觀察圖像1為明視野像。
(ii)對比(i)的觀察圖像靠近對物透鏡6達預定距離的圖像進行攝影。以其作為觀察圖像2。就該預定距離而言，能夠設定為例如1μm的等級。
(iii)求取觀察圖像1與觀察圖像2之差分。
(iv)進行圖像上的差分值的二值化。
(v)使用半徑為預定大小的像素的圓形遮罩進行膨脹處理，將同一細胞2的分離像素整合成一個。
(vi)使用(v)的上述像素的圓形遮罩進行縮小處理，將細胞2以外的小雜訊去除。
(vii)使附近的像素連結並標記(labeling)，量測細胞數。
(viii)依據已標記之細胞2的大小來過濾(filtering)。亦即，若太大則數為2個，藉此應對在步驟(v)中將別的細胞2視為同一細胞2的情形。若太小則視為雜訊，藉此應對未完全去除細胞2以外之存在的情形。
上述的圖像處理係可使用顯微鏡裝置1的圖像資訊檢測部16與控制部20與載台3進行下述(1)至(7)的程序。
(1)個人電腦21發出指令。
(2)自個人電腦21接收到指令的D/A介面卡輸出電壓。
(3)移動載台3。
(4)以攝像機擷取通過對物透鏡6而得的圖像。
(5)將所擷取的圖像傳送至個人電腦21。
(6)個人電腦21進行圖像處理。
(7)根據經圖像處理過的資訊，個人電腦發出指令給D/A介面卡。
藉由圖像處理而量測各圖像的細胞數，該細胞數係成為觀察區域的各觀察點的細胞數。藉此便可求得觀察區域內的細胞分佈。使用各觀察點的細胞數，計算，而能夠求取相對於時間變化的變化量以作為細胞的移動速度的集團平均v0 。
進一步地，亦能夠求取細胞位置的分散的時間變化Wi 。
接著，針對組合上述螢光觀察的最佳控制法則、及在應用最佳控制法則時所必要之細胞數等的量測所用的圖像處理之螢光觀察進行說明。
第3圖係使用本發明第1實施形態的顯微鏡裝置1的螢光觀察程序的流程圖的一例。
首先，於步驟ST1，將被觀察物2設定為預定間隔，以d(μm)間隔(以下稱之為d間隔)進行觀察區域內的明視野觀察。被觀察物2係例如屬於免疫細胞的一種的T細胞。於步驟ST2，算出觀察區域內的被觀察物2的平均位置及分散。
在步驟ST3中係依據希望觀察的被觀察物2的數目決定螢光觀察區域。
於步驟ST4，以d間隔進行螢光觀察區域的螢光觀察及明視野觀察。為了增加穿透光圖像的資訊，亦可相較於螢光觀察將明視野觀察的觀察間隔縮小，或使觀察區域擴大。
於步驟ST5，待機預定時間，例如20秒。為了增加用於控制的穿透光的圖像資訊，亦可將明視野觀察的待機時間相較於螢光觀察予以縮短。
接著，於步驟ST6，依循最佳控制法則決定螢光觀察區域。
於步驟ST7，依循被觀察物2的運動模型決定螢光觀察區域的中心位置。
接著，於步驟ST8，以d間隔進行螢光觀察區域的螢光觀察及明視野觀察。d間隔可設定為例如300μm。為了增加穿透光圖像的資訊，亦可將明視野觀察的觀察間隔相較於螢光觀察予以縮小、或使觀察區域擴大。
於步驟ST9，判定是否結束螢光觀察。其中，於步驟ST9，當判定為螢光觀察未反覆進行有預定次數(例如T次)時，再次從步驟ST5開始進行步驟ST8的螢光觀察。
於步驟ST9，當判定為從步驟ST5至步驟ST8的被觀察物2的測定已進行有T次時，結束螢光觀察。如此，便能夠依循最佳控制法則進行被觀察物2的螢光觀察。
在最初之第k=0次的試行中，係例如在觀察區域內以d間隔來觀察全觀察區域。第k=1次以後的試行之後係觀察螢光觀察區域寬度2x(k)。x(k)係由最佳控制量U*(k)決定。
在此，螢光觀察區域的中心係利用以上述(i)至(viii)的穿透光圖像處理程序求得的細胞2的運動模型參數v0 進行更新。在中心、寬度x(k)的條件下，以設置在圖像資訊檢測部16的攝像機拍攝預定位元數(例如8位元)的灰階明視野觀察像，將該灰階圖像進行圖像處理，決定第k+1次的試行的x(k+1)。同時，以設置在螢光圖像資訊檢測部17的螢光觀察用攝像機拍攝螢光觀察像。
依據顯微鏡裝置1，能夠將習知技術中進行螢光觀察前觀察者以手動進行的螢光觀察的參數予以自動化。故能夠減輕觀察者的負擔。
藉由控制部20，還能夠進行螢光觀察的控制與螢光圖像的記錄。如第1圖所示，控制部20亦可構成為復具備用以控制激發用光源5而作為第2光源控制部的激發用光源控制部23。激發用光源控制部23係具有根據由被觀察物2的穿透光所產生的圖像資料來控制激發光5A的關閉與開啟時間之功能。此外，亦可具備選擇激發光5A的波長及強度來進行照射之功能。
為了進行螢光圖像之記錄與圖像處理，將來自螢光圖像資訊檢測部17的偵測輸出予以輸入至控制部20。
並且，依據顯微鏡裝置1，相較於自被觀察物2的螢光F，從穿透光圖像獲得的被觀察物2的資訊係光量多且以高速記錄。是以，藉由將與螢光F同時取得的穿透光圖像用於螢光圖像的解析處理，提升解析結果的時間空間精度。
在顯微鏡裝置1中，能夠以使之連動於從穿透光圖像獲得的位置等細胞資訊的方式記錄螢光圖像資訊檢測部17的螢光圖像。亦即，只要僅於照射螢光F的時間記錄螢光圖像即可。是以不需要記錄被觀察物2沒有進入顯微鏡裝置1的視野的時間的螢光圖像。故能夠減少記錄螢光圖像所需的演算時間與記憶裝置容量，而能夠有效利用個人電腦21。由於不必記錄不需要的螢光圖像，因此亦能夠大幅地縮短螢光圖像的解析時間。
另外，在本發明中，使用穿透光圖像的螢光觀察的控制係能夠一般化為排程(scheduling)問題。故除了上述的最佳控制法則之外，螢光觀察的控制亦能夠使用PID控制等古典控制；準最佳控制等現代控制、H∞控制、取樣控制、閒滯控制(dead beat control)、適應控制等後現代控制理論；類神經網路控制、模糊控制、遺傳基因演算法等智慧型控制。
此外，顯微鏡裝置1的構成可採用下示的各種實施形態。
(第2實施形態)
第4圖係第2實施形態的顯微鏡裝置30的構成示意圖。
顯微鏡裝置30與顯微鏡裝置1的差異點在於，顯微鏡裝置30係設置有能夠使對物透鏡6往穿透光T的光軸、亦即Z軸方向移動的對物透鏡用驅動部32。對物透鏡用驅動部32係由控制部20控制。對物透鏡用驅動部32係可使用像是壓電元件(piezoelectric element)的驅動零件來構成。由於其餘構成與顯微鏡裝置1相同故省略說明。
(第3實施形態)
第5圖係第3實施形態的顯微鏡裝置35的構成示意圖。
顯微鏡裝置35與顯微鏡裝置1的差異點在於，顯微鏡裝置35係設置有能夠使圖像資訊檢測部16側的成像透鏡7往光軸方向(Z軸方向)移動的穿透光用的成像透鏡用驅動部37。成像透鏡用驅動部37係由控制部20控制。成像透鏡用驅動部37係可使用像是壓電元件的驅動零件來構成。由於其餘構成與顯微鏡裝置1相同故省略說明。
(第4實施形態)
第6圖係第4實施形態的顯微鏡裝置40的構成示意圖。
顯微鏡裝置40與顯微鏡裝置1的差異點在於，顯微鏡裝置40係在螢光圖像資訊檢測部17之前設置有螢光波長選擇部25。螢光波長選擇部25係具有能夠將兩種螢光波長加以分離並檢測的構成。螢光波長選擇部25係由第3分色鏡26、鏡27、及稜鏡28構成。再者，亦可設置透鏡29。依據此構成，能夠將2波長的螢光F加以分離並偵測。螢光波長選擇部25係可配置於鏡筒部15或螢光圖像資訊檢測部17。由於其餘構成與顯微鏡裝置1相同故省略說明。
雖顯示螢光波長選擇部25進行2波長的螢光F的分離之態樣，惟亦可藉由使用分光器來偵測多波長的螢光。亦即，螢光波長選擇部25可構成為具備下述之波長選擇手段者，亦即，該波長選擇手段係由將至少1波長以上的螢光F予以分離的稜鏡與分光器等零件所構成者。
依據顯微鏡裝置40，便能夠控制激發光5A的種類與強度。亦即，能夠針對複數個螢光色素進行觀測時間的自動分配等。一般而言，細胞2會因其運動狀態與來自外部的刺激，使得活化或非活化的細胞2內的離子、分子是不同。因此，使自穿透光圖像獲得的被觀察物2的運動資訊與細胞2的形狀及刺激的種類與強度等連動，而能夠進行激發被觀察物2的激發光5A的波長或強度的選擇控制。藉此，使之與自穿透光圖像獲得的被觀察物2的資訊連動，而能夠有效率地取得來自被觀察物2的螢光資訊。
另外，在同時觀察複數種類的細胞2時，亦可利用穿透光圖像所含有的各細胞2的面積、形狀、色濃度、色調、紋理(texture)等而由圖像處理自動判別細胞2種類(請參考非專利文獻7)。
(第5實施形態)
第7圖係第5實施形態的顯微鏡裝置45的構成示意圖。
顯微鏡裝置45與顯微鏡裝置1的差異點在於，顯微鏡裝置45係設置有能夠使插入在螢光圖像資訊檢測部17的光軸方向的成像透鏡12往光軸方向移動的成像透鏡用驅動部52。由於其餘構成與顯微鏡裝置1相同故省略說明。
依據顯微鏡裝置45，係藉由成像透鏡驅動部52驅動成像透鏡12，藉此能夠改變被觀察物2的焦點位置。成像透鏡12的驅動係可獨立於檢測穿透光T的圖像資訊檢測部16進行。藉此，便能夠進行來自被觀察物2的螢光F的光軸方向的觀察。
(第6實施形態)
第8圖係第6實施形態的顯微鏡裝置50的構成示意圖。
顯微鏡裝置50與顯微鏡裝置1的差異點在於，顯微鏡裝置50於光學系統10中復設置兩個針孔53、54而以共焦光學系統構成。第1針孔53係配設在激發用光源5與過濾器9之間的光軸上。亦可交換第1針孔53與過濾器9的配置順序。第2針孔係配置在螢光圖像資訊檢測部17與成透鏡12之間的螢光F的光軸上。亦可交換第2針孔54與成像透鏡12的配置順序。由於其餘構成與顯微鏡裝置1相同故省略說明。
依據顯微鏡裝置50，觀察螢光F的光學系統係以共焦光學系統構成。藉由設置第1針孔53，能夠控制激發用光源5的照射位置。藉由設置第2針孔54，來自焦點以外的光不會入射至螢光圖像資訊檢測部17。故可獲得清晰的螢光像。此外，在載置被觀察物2的載台3的控制係以XYZ載台構成的情形中，係相應於XYZ載台3的移動而進行被觀察物2的掃描。
(第7實施形態)
第9圖係第7實施形態的顯微鏡裝置55的構成示意圖。
顯微鏡裝置55與顯微鏡裝置50的差異點在於，顯微鏡裝置55復設置以使第2針孔54往螢光F的光軸方向移動及/或旋轉的方式驅動第2針孔54的針孔驅動部56。由於其餘構成與顯微鏡裝置1相同故省略說明。
在顯微鏡裝置55中，藉由以針孔驅動部56驅動經插入在螢光的光軸方向的第2針孔54，而能夠改變來自被觀察物2的螢光F的焦點及位置。第2針孔54的驅動係可獨立於檢測穿透光T的圖像資訊檢測部16來進行。此外，第2針孔54亦可由複數個孔構成。
此外，亦可設置驅動第1針孔53的針孔驅動部58。藉由使第1針孔53在光軸上移動及/或旋轉，亦能夠控制激發用光源5的照射位置。此外，第1針孔53亦可由複數個孔構成。
(第8實施形態)
第10圖係第8實施形態的顯微鏡裝置60的構成示意圖。
顯微鏡裝置60與顯微鏡裝置1的差異點在於，顯微鏡裝置60具有從被觀察物2的下方照射穿透光T的所謂正立型光學系統10A。由於其餘構成與顯微鏡裝置1相同故省略說明。
顯微鏡裝置60的光學系統10A係可採用第2至7實施形態的顯微鏡裝置30、35、40、45、55的光學系統10中任一者或組合該些光學系統10之構成。舉例而言，在顯微鏡裝置60中，亦可如顯微鏡裝置30設置使對物透鏡6能夠往光軸方向移動(Z軸方向)的對物透鏡用驅動部32。
此外，在顯微鏡裝置60中，亦可如顯微鏡裝置35設置使圖像資訊檢測部16的成像透鏡7能夠往光軸(Z軸方向)移動的成像透鏡驅動部37。
顯微鏡裝置30、35、40、45、55、60的任一者，皆能夠與顯微鏡裝置1同樣地進行穿透光圖像及螢光圖像的觀察。
(被觀察物的環境控制)
針對被觀察物2的環境控制進行說明。
第11圖係環境控制部60的構成示意圖，其中，(A)為平面圖，(B)為沿(A)的X-X線之剖面圖。環境控制部60係構成為含有主體部62；及收容部64，配置在主體部62的下部，用以收容被觀察物2。
主體部62係構成為以載玻片66及樹脂膜67夾著樹脂板65，具體而言，主體部62係具備有：長方形的樹脂板65，具有與收容部64對應的開口65A；載玻片66，配設在樹脂板65的上部，覆蓋樹脂板65；及樹脂膜67，配設在樹脂部65的下部，覆蓋樹脂板65。此外，於主體部62設有連接至樹脂板65的開口部65A的氣體配管68。從氣體配管68的輸入側68A導入環境氣體69至輸出側68B。就環境氣體69而言，可例舉出氮氣(單體)、氧氣(單體)、二氧化碳(單體)、空氣(混合物)、及該些的混合氣體等。
其中，樹脂部65係可使用例如丙烯酸樹脂。樹脂膜67係可使用由聚酯樹脂(mylar)所構成的膜等。此外，亦可具備保持樹脂板65、玻片66及樹脂膜67的保持手段70。
收容部64係具有皿狀的容器構造，容器最上部的外周部係抵接於樹脂膜67。在收容部64的底部的開口係配設有玻璃蓋71。於樹脂膜67之與收容器61相對向的底面係設有玻璃蓋72。環境氣體69係經由設置於樹脂膜67的細孔67A而被導入至收容部64。收容部64係充滿未圖示的被觀察物2與被觀察物用的培養液71。藉此，收容室64內的被觀察物2與被觀察物用的培養液74便曝露於環境氣體69中。
藉由將環境控制部60載置於顯微鏡裝置1的載台3，便能夠在將被觀察物2保持於培養液74中的狀態下進行觀察。此外，若將顯微鏡裝置1收容於恆溫槽內，則能夠使培養液74的溫度固定。藉此，能夠以將被觀察物2保持於培養液74中且使溫度與環境氣體69處於固定的狀態之方式觀察被觀察物2的穿透光T與螢光F。
環境控制部60亦可構成為能夠觀察複數個被觀察物2。具體而言，亦可採用配置有複數個第11圖所示的環境控制部60之構造。
第12圖係能夠觀察複數個被觀察物的環境控制部80的構成示意圖，其中，(A)為平面圖，(B)為沿(A)的X-X線之剖面圖。
環境控制部80與環境控制部60的差異點在於，環境控制部80的收容部84並非一體者，而是藉由格子狀的障壁部85區隔成具有複數個收容隔間86。在各收容隔間86係注入有培養液74。由於其餘構成與環境控制部60相同故省略說明。
依據環境控制部80，由於能夠將被觀察物2收容在複數個收容隔間86的各者，因此能夠以使溫度與環境氣體69處於固定的狀態之方式觀察來自複數個被觀察物2的穿透光T與螢光F。亦可令注入至複數個收容隔間86的培養液74的種類相異且使作為被觀察物2的細胞為相同種類。在這些情形中，能夠以使溫度與環境氣體69處於固定的狀態之方式連續地觀察從改變培養液74的條件時的各細胞2而來之穿透光T與螢光F。相反地，亦可令注入至複數個收容隔間86的培養液74為相同種類且使作為被觀察物2的細胞種類相異。
此外，在以具備有環境控制部60、80的顯微鏡裝置1所進行的螢光觀察中，使之與自穿透光圖像獲得的被觀察物2的資訊連動，而能夠有效率地取得來自被觀察物2的螢光資訊。故能夠縮短用來使被觀察物2產生螢光F的激發光5A的照射時間。是以，當被觀察物2為細胞等生物試料時，能夠比習知的螢光觀察更長時間地觀察穿透光T與螢光F。
此外，環境控制部60、80亦可具備用以刺激被觀察物2的刺激手段。就此類的刺激手段而言，可例舉出電性刺激、磁性刺激、力學性刺激、超音波刺激、溫度性刺激、化學性刺激、光刺激等。
實施例
以下，利用實施例更進一步詳細說明本發明。
製作第4圖的顯微鏡裝置30。關於光學系統10，使用倒立顯微鏡(Olympus股份有限公司製，IX71)，照明用光源4及激發用光源5係分別使用鹵素燈與氙氣燈。對物透鏡6(Olympus股份有限公司製，UApo40×3/340)係使用倍率40倍者。
用來將明視野觀察像擷取至個人電腦21的圖像資訊檢測部16係使用攝像機(POINTGREY製，Dragofly Express)。該攝像機係能夠以100fps(幀(frame)/秒)取得8位元的灰階圖像。圖像大小係640×480。
做為用來朝顯微鏡裝置30的光軸方向控制對物透鏡60的位置的對物透鏡用驅動部32者，係使用壓電載台(piezo stage)(Physik Instrument製，P-723)。該壓電載台32的最大運轉距離為350μm。藉由電壓輸入，使壓電載台32移動。壓電載台32的電壓輸入係使用D/A轉換介面卡(Interface製D/A介面卡，PCI-3346A)。
控制部20係使用搭載有RT-Linux作為即時基本軟體的個人電腦21。
螢光圖像資訊檢測部17的偵測器係使用制冷CCD攝像機(Q-Imaging公司製，Retige 2000R，1600×1200像素)。冷卻溫度設定為比周圍溫度低25℃的溫度。螢光F係藉由光學系統10的雙埠(dual port)內的分色鏡19(Semrock製的分色鏡，FF01-520/35-25)而與穿透光T分離。為了避免螢光F的激發光5A、螢光F及追蹤用的穿透光T發生干涉，選用波長帶各自相異的過濾器。致冷CCD攝像機係進行將4×4像素整合成1個的箱化處理，將取得像素數設定為400×300像素。曝光時間設定為33ms。
如前述依循第3圖所示的流程圖，進行屬於免疫細胞的一種的T細胞2的觀察。將d間隔設為1.5μm。依據希望觀察的細胞數決定螢光觀察區域寬度x(0)。接著，在螢光觀察區域內以1.5μm間隔同時進行螢光觀察與明視野觀察。之後，於待機20秒後，依循最佳控制法則決定螢光觀察區域，依循細胞2的運動模型求取螢光觀察區域的中心。接著，反覆60次(T=60)之在螢光觀察區域以1.5μm間隔同時進行螢光觀察與明視野觀察的作業。
第13圖係剛開始進行觀察時的細胞分佈的一例之圖。第13圖的橫軸為壓電載台32的位置(μm)，縱軸為細胞數(個)。
第14圖係在螢光觀察程序中，比較使用控制量U(k)的實施例的評價函數J與將螢光觀察區域寬度予以固定時的比較例的評價函數J之示意圖。第14圖的橫軸表示固定時的螢光觀察區域的寬度(μm)，縱軸表示評價函數J的值。使用本發明的控制量時的螢光區域的寬度係動態變化。
由第14圖可知，比較使用控制量U(k)的實施例的評價函數J與固定螢光觀察區域寬度的比較例的評價函數J時，使用本發明的控制量的實施例的評價函數J之值係恆常比比較例的J之值小，可知實施例獲得最佳化。
本發明並不限定於上述實施形態，在申請專利範圍的所記載的發明範圍內當可進行各種變形，該些變形為本發明的範圍所涵蓋亦自不待言。在上述實施形態中，雖是於第1及第2檢測光學系統16、17使用攝影元件，但亦能以還能夠在攝像元件位置進行目視觀察與照像攝影等之方式，依需要而將檢測光學系統設計為複數個檢測光學系統。此外，無庸置疑，偵測螢光F的檢測光學系統17的構成等係可相應於被觀察物2而選定最適當的設計與使用零件。
螢光觀察區域的中心亦可根據被觀察物的圖像資訊或根據該圖像資訊與被觀察物的運動模型來求取。
載台的控制亦可根據被觀察物的運動模型或根據該運動模型與上述圖像資訊來進行。
藉由調整成像透鏡7、成像透鏡12的倍率(例如降低倍率)，便能夠縮小螢光圖像資訊檢測部17所取得的圖像中的被觀察物的大小。藉此，觀察視野得以擴大，而能夠同時觀察更多數目的被觀察物。並且，表示被觀察物的像素數變少，亦能夠再進一步縮短控制部20對每一細胞的圖像處理時間。
1、30、35、40、45、50、55、60．．．顯微鏡裝置
2．．．被觀察物
3．．．XY載台或XYZ載台
4．．．照明用光源
5．．．激發用光源
5A．．．照明光
6．．．對物透鏡
7．．．成像透鏡(穿透光用)
8、9．．．過濾器
10、10A．．．光學系統
12．．．成像透鏡(螢光用)
15．．．鏡筒部
16．．．圖像資訊檢測部
17．．．螢光圖像資訊檢測部
18、19．．．第1及第2分束器(分色鏡)
20．．．控制部
21．．．個人電腦
22．．．顯示裝置
23．．．激發用光源控制部
25．．．螢光波長選擇部
26．．．第3分色鏡
27．．．鏡
28．．．稜鏡
29．．．透鏡
32．．．對物透鏡用驅動部
37．．．穿透光的成像透鏡用驅動部
52．．．螢光用成像透鏡用驅動部
53．．．第1針孔
54．．．第2針孔
56、58．．．針孔驅動部
60、80．．．環境控制部
62‧‧‧主體部
64、84‧‧‧收容部
65‧‧‧樹脂板
66‧‧‧載玻片
67‧‧‧樹脂膜
67A‧‧‧細孔
68‧‧‧氣體配管
68A‧‧‧輸入側
68B‧‧‧輸出側
69‧‧‧環境氣體
70‧‧‧保持手段
71、72‧‧‧玻璃蓋
74‧‧‧培養液
85‧‧‧障壁部
86‧‧‧收容隔間
F‧‧‧螢光
T‧‧‧穿透光
第1圖係本發明第1實施形態的顯微鏡裝置的構成示意圖。
第2圖係螢光觀察區域的模型之圖。
第3圖係使用上述第1實施形態的顯微鏡裝置的螢光觀察步驟的流程圖。
第4圖係本發明第2實施形態的顯微鏡裝置的構成示意圖。
第5圖係本發明第3實施形態的顯微鏡裝置的構成示意圖。
第6圖係本發明第4實施形態的顯微鏡裝置的構成示意圖。
第7圖係本發明第5實施形態的顯微鏡裝置的構成示意圖。
第8圖係本發明第6實施形態的顯微鏡裝置的構成示意圖。
第9圖係本發明第7實施形態的顯微鏡裝置的構成示意圖。
第10圖係本發明第8實施形態的顯微鏡裝置的構成示意圖。
第11圖係環境控制部的構成示意圖，其中，(A)為平面圖，(B)為沿(A)的X-X線之剖面圖。
第12圖係能夠觀察複數個被觀察物的不同環境控制部的構成示意圖，其中，(A)為平面圖，(B)為沿(A)的X-X線之剖面圖。
第13圖係剛開始進行觀察時的細胞分佈的一例之圖。
第14圖係在螢光觀察步驟中，比較使用控制量U(k)的實施例的評價函數J與將螢光觀察區域寬度予以固定時的比較例的評價函數J之示意圖。
1．．．顯微鏡裝置
2．．．被觀察物
3．．．XY載台或XYZ載台
4．．．照明用光源
5．．．激發用光源
5A．．．照明光
6．．．對物透鏡
7．．．成像透鏡(穿透光用)
8、9．．．過濾器
10．．．光學系統
12．．．成像透鏡(螢光用)
15．．．鏡筒部
16．．．圖像資訊檢測部
17．．．螢光圖像資訊檢測部
18、19．．．第1及第2分束器(分色鏡)
20．．．控制部
21．．．個人電腦
22．．．顯示裝置
23．．．激發用光源控制部
F．．．螢光
T．．．穿透光

Claims (22)

  1. 一種顯微鏡裝置，係具備：載台，用以載置被觀察物；第1光源，對上述被觀察物照射照明光；第2光源，對上述被觀察物照射用以激發螢光的激發光；圖像資訊檢測部，檢測來自上述被觀察物之穿透光或反射光所得到的圖像資訊；螢光圖像資訊檢測部，檢測由上述被觀察物所發出的螢光所得到的螢光圖像資訊；及控制部，根據上述被觀察物的運動模型與輸入自上述圖像資訊檢測部的上述被觀察物的圖像資訊來決定上述被觀察物的螢光觀察區域，且就上述螢光觀察區域內的每預定間隔取得輸入自上述圖像資訊檢測部的上述被觀察物的圖像資訊與輸入自上述螢光圖像資訊檢測部的螢光圖像資訊。
  2. 如申請專利範圍第1項之顯微鏡裝置，其中，前述控制部係依循包括最佳控制、準最佳控制之現代控制來決定前述螢光觀察區域。
  3. 如申請專利範圍第1項之顯微鏡裝置，其中，前述控制部係依循前述被觀察物的運動模型與前述被觀察物的圖像資訊的至少一方來決定前述螢光觀察區域的中心位置。
  4. 如申請專利範圍第1項之顯微鏡裝置，其中，前述控制 部係依據前述被觀察物的運動模型與前述被觀察物的圖像資訊的至少一方，控制上述載台以追蹤上述被觀察物，並且控制上述被觀察物的螢光圖像資訊的取得。
  5. 如申請專利範圍第1項之顯微鏡裝置，其中，前述控制部係藉由包括以前述圖像資訊的比例、積分、微分的任一者或該些之組合所進行之PID控制之古典控制來控制前述載台。
  6. 如申請專利範圍第1項之顯微鏡裝置，其中，前述控制部係具備用來控制前述第1光源的第1光源控制部、及用來控制前述第2光源的第2光源控制部。
  7. 如申請專利範圍第1項之顯微鏡裝置，其中，前述載台係使前述被觀察物的位置移動的二維或三維載台。
  8. 如申請專利範圍第1項之顯微鏡裝置，其中，前述螢光圖像資訊檢測部係具備將至少1個以上之波長的螢光加以分離之波長選擇手段。
  9. 如申請專利範圍第1項之顯微鏡裝置，其中，復具備配設在前述第2光源與前述被觀察物之間的第1針孔、及配置在前述被觀察物與前述螢光圖像資訊檢測部之間的第2針孔。
  10. 如申請專利範圍第9項之顯微鏡裝置，其中，復具備使前述第1針孔或前述第2針孔移動及/或旋轉的針孔驅動部。
  11. 如申請專利範圍第1項之顯微鏡裝置，其中，復具備配設在前述第1光源與前述被觀察物之間的對物透鏡、及 該對物透鏡的驅動部。
  12. 如申請專利範圍第1項之顯微鏡裝置，其中，復具備配設在前述被觀察物與前述圖像資訊檢測部之間的成像透鏡、及該成像透鏡的驅動部。
  13. 如申請專利範圍第1項之顯微鏡裝置，其中，復具備配設在前述被觀察物與前述螢光圖像資訊檢測部之間的成像透鏡、及該成像透鏡的驅動部。
  14. 如申請專利範圍第13項之顯微鏡裝置，其中，復具備收容前述被觀察物且充滿環境氣體的環境控制部。
  15. 如申請專利範圍第14項之顯微鏡裝置，其中，前述環境控制部係具備能夠收容複數個前述被觀察物的收容部。
  16. 如申請專利範圍第1項之顯微鏡裝置，其中，復具備用以刺激前述被觀察物的被觀察物刺激手段。
  17. 一種被觀察物的螢光觀察方法，係藉由顯微鏡裝置來取得被觀察物的圖像資訊與該被觀察物的螢光圖像資訊者，該方法係具有下述階段：第1階段，由上述顯微鏡裝置的控制部根據上述被觀察物的圖像資訊與上述被觀察物的運動模型來決定上述被觀察物的螢光觀察區域；及第2階段，在上述螢光觀察區域內的預定位置由上述顯微鏡裝置的控制部取得上述螢光圖像資訊。
  18. 如申請專利範圍第17項之被觀察物的螢光觀察方法，其中，依循包括PID控制之古典控制、包括最佳控制、 準最佳控制之現代控制來決定前述第1階段的螢光觀察區域。
  19. 如申請專利範圍第17項之被觀察物的螢光觀察方法，其中，在前述第1階段與第2階段之間，根據前述被觀察物的圖像資訊與前述被觀察物的運動模型的至少一方來決定前述螢光觀察區域的中心位置。
  20. 如申請專利範圍第17項之被觀察物的螢光觀察方法，其中，在前述第2階段，取得前述被觀察物的圖像資訊。
  21. 如申請專利範圍第17至20項中任一項之被觀察物的螢光觀察方法，其中，就前述螢光觀察區域內的每一預定位置反覆進行預定次數之前述各階段。
  22. 如申請專利範圍第17項之被觀察物的螢光觀察方法，其中，前述運動模型的參數係由前述被觀察物的位置、速度、分佈、種類、形狀、離子濃度、分子濃度的任一者或該些的組合所構成。
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