WO2010029799A1 - 顕微鏡装置及びそれを用いた蛍光観察方法 - Google Patents

Abstract

　細胞等の被観察物の位置制御と蛍光記録を制御する顕微鏡装置及び蛍光観察方法を提供する。顕微鏡装置１は、被観察物２を載置するステージ３と、被観察物２の照明用光源４と、被観察物２に蛍光Ｆを励起する励起光用光源５と、被観察物２で生じた光Ｔによる画像情報を検出する画像情報検出部１６と、蛍光Ｆによる蛍光画像情報を検出する蛍光画像情報検出部１７と、被観察物２の運動モデルと画像情報検出部１６から入力された被観察物２の画像情報とに基づいて被観察物２の蛍光観察領域を決定し、画像情報検出部１６から入力された被観察物２の画像情報と蛍光画像情報検出部１７から入力された蛍光画像情報とを蛍光観察領域内の所定の間隔毎に取得する制御部２０と、を備える。

Description

顕微鏡装置及びそれを用いた蛍光観察方法

　本発明は、生体組織等の蛍光観察などに使用される顕微鏡装置及びそれを用いた被観察物の蛍光観察方法に関する。

　分子生物学分野等において、生体組織や細胞内イオン、分子等の観察は必須の技術である。光学顕微鏡は、主に生体組織を観察するときに用いられる。また、レーザー共焦点顕微鏡は、光を生体細胞の一部に照射し、その照射位置を移動させ、細胞の一部を観察するときに用いられる。

　光学顕微鏡の主な観察技術の一つに、生体組織の細胞内のイオンや分子に蛍光色素を付け、その蛍光色素に励起光を照射し、励起された蛍光色素が発する蛍光を観察する蛍光観察法がある。
　蛍光と励起光の波長は異なっている。従って、蛍光を解析することで細胞内分子の検出や濃度の計測が可能になる。このため、蛍光観察は以下の長所を持つ。
(i)イオンや分子の大きさでも観察できる。
(ii)特定のイオンや分子のみを観察できる。
(iii)蛍光の明るさがイオンや分子濃度に応じて変化するので、これらの濃度を測定することができる。

　しかしながら、一般に蛍光観察は以下の短所も有している。
(i)励起光の波長帯域が紫外の場合、励起光が細胞にとって有毒となる。
(ii)励起光を当て続けると蛍光色素が退色する。退色とは、蛍光の強さが弱まることである。

　蛍光観察が可能な蛍光顕微鏡を使用して動く細胞を観察していると、細胞が顕微鏡の視野外に出て観察が中断してしまう場合がある。

　この問題の解決方法として、（１）対物レンズの倍率を下げて視野を広げる、（２）機械的又は化学的に細胞の動きを抑制する、（３）ステージを動かし細胞の位置を視野の中心にする。しかし、（１）の方法は空間解像度が低下し、（２）の方法は細胞へ悪影響を及ぼす可能性がある。

　上記（３）の解決方法に関して特許文献１及び２には、微小な観察物を観察するために被観察物を追跡する機構を備えた光学顕微鏡が開示されている。これらの光学顕微鏡は、透過光を用いた細胞位置及び観察領域の制御と透過光記録とを行うことができる。

　特許文献３～５には、蛍光を用いた細胞位置及び観察領域の制御と蛍光記録とを行うことができる蛍光顕微鏡が開示されている。

　非特許文献１～５には、比較的大きな被観察物として動くゾウリムシを視野に固定して観察する方法が報告されている。

　培養液中を自由に動くことが可能な細胞のうち、医学及び生物学分野で重要視されているものとして、細菌やウイルスから人体を守る機能を持つ免疫細胞が挙げられる(非特許文献６参照）。

　免疫機能に関連する細胞内分子は数多く存在するが、それらの分子の検出や分子濃度の時間変化を計測するためには蛍光観察を用いなければならない。

　免疫細胞の中でも、スライドガラスの表面にはあまり付着せず、浮遊している細胞は浮遊細胞に分類される。シャーレ中の浮遊細胞は、培養液の対流、重力、シャーレの壁及び底部、水面及び細胞同士の相互作用などにより、常に位置を変えている。浮遊細胞の観察には、例えば非特許文献１で報告されている奥らの手法を用いて、一つの細胞を追跡する方法も考えられる。

特開平５－８０２５５号公報 特開平７－２５３５４８7号公報 特開平７－２６１０９７号公報 特開２００５－２１４９２４号公報 特開２００６－２９２４２０号公報 ＷＯ２００３／１０２６３６号公報

H. Oku, N. Ogawa, Ishikawa, K. Hashimoto, "Two-dimensional tracking of a motile micro-organism allowing high-resolution observation with various imaging techniques", Review of Scientific Instruments, Vol.76, No.3, 2005 H. Oku, M. Ishikawa, Theodorus, and K. Hashimoto, "High-speed autofocusing of a cell using diffraction patterns", Optics Express, Vol.14, No.9, pp.3952-3960, 2006 奥寛雅，石井抱，石川正俊：マイクロビジュアルフィードバックシステム，電子情報通信学会誌 D-II，Vol.J84-D-II，No.6，pp.994-1002, 2001 奥寛雅，石川正俊：キロヘルツオーダーで応答可能な高速ビジョンチップ用可変焦点レンズの構造，光学，Vol.31，No.10，pp.758-764, 2002 橋本浩一：微生物を用いたアクティブセンシング，ＳＯＲＳＴジョイントシンポジウム（６）講演要旨集，pp．23-26，2007年1月30日 Ｄ．Ｍ．ディビス：会話する免疫細胞，日経サイエンス, pp. 52-60, 2006年5月号 谷村保明：白血球分類の自動化, MEDICAL IMAGING TECHNOLOGY, Vol.14, No.1, pp.14-22, 1996

　蛍光観察パラメータは、現在、観察者が経験則に従って決めている。つまり、客観的評価に従って決定しているものではないというのが現状である。この場合、細胞の位置、分布、種類等が変化しても、観察者は臨機応変に蛍光観察パラメータを調整することも困難になっている。
　観察者が多くの細胞を観察しようとして、励起光の照射範囲や照射時間を過剰に広げた場合には、細胞と蛍光色素に不必要な悪影響を与えることになる。また、取得される蛍光画像データが大量となり、解析に多くの時間が掛かるようになる。

　従来の蛍光顕微鏡においても、励起光の種類や強度を自動的に制御することで細胞内の複数のイオンや分子の活性化状態を継時的に観察し、一回の実験中に起こった細胞内の複数のイオンや分子の相互作用を一括して可視化することが行われてきた。しかしながら、この自動制御は、予め決められた時間スケジュールに従ったものであるか、蛍光画像から得られる細胞情報と連動したものであった。

　蛍光画像だけを制御に用いた場合、蛍光は光の強度が弱いために制御用の画像を得るための露光時間が長くなる。つまり、制御にかかる時間が長くなってしまう。このため、細胞が移動する最大速度が早いと、制御が有効に機能しなくなる場合が多くなる。このような制御法は、本来動かない細胞を長時間観察した際に起こるずれを補正することを主目的としていた。

　本発明は上記課題に鑑み、被観察物からの透過光等を制御に用いることで、蛍光観察時の被観察物の位置や観察領域等の自動制御を行うことができる、顕微鏡装置及びそれを用いた被観察物の蛍光観察方法を提供することを目的としている。

　上記目的を達成するため、本発明の顕微鏡装置は、被観察物を載置するステージと、被観察物に照明光を照射する第１の光源と、被観察物に蛍光を励起するための励起光を照射する第２の光源と、上記照明光によって得られた被観察物の画像情報を検出する画像情報検出部と、上記励起光によって被観察物に生じた蛍光により画像情報を検出する蛍光画像情報検出部と、被観察物の運動モデルと画像情報検出部から入力された被観察物の画像情報とに基づいて被観察物の蛍光観察領域を決定し、画像情報検出部から入力された被観察物の画像情報と蛍光画像情報検出部から入力された蛍光画像情報とを蛍光観察領域内の所定の間隔毎に取得する制御部と、を備えたことを特徴とする。
　運動モデルとは、被観察物が持つ物理学的特性あるいは化学的特性の内、特定の次元、あるいは特定の次元の組み合わせ、あるいは特定の次元の重み付き組み合わせに注目し、その次元上における被観察物の時空間変化を予測することを目的としたモデルのことを意味する。例えば、被観察物の位置，速度，分布，種類，形状，イオン濃度，分子濃度等の何れか又はこれらの組み合わせの時空間変化を表す数理モデルを意味する。

　上記構成において、制御部は、好ましくは、蛍光観察領域をＰＩＤ制御等の古典制御、最適制御，準最適制御等の現代制御、Ｈ∞制御，サンプル値制御，有限時間整定制御，適応制御等のポスト現代制御論、ニューラルネットワーク制御，ファジィ制御，遺伝的アルゴリズム制御等の知的制御に従って決定する。
　ＰＩＤ制御とは、目標値と出力値との偏差の最小化を、偏差に比例する項，偏差の積分項，および偏差の微分項の何れか又はこれらの組み合わせにより表現される制御則に従って行う制御手法である。
　最適制御とは、蛍光観察の効率を示す評価関数を作成し、それを最小化もしくは最大化することで、最適な制御則を導出する制御手法である。
　準最適制御とは、蛍光観察の効率を示す評価関数を作成し、それを局所的に最小化もしくは最大化することで、局所的に最適な制御則を導出する制御手法である。
　制御部は、好ましくは、被観察物の運動モデルに従って蛍光観察領域の中心位置を決定する。制御部は、好ましくは、第１の光源を制御するための第１光源制御部と第２の光源を制御するための第２光源制御部とを備えている。
　ステージは、好ましくは、被観察物の位置を移動させる三次元ステージである。
　蛍光画像情報検出部は、好ましくは、少なくとも１波長以上の蛍光を分離する波長選択手段を備えている。
　好ましくは、第２の光源と被観察物との間に配設される第１のピンホールと蛍光と蛍光画像情報検出部との間に配設される第２のピンホールとを備えている。好ましくは、第１のピンホール又は第２のピンホールを移動及び／又は回転させるピンホール駆動部を、備えている。
　好ましくは、第１の光源と被観察物との間に配設される対物レンズと対物レンズの駆動部とを備えている。好ましくは、被観察物で生じた光と前記画像情報検出部との間に配設される結像レンズと、結像レンズの駆動部と、を備えている。好ましくは、蛍光と蛍光画像情報検出部との間に配設される結像レンズと、結像レンズの駆動部と、を備えている。
　好ましくは、被観察物を収容しかつ雰囲気ガスで満たされる環境制御部を備えている。環境制御部は、雰囲気ガスの種類、雰囲気ガスの温度を制御するものである。雰囲気ガスとして、窒素ガス（単体），酸素ガス（単体），二酸化炭素（単体），空気（混合物），およびそれらの混合ガスを利用することができる。環境制御部は、好ましくは、複数の被観察物を収容することができる収容部を備えている。
　好ましくは、被観察物を刺激する被観察物刺激手段を備えている。被観察物に与える刺激として、例えば電気的刺激，磁気的刺激，力学的刺激，超音波刺激，温度的刺激，化学的刺激，光刺激等を利用することできる。被観察物刺激手段としては、例えば被観察物に電気的刺激や磁気的刺激を与えるために、電極，電流，電池，抵抗，コンデンサ，磁石，コイル，超伝導体，完全導体，電気伝導体，半導体，絶縁体，誘電体，圧電体，焦電体，強誘電体，イオン伝導体等からなる電気的刺激制御装置を利用することができる。例えば被観察物に力学的刺激を与えるために、短針，プローブ，アクチュエータ，圧電体，遠心機，重り，ばね等からなる力学的刺激制御装置を利用することができる。或いは、被観察物に超音波刺激を与えるために、電歪振動子，磁歪振動子等の超音波刺激制御装置を利用することができる。或いは、例えば被観察物に温度的刺激を与えるために、ヒーター，クーラー，熱伝導体，温度計，サーモグラフィー等からなる温度的刺激制御装置を利用することができる。さらには、例えば被観察物に化学刺激を与えるために、化学物質の濃度もしくは状態を時空間変化させる、ピペット，ポンプ，シリンジ，プロペラ，スクリュー，マイクロ流体デバイスからなる化学的刺激制御装置を利用することができる。例えば被観察物に光刺激を与えるために、ミラー，プリズム，フィルタ，ランプ，レーザー，メーザー等の光刺激制御装置を利用することができる。
　これらの刺激制御装置及びその部材が相互に補完的であることは勿論である。例えば、光刺激制御装置は、ケージド化合物に光を当てて分解することで、細胞内外の化学物質の濃度もしくは状態を時空間変化させることができ、化学的刺激制御装置にもなりうる。また、光刺激制御装置は、光で測定液を温めることができ、温度的刺激制御装置にもなりうる。

　上記目的を達成するため、本発明の蛍光観察方法は、被観察物の画像情報と被観察物の運動モデルとに基づいて被観察物の蛍光観察領域を決定する第１段階と、蛍光観察領域内の所定の位置で蛍光画像情報を取得する第２段階と、を備えている。

　上記構成において、第１段階の蛍光観察領域を、好ましくは、ＰＩＤ制御等の古典制御、最適制御，準最適制御等の現代制御、Ｈ∞制御，サンプル値制御，有限時間整定制御，適応制御等のポスト現代制御論、ニューラルネットワーク制御，ファジィ制御，遺伝的アルゴリズム制御等の知的制御に従って決定する。
　第１段階と第２段階との間において、好ましくは、被観察物の画像情報と被観察物の運動モデルとの少なくとも一方に基づいて蛍光観察領域の中心位置を決定する。第２段階において、好ましくは、被観察物の画像情報を取得する。各段階を、蛍光観察領域内の所定の位置毎に所定の回数繰り返し行うようにすれば好ましい。
　運動モデルのパラメータは、好ましくは、被観察物の位置，速度，分布，種類，イオン濃度，分子濃度等の何れか又はこれらの組み合わせからなる。

　本発明の顕微鏡装置によれば、被観察物からの画像情報と被観察物の運動モデルに基づいて蛍光観察領域を決めるので、蛍光観察を自動的に行うことができる。

　本発明の顕微鏡装置を用いた蛍光観察方法によれば、被観察物の運動モデルに基づいて評価関数と自動制御則を導出するために被観察物の位置，分布，種類，状態，イオン濃度，分子濃度等をフィードバック情報として用いることで、被観察物の動的変化に対しても臨機応変かつ自動的に蛍光観察パラメータを調整することができる。

本発明の第１実施形態に係る顕微鏡装置の構成を示す模式図である。 蛍光観察領域のモデルを示す図である。 上記第１実施形態に係る顕微鏡装置を用いた蛍光観察手順を示すフロー図である。 第２実施形態に係る顕微鏡装置の構成を示す模式図である。 第３実施形態に係る顕微鏡装置の構成を示す模式図である。 第４実施形態に係る顕微鏡装置の構成を示す模式図である。 第５実施形態に係る顕微鏡装置の構成を示す模式図である。 第６実施形態に係る顕微鏡装置の構成を示す模式図である。 第７実施形態に係る顕微鏡装置の構成を示す模式図である。 第８実施形態に係る顕微鏡装置の構成を示す模式図である。 環境制御部の構成を示す模式図で、（Ａ）は平面図、（Ｂ）は（Ａ）のＸ－Ｘに沿った断面図である。 複数の被観察物の観察ができる環境制御部の別の構成を示す模式図で、（Ａ）は平面図、（Ｂ）は（Ａ）のＸ－Ｘに沿った断面図である。 観察開始直後の細胞分布の一例を示す図である。 蛍光観察手順において、制御量Ｕ（ｋ）を用いた実施例の評価関数Ｊと、蛍光観察領域幅を固定した場合の比較例の評価関数Ｊと、を比較した模式図である。

　以下、この発明の実施の形態について図面を参照して詳細に説明する。各図において同一又は対応する部材には同一符号を用いる。
（第１実施形態）
　図１は本発明の第１実施形態に係る顕微鏡装置１の構成を示す模式図である。第１実施形態に係る顕微鏡装置１は、被観察物２を載置し、被観察物２の位置を自由に移動し得るステージ３と、光学系１０と、ステージ３の位置等を制御する制御部２０と、を備えている。
　光学系１０は、被観察物２の像や位置を検出するために被観察物２に照明光を照射する照明用光源４と、被観察物２から生じる蛍光を励起するための励起光を照射する励起用光源５と、照明用光源４の光が照射されて被観察物２から得られた透過光Ｔの光路、励起光５Ａを被観察物２に導く光路及び被観察物２によって生じた蛍光Ｆの光路を形成するための光学部品を配置した鏡筒部１５と、鏡筒部１５から出射した被観察物２からの透過光からなる画像情報を検出する画像情報検出部１６と、鏡筒部１５から出射された被観察物２の蛍光画像情報を検出する蛍光画像情報検出部１７と、を有している。被観察物２は、例えば生体試料である細胞等であってよい。

　ステージ３には被観察物２が載置され、後述する制御部２０により被観察物２の位置が制御される。このステージ３は、所謂電動ステージであり、被観察物２の載置される二次元の平面（Ｘ－Ｙ平面）で駆動制御されるＸＹステージでも、又は三次元で駆動制御されるＸＹＺステージであってもよい。三次元の駆動はマニピュレータで行ってもよい（非特許文献３参照）。
　ここで、観察領域のＸＹ軸方向に関する位置制御は、照明用光源４や励起用光源５の照射位置、後述するピンホールの配置される位置を制御してなされてもよい。観察領域のＺ軸方向に関する位置制御は、後述する対物レンズ，結像レンズ，ピンホールの配置される位置を制御してなされてもよい（特許文献６、非特許文献２，４参照）。

　照明用光源４が透過光用の光源である場合、照明用光源４は、被観察物２が吸収する波長又は反射する波長を含む光を発するものであれば何でもよい。このような照明用光源４としては、ハロゲンランプ等の各種ランプ、発光ダイオード、各種レーザーを使用することができる。透過光Ｔが励起光５Ａや蛍光Ｆと干渉しないように、照明用光源から出力される光のうち励起光５Ａや蛍光Ｆと同じ波長帯は光学フィルタ８等でカットされることが望ましい。照明用光源４から被観察物２へ照射された照明光が、被観察物２からの透過光Ｔや反射光となって画像情報検出部１６で検出される。被観察物２からの画像は、所謂明視野像や暗視野像等の画像情報である。

　励起用光源５は、被観察物２それ自体又は被観察物２に含有させた蛍光体を励起できる光源であれば何でもよい。このような励起用光源５としては、キセノンランプ，水銀ランプ等のランプ，アルゴンレーザ等の各種レーザーを励起光５Ａとすることができる。励起光５Ａを、透過光Ｔや蛍光Ｆと干渉させないためには、不必要な波長帯を光学フィルタ９等でカットすることが望ましい。励起用光源５は、図示しない投光管を介して被観察物２に導入されてもよい。

　鏡筒部１５は、照明用光源４の光によって被観察物２で生じた光、励起光５Ａ及び蛍光Ｆを通過させる光路を形成するために、第１及び第２のビームスプリッター１８，１９、対物レンズ６及び結像レンズ７からなる光学部品を含んで構成されている。図示の場合には、倒立型の顕微鏡装置の一例を示している。ここで、照明用光源４の光によって被観察物２で生じた光は、透過光Ｔではなく反射光であってもよい。

　第１及び第２のビームスプリッター１８，１９は、鏡筒部１５に設けた図示しないポートに配置されてもよい。ビームスプリッター１８，１９は、照明用光源４の波長と被観察物２から発生する蛍光Ｆの波長とを分離できるダイクロイックミラーなどを使用することができる。以下の説明においては、ビームスプリッター１８，１９をダイクロイックミラーとして説明する。

　第１のダイクロイックミラー１８は、短波長の光を反射し長波長の光を透過させる作用を有しているので、励起光５Ａは反射し、紙面上方の被観察物２へ入射する。一方、被観察物２からの透過光Ｔは、励起光５Ａの波長よりも長波長の光を用いることにより、第１のダイクロイックミラー１８を透過する。

　第２のダイクロイックミラー１９は、第１のダイクロイックミラー１８の下方に配置されている。第１のダイクロイックミラー１８を透過した被観察物２からの透過光Ｔは、第２のダイクロイックミラー１９と結像レンズ７を通過し、鏡筒部１５から画像情報検出部１６へ出射される。結像レンズ７と画像情報検出部１６との間に図示しないフィルタを配置しておくことにより、透過光Ｔを励起光５Ａや蛍光Ｆと干渉させずに画像情報検出部１６へ入射させてもよい。

　第１のダイクロイックミラー１８を透過した被観察物２からの蛍光Ｆは、第２のダイクロイックミラー１９で反射され、結像レンズ１２を通過し、その後蛍光画像情報検出部１７へ出射される。結像レンズ１２と蛍光画像情報検出部１７との間に図示しないフィルタを配置しておくことにより、蛍光Ｆを励起光５Ａや透過光Ｔと干渉させずに蛍光画像情報検出部１７へ入射させてもよい。

　画像情報検出部１６は、照明用光源４からの光が被観察物２からの透過光Ｔや反射光による画像情報を取得できる検知器を備えている。透過光Ｔの光軸で、かつ、透過光Ｔを検出する画像情報検出部１６の直前には結像レンズ７が設けられている。検知器には撮像素子、例えば、ＣＣＤ型撮像素子やＣＭＯＳ型撮像素子を使用できる。さらに、これらの撮像素子は、Ｓ／Ｎ比（信号対雑音比）を向上させて雑音を減らすように、例えば液体窒素やペルチェ素子を使用した冷却装置で冷却してもよい。検知器は、画像処理を行う計算機を備えていてもよい。また、目視観察用として接眼レンズを備えていてもよい。

　蛍光画像情報検出部１７は、被観察物２からの蛍光画像を取得できる検知器を備えている。この検知器は、目的に応じて銀塩カメラや撮像素子を用いることができる。撮像素子としては、画像情報検出部１６と同様に、ＣＣＤ型撮像素子やＣＭＯＳ型撮像素子を使用できる。さらに、これらの撮像素子は、Ｓ／Ｎ比（信号対雑音比）を向上させ雑音を減らすように、液体窒素やペルチェ素子を使用した冷却装置で冷却してもよい。蛍光Ｆの光路上で、かつ、蛍光Ｆを検出する蛍光画像情報検出部１７の直前に結像レンズ１２を設けてもよい。また、目視観察用として接眼レンズを備えていてもよい。

　画像情報検出部１６用の結像レンズ７と蛍光画像情報検出部１７用の結像レンズ１２は異なるレンズであってもよい。例えば、画像情報検出部１６用の結像レンズ７の倍率を下げると共に、蛍光画像情報検出部１７用の結像レンズ１２の倍率を上げるようにしてもよい。この場合、画像情報検出部１６で取得する透過光Ｔの画像の視野を広げることができると共に、蛍光画像情報検出部１７では、被観察物２のより拡大した蛍光画像を得ることができる。

　図１では、説明のために透過光Ｔの光路や励起光５Ａ及び蛍光Ｆの光路を重ならないように示しているが、これらの各光路は一致させてもよい。画像情報検出部１６と蛍光画像情報検出部１７との間で、視野中心位置及び焦点位置のズレが生じる場合がある。この場合、予めそれらのズレを測定し、被観察物２の位置制御及び観察領域制御におけるオフセットとして利用してもよい。オフセットを掛けることによって、視野中心位置や焦点位置のズレを補正することができる。

　制御部２０は、被観察物２の透過光Ｔや反射光による画像情報が、画像情報検出部１６を介して入力される。制御部２０は、画像情報の処理と、画像情報の処理結果に基づいたステージ３の制御とを行う。制御部２０は電子計算機から構成されている。このような電子計算機としては、パーソナルコンピュータ２１を用いることができる。パーソナルコンピュータ２１は、被観察物２の画像などを表示するディスプレー装置２２を備えている。パーソナルコンピュータ２１は、画像情報検出部１６及び光画像情報検出部１７における撮影の開始及び終了，撮影速度，撮影画素数，ビニング数，ゲイン，ビット数等を制御する。

　制御部２０には、光学系１０により被観察物２を透過した透過光Ｔの画像情報が入力され、この画像情報により制御部２０はステージ３上の被観察物２の位置を制御する。

　顕微鏡装置１においては、画像情報検出部１６から入力された被観察物２の画像情報と被観察物２の運動モデルとに基づいて、被観察物２の蛍光観察領域を決定し、ステージ３を動かして、蛍光観察領域内の所定の間隔毎の位置で、画像情報検出部１６から入力された被観察物２の画像情報と蛍光画像情報検出部１７から入力された蛍光画像情報とを取得する。
　ここで、運動モデルのパラメータは、被観察物２の位置，速度，分布，種類，形状，イオン濃度，分子濃度の何れか又はこれらの組み合わせからなる。
　具体的には、蛍光観察のために、制御部２０は、画像情報検出部１６から入力された被観察物２の透過光の画像情報により、被観察物２の蛍光観察領域を決定する第１段階と、被観察物２の運動モデルに従って蛍光観察領域の中心位置を決定する第２の段階と、所定の間隔で蛍光観察領域内の蛍光観察と明視野観察とを行う第３の段階と、を含む制御を行い、被観察物２の蛍光情報の取得を制御することができる。ここで、蛍光観察領域は、後述する最適制御則等の知的制御に従って決定することができる。

（位置制御アルゴリズム）
　先ず、第１段階における被観察物２の透過光の画像情報により、被観察物２の細胞位置を制御する方法、即ち細胞位置制御アルゴリズムについて説明する。
　画像情報検出部１６において、被観察物２の透過光の画像を取得し、次に、画像情報から画像特徴量を抽出する。画像特徴量は、画像情報の二値化によって観察対象の存在する領域を抽出し、このとき、直前に観察対象が存在していた領域の近傍でのみ抽出を行うセルフウィンドウ法を用いることで、障害物に惑わされることなく観察対象のみを抽出することができる（非特許文献１参照）。

　具体的には、透過光画像特徴量として、上記の二値データから０，１，２次モーメントを計算する。この画像特徴量を、制御部２０のパーソナルコンピュータ２１で読み出し、被観察物２の重心と方向を求める。被観察物２の運動はカルマンフィルタやパーティクルフィルタ等で予測してもよい。

　次に、被観察物２の重心が視野中心に移動するように、ステージ３のモーター回転角の目標値を定め、このモーターをフィードバック制御する。例えば、ステージ３にはＸＹＺステージを使用することができる。このフィードバック制御には、比例、積分、微分の何れか、またはこれらの組み合わせによる制御手法を用いることができる。
　また、被観察物２の特定の部位を観察するために、もしくは被観察物２の立体画像を取るため意図的に、被観察物２の重心からずれた特定の位置を視野中心に移動するように、ステージ３のモーター回転角の目標値を定め、このモーターをフィードバック制御してもよい。

　透過光画像特徴量は、上記セルフウィンドウ法以外を用いてもよく、例えば、被観察物２の回折像から抽出してもよい（非特許文献２参照）。

　被観察物２の軌跡を再構成、つまり、再現するためには、上記のＸＹＺステージ３の変位情報をパーソナルコンピュータ２１に記録しておく。これにより被観察物２の軌跡を得ることができる。

　透過光Ｔを使用するのは、追跡対象となる被観察物２の全体像を高輝度で安定して写すためである。透過光Ｔ以外には、落斜照明を用いた被観察物２からの反射光を用いることもできる。反射光の光源は、照明用光源４と同様の光源を用いることができる。この場合、被観察物２からの画像は反射光画像である。
　なお、照明用光源４からの透過光Ｔを被観察物２に当て過ぎると、被観察物２の温度を上げるおそれがある。このため、本実施形態の制御部２０は、照明用光源４からの光の強度や照射時間などを調整できるようにしている。

（蛍光観察方法）
　次に、本発明の顕微鏡装置１を用いた蛍光観察方法について説明する。
　被観察物２には、蛍光試薬を担持または注入する。被観察物２が細胞の場合には、Ｉｎｄｏ－１（ＡＭ体、同仁化学研究所）のような蛍光試薬を使用し、適度な濃度で所定時間負荷すればよい。Ｉｎｄｏ－１（ＡＭ体）は蛍光Ｆを発しないが、微生物の細胞膜を通過する。

　細胞膜を通過したＩｎｄｏ－１（ＡＭ体）は、体内の酵素エステラーゼによって脱ＡＭ体に変化する。つまり、Ｉｎｄｏ－１（ＡＭ体）は、細胞膜を通過すると、蛍光Ｆを発するが細胞膜を通過できないＩｎｄｏ－１に変化する。Ｉｎｄｏ－１はＣａ^２＋イオンと結合した場合と解離した場合で異なる波長の蛍光Ｆを発する。

　結合と解離のそれぞれの状態にあるＩｎｄｏ－１の量は、Ｃａ^２＋濃度によって変化する。つまり、Ｃａ^２＋濃度の上昇に伴い、結合状態のＩｎｄｏ－１による蛍光Ｆは増え、逆に、解離状態のＩｎｄｏ－１による蛍光Ｆは減少する。この特性により、それぞれの波長における蛍光Ｆの強度を比較することで、Ｃａ^２＋濃度を求めることができる。具体的には、後述する顕微鏡装置４０を用いた場合には、２波長蛍光観察像を波長ごとに分割し、各画素ごとに計算した蛍光強度比を、予め作成しておいた検量線に代入することで、Ｃａ^２＋濃度を求めることができる。

　Ｃａ^２＋イオンのみならず、顕微鏡装置１におけるフィルタ９及びダイクロイックミラー１８，１９，２６を交換することで、他のイオンや分子を対象とした蛍光色素を利用することも可能である。

（蛍光観察領域の制御アルゴリズム）
　顕微鏡装置１を用いて、蛍光観察枚数を減らすこと及び蛍光観察できる細胞数を増やすための制御について説明する。
　この制御としては、蛍光観察のためにステージ３のＺ軸方向、つまり、結像レンズ７の位置の時間的変化、より具体的には蛍光観察領域幅の時間的変化として与える。

　蛍光観察の手順として、最初に蛍光観察する領域を決定する。図２は、蛍光観察領域のモデルを示す図である。図の斜線で示した箇所は蛍光観察する領域を示す。その観察領域を等分割する。分割する幅ｄ（ここで、ｄ＞０）は、観察する対象によって決定する。次に、観察領域の各点で蛍光観察を行う。そして、数十秒の時間をおいた後、観察領域を再設定し、蛍光観察を行う。これらの観察をＴ回（ここで、Ｔ＞０）繰り返す。

　一枚の蛍光観察で励起光５Ａを照射する時間ｅ（＞０）と、観察点の数Ｎ（ｋ）(ここで、ｋ＞０）とを掛けた値であるｅＮ（ｋ）が、一回の蛍光観察で励起光５Ａを照射した総時間となる。ｅは可変にも拡張できるが、ここでは簡単のために固定とする。ｋ∈{０，１，・・・，Ｔ－１}回目の蛍光観察の領域幅２ｘ（ｋ）は、下記(１)式によって与えられる。

　蛍光観察時間は、ｋ回目の試行からｋ＋１回目の蛍光Ｆに移行するときに、ｘ（ｋ）をｘ（ｋ＋１）と更新する。

　蛍光観察の評価関数として、下記(２)式によって与えられるＪ（Ｔ）を導入する。

　ここで、ｑ（＞０)、ｒ（＞０）は、それぞれ、蛍光観察に要する時間と観察される細胞数に関する重みである。ｙ（ｋ）は蛍光観察領域幅２ｘ（ｋ）内で蛍光観察される細胞数である。（２)式において、右辺は蛍光観察枚数Ｎ（ｋ）が少ないほど小さくなり、蛍光観察される細胞数ｙ（ｋ）が多いほど小さくなる。一方、Ｎ（ｋ）が少なくなると、ｙ（ｋ）も少なくなる。
　よって問題は、評価関数Ｊ（Ｔ）を最小化する蛍光観察パラメータＮ（ｋ）を探す問題と置き換えられる。（１）式より、Ｎ（ｋ）とｘ（ｋ）とは（１）式の関係があるので、以下ではｘ（ｋ）の最適制御側を求める。

　時刻ｋにおけるｘ（ｋ）を、下記（３）式によって更新する。

　ここで、ｘ（ｋ）は正の値である。制御量ｕ（ｋ）は細胞数の観測値ｙ（ｋ）をフィードバックしたものである。（３）式は、次の時刻のｘ（ｋ＋１）は今の時刻のｘ（ｋ）に制御量ｕ（ｋ）を加えたものであることを意味する。

　以上のことから、ｘ（ｋ）を求める問題は、下記（４）式で定義される最適制御量Ｕ^＊（Ｔ－１）＝［ｕ^＊（０），ｕ^＊（１），・・・，ｕ^＊（Ｔ－１）］を求めることに帰着できる。これは、制御理論において最適な出力フィードバック則を求める問題となる。従って、下記（５）式の最適制御則Ｕ^＊（Ｔ－１)を満たす最適制御則Ｕ^＊（Ｔ－１）＝[u^＊（０），u^＊（１）,・・・，u^＊(Ｔ－１)]を求める。

　いま、制御量ｕ（ｋ）を求める上で問題となるのは、顕微鏡装置１の光軸方向に沿った細胞２の運動である。これは、顕微鏡装置１の光軸方向の運動によって、細胞２が蛍光観察領域に存在しなくなることが問題であるためである。従って、顕微鏡装置１の光軸における細胞２の運動を予想するためのモデルを用いる。そして、蛍光観察領域幅２ｘ（ｋ）とその領域内に存在する細胞数ｙ（ｋ）の関係を求める。

　全細胞数をＭとする。細胞２を識別するための番号をｉとする。ｉは、ｉ∈{１，２，・・・,Ｍ}の範囲とする。細胞２の顕微鏡装置１の光軸方向の位置ｚ_ｉ（ｋ）（＞０）を、下記（５）式とする。

　ここで、ｖ_０は細胞２の移動速度の集団平均を表す定数である。ω_i（ｋ）は、細胞２の運動の項に入るホワイトノイズである。その特性は、平均Ｅ[ω_ｉ（ｋ）]＝０で、分散は下記（６）式によって与えられるとする。

　ここで、δ_ｋτ及びδ_ijはクロネッカーのデルタである。Ｔは、転置を表す。

　初期位置ｚ_ｉ（０）は、下記（７）式によって与えられる平均と下記（８）式によって与えられる分散が既知である確率変数とする。ｖ_０とω_ｉ（ｋ）とは独立であるとする。ここで、

　ｚ_ｉ（ｋ）の分散Ｐ_ｉ（ｋ）の時間更新式は、上記の（５）式から、下記(９)式によって与えられる。

　細胞２の運動モデルとして、細胞２の分布を与えることによって、各時刻における細胞位置の平均と分散を求めることができる。細胞位置の集団平均ｚバー（ｋ）は下記(１０)式によって与えられ、細胞位置の分散の集団平均Ｐ（ｋ）は下記(１１)式によって与えられる。

　細胞数が十分に多いときは、中心極限定理によって、細胞２の分布は正規分布とみなすことできる。よって、ｋにおける細胞２の顕微鏡装置１の光軸方向における位置の分布は、下記（１２）式の確率密度関数ｈ（ｚ（ｋ））によって与えられるとする。

　この場合、Ｐ（ｋ）とｚバー（ｋ）の時間更新は、上記（９）～（１２）式によって、それぞれ、下記（１３）式及び（１４）式によって与えられる。蛍光観察領域の中心は、(１４)式のｚバー（ｋ＋１）に一致するように制御する。

　ｋにおける顕微鏡装置１の光軸方向の細胞数分布ｆ（ｋ，ｎ（ｋ））を、下記(１５)式のように確率密度関数ｈ（ｎ（ｋ））のＭ倍であるとする。なぜならば、正規分布であるｈ（ｎ（ｋ））をｎ（ｋ）について－∞から＋∞の区間で積分すると１となるが、ｆ（ｋ，ｎ（ｋ））の同区間での積分値はその定義からＭとなるためである。

　顕微鏡装置１の光軸方向の観測領域幅２ｘ（ｋ）内に存在する細胞数ｙ（ｋ）は、下記(１６)式によって与えられる。

　ｙ（ｋ）に関する上記（１６）式をｘ（ｋ）に関して線形近似すると、下記(１７)式となる。

　ここで、ｃ（ｋ）はｘ（ｋ）に掛かる係数で、下記（１８）式によって与えられる。

　（１８）式より、ｘ（ｋ－１）＞０のときｃ（ｋ）＞０となることがわかる。これは、観測幅に対して、その領域内に存在する細胞数が単調増加することを意味し、物理的に妥当である。
　ｓ（ｋ）はｘ（ｋ）を含まない項であり、下記（１９）式によって与えられる。

　次に、最適制御量の導出について説明する。
　（１）式と（１７）式を（２）式に代入して、評価関数Ｊ（Ｔ）を整理すると、Ｊ（Ｔ）は下記(２０)式によって与えられる。

　ここで、ｑ_２（ｋ）、α(ｋ)及びβ(ｋ)は下記(２１)式によって与えられる。

　そして、評価区間をｌ（ｌはＬの小文字）からＴ回目までとした観察における評価関数の総和Ｊバー（ｌ）を、下記（２２）式によって定義する。

　ここで、ｌは、ｌ∈{１，２，・・・,Ｔ－１}の範囲である。

　数学的帰納法を用いると、ｌ＝ｍにおけるＪバー（ｍ）は下記(２３)式となる。

　（２３）式に最適性の原理を適用すると、最適制御量ｕ^＊（ｋ）が下記（２４）式によって与えられる。

　さらに、（２４）式の最適制御量ｕ^＊（ｋ）を（１７）式を用いて書き直すと、最適制御量ｕ^＊（ｋ）は下記（２５）式によって与えられる。

　最適制御量ｕ^＊（ｋ）は、細胞数の観測値ｙ（ｋ）をフィードバックしたものであることを示している。

（画像処理）
　最適制御量を得るために必要な細胞数等の計測のための画像処理について説明する。
　細胞２の運動モデルの同定として必要なのは、顕微鏡装置１の光軸方向への細胞２の移動速度の集団平均ｖ_０と、細胞位置の分散の時間変化Ｗ_iである。なお、被観察物２が静止物の場合は、移動速度の集団平均ｖ_０及び位置の分散の時間変化Ｗ_iを０として扱うことができる。

　細胞数を計測していくと、細胞２が焦点からずれた位置に存在するときにも数える場合がある。この場合、実際に細胞２が存在しない位置に、細胞２が存在すると計測していることになるので測定誤差となる。よって、細胞位置を推定する手法が必要不可欠であり、ベッケ線法等を応用することができる。

　細胞２の位置が焦点距離よりも対物レンズ６側に近いとき、細胞２の内側に明るい縞が生じ、外側に黒い縞が生じる。細胞２の位置が焦点距離よりも対物レンズ６側から遠いとき、細胞２の外側に明るい縞が生じ、内側に黒い縞が生じる。これらはベッケ線と呼ばれている。これは、細胞２を観察すると、焦点面を境に光の回折が大きく変化することによる。このベッケ線を画像処理に応用することにより、細胞２の顕微鏡装置１の光軸方向位置を推定することができる（非特許文献２参照）。

　上記の画像処理方法によれば、ベッケ法を用いて細胞位置を推定するので、細胞２が焦点からずれた位置に存在するときの、細胞数測定誤差を小さくすることができる。

　透過光画像処理は、以下の手順によって行うことができる。
(i)細胞２が浮遊する試験溶液の観察領域を顕微鏡装置１の光軸方向とし、被観察物２を画像情報検出部１６に設けたカメラ等で撮像する。これを観察画像１とする。この場合、観察画像１は、明視野像である。
(ii)(i)の観察画像よりも所定の距離だけ対物レンズ６に近い画像を撮影する。これを観察画像２とする。所定の距離としては、例えば１μｍのオーダーとすることができる。
(iii)観察画像１と観察画像２との差分をとる。
(iv)画像上の差分値の二値化を行う。
(v)半径が所定の大きさの画素の円形マスクを使用して膨張処理を行い、同一細胞２の離れた画素を一つに纏める。
(vi) (v)の上記画素の円形マスクを使用して縮小処理し、細胞２以外の小さなノイズを除去する。
(vii)八近傍の画素を連結させてラベリングし、細胞数を計測する。
(viii)ラベリングした細胞２の大きさによってフィルタリングする。つまり、大きすぎれば二つと数え、手順(v)で別の細胞２を同一細胞２とみなした場合に対処する。小さすぎればノイズとみなし、細胞２以外の存在を消しきれなかった場合に対処する。

　上記の画像処理は、顕微鏡装置１の画像情報検出部１６と制御部２０とステージ３を用いて、以下の（1）～（7）の手順によって行うことができる。
(1)パーソナルコンピュータ２１が指示を出す。
(2)パーソナルコンピュータ２１から指示を受けたＤ／Ａボードが電圧を出力する。
(3)ステージ３を動かす。
(4)対物レンズ６を通して得た画像をカメラで取り込む。
(5)取り込んだ画像を、パーソナルコンピュータ２１に送る。
(6)パーソナルコンピュータ２１が画像処理を行う。
(7)画像処理した情報をもとに、パーソナルコンピュータ２１がＤ／Ａボードに指示を出す。

　画像処理によって各画像の細胞数を計測し、この細胞数が、観察領域の各観察点の細胞数となる。これより、観察領域内の細胞分布が求められる。各観察点の細胞数を用いて、ｚバー（ｋ）を計算し、時間変化に対するｚバー（ｋ）の変化量を細胞の移動速度の集団平均ｖ_０として求めることができる。

　さらに、細胞位置の分散の時間変化Ｗ_iも求めることができる。

　次に、上記蛍光観察の最適制御則と、最適制御則の適用に必要な細胞数等の計測のための画像処理と、を組み合わせた蛍光観察について説明する。
　図３は、本発明の第１実施形態に係る顕微鏡装置１を用いた蛍光観察手順を示すフロー図の一例である。
　先ず、ステップＳＴ１において、被観察物２を所定の間隔として、ｄ（μｍ）間隔（以下、ｄ間隔と呼ぶ）で、観察領域内の明視野観察を行う。被観察物２は、例えば免疫細胞の一種であるＴ細胞である。

　ステップＳＴ２において、観察領域内の被観察物２の平均位置と分散を算出する。
　ステップＳＴ３では、観察したい被観察物２の数に応じて蛍光観察領域を決定する。
　ステップＳＴ４において、ｄ間隔で、蛍光観察領域の蛍光観察と明視野観察を行う。透過光画像の情報を増すために、蛍光観察と比べて明視野観察の観察間隔を狭めたり、観察領域を広げてもよい。
　ステップＳＴ５において、所定の時間、例えば２０秒待機する。制御に用いる透過光の画像情報を増すために、蛍光観察と比べて明視野観察の待機時間を短くしてもよい。

　次に、ステップＳＴ６において、最適制御則に従って蛍光観察領域を決定する。
　ステップＳＴ７において、被観察物２の運動モデルに従って蛍光観察領域の中心位置を決定する。

　次に、ステップＳＴ８において、ｄ間隔で、蛍光観察領域の蛍光観察と明視野観察を行う。ｄ間隔は、例えば３００μｍとすることができる。透過光画像の情報を増すために、蛍光観察と比べて明視野観察の観察間隔を狭めたり、観察領域を広げてもよい。

　ステップＳＴ９において、蛍光観察を終了するか否かを判定する。そして、ステップＳＴ９において、蛍光観察が所定回数、例えばＴ回繰り返していないと判定した場合には、再びステップＳＴ５からステップＳＴ８の蛍光観察を行う。

　ステップＳＴ９において、ステップＳＴ５からステップＳＴ８までの被観察物２の測定がＴ回行われたと判定したとき、蛍光観察を終了する。このようにして、被観察物２の蛍光観察を、最適制御則に従って行うことができる。

　最初のｋ＝０回目の試行では、例えば観察領域内をｄ間隔で全観察領域を観察する。ｋ＝１回目以降の試行以降は、蛍光観察領域幅２ｘ（ｋ）を観察する。ｘ（ｋ）は最適制御量Ｕ^＊（ｋ）によって決定する。

　ここで、蛍光観察領域の中心zバー（ｋ）は、上記(i)～(viii) の透過光画像処理手順で求めた細胞２の運動モデルパラメータｖ_０を利用して更新する。中心zバー（ｋ）、幅ｘ（ｋ）で、所定ビット、例えば８ビットグレースケールの明視野観察像を、画像情報検出部１６に設けたカメラで撮像し、このグレースケール画像を画像処理し、ｋ＋１回目の試行のｘ（ｋ＋１）を決定する。同時に，蛍光画像情報検出部１７に設けた蛍光観察用カメラで蛍光観察像を撮像する。

　顕微鏡装置１によれば、従来、蛍光観察前に観察者が手動で行っていた蛍光観察のパラメータを自動化することができる。このため観察者の負担を軽減することができる。

　制御部２０によって、さらに、蛍光観察の制御や蛍光画像の記録を行うことができる。図１に示すように、制御部２０はさらに、励起用光源５を制御するための第２光源制御部としての励起用光源制御部２３を備えて構成されてもよい。励起用光源制御部２３は、被観察物２の透過光Ｔによる画像データに基づいて、励起光５Ａにおける点滅や点灯時間を制御する機能を有している。また、励起光５Ａの波長及び強度を選択して照射する機能を備えていてもよい。

　蛍光画像の記録や画像処理を行うために、蛍光画像情報検出部１７からの検知出力が制御部２０に入力される。

　さらに、顕微鏡装置１によれば、透過光画像から得られる被観察物２の情報は、被観察物２からの蛍光Ｆに比較して光量が多く、かつ、高速に記録されている。したがって、蛍光Ｆと同時に取得した透過光画像を、蛍光画像の解析処理に用いることで解析結果の時空間精度が向上する。

　顕微鏡装置１では、透過光画像から得られる位置などの細胞情報と連動させて、蛍光画像情報検出部１７の蛍光画像を記録することができる。つまり、蛍光Ｆが照射されている時間だけ蛍光画像を記録すればよい。したがって、被観察物２が顕微鏡装置１の視野に入っていない時間の蛍光画像記録が不要となる。このため、蛍光画像記録のための演算時間や記憶装置の容量を減らすことができ、パーソナルコンピュータ２１を有効利用することができる。無駄な蛍光画像を記録する必要がなくなるので、蛍光画像の解析時間も大幅に短縮することができる。
　なお、本発明において、透過光画像を用いた蛍光観察の制御は、スケジューリング問題と一般化できる。このため、蛍光観察の制御には、上記した最適制御則以外に、ＰＩＤ制御等の古典制御、準最適制御等の現代制御、Ｈ∞制御，サンプル値制御，有限時間整定制御，適応制御等のポスト現代制御論、ニューラルネットワーク制御，ファジィ制御，遺伝的アルゴリズム制御等の知的制御を用いてもよい。

　さらに、顕微鏡装置１の構成は、以下に示す種々の実施形態とすることができる。
（第２実施形態）
　図４は、第２実施形態に係る顕微鏡装置３０の構成を示す模式図である。
　顕微鏡装置３０が顕微鏡装置１と異なるのは、対物レンズ６を透過光Ｔの光軸、即ちＺ軸方向に移動できるように対物レンズ用駆動部３２を設けた点にある。対物レンズ用駆動部３２は、制御部２０によって制御される。対物レンズ用駆動部３２は、ピエゾ素子のような駆動部品を用いて構成することができる。他の構成は顕微鏡装置１と同じであるので説明は省略する。

（第３実施形態）
　図５は、第３実施形態に係る顕微鏡装置３５の構成を示す模式図である。
　顕微鏡装置３５が顕微鏡装置１と異なるのは、画像情報検出部１６側の結像レンズ７を光軸方向（Ｚ軸方向）に移動できるように透過光用の結像レンズ用駆動部３７を設けた点にある。結像レンズ用駆動部３７は、制御部２０によって制御される。結像レンズ用駆動部３７は、ピエゾ素子のような駆動部品を用いて構成することができる。他の構成は顕微鏡装置１と同じであるので、説明は省略する。

（第４実施形態）
　図６は、第４実施形態に係る顕微鏡装置４０の構成を示す模式図である。
　顕微鏡装置４０が顕微鏡装置１と異なるのは、蛍光画像情報検出部１７の前に蛍光波長選択部２５を設けた点にある。蛍光波長選択部２５は、二つの蛍光波長を分離して検出できる構成を有している。蛍光波長選択部２５は、第３のダイクロイックミラー２６とミラー２７とプリズム２８とから構成されている。さらに、レンズ２９を設けてもよい。この構成によれば、２波長の蛍光Ｆを分離して検知することができる。蛍光波長選択部２５は、鏡筒部１５又は蛍光画像情報検出部１７に配置することができる。他の構成は顕微鏡装置１と同じであるので、説明は省略する。

　蛍光波長選択部２５は、２波長の蛍光Ｆの分離を行う態様を示しているが、分光器を用いることで多波長の蛍光Ｆを検知してもよい。つまり、蛍光波長選択部２５は、少なくとも１波長以上の蛍光Ｆを分離するプリズムや分光器等の部品からなる波長選択手段を備えて構成することができる。

　顕微鏡装置４０によれば、励起光５Ａの種類や強度の制御が可能になる。つまり、複数の蛍光色素に対して、観測時間の自動割り振りなどが可能になる。一般に、細胞２は、その運動状態や外部からの刺激により、活性化または不活性化する細胞２内のイオンや分子が異なることが知られている。このため、透過光画像から得られる被観察物２の運動情報や細胞２の形状及び刺激の種類や強度等と連動させて、被観察物２へ励起する励起光５Ａの波長や強度の選択制御が可能となる。これにより、透過光画像から得られる被観察物２の情報に連動させて、被観察物２からの蛍光情報を効率よく取得することができる。
　なお、複数種類の細胞２を同時に観察するときには、透過光画像に含まれる各細胞２の面積，形状，色の濃度，色調，テクスチャ等を用いて、細胞２の種類を画像処理で自動判別することも可能である（非特許文献７参照）。

（第５実施形態）
　図７は、第５実施形態の顕微鏡装置４５の構成を示す模式図である。
　顕微鏡装置４５が顕微鏡装置１と異なるのは、蛍光画像情報検出部１７の光軸方向に挿入された結像レンズ１２を光軸方向に移動させるように、結像レンズ用駆動部５２を設けている点にある。他の構成は顕微鏡装置１と同じであるので、説明は省略する。

　顕微鏡装置４５によれば、結像レンズ１２を、結像レンズ用駆動部５２によって駆動することによって被観察物２の焦点位置を変えることができる。結像レンズ１２の駆動は、透過光Ｔを検出する画像情報検出部１６に対して独立して行うことができる。これにより、被観察物２からの蛍光Ｆの光軸方向の観察を行うことができる。

（第６実施形態）
　図８は、第６実施形態に係る顕微鏡装置５０の構成を示す模式図である。
　顕微鏡装置５０が顕微鏡装置１と異なるのは、光学系１０中に、さらに２つのピンホール５３，５４を設けて共焦点光学系で構成した点にある。第１のピンホール５３は、励起用光源５とフィルタ９との間の光軸上に配設されている。第１のピンホール５３とフィルタ９の配置順は入れ替えてもよい。第２のピンホール５４は、蛍光画像情報検出部１７と結像レンズ１２との間の蛍光Ｆの光軸上に配設されている。第２のピンホール５４と結像レンズ１２との配置順は入れ替えてもよい。他の構成は顕微鏡装置１と同じであるので、説明は省略する。

　顕微鏡装置５０によれば、蛍光Ｆを観察する光学系が共焦点光学系で構成されている。第１のピンホール５３を設けることによって、励起用光源５の照射位置を制御することができる。第２のピンホール５４を設けることによって、焦点以外からの光が蛍光画像情報検出部１７へ入射しなくなる。このため、明瞭な蛍光像が得られる。さらに、被観察物２を載置するステージ３の制御がＸＹステージで行う構成の場合には、ＸＹステージ３の移動に応じて被観察物２の走査が行われる。

（第７実施形態）
　図９は、第７実施形態の顕微鏡装置５５の構成を示す模式図である。
　顕微鏡装置５５が顕微鏡装置５０と異なるのは、さらに、第２のピンホール５４を蛍光Ｆの光軸方向に移動及び／又は回転させるように第２のピンホール５４を駆動するピンホール駆動部５６を設けている点にある。他の構成は顕微鏡装置１と同じであるので、説明は省略する。

　顕微鏡装置５５では、蛍光の光軸方向に挿入された第２のピンホール５４を、ピンホール駆動部５６によって駆動することによって被観察物２から蛍光Ｆの焦点及び観察位置を変えることができる。第２のピンホール５４の駆動は、透過光Ｔを検出する画像情報検出部１６に対して独立して行うことができる。また、第２のピンホール５４は、複数の穴から構成されていてもよい。

　さらに、第１のピンホール５３を駆動するピンホール駆動部５８を設けてもよい。第１のピンホール５３を光軸上で移動及び／又は回転させることで、励起用光源５の照射位置を制御することもできる。また、第１のピンホール５３は、複数の穴から構成されていてもよい。

（第８実施形態）
　図１０は、第８実施形態の顕微鏡装置６０の構成を示す模式図である。
　顕微鏡装置６０が顕微鏡装置１と異なるのは、被観察物２の下方から透過光Ｔが照射される、所謂正立型の光学系１０Ａを有している点である。他の構成は顕微鏡装置１と同じであるので、説明は省略する。

　顕微鏡装置６０の光学系１０Ａは、第２～第７の実施形態に係る顕微鏡装置３０，３５，４０，４５，５５の光学系１０の何れか又はこれらを組み合わせた構成とすることができる。例を挙げると、顕微鏡装置６０において、顕微鏡装置３０のように対物レンズ６を光軸方向（Ｚ軸方向）に移動できるように対物レンズ用駆動部３２を設けてもよい。

　さらに、顕微鏡装置６０において、顕微鏡装置３５のように画像情報検出部側１６の結像レンズ７を光軸（Ｚ軸方向）に移動できるように結像レンズ用駆動部３７を設けてもよい。

　顕微鏡装置３０，３５，４０，４５，５０，５５，６０の何れにおいても、顕微鏡装置１と同様に透過光画像及び蛍光画像の観察を行うことができる。

（被観察物の環境制御）
　被観察物２の環境制御について説明する。
　図１１は環境制御部６０の構成を示す模式図であり、（Ａ）は平面図、（Ｂ）は（Ａ）のＸ－Ｘに沿った断面図である。環境制御部６０は、本体部６２と、本体部６２の下部に配置され被観察物２を収容する収容部６４と、を含んで構成されている。
　本体部６２は、樹脂板６５をスライドガラス６６と樹脂フィルム６７とで挟んで構成され、具体的には本体部６２は、収容部６４に対応する開口６５Ａを有している長方形の樹脂板６５と、樹脂板６５の上部に配設され樹脂板６５を覆うスライドガラス６６と、樹脂板６５の下部に配設され樹脂板６５を覆う樹脂フィルム６７と、を備えている。さらに、本体部６２には、樹脂板６５の開口部６５Ａに接続するガス配管６８が設けられている。ガス配管６８の入力側６８Ａから出力側６８Ｂへ雰囲気ガス６９が導入される。雰囲気ガス６９としては、窒素ガス（単体）、酸素ガス（単体）、二酸化炭素（単体）、空気（混合物）、およびそれらの混合ガス等を挙げることができる。
　ここで、樹脂板６５は、例えばアクリル樹脂を用いることができる。樹脂フィルム６７は、マイラーからなるフィルム等を用いることができる。さらに、樹脂板６５、スライドガラス６６及び樹脂フィルム６７を保持する保持手段７０を備えていてもよい。

　収容部６４は皿状の容器構造を有しており、容器最上部の外周部が樹脂フィルム６７に当接されている。収容部６４における底部の開口にはカバーガラス７１が配設されている。樹脂フィルム６７において収容部６４と対向する下面には、カバーガラス７２が設けられている。雰囲気ガス６９は、樹脂フィルム６７に設けられている細孔６７Ａを介して収容部６４へ導入される。収容部６４は、図示しない被観察物２と被観察物用の培養液７４で満たされる。これにより、収容部６４内の被観察物２と被観察物用の培養液７４は、雰囲気ガス６９に曝されるようになる。

　環境制御部６０を顕微鏡装置１のステージ３に載置することで、被観察物２を培養液７４に保持した状態で観察することができる。さらに、顕微鏡装置１を恒温槽内に収容すれば、培養液７４の温度を一定とすることができる。これにより、被観察物２を培養液７４に保持し、温度と雰囲気ガス６９を一定の状態として、被観察物２の透過光Ｔや蛍光Ｆを観察することができる。

　環境制御部６０は、複数の被観察物２を観察することができるように構成されてもよい。具体的には、図１１に示した環境制御部６０を複数配設した構造としてもよい。
　図１２は複数の被観察物２の観察ができる環境制御部８０の構成を示す模式図で、（Ａ）は平面図、（Ｂ）は（Ａ）のＸ－Ｘに沿った断面図である。
　環境制御部８０が環境制御部６０と異なるのは、収容部８４が一体ではなく、格子状の障壁部８５によって複数の収容区画８６を有するように仕切られている点である。各収容区画８６には培養液７４が注入されている。他の構成は環境制御部６０と同じであるので、説明は省略する。

　環境制御部８０によれば、複数の収容区画８６のそれぞれに被観察物２を収容することができるので、複数の被観察物２からの透過光Ｔや蛍光Ｆを、温度と雰囲気ガス６９を一定の状態にして観察することができる。複数の収容区画８６に注入する培養液７４の種類を異なるようにし、被観察物２となる細胞の種類は同じものとしてもよい。これらの場合には、培養液７４の条件を変えたときの各細胞２からの透過光Ｔや蛍光Ｆを、温度と雰囲気ガス６９を一定の状態にして連続的に観察することができる。逆に、複数の収容区画８６に注入する培養液７４の種類を同じとして、被観察物２となる細胞の種類は異なるものとしてもよい。

　さらに、環境制御部６０，８０を備えた顕微鏡装置１による蛍光観察では、透過光画像から得られる被観察物２の情報に連動させて、被観察物２からの蛍光情報を効率よく取得することができる。このため、被観察物２へ蛍光Ｆを発生させるための励起光５Ａの照射時間を短くすることができる。従って、被観察物２が細胞等の生体試料である場合には、従来の蛍光観察に比較して、より長時間透過光Ｔや蛍光Ｆを観察することができる。

　さらに、環境制御部６０，８０は、被観察物２を刺激するための刺激手段を備えていてもよい。このような刺激手段としては、電気的刺激，磁気的刺激，力学的刺激，超音波刺激，温度的刺激，化学的刺激，光刺激等が挙げられる。

　以下、本発明を実施例により詳細に説明する。
　図４に示す顕微鏡装置３０を製作した。光学系１０としては、倒立顕微鏡（オリンパス株式会社製、ＩＸ７１）を使用し、照明用光源４及び励起用光源５は、それぞれ、ハロゲンランプとキセノンランプを使用した。対物レンズ６（オリンパス株式会社製、ＵＡｐｏ４０×３／３４０）は４０倍のものを用いた。

　明視野観察像をパーソナルコンピュータ２１に取り込む画像情報検出部１６には、カメラ（POINTGREY製、Dragofly Express）を用いた。このカメラは、１００ｆｐｓ（フレーム／秒)で８ビットのグレースケール画像を取得することができる。画素サイズは、６４０×４８０である。

　対物レンズ６の位置を顕微鏡装置３０の光軸方向に制御する対物レンズ用駆動部３２として、ピエゾステージ（Physik Instrument 製、Ｐ－７２３）を用いた。このピエゾステージ３２の最大稼動距離は３５０μｍである。電圧入力により、ピエゾステージ３２は動く。ピエゾステージ３２への電圧入力には、Ｄ／Ａ変換ボード（Interface製Ｄ／Ａボード、ＰＣＩ－３３４６Ａ）を使用した。

　制御部２０は、リアルタイム基本ソフトウェアとして、ＲＴ－Ｌｉｎｕｘを搭載したパーソナルコンピュータ２１を用いた。

　蛍光画像情報検出部１７の検知器は、冷却ＣＣＤカメラ（Q-Imaging社製、Retiga 2000Ｒ、１６００×１２００画素）を用いた。冷却温度は、周囲温度よりも２５℃低い温度とした。蛍光Ｆは、光学系１０のデュアルポート内のダイクロイックミラー１９（Semrock 製のダイクロイックミラー、FF01-520/35-25）によって透過光Ｔと分離した。蛍光Ｆの励起光５Ａ、蛍光Ｆ及び追跡用の透過光Ｔが干渉しないよう、それぞれの波長帯が異なるようにフィルタを選んだ。冷却ＣＣＤカメラは、４×４画素を一まとめにするビニング処理を行い、取得画素数を４００×３００画素とした。露光時間は３３ｍｓとした。

　前述のように図３に示すフロー図に従って、免疫細胞の一種であるＴ細胞２の観察を行った。ｄ間隔を１．５μｍとした。観察したい細胞数に応じて、蛍光観察領域幅ｘ（０）を決定した。そして、蛍光観察領域内を、１．５μｍ間隔で蛍光観察と明視野観察を同時に行った。以降は、２０秒間待機の後、最適制御則に従って蛍光観察領域を決定し、細胞２の運動モデルに従って蛍光観察領域の中心を求めた。そして、蛍光観察領域を１．５μｍ間隔で蛍光観察と明視野観察を同時に行う、という作業を６０回（Ｔ＝６０）繰り返した。

　図１３は、観察開始直後の細胞分布の一例を示す図である。図１３の横軸はピエゾステージ３２の位置（μｍ）であり、縦軸は細胞数（個）である。

　図１４は、蛍光観察手順において、制御量Ｕ（ｋ）を用いた実施例の評価関数Ｊと、蛍光観察領域幅を固定した場合の比較例の評価関数Ｊと、を示す模式図である。図１４の横軸は固定した場合の蛍光観察領域の幅（μｍ）を示し、縦軸は評価関数Ｊの値を示す。本発明の制御量を用いた場合の蛍光領域の幅は、動的に変えている。
　図１４から明らかなように、制御量Ｕ（ｋ）を用いた実施例の評価関数Ｊと蛍光観察領域幅を固定した比較例の評価関数Ｊを比較すると、本発明の制御量を用いた実施例の評価関数Ｊの値が常に比較例のＪの値よりも小さくなっており、最適化されていることが分かる。

　本発明は、上記実施の形態に限定されることなく、請求の範囲に記載した発明の範囲内で種々の変形が可能であり、それらも本発明の範囲内に含まれることはいうまでもない。上述した実施形態においては、第１及び第２の検出光学系１６，１７に撮像素子を用いたが、撮像素子位置で目視の観察や写真撮影なども行うことができるように、検出光学系は必要に応じて複数の検出光学系とすることも可能である。また、蛍光Ｆを検知する検出光学系１７の構成などは、被観察物２に応じて最適な設計や使用部品を選定できることは勿論である。
　蛍光観察領域の中心は、被観察物の画像情報に基づいて、或いは当該画像情報と被観察物の運動モデルとに基づいて、求めても良い。
　ステージの制御は、被観察物の運動モデルに基づいて、或いは当該運動モデルと上記画像情報とに基づいて行っても良い。
　結像レンズ７、結像レンズ１２の倍率を調整すること、例えば倍率を低くすることで、画像情報検出部１６，蛍光画像情報検出部１７で取得する画像中の被観察物の大きさを小さくすることができる。これによって、観察視野が広がり、より多数の被観察物を同時に観察することができる。そして、被観察物を表す画素数が少なくなり、制御部２０における細胞一つ当たりの画像処理時間を一層短縮することもできる。

　１，３０，３５，４０，４５，５０，５５，６０：顕微鏡装置
　２：被観察物
　３：ＸＹまたはＸＹＺステージ
　４：照明用光源
　５：励起用光源
５Ａ：励起光
　６：対物レンズ
　７：結像レンズ（透過光用）
８，９：フィルタ
１０，１０Ａ：光学系
１２：結像レンズ（蛍光用）
１５：鏡筒部
１６：画像情報検出部
１７：蛍光画像情報検出部
１８，１９：第１及び第２のビームスプリッター（ダイクロイックミラー）
２０：制御部
２１：パーソナルコンピュータ
２２：ディスプレー装置
２３：励起用光源制御部
２５：蛍光波長選択部
２６：第３のダイクロイックミラー
２７：ミラー
２８：プリズム
２９：レンズ
３２：対物レンズ用駆動部
３７：透過光の結像レンズ用駆動部
５２：蛍光用結像レンズ用駆動部
５３：第１のピンホール
５４：第２のピンホール
５６，５８：ピンホール駆動部
６０，８０：環境制御部
６２：本体部
６４，８４：収容部
６５：樹脂板
６６：スライドガラス
６７：樹脂フィルム
６７Ａ：細孔
６８：ガス配管
６８Ａ：入力側
６８Ｂ：出力側
６９：雰囲気ガス
７０：保持手段
７１，７２：カバーガラス
７４：培養液
８５：障壁部
８６：収容区画
　Ｆ：蛍光
　Ｔ：透過光

Claims (22)

1. 　被観察物を載置するステージと、
   　上記被観察物に照明光を照射する第１の光源と、
   　上記被観察物に蛍光を励起するための励起光を照射する第２の光源と、
   　上記被観察物で生じた光による画像情報を検出する画像情報検出部と、
   　上記被観察物で生じた蛍光による蛍光画像情報を検出する蛍光画像情報検出部と、
   　上記被観察物の運動モデルと上記画像情報検出部から入力された上記被観察物の画像情報とに基づいて上記被観察物の蛍光観察領域を決定し、上記画像情報検出部から入力された上記被観察物の画像情報と上記蛍光画像情報検出部から入力された蛍光画像情報とを上記蛍光観察領域内の所定の間隔毎に取得する制御部と、
   を備えたことを特徴とする、顕微鏡装置。
2. 　前記制御部は、前記蛍光観察領域を最適制御，準最適制御等の現代制御に従って決定することを特徴とする、請求項１に記載の顕微鏡装置。
3. 　前記制御部は、前記被観察物の運動モデルと前記被観察物の画像情報との少なくも一方に従って前記蛍光観察領域の中心位置を決定することを特徴とする、請求項１に記載の顕微鏡装置。
4. 前記制御部は、前記被観察物の運動モデルと前記被観察物の画像情報との少なくとも一方により、上記被観察物を追尾するように上記ステージを制御すると共に、上記被観察物の蛍光情報の取得を制御することを特徴とする、請求項１に記載の顕微鏡装置。
5. 前記制御部は、前記画像情報による比例，積分，微分の何れか又はこれらの組み合わせによるＰＩＤ制御等の古典制御により前記ステージを制御することを特徴とする、請求項１に記載の顕微鏡装置。
6. 　前記制御部は、前記第１の光源を制御するための第１光源制御部と前記第２の光源を制御するための第２光源制御部とを備えていることを特徴とする、請求項１に記載の顕微鏡装置。
7. 　前記ステージは、前記被観察物の位置を移動させる二次元または三次元ステージであることを特徴とする、請求項１に記載の顕微鏡装置。
8. 　前記蛍光画像情報検出部は、少なくとも１波長以上の蛍光を分離する波長選択手段を備えたことを特徴とする、請求項１に記載の顕微鏡装置。
9. 　前記第２の光源と前記被観察物との間に配設される第１のピンホールと、前記蛍光と前記蛍光画像情報検出部との間に配設される第２のピンホールと、を備えたことを特徴とする、請求項１に記載の顕微鏡装置。
10. 　前記第１のピンホール又は前記第２のピンホールを移動及び／又は回転させるピンホール駆動部を、備えたことを特徴とする、請求項９に記載の顕微鏡装置。
11. 　前記第１の光源と前記被観察物との間に配設される対物レンズと、該対物レンズの駆動部と、を備えたことを特徴とする、請求項１に記載の顕微鏡装置。
12. 　前記被観察物で生じた光と前記画像情報検出部との間に配設される結像レンズと、該結像レンズの駆動部と、を備えたことを特徴とする、請求項１に記載の顕微鏡装置。
13. 　前記蛍光と前記蛍光画像情報検出部との間に配設される結像レンズと、該結像レンズの駆動部と、を備えたことを特徴とする、請求項１に記載の顕微鏡装置。
14. 　前記被観察物を収容しかつ雰囲気ガスで満たされる環境制御部を備えたことを特徴とする、請求項１３記載の顕微鏡装置。
15. 　前記環境制御部は、複数の前記被観察物を収容することができる収容部を備えたことを特徴とする、請求項１４に記載の顕微鏡装置。
16. 　前記被観察物を刺激する被観察物刺激手段を備えたことを特徴とする、請求項１に記載の顕微鏡装置。
17. 　被観察物の画像情報と該被観察物の蛍光画像情報とを取得する蛍光観察方法であって、
    　上記被観察物の画像情報と上記被観察物の運動モデルとに基づいて上記被観察物の蛍光観察領域を決定する第１段階と、
    　上記蛍光観察領域内の所定の位置で上記蛍光画像情報を取得する第２段階と、
    を備えたことを特徴とする、被観察物の蛍光観察方法。
18. 　前記第１段階の蛍光観察領域を、ＰＩＤ制御等の古典制御、最適制御，準最適制御等の現代制御に従って決定することを特徴とする、請求項１７に記載の被観察物の蛍光観察方法。
19. 　前記第１段階と前記第２段階との間において、前記被観察物の画像情報と前記被観察物の運動モデルとの少なくとも一方に基づいて前記蛍光観察領域の中心位置を決定することを特徴とする、請求項１７に記載の被観察物の蛍光観察方法。
20. 　前記第２段階において、前記被観察物の画像情報を取得することを特徴とする、請求項１７に記載の被観察物の蛍光観察方法。
21. 　前記各段階を、前記蛍光観察領域内の所定の位置毎に所定の回数繰り返し行うことを特徴とする、請求項１７～２０の何れかに記載の被観察物の蛍光観察方法。
22. 　前記運動モデルのパラメータは、前記被観察物の位置，速度，分布，種類，形状，イオン濃度，分子濃度の何れか又はこれらの組み合わせからなることを特徴とする、請求項１７に記載の被観察物の蛍光観察方法。

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