JP2014098724A - 顕微鏡装置及びそれを用いた蛍光観察方法 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】顕微鏡装置1は、被観察物2を載置するステージ3と、被観察物2の照明用光源4と、被観察物2に蛍光Fを励起する励起光用光源5と、照明光による光T、励起光5A及び蛍光Fの光路を形成している鏡筒部15と、被観察物2で生じた光Tによる画像情報を検出する画像情報検出部16と、蛍光Fによる蛍光画像情報を検出する蛍光画像情報検出部17と、被観察物2の運動モデルと画像情報検出部16から入力された被観察物2の画像情報とに基づいて被観察物2の蛍光観察領域を決定し、画像情報検出部16から入力された被観察物2の画像情報と蛍光画像情報検出部17から入力された蛍光画像情報とを蛍光観察領域内の所定の間隔毎に取得する制御部20と、を備えている。
【選択図】図1
Description
蛍光と励起光の波長は異なっている。従って、蛍光を解析することで細胞内分子の検出や濃度の計測が可能になる。このため、蛍光観察は以下の長所を持つ。
(i)イオンや分子の大きさでも観察できる。
(ii)特定のイオンや分子のみを観察できる。
(iii)蛍光の明るさがイオンや分子濃度に応じて変化するので、これらの濃度を測定することができる。
(i)励起光の波長帯域が紫外の場合、励起光が細胞にとって有毒となる。
(ii)励起光を当て続けると蛍光色素が退色する。退色とは、蛍光の強さが弱まることである。
観察者が多くの細胞を観察しようとして、励起光の照射範囲や照射時間を過剰に広げた場合には、細胞と蛍光色素に不必要な悪影響を与えることになる。また、取得される蛍光画像データが大量となり、解析に多くの時間が掛かるようになる。
制御部は、好ましくは、被観察物の運動モデルに従って蛍光観察領域の中心位置を決定する。
制御部は、好ましくは、第1の光源を制御するための第1光源制御部と第2の光源を制御するための第2光源制御部とを備えている。
ステージは、好ましくは、被観察物の位置を移動させる三次元ステージである。
蛍光画像情報検出部は、好ましくは、少なくとも1波長以上の蛍光を分離する波長選択手段を備えている。
好ましくは、第2の光源と被観察物との間に配設される第1のピンホールと蛍光と蛍光画像情報検出部との間に配設される第2のピンホールとを備えている。
好ましくは、第1のピンホール又は第2のピンホールを移動及び/又は回転させるピンホール駆動部を、備えている。
好ましくは、第1の光源と被観察物との間に配設される対物レンズと対物レンズの駆動部とを備えている。
好ましくは、被観察物で生じた光と前記画像情報検出部との間に配設される結像レンズと、結像レンズの駆動部と、を備えている。
好ましくは、蛍光と蛍光画像情報検出部との間に配設される結像レンズと、結像レンズの駆動部と、を備えている。
好ましくは、被観察物を収容すると共に、雰囲気ガスで満たされる環境制御部を備えている。
環境制御部は、好ましくは、複数の被観察物を収容することができる収容部を備えている。
好ましくは、被観察物を刺激する被観察物刺激手段を備えている。
第1段階と第2段階との間において、好ましくは、被観察物の画像情報と被観察物の運動モデルとに基づいて蛍光観察領域の中心位置を決定する。
第2段階において、好ましくは、被観察物の画像情報を取得する。
各段階を、好ましくは、蛍光観察領域内の所定の位置毎に、所定の回数繰り返し行う。
運動モデルのパラメータは、好ましくは、被観察物の位置、速度、分布、種類の何れか又はこれらの組み合わせからなる。
(第一実施形態)
図1は本発明の第1実施形態の顕微鏡装置1の構成を示す模式図である。
本発明の顕微鏡装置1は、被観察物2を載置し、被観察物2の位置を自由に移動し得るステージ3と、光学系10と、ステージ3の位置等を制御する制御部20と、を備えている。
光学系10は、被観察物2の像や位置を検出するために被観察物2に照明光を照射する照明用光源4と、被観察物2からの蛍光を励起するための励起光を照射する励起用光源5と、照明用光源4の光が照射されて被観察物2で生じた透過光Tの光路、励起光5Aを被観察物2に導く光路及び被観察物2で生じた蛍光Fの光路を形成するための光学部品を配置した鏡筒部15と、鏡筒部15から出射した被観察物2からの透過光からなる画像情報を検出する画像情報検出部16と、鏡筒部15から出射された被観察物2の蛍光画像情報を検出する蛍光画像情報検出部17と、を有している。被観察物2は、例えば、生体試料である細胞等であってよい。
ここで、XY軸方向の位置制御は照明用光源4や励起用光源5の照射位置や、後述するピンホールの位置で行ってもよい。また、Z軸方向の位置制御は、後述する対物レンズ、結像レンズやピンホールで行ってもよい(特許文献6、非特許文献2,4参照)。
ここで、運動モデルのパラメータは、被観察物2の位置、速度、分布、種類、形状の何れか又はこれらの組み合わせからなる。
具体的には、蛍光観察のために、制御部20は、画像情報検出部16から入力された被観察物2の透過光の画像情報により、被観察物2の蛍光観察領域を決定する第1段階と、被観察物2の運動モデルに従って蛍光観察領域の中心位置を決定する第2の段階と、所定の間隔で蛍光観察領域内の蛍光観察と明視野観察とを行う第3の段階と、を含む制御を行い、被観察物2の蛍光情報の取得を制御することができる。ここで、蛍光観察領域は、後述する最適制御則等に従って決定することができる。
先ず、第1段階における被観察物2の透過光の画像情報により、被観察物2の細胞位置を制御する方法、即ち細胞位置制御アルゴリズムについて説明する。
画像情報検出部16において、被観察物2の透過光の画像を取得し、次に、画像情報から画像特徴量を抽出する。画像特徴量は、画像情報の二値化によって観察対象の存在する領域を抽出し、このとき、直前に観察対象が存在していた領域の近傍でのみ抽出を行うセルフウィンドウ法を用いることで、障害物に惑わされることなく観察対象のみを抽出することができる(非特許文献1参照)。
次に、本発明の顕微鏡装置1を用いた蛍光観察方法について説明する。
被観察物2には、蛍光試薬を担持または注入する。被観察物2が細胞の場合には、Indo−1(AM体、同仁化学研究所)のような蛍光試薬を使用し、適度な濃度で所定時間負荷すればよい。Indo−1(AM体)は蛍光Fを発しないが、微生物の細胞膜を通過する。
顕微鏡装置1を用いて、蛍光観察枚数を減らすこと及び蛍光観察できる細胞数を増やすための制御について説明する。
制御としては、上記蛍光観察のためにステージ3のZ軸方向、つまり、結像レンズ7の位置、より具体的には蛍光観察領域幅の時間的変化として与える。
図2は、蛍光観察領域のモデルを示す図である。図の斜線で示した箇所は蛍光観察する領域を示す。その観察領域を等分割する。分割する幅d(ここで、d>0)は、観察する対象によって決定する。次に、観察領域の各点で蛍光観察を行う。そして、数十秒の時間をおいた後、観察領域を再設定し、蛍光観察を行う。これらの観察をT回(ここで、T>0)繰り返す。
よって問題は、評価関数J(T)を最小化する蛍光観察パラメータN(k)を探す問題と置き換えられる。(1)式より、N(k)とx(k)とは線形の関係にあるので、以下ではx(k)の最適制御側を求める。
(1)式と(18)式を(2)式に代入して、評価関数J(T)を整理すると、J(T)は下記(21)式によって与えられる。
4)式となる。
最適制御則を得るために必要な細胞数等の計測のための画像処理について説明する。
細胞2の運動モデルの同定として必要なのは、顕微鏡装置1の光軸方向への細胞2の移動速度の集団平均v0と、細胞位置の分散の時間変化Wiである。なお、被観察物2が静止物の場合は、移動速度の集団平均v0及び位置の分散の時間変化Wiを0として扱うことができる。
(i)細胞2が浮遊する試験溶液の観察領域を顕微鏡装置1の光軸方向とし、被観察物2を画像情報検出部16に設けたカメラ等で撮像する(これを観察画像1とする)。この場合、観察画像1は、明視野像である。
(ii)(i)の観察画像よりも所定の距離だけ対物レンズ6に近い画像を撮影する(これを観察画像2とする)。所定の距離としては、例えば1μmのオーダーとすることができる。
(iii)観察画像1と観察画像2との差分をとる。
(iv)画像上の差分値の二値化を行う。
(v)半径が所定の大きさの画素の円形マスクを使用して膨張処理を行い、同一細胞2の離れた画素を一つに纏める。
(vi)上記画素の円形マスクを使用して縮小処理し、細胞2以外の小さなノイズを除去する。
(vii)八近傍の画素を連結させてラベリングし、細胞数を計測する。
(viii)ラベリングした細胞2の大きさによってフィルタリングする。つまり、大きすぎれば二つと数え、手順(v)で別の細胞2を同一細胞2とみなした場合に対処する。小さすぎればノイズとみなし、細胞2以外の存在を消しきれなかった場合に対処する。
(1)パーソナルコンピュータ21が指示を出す。
(2)パーソナルコンピュータ21から指示を受けたD/Aボードが電圧を出力する。
(3)ステージ3を動かす。
(4)対物レンズ6を通して得た画像をカメラで取り込む。
(5)取り込んだ画像を、パーソナルコンピュータ21に送る。
(6)パーソナルコンピュータ21が画像処理を行う。
(7)画像処理した情報をもとに、パーソナルコンピュータ21がD/Aボードに指示を出す。
図3は、本発明の顕微鏡装置1を用いた蛍光観察手順を示すフロー図の一例である。
先ず、ステップST1において、被観察物2を所定の間隔として、d(μm)間隔で(以下、d間隔と呼ぶ)、観察領域内の明視野観察を行う。被観察物2は、例えば免疫細胞の一種であるT細胞である。
ステップST3では、観察したい被観察物2の数に応じて蛍光観察領域を決定する。
ステップST4において、d間隔で、蛍光観察領域の蛍光観察と明視野観察を行う。透過光画像の情報を増すために、蛍光観察と比べて明視野観察の観察間隔を狭めたり、観察領域を広げてもよい。
ステップST5において、所定の時間、例えば20秒待機する。制御に用いる透過光の画像情報を増すために、蛍光観察と比べて明視野観察の待機時間を短くしてもよい。
ステップST7において、被観察物2の運動モデルに従って蛍光観察領域の中心位置を決定する。
なお、本発明において、透過光画像を用いた蛍光観察の制御は、スケジューリング問題と一般化できる。このため、蛍光観察の制御には、上記した最適制御則以外に、準最適制御や、ニューラルネットワーク制御、ファジィ制御、遺伝的アルゴリズム等の知的制御等を用いてもよい。
(第二実施形態)
図4は、第2実施形態の顕微鏡装置30の構成を示す模式図である。
顕微鏡装置30が顕微鏡装置1と異なるのは、対物レンズ6を透過光Tの光軸、即ちZ軸方向に移動できるように対物レンズ用駆動部32を設けた点にある。対物レンズ用駆動部32は、制御部20によって制御される。対物レンズ用駆動部32は、ピエゾ素子のような駆動部品を用いて構成することができる。他の構成は顕微鏡装置1と同じであるので説明は省略する。
図5は、第3実施形態の顕微鏡装置35の構成を示す模式図である。
顕微鏡装置35が顕微鏡装置1と異なるのは、画像情報検出部16側の結像レンズ7を光軸方向(Z軸方向)に移動できるように透過光用の結像レンズ用駆動部37を設けた点にある。結像レンズ用駆動部37は、制御部20によって制御される。結像レンズ用駆動部37は、ピエゾ素子のような駆動部品を用いて構成することができる。他の構成は顕微鏡装置1と同じであるので、説明は省略する。
図6は、第4実施形態の顕微鏡装置40の構成を示す模式図である。
顕微鏡装置40が顕微鏡装置1と異なるのは、蛍光画像情報検出部17の前に蛍光波長選択部25を設けた点にある。蛍光波長選択部25は、2つの蛍光波長を分離して検出できる構成を有している。蛍光波長選択部25は、第3のダイクロイックミラー26とミラー27とプリズム28とから構成されている。さらに、レンズ29を設けてもよい。この構成によれば、2波長の蛍光Fを分離して検知することができる。蛍光波長選択部25は、鏡筒部15又は蛍光画像情報検出部17に配置することができる。他の構成は顕微鏡装置1と同じであるので、説明は省略する。
なお、複数種類の細胞2を同時に観察するときには、透過光画像に含まれる各細胞2の面積、形状、色の濃度、色調、テクスチャ等を用いて、細胞2の種類を画像処理で自動判別することも可能である(非特許文献7参照)。
図7は、第5実施形態の顕微鏡装置45の構成を示す模式図である。
顕微鏡装置45が顕微鏡装置1と異なるのは、蛍光画像情報検出部17の光軸方向に挿入された結像レンズ12を光軸方向に移動させるように、結像レンズ用駆動部52を設けている点にある。他の構成は顕微鏡装置1と同じであるので、説明は省略する。
図8は、第6実施形態の顕微鏡装置50の構成を示す模式図である。
顕微鏡装置50が顕微鏡装置1と異なるのは、光学系10中に、さらに2つのピンホール53,54を設けて共焦点光学系で構成した点にある。第1のピンホール53は、励起用光源5とフィルタ9との間の光軸上に配設されている。第1のピンホール53とフィルタ9の配置順は入れ替えてもよい。第2のピンホール54は、蛍光画像情報検出部17と結像レンズ12との間の蛍光Fの光軸上に配設されている。第2のピンホール54と結像レンズ12との配置順は入れ替えてもよい。他の構成は顕微鏡装置1と同じであるので、説明は省略する。
図9は、第7実施形態の顕微鏡装置55の構成を示す模式図である。
顕微鏡装置55が顕微鏡装置50と異なるのは、さらに、第2のピンホール54を蛍光Fの光軸方向に移動及び/又は回転させるように第2のピンホール54を駆動するピンホール駆動部56を設けている点にある。他の構成は顕微鏡装置1と同じであるので、説明は省略する。
図10は、第8実施形態の顕微鏡装置60の構成を示す模式図である。
顕微鏡装置60が顕微鏡装置1と異なるのは、被観察物2の下方から透過光Tが照射される、所謂正立型の光学系10Aを有している点である。他の構成は顕微鏡装置1と同じであるので、説明は省略する。
被観察物2の環境制御について説明する。
図11は環境制御部60の構成を示す模式図であり、(A)は平面図、(B)は(A)のX−Xに沿った断面図である。
環境制御部60は、本体部62と、本体部62の下部に配置され被観察物2を収容する収容部64と、を含んで構成されている。
本体部62は、収容部64に対応する開口を有している長方形の樹脂板65と、樹脂板65の上部に配設され樹脂板65を覆うスライドガラス66と、樹脂板65の下部に配設され樹脂板65を覆う樹脂フィルム67と、を備えている。さらに、樹脂板65の開口部65Aに接続するガス配管68が設けられており、ガス配管68の入力側68Aから出力側68Bへ雰囲気ガス69が導入される。雰囲気ガス69としては、二酸化炭素(CO2)と空気の混合ガス等を挙げることができる。
ここで、樹脂板65は、例えばアクリル樹脂を用いることができる。樹脂フィルム67は、マイラーからなるフィルム等を用いることができる。さらに、板65、スライドガラス66及び樹脂フィルム67を保持する保持手段70を備えていてもよい。
図12は複数の被観察物2の観察ができる環境制御部80の構成を示す模式図で、(A)は平面図、(B)は(A)のX−Xに沿った断面図である。
環境制御部80が環境制御部60と異なるのは、収容部84が一体ではなく、格子状の障壁部85によって複数の収容区画86を有するように仕切られている点である。各収容区画86には培養液74が注入されている。他の構成は環境制御部60と同じであるので、説明は省略する。
図4に示す顕微鏡装置30を製作した。光学系10としては、倒立顕微鏡(オリンパス株式会社製、IX71)を使用し、透過用光源4及び励起用光源5は、それぞれ、ハロゲンランプとキセノンランプを使用した。対物レンズ6(オリンパス株式会社製、UApo40×3/340)は40倍のものを用いた。
図14から明らかなように、本発明の制御則と蛍光観察領域幅を固定した比較例の評価関数Jを比較すると、本発明の制御則を用いた実施例の評価関数Jの値が常に比較例のJの値よりも小さくなっており、最適化されていることが分かる。
2:被観察物
3:XYまたはXYZステージ
4:照明用光源
5:励起用光源
5A:励起光
6:対物レンズ
7:結像レンズ(透過光用)
8,9:フィルタ
10,10A:光学系
12:結像レンズ(蛍光用)
15:鏡筒部
16:画像情報検出部
17:蛍光画像情報検出部
18,19:第1及び第2のビームスプリッター(ダイクロイックミラー)
20:制御部
21:パーソナルコンピュータ
22:ディスプレー装置
23:励起用光源制御部
25:蛍光波長選択部
26:第3のダイクロイックミラー
27:ミラー
28:プリズム
29:レンズ
32:対物レンズ用駆動部
37:透過光の結像レンズ用駆動部
52:蛍光用結像レンズ用駆動部
53:第1のピンホール
54:第2のピンホール
56,58:ピンホール駆動部
60,80:環境制御部
62:本体部
64,84:収容部
65:樹脂板
66:スライドガラス
67:樹脂フィルム
67A:細孔
68:ガス配管
68A:入力側
68B:出力側
69:雰囲気ガス
70:保持手段
71,72:カバーガラス
74:培養液
85:障壁部
86:収容区画
F:蛍光
T:透過光
Claims (20)
- 被観察物を載置するステージと、
上記被観察物に照明光を照射する第1の光源と、
上記被観察物に蛍光を励起するための励起光を照射する第2の光源と、
上記照明光の照射によって上記被観察物で生じた光、上記励起光及び上記蛍光のそれぞれの光路が形成されている鏡筒部と、
上記被観察物で生じた光による画像情報を検出する画像情報検出部と、
上記被観察物で生じた蛍光による蛍光画像情報を検出する蛍光画像情報検出部と、
上記被観察物の運動モデルと上記画像情報検出部から入力された上記被観察物の画像情報とに基づいて上記被観察物の蛍光観察領域を決定し、上記画像情報検出部から入力された上記被観察物の画像情報と上記蛍光画像情報検出部から入力された蛍光画像情報とを上記蛍光観察領域内の所定の間隔毎に取得する制御部と、
を備えたことを特徴とする、顕微鏡装置。 - 前記制御部は、前記蛍光観察領域を最適制御則に従って決定することを特徴とする、請求項1に記載の顕微鏡装置。
- 前記制御部は、前記被観察物の運動モデルに従って前記蛍光観察領域の中心位置を決定することを特徴とする、請求項1に記載の顕微鏡装置。
- 前記制御部は、前記第1の光源を制御するための第1光源制御部と前記第2の光源を制御するための第2光源制御部とを備えたことを特徴とする、請求項1に記載の顕微鏡装置。
- 前記ステージは、前記被観察物の位置を移動させる三次元ステージであることを特徴とする、請求項1に記載の顕微鏡装置。
- 前記蛍光画像情報検出部は、少なくとも1波長以上の蛍光を分離する波長選択手段を備えたことを特徴とする、請求項1に記載の顕微鏡装置。
- 前記第2の光源と前記被観察物との間に配設される第1のピンホールと、前記蛍光と前記蛍光画像情報検出部との間に配設される第2のピンホールと、を備えたことを特徴とする、請求項1に記載の顕微鏡装置。
- 前記第1のピンホール又は前記第2のピンホールを移動及び/又は回転させるピンホール駆動部を、備えたことを特徴とする、請求項7に記載の顕微鏡装置。
- 前記第1の光源と前記被観察物との間に配設される対物レンズと、該対物レンズの駆動部と、を備えたことを特徴とする、請求項1に記載の顕微鏡装置。
- 前記被観察物で生じた光と前記画像情報検出部との間に配設される結像レンズと、該結像レンズの駆動部と、を備えたことを特徴とする、請求項1に記載の顕微鏡装置。
- 前記蛍光と前記蛍光画像情報検出部との間に配設される結像レンズと、該結像レンズの駆動部と、を備えたことを特徴とする、請求項1に記載の顕微鏡装置。
- 前記被観察物を収容すると共に、雰囲気ガスで満たされる環境制御部を備えたことを特徴とする、請求項11記載の顕微鏡装置。
- 前記環境制御部は、複数の前記被観察物を収容することができる収容部を備えたことを特徴とする、請求項12に記載の顕微鏡装置。
- 前記被観察物を刺激する被観察物刺激手段を備えたことを特徴とする、請求項1に記載の顕微鏡装置。
- 被観察物の画像情報と該被観察物の蛍光画像情報とを取得する顕微鏡装置を用いた蛍光の観察方法であって、
上記被観察物の画像情報と上記被観察物の運動モデルとに基づいて上記被観察物の蛍光観察領域を決定する第1段階と、
上記蛍光観察領域内の所定の位置で上記蛍光画像情報を取得する第2段階と、
を備えたことを特徴とする、蛍光観察方法。 - 前記第1段階の蛍光観察領域を、最適制御則に従って決定することを特徴とする、請求項15に記載の蛍光観察方法。
- 前記第1段階と前記第2段階との間において、前記被観察物の画像情報と上記被観察物の運動モデルとに基づいて前記蛍光観察領域の中心位置を決定することを特徴とする、請求項15に記載の蛍光観察方法。
- 前記第2段階において、前記被観察物の画像情報を取得することを特徴とする、請求項15に記載の蛍光観察方法。
- 前記各段階を、前記蛍光観察領域内の所定の位置毎に所定の回数繰り返し行うことを特徴とする、請求項15〜18の何れかに記載の蛍光観察方法。
- 前記運動モデルのパラメータは、前記被観察物の位置、速度、分布、種類、形状の何れか又はこれらの組み合わせからなることを特徴とする、請求項15に記載の蛍光観察方法。
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