JP4773348B2 - 高感度かつ迅速なバイオ検出法 - Google Patents
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Description
図1は、ターゲット114に対して親和性を有するプローブ116を利用したバイオ検出系100の略線図である。プローブ116は、プローブリンカー118により、固体基板120へ貼付けられている。プローブリンカー118は、一般に、基板120へのターゲット分子の偶発性の結合を低減するためにさらに役立つコーティングを含む。ターゲット114は、ターゲットリンカー112を介してタグ119へ連結され、これが検出器(示されず)により検出されることが可能である。
本発明のいくつかの態様は、ターゲット114に対する電気泳動力の適用を含んでおり、かかる力に関与する電極は、プローブ116が貼付けられている場所と必ずしも一致しない。電気泳動力の適用は、多数の態様によることが可能であり、そのうちの二つが議論を目的として提示される:第一には、電極はプローブ位置116の下には全くなく、また電気泳動力は主として基板120の表面に平行であり、第二には、単一の電極が複数のプローブ116位置の下にある。プローブ位置、および電気泳動力を生じる電極の構造的な配置が、本発明による使用のために最適化された種々の成分とともに最初に考慮され、その後に、種々の成分の提携した操作が記述されることに注目するべきである。また、電気泳動よりもむしろ誘電泳動が、大きくかつ静電分極可能なターゲット(またはターゲットに付着されたタグ)を移動するために使用可能であることも注目されるべきである。これらの方法は一般に、一様でない電気的または電気泳動的フィールドを作成するよう、2または3次元のいずれかに形づくられた電極の使用を必要とする。これらの誘電泳動用電極は、マルクス(G. H. Markx)およびペシグ(R. Pethig)著、「Dielectrophoretic Separation of Cells : Continuous Separation(細胞の誘電泳動:連続分離)」、Biotechnol. Bioeng.、1995年、第45巻、p.337−343、および、マルクス(G. H. Markx)、フアング(Y. Huang)、ゾウ(X.-F. Zhou)、およびペシグ(R. Pethig)著、「Dielecrophoretic characterization and separation of micro-organisms(微生物の誘電泳動的特徴づけおよび分離)」、Microbiology、1994年、第140巻、p.585−591、に提示されている。
図4Aは、バイオ検出用セルの斜視図であって、単一のプローブ電極200は、アレイ180内に配置されている多数のプローブ位置170の下にある。セルの壁は線図中には配置されておらず、また一般にはガスケット材を含んでなることができ、水密封シールを形成する。基準電極190は、好ましくはプローブ電極200の上に物理的に配置され、プローブ電極200とほぼ同じサイズのものであって、二つの電極の間の電場が実質的に均一であるようにする。しかしながら、基準電極200について、同様の、またはさらになお小さい均一性を可能にする様々な形状および位置を有することもまた、本発明の精神の範囲内にある。一般に、電極はほぼ互いに平行であり、生じる電気泳動フィールドがプローブ電極200の表面に対してほぼ垂直になるようにし、プローブ位置170上にターゲットの沈着さえも生じるようにする。
別の配置は、バイオ検出セルの斜視図、図4Bに示されており、これにおいて電極はプローブ位置170の下にない。この場合、プローブ116はアレイ180内に配置されたプローブ位置170内に配置される。第1の電極210および第2の電極220は、アレイ180に対して横方向にあり、この図でP、Q、およびRと表示された部分基準電極195のアレイの下に位置する。部分基準電極195の数およびタイプは異なることが可能であり、第1の電極210、第2の電極220、および部分基準電極195を置くことの目的は、電極の相対的な電圧を調整することにより、電場の強さおよびトポロジーを管理することである。たとえば、第2の電極220および部分基準電極195P、Q、およびRを負のバイアスに、第1の電極210を相対的に正のバイアスに配置することは、アレイ180の表面にわたり、ほとんど水平の電場を生じることができる。多数の部分基準電極195の必要性は、大きい電極にわたる電場を維持することを困難にする、大きい連続電極に伴って生じることがある電場の「短絡(shorting)」に起因するものである。
ほとんどの生体分子は関連した静電荷を有しており、それは該分子がその中に維持されている溶液のpHによって調節されることが可能である。核酸については、電荷は一般に負であってリン酸骨格によって決定され、かつ、それに加えて直接的に核酸の長さに関連している。本発明の目的のためには、ターゲット114分子のサイズが異なる可能性があることから、このことは一定の不利益を有する。異なる遺伝子に関連したRNA分子が測定される適用を考慮されたい。かかる場合には、各遺伝子に関連したRNAの長さは、遺伝子の長さによって変わるであろう。さらに、高等生物からのRNAはポリアデニル化されており、「ポリA」テールの長さはRNAごとに異なっている。このことは、異なるRNAの全てにわたって、あるいは同じ遺伝子に関連したRNAにわたってでさえも、比較的一定の力を与えることが難しいことを意味している。
上記のアッセイフォーマットは、主としてサンドイッチアッセイフォーマットに関する。しかしながら、ホルモンまたは物質乱用の薬物のような非常に小さいターゲット114の場合には、プローブ116とタグ結合成分272の双方の、同時の高親和性の結合を可能にする試薬を見つけるための結合は困難である。かかる二つの結合試薬がなければ、サンドイッチアッセイを実施することには困難が伴う。
上記のように、プローブ116はリンカー118を介して基板120へ付着される。このリンカー118は、官能基によるコーティングを便利に含んでなり、該官能基がプローブ116の結合を可能にする。また、コーティングは好ましくは低い非特異結合性をもち、プローブ116に特異的ではない溶液中のターゲット114または指標290が、表面に結合しないようにする。かかるコーティング物質の実例は、アマシャム(Amersham)によるコードリンク(Codelink)および、アクセルr8(Accelr8)によるオプティケム(OptiChem)を含み、それらは、ヒドロゲル様のコーティングを、非常に低い非特異バックグラウンド、ならびに電気的特性の双方とともに含んでなる。別法として、コーティングは誘導体化されたシランを含んでなることが可能である。
本発明による競合系を成している他の多くの成分があり、ターゲット114上に電気泳動力を引き起こしかつ調節することができる、電極間の電位差を確立するためのパワーコントローラ、指標290を照明するための照明装置、指標290の照明により発生されるシグナルを検出するための検出器、および、検出器からの情報を記憶し、次いでそれを使用者に提示するか、または多数の供給源または時間からの情報を比較する、記憶コントローラ(たとえば、コントローラおよびハードディスクドライブ)を含む。これらの成分のいくつかは、この技術において周知であり、電気泳動用パワーサプライ(コンピュータ制御可能であり、定電圧または定電流を供給するべく設定可能であり、ディジタルまたはアナログ電子回路が補足されて、本明細書の他の箇所に記述されたような低〜高周波の波形を供給することが可能であり、かつ誘電泳動に使用されることも可能である)、照明(たとえば、レーザ、アークランプ、白熱電球、顕微鏡用光コンデンサ、および光を導波路内へ(coupkling)する方法も含むことが可能である)、インジケータ(前文および下文において記述される)、検出器(カメラ、レンズ、フィルターセット、画像解析用ソフトウエア)など、すなわちそれらの配列および用途が、新規であり、かつ本発明における新規な効果のためである、といったものである。
本発明は、本発明の段階の、略ブロック工程系統図、図8に示された三つの段階を含んでなると考えることが可能である。
図10は、プローブ位置の下にない電極を含む系の略ブロック工程系統図である。段階360において、負に帯電したターゲット114は、図4Bに示されたものと類似の反応セルへ添加される。この議論のためは、ターゲット114は核酸であると考えられ、プローブ116は、実際にはタンパク質、糖タンパク質、デンプン、または他の興味の分子であることも可能であるが、相補的な核酸配列であると考えることができる。段階362において、電極Aが電極B、P、Q、およびRに対して相対的に正にバイアスされ、負に帯電したターゲット114をその電極へ引き付け、その上に集めるようにすることができる。段階364では、電極Bが電極A、P、Q、およびRに対して相対的に正にバイアスされ、ターゲット114が電極Bへ引かれるようにし、その通過の間に、それはアレイ180の位置170のプローブ116に非常に近接した状態にもって行かれ、ターゲット114とプローブ116との間の反応が起こりやすいようにする。電極P、Q、およびR上の負のバイアスは、ターゲット114の移動の間に、下向きの成分による電場ベクトルを維持しており、ターゲットがプローブ116と密な近接を維持するようにする。再度、上部の電極P、Q、およびRの位置および相対電圧が、セル内の電場ベクトルを形作るべく調整可能であることが注目されるべきである。位置170から上向きおよび横向きの電場ベクトルの大きさは、特異的に結合したターゲット114を対応するプローブ116に対して結合する結合力よりも、低くなければならない。
図11Aは、プローブ位置の下にある電極を含むセルの略ブロック工程系統図であり、図4Aとの関係において最もよく理解されることが可能である。段階360においては、負に帯電したターゲットがセルへ添加される。段階382において、電極Dは電極Cに対して相対的に正にバイアスされ、ターゲットがこの電極上へ移動するようにし、そこにおいてアレイ180上のアレイ位置170上に配置されたプローブ116と密に近接する。この密な緊密のゆえに、ターゲット114とプローブ116との間の反応は非常に迅速に起こる。段階370においては、事象の指標、たとえば電気泳動用タグ270がセルへ添加される。段階386では、電極Dは電極Cに対して再度相対的に正にバイアスされる。電場の影響下に、電気泳動用タグ270は電極Cへ移動し、そこでターゲット114と反応する。段階388では、電極Cは電極Dに対して相対的に正バイアスにセットされる。電極Cの正バイアスは、特異的に結合された物質を測定するため、およびそれを非特異的に結合された物質から識別するため、プローブ位置170に結合した物質の量がモニターされるにつれて、電極Bの正のバイアスは一般的に、段階的な様式で増大される。
上記の議論において、電気泳動力ついては、静磁気力が置換可能であることが注目されるべきである。しかしながら、ほとんどの部分について、検出されるべき生体分子または生物体がそれ自身磁性ではないとすれば、静磁気力の使用のためには、ターゲット114は常磁性粒子によってタグされねばならない。かかる粒子の実例は、バングズ・ラボラトリーズ(Bangs Laboratories)(インディアナ州フィッシャーズ)からのエスタポール(Estapor)粒子、およびダイナル・インク(Dynal, Inc.)(ノルウェー)からのダイナビーズ(Dynabeads)を含む。したがって、図7C、E、およびFの粒子293および295は、常磁性粒子で置換されるであろうが、それらは好ましくは直径1ミクロン未満であり、さらに好ましくは直径250nm未満であり、最も好ましくは直径100nm未満であり;一般に、粒子が小さいほど、プローブ116へ向かうターゲット114の拡散を妨げることは少なく、反応のカイネティクスは速い。電極の代わりに、プローブ116の上または下のいずれか(基板120との関係において)の、永久または電磁石の配置は、力を与えるよりも、磁気的にタグされたターゲット114をプローブ116へ向かって、または離して移動させる。この力の大きさは、プローブ116からの磁場供給源の距離を変えることか、透磁性の異なるシムの配置か、または電磁石の場合には、コイルを通る電流、コイルの物理的分布、コイルの中または周囲の透磁性物質の存在、および他の、この技術において周知の手段を変えることによって調節可能である。
上記のように、異なる識別による多数回の洗浄の使用、ならびにターゲットのプローブに対する結合のモニタリングは、リアルタイム検出の使用を必要とする。このことは、あらかじめ決められた時間にわたって反応が進行した後に、反応が競合され、洗浄が行なわれ、次にその上で反応が行なわれた基板が検出用に調製される、一般の慣例的な状況から区別されるべきである。本発明の多くの好ましい態様においては、光学的な検出手段が用いられる。電極が互いに向い合っている(たとえば、平行または反対に)これらの例では、光学的検出が行なわれるためには、外部の光学的装置が二つの電極の間に発生された光学的シグナルを受信するため、一方または双方の電極が、好ましくは光学的に透明である。
上記の方法による反応の促進は、電場を空間的および時間的の双方に変えることによって改良され、プローブ116のターゲット114との反応を改善するようにすることが可能である。図12Aは、反応セル内の二つの垂直な軸の上にアレンジされた三つの電極の略線図である。電極E1および電極E2は電極195を表しており、電極E4は電極200を表している。すなわち、アレイ180は電極E4の上に配置されている。異なる電極の間の電圧電位は、以下に記述されるように反応速度を改善するような方法で変えられることができる。以下の議論において、用語、ターゲット114およびタグされたターゲット275の使用は、大体のところ、交換できるように使用されている。
電気泳動的な反応促進は、通常の緩衝液中で、電気泳動に必要な電流を供給するために必要な、電極における酸化還元反応に携わるための、水または成分塩類イオン(たとえば、ナトリウムおよび塩化物)の電気分解を用いて行なわれることが可能である。これらの緩衝液の使用に関連した多くの問題があるが、そのために、本発明らは一つの実例として塩化ナトリウムを使用することができる。まず、もしインジウム酸化第一錫(ITO)または他の酸化還元活性物質が、一方または双方の電極において使用されるなら(たとえば、光学的に透明または半透明の電導電極を供給するため)、電気泳動に動力を提供する酸化還元電位は、それにおいて電極が酸化還元反応に関与する電位よりも低い必要がある。たとえば塩化ナトリウムを用いた緩衝液の場合には、酸化還元反応が高速で起こる電位は2ボルトより大きく、この電位ではITOは使用不能である。
これらの影響を低減するためには、前文にリストされた問題に苦しめられない酸化還元剤を供給することが好ましい。かかる試薬の一つの実例は、ベンゾキノン/ハイドキノン系である。この場合、ハイドロキノンはアノードでベンゾキノンヘ酸化され、ベンゾキノンはカソードでハイドロキノンへ還元される。反応は電極において相補的である(すなわち、逆の電位をもつ)ことから、セルの電位は、電極における標準電位の差異よりもむしろ濃度の差異に起因しており、したがって、電気泳動酸化還元反応は二つの電極の間の比較的低い電位において起こる。さらに、この2種は帯電されていないため、この酸化還元剤は溶液の導電性を有意に増大せず、したがって荷電分子(たとえばDNA)または電気泳動による移動のための物質(たとえば細菌)と競合しない。
アノード:2I-−2e- → I2
カソード:S4O6 -2+2e-→2S2O3 -2
この反応の産物は、2S2O3 -2+I2→S4O6 -2+2I-、に従って互いに自発性に反応し、出発状態を再生する。
酸化還元産物はアノードにおいて発生され、カソードは、これらの表面へ輸送されている分子および物質に対しては潜在的に有害であり得る。たとえば、多くの酸化還元剤はアノードにおいてH+を発生し、それは局所的なpHの低下を引き起こす。このpHの低下は、もし充分に大きい場合には、核酸のハイブリダイゼーションを破壊し、タンパク質を変性させ、タンパク質−タンパク質、またはタンパク質−核酸相互作用を遮るか、または細菌を殺すことが可能である。潜在的に危険な他の酸化還元産物はまた、強塩基、および強力な酸化または還元剤も含む。これらの産物を、アノードまたはカソードにおいて検出されるべき分子または物質に干渉することから防ぐため、電極上に不動態化層をもつことが好ましい。
10mMベンゾキノンおよび10mMハイドロキノン、インジウム酸化第一錫(ITO)電極300ミクロンの分離、および1.5ボルトよりおおきい電位およびITOの破壊よりも低い電圧、という条件下において、可溶性(たとえば、蛍光色素へ結合された核酸)または不溶性(たとえば、ポリスチレン球)のマーカーに不均一性が発生することが観察されている。不均一性は濃縮および希薄化の領域によって明示され、濃縮の領域は直径数百ミクロンのほぼ円形のスポットの領域で始まり、それは長くなり、セルのパターンに濃縮されていき、これにおいて、エッジは濃縮の領域であり、セルの中央領域は希薄化の領域である。図15は、その中でかかるセルが形成された、直径約1cmの領域の平面略図である。一般に、この不均一性は電気泳動による輸送の加速の使用に対し、障害である可能性がある。
もし電極200がセルの横のディメンションに対して小さいとすれば、電極200へ向かう力の適用は、結果として、タグされたターゲット275の比較的均等な分布を電極上に生じるであろう。もし特定の位置170が電極200のサイズに比較して小さければ、このことは、タグされたターゲット275のわずかな部分のみがプローブ116に結合される結果になるであろう。それゆえ、混合する段階を、電極200へ向かう力の適用と、一緒に、または点在させて、組合せることが有利である。このことは、タグされたターゲット275の、プローブ116との反応を促進するようにするための、垂直力および水平力を含んでいる、反応の略ブロック図、図16Aに描かれている。水平力のような、混合を与える方法は、下文において詳細に議論されるが、セル内の媒体の物理的な混合(たとえば、物理的な撹拌機構、ポンプ、電気浸透流、表面波音響学、および他の手段による)、ターゲット114に対する水平な電気泳動力の使用、ターゲット114に対する磁力の使用、および他の便利な手段を含むとみなすことができる。溶液の総体流を含むこれらの力(たとえば、電気浸透現象、撹拌、ポンプ、および表面音響学)は、実行することが特に容易である。垂直力は、電気泳動、誘電泳動、濾過、磁場の誘引、および、タグされたターゲット275(またはタグされていない適当なターゲット114)をプローブ116の近くに運ぶことができるような、他の力を含むことが可能である。
図17Aは、水平および垂直力を調節する手段の略ブロック図である。電極200は基板120上に位置しており、水平力のアプリケータ520によって囲まれている。水平力を適用するための様々な手段は、下文に詳細に記述される。アプリケータ520は、コントローラ510へ連結されており、それは次に検出器500からの入力を受信する。コントローラは、アプリケータ520によって適用された水平力、ならびに電極195および200によって向けられた垂直力の、双方の大きさを調節する。検出器500は、電極200に対して密に近接したタグされたターゲット275を、リアルタイムでモニターする。すなわち、電極200の数十または数百ナノメートル以内にあるタグされたターゲット275が検出され、電極からさらに遠い距離にある他のタグされたターゲット275は検出されない。検出器500によってこのリアルタイムのモニタリングが行なわれる手段は、下文に詳細に議論される。
本発明の精神の範囲内において使用されてもよい、多くの異なる水平の力および流れがある。とりわけ、これらは電気泳動力、電気浸透、音響波、機械的撹拌、および液体ポンピングを含む。たとえば、図4Bにおいては、側方にある電極210および220が、タグされたターゲット275へ水平力を適用するべく使用されることが可能である。かかる場合、垂直の電場の大きさは、電極210および220からの水平な電場の大きさに関連して、基準電極195上の電位によって調整されることが可能である。
いくつかの場合に、タグされたターゲットは、種々の手段によって検出可能なシグナルを発生する目的で、その後の基質への暴露を必要とする。たとえば、化学発光は、化学発光シグナルを発生するため、酵素タグに対する基質の添加を必要とする。電気泳動力は、酵素の近傍に基質を運ぶことによって酵素反応を駆動しするべく使用されることが可能であり、次いで、反対に荷電された状態への基質の酵素的変換に際し、変換された基質を迅速に酵素から払いのけるべく使用されることが可能であって、酵素による基質のより迅速な変換を可能にする。
概要
上記の段落においては、多くの参照は、電極上のバイアスを増すことにより、得意的に結合したもの対非特異的に結合したものを識別するためになされており、それは静電力の量を増すことにより、タグ270および付着されたターゲット114をプローブ116から引き離す。このプロセスは、電気泳動力を用いた識別についての略ブロック工程系統図、図22にさらに詳細に記述されている。
図23Aは、本発明の一つの態様の断面図であり、これにおいて、上部表面上のプリズム1140は、スライド導波管1120内へ光を導入するべく使用される。図に示されたプリズム1140は、三角の平行六面体であって、これにおいて一つの表面はスライド1120の上部表面上に置かれており、受入れ表面1142はスライド1120のエッジ1123とほぼ同じ方向に面している。ほぼ平行な光線1132は、好ましくは表面1142に対してほとんど垂直であるが、垂直でなくてもよく、それゆえ表面1142において屈折され、ほとんど反射なしに表面1142へ進入する。これらの光線1132は、プリズム1140の底部表面に出会い、プリズムの底部表面およびスライドの上部表面1122の平面性および近位のため、光線1132は、プリズム1140とスライド1120との間の隙間を切抜け、スライド1120に入る。光線1132の方向は、光線1132が、スライド1120の底部表面1124に出会ったとき表面1124からほとんど全てが反射するように選ばれ、表面1124と下の媒体(一般には空気)との間の臨界角よりも大きい角度で当たるようにする。
図24Bは、平行照明の代わりに集光照明を使用することによって修飾された、図24Aの断面図である。集光照明1131はプリズム1140に進入し、その間に受入れ表面1142においていくぶん屈折される。ガラスのいかなる不具合または界面の汚染物(たとえば、塵)も、光の散乱に寄与することがあるため、光線経路1131の集光点は、プリズム1140とスライド1120との間の界面にないことが便利である。散乱光は、スライド1120における全内部反射を必ずしも維持するものではなく、そのため集光点は、好ましくは光1131がスライド1120に進入する点の前または後である。
図23AおよびB、および図24AおよびBの態様は、おそらくスライドの端近くの、固定された位置にある、プリズム1140および/または関連する照明源とともに使用されること可能であるが、プリズム1140および/または関連する照明源が移動可能であって、スライドの異なる領域、特に照明が意図的に不均一である場所を照明することができることもまた本発明の精神の範囲内にある。
本発明のもう一つの態様は、一般的には1ミリメートル以上の厚さをもつスライドを使用するよりもむしろ、非常に薄い導波管を作成することである。このことは、様々な方法で達成可能である。たとえば、スライド自体が、おそらくは可尭性のハイインデックスプラスチック材料からなるフィルムとして構築されることが可能である。このことは、フィルムが構造上の剛性を維持するためのものである場合、検出プロセスにおいて用いられる生物学的および化学的反応にとってプラスチック材料が不適当である場合、および、内部反射角度が臨界角よりも小さくなるとき、曲げるための物質が潜在的に光を逃がす可能性のある場合を含め、いくつかの適用においては便利ではないことがある。
上記の態様においては、導波管1180内へ捕捉される照明は、スライド1120の上部表面の方向へ導入され、そこから検出が行われる。エバネセント波は、光が導波管1180内へ捕捉されず、スライド1120の上部表面に対して単に一回反射する系によって創製されることが可能であることもまた注目されるべきである。反射の位置において、エバネセント波は創製される。この構造が、いくぶん類似した構造で形成されてはいるが、適当な上部表面位置の照明の後に、光がスライド1120によって拘束されないことを除いて、図24Cにおける積分反射の態様と、かなり理論的に重なる部分を共有していることが注目されるべきである。
リアルタイム検出の他の方法は、散乱、蛍光、アップコンバート性蛍りん光体、量子ドット、または他の指標、ならびに表面プラズモン共鳴(SPR)とともに、共焦点顕微鏡法を含め、本発明の精神の範囲内において便利である。共焦点顕微鏡法は、非常に浅い視野の深さを利用して、プローブ116から引き離された指標タグが視野の外となり、光のエネルギーが空間フィルタを通して分散されるかまたは低減されるようにする。共焦点イメージングに類似したイメージングもまた、非常に多数の対象を用いて可能であって、これもまた浅い視野の深さを有する。表面プラズモン共鳴は、上記のようなシングルバウンス非導波管構造を用いた検出法のものと類似した成分の配置を使用しており、これにおいてガラスの上部表面は反射性の、便利なことには金である金属表面でコートされている。この場合に、金によって反射される光の量は、プローブ116に結合した物質の存在によって影響される。表面プラズモン共鳴は、本発明に充分適合しており、金表面は、反射性表面として、ならびに反応促進および結合力識別のための電極としての、双方に寄与することが可能である。
以下の議論においては、電極間の電位、電位を通して結果として生じる電気泳動力がターゲット114に対する垂直力の実例として使用される。しかしながら、力の調節は、磁気力のような(たとえば磁性粒子を含んでなるタグ270に対して)、他の力の適用手段を用いた場合にも、同様な様式でもたらされることが可能であることに注目されるべきである。さらに、力は、横向きの電気泳動、横向きの磁場の適用、および横向きの力の様々な適用手段によって適用された水平力を含むことも可能である。これらの横向きの力の適用が、気泡または、類似の空気−水界面の導入を含むことも可能であって、その理由が、これらの界面が、表面張力を介してターゲット114に対し非常に強い力を適用することであることに注目されるべきである。これらの力の適用が、力が垂直でも水平でもなく、図5におけるように双方の局面をもつことが可能であることに注目されるべきである。
概要
細菌の正体を、食品病原体、生物戦争用薬剤、および種々の動物およびヒトの疾病に関して同定することは重要である。これらの細菌の迅速かつ感度のよい検出に加えて、動物およびヒトの疾病の場合には、さらに抗生物質、抗真菌剤、および他の医薬品に対する微生物の感受性を測定することは、大きな利益がある。特に興味のある細菌は、ヒトの病原体であり、シュードモナス属、ステノトロホモナス属、アシネトバクター属、エンテロバクター属、エシェリキア属、クレブシエラ属、プロテウス属、セラチア属、ヘモフィルス属、ストレプトコッカス属、スタフィロコッカス属、エンテロコッカス属、マイコバクテリウム属、ナイセリア属といった属の集合、および医療において遭遇する他のヒト病原体から選ばれる細菌である。本発明は、この適用に非常に充分適している。
試料は、いくつかの呼吸器洗浄については、1ミリリットルから1リットルまでの範囲であることが可能であり、さらに細菌濃度では、ミリリットルあたり10細菌から106細菌までの範囲であることが可能である。さらに、試料は血液、尿、痰、洗浄液、または他の培地中に存在することが可能である。試料の濃縮は、試料を濃縮して、少数存在している細菌が全て有効に系へ導入されるようにするとともに、バックグラウンドの液体培地が、系への導入に際して一貫した性質を持つように標準化されることができるようにする。しかしながら、ある試料は、本発明の範囲内の濃縮または他の修飾無しに使用されることが可能であることに注目されるべきである。
権出ゾーンは、便利なことに密閉されたセル内にあり、細菌がその上で固定されかつ検出されることとなる一以上の表面を含む。検出セルの一般的なフォーマットは、細菌検出セル804の略平面図である図32A、および横断面Xによる図32Aの検出セルの側面略線図である図32Bに示されている。
生物の検出は、種々の異なる手段において行われることが可能であるが、一般的にはそれは視覚的な検出手段による。これらの場合、検出表面820の拡大された画像が、染色を加えて、または加えずに得られ、この画像が好ましくは自動化された電子的手段により解析される。本発明における検出についてのさらに一般的な議論は、前文も参照のこと。
生物生存率は、多様な方法によって測定されることが可能であり、生存可能な生物(生体染色)ならびに死んだ生物(死体染色)に光を当てる、双方の方法を含むことができる。これらの染色は、エチジウムまたはプロピジウム色素、ヨウ化ヘキシジウム(hexidium iodide)、SYTO核酸染色剤、7−アミニアクチノマイシンD(7-aminiactinomycin D)、SYTOXグリーン/橙/青核酸染色剤などを不含むことが可能である。これらのおよび他の染色剤についての良好な序説は、www.probes.com.におけるモレキュラー・プローブズ・ハンドブック(Molecular Probes Handbook)から入手可能である。
細菌は、次に、それらの生存度、増殖特性、および種々の薬剤(抗生物質のような)に対する感受性を測定する目的で増殖される。増殖は、適当な培地の存在下に、適当な温度および酸素飽和または欠乏下(たとえば、一般的には試料の供給源に依存して、たとえば嫌気性または好気性細菌用に)における、細菌のインキュベーションによって起こる。インキュベーション培地は一般に、モニターされる細菌に適合されるであろう−たとえば、肺吸引液、尿検体、および血液検体は、すべて各々の起源の細菌または他の生物に充分適合された培地で、この技術において周知のようにインキュベートされるであろう。さらに、効果について検査されるべき抗増殖剤もまたこの技術において周知であり、新規な薬剤の発見とともに、また、現在使用中の混合物が耐性の出現によって変わるにつれて、変化するであろう。
前文では、電気泳動手段を用いた検出表面への輸送が議論されたが;他の手段がここに議論される。たとえば、細菌は遠心力を用いて検出表面へ輸送されることが可能である。図39Aは、捕捉表面905上への細菌の濃縮のために修正された遠心チューブ900の略図であり、図39Bは、図39Aの遠心チューブ900の断面図である。チューブ900は三つの分離可能な部品、試料チューブ903、捕捉部品910、および底部品912を含んでなる。試料チューブ903は、外部構造904を含んでなり、それは、好ましくは200xgを超え、さらに好ましくは1000xgを超え、さらになお好ましくは2500xgを超える遠心力を加えることが可能な遠心分離機用の遠心分離用固定具内に、ぴったり適合する直径をもつ円筒である。試料チューブ900は、さらに内部構造907を含んでなり、それは強度を目的として、外部構造904と接しており、内部構造907は四角形または長方形の断面を有する。試料チューブ903は、細菌試料を含有している試料916を保持することに注目されるべきであって、遠心分離される場合、試料中の細菌を、捕捉表面905上に沈着するが、これは好ましくは四角形または長方形の断面を有しており(他の形状も本発明において可能であるが)、その形状が内部構造907の形状に合致する。内部構造907の断面の形状は、捕捉表面905の形状によって制限されており、遠心力と試料チューブ903の材料とが、内部構造907が、外部構造904なしにその大きさの完全性を維持することができるようになっているか、または、遠心チューブ900がその中に適合する遠心分離用固定具が、チューブ900の形状(たとえば、四角形または長方形)にほぼ適合するなら、内部構造907および外部構造904を有する代わりに、内部構造907のみがあることも可能である。
当業者には、上記の態様が本発明の多くの可能な特別の態様のうちの一部の例示にすぎないことは明らかであろう。本発明の方法が、ほとんど数えきれない数の、指標、検出器、混合手段、力の適用手段などを提供することが認識されるべきである。
Claims (52)
- 溶液中の第1のタイプの生きている微生物を検出するための装置であって、下記:
チャンバーの相対する壁の上に第1の電気泳動の電極及び第2の電気泳動の電極を含んでなるチャンバーであって、前記電極の間に電位がかけられた場合、電極は、前記微生物が第1の電極に向かって移動を引き起こすように設定され;
前記電極の間のチャンバー内へ前記溶液を輸送するように設定されるインプットポート;
前記チャンバーの外へ前記溶液を輸送するように設定されるアウトプットポート;
前記第1のタイプの生きている微生物に結合する複数の第1の捕捉剤を含んでなる、前記第1の電極上に配置される第1の捕捉表面であって、ここで、生きている微生物は、成長および分裂している微生物であり;
前記第1と第2の電極の間の電位を調節するように設置された、第1と第2の電極に操作可能に結合させる電極コントローラ;
前記第1の捕捉剤に結合した前記第1のタイプの生きている微生物の量を検出するように設定される光学検出器;そして
光学検出器によって測定される第1のタイプの生きている微生物の量を記憶する記憶コントローラ
を含んでなる、前記装置。 - 酸化剤又は還元剤を含む溶液をさらに含んでなる、請求項1に記載の装置。
- 前記光学検出器が、光散乱イメージング、明視野イメージング、暗視野イメージング、位相イメージング、蛍光イメージング、アップコンバート性リン光体イメージング、量子ドットイメージング、及び化学発光イメージングからなるセットから選ばれる方法によって、第1のタイプの微生物を検出するように設定される、請求項1に記載の装置。
- 前記第1の電極及び第2の電極からなるセットから選ばれる電極が、光学的に透明である、請求項1に記載の装置。
- 前記光学検出器が、さらに前記捕捉表面上での少なくとも一部の第1のタイプの微生物の位置を測定するように設定される、請求項3に記載の装置。
- 前記溶液がさらに第2のタイプの微生物を含んでおり、前記光学検出器は第1のタイプの微生物を第2のタイプの微生物から識別することが可能である、請求項1に記載の装置。
- 前記第1のタイプの微生物に結合した第1のタグ;及び
前記第2のタイプの微生物に結合した第2のタグ
をさらに含み、前記光学検出器は第1のタグを前記第2のタグから識別することが可能である、請求項6に記載の装置。 - 前記光学検出器が、第1のタグ及び第2のタグの量及び位置を測定するように設定される、請求項7に記載の装置。
- 前記第1の捕捉剤が、第1のタイプの微生物に結合する抗体を含んでなる、請求項7に記載の装置。
- 前記光学検出器が、電気泳動によって第1及び第2のタイプの微生物を識別するように設定される、請求項6に記載の装置。
- 前記第1の捕捉剤が、高分子電解質を含んでなる、請求項1に記載の装置。
- 前記溶液が、さらに第2のタイプの微生物を含み、前記第2の微生物は第1の捕捉剤に結合しない、請求項1に記載の装置。
- 前記第1の捕捉剤が、抗体及びアプタマーからなるセットから選ばれる、請求項12に記載の装置。
- 前記第1の電極に結合した第2の捕捉剤をさらに含み、前記第2の捕捉剤は、第2のタイプの微生物を結合することが可能であり、そして、
前記光学検出器は、第2の捕捉剤に結合した第2のタイプの微生物の量を検出することができ、
前記光学検出器は、微生物が第1の捕捉剤又は第2の捕捉剤に結合するかどうかによって、第1のタイプの微生物を第2のタイプの微生物から識別するように設定される、請求項12に記載の装置。 - 前記第1の電極と共面である第3の電極をさらに含み、第2のタイプの微生物を結合することが可能である第2の捕捉剤は、前記第3の電極に結合し、そして、第1の電極と第2の電極との間の第1の電位差、及び第3の電極と第2の電極との間の第2の電位差は、独立して、電極コントローラによって調節することができる、請求項12に記載の装置。
- 前記光学検出器が、第1の時間と第2の時間との間の第1のタイプの微生物の増殖の差異を測定するように設定される、請求項1に記載の装置。
- 前記微生物が、シュードモナス(Pseudomonas)属、ステノトロホモナス(Stenotrophomonas)属、アシネトバクター(Acinetobacter)属、エンテロバクター(Enterobacter)属、エシェリキア(Escherichia)属、クレブシエラ(Klebsiella)属、プロテウス(Proteus)属、セラチア(Serratia)属、ヘモフィルス(Haemophilus)属、ストレプトコッカス(Streptococcus)属、スタフィロコッカス(Staphylococcus)属、エンテロコッカス(Enterococcus)属、マイコバクテリウム(Mycobacterium)属、カンジダ(Candida)属、アスペルギルス(Aspergillus)属、およびナイセリア(Neisseria)属からなるセットより選ばれる、請求項1に記載の装置。
- 前記酸化剤が、ベンゾキノン、ジチオール、ケトン、フェロシニウム、フェリシアニド、ジヒドロアスコルベート、酸化されたグルタチオン、酸化されたメチルビオローゲン、水、およびハロゲンからなるセットより選ばれる、請求項2に記載の装置。
- 酸化剤が水である、請求項18に記載の装置。
- 前記還元剤が、ジチオスレイトール、ジチオエリトリトール、ジチオアルカン、ジチオアルケン、チオアルカン、チオアルケン、チオール、ヒドロキノン、アルコール、フェロセン、フェロシアニド、アスコルベート、グルタチオン、メチルビオローゲン、水、またはハロゲン化物からなるセットより選ばれる、請求項2に記載の装置。
- 前記溶液の伝導率が100マイクロシーメンス/cm未満である、請求項1に記載の装置。
- 前記溶液の伝導率が10マイクロシーメンス/cm未満である、請求項1に記載の装置。
- 前記溶液が両性イオン緩衝液を含んでなる、請求項1に記載の装置。
- 前記溶液中の第1のタイプの微生物を濃縮するインプットポートの前に配置される濃縮器をさらに含んでなる、請求項1に記載の装置。
- 前記濃縮器が遠心分離機を含んでなる、請求項24に記載の装置。
- 前記濃縮器がイオン交換粒子を含んでなる、請求項24に記載の装置。
- 前記検出器が、前記第1の電極の表面の一部分のシグナルを平均化することによって、第1のタイプの微生物を検出するように構成される、請求項3に記載の装置。
- 前記光学検出器がカメラを含んでなる、請求項3に記載の装置。
- 前記カメラの各ピクセルに対応する視野が2ミクロン未満である長軸を含んでなる、請求項28に記載の装置。
- 前記カメラの各ピクセルに対応する視野が0.5ミクロン未満である長軸を含んでなる、請求項28に記載の装置。
- 前記第1の電極が金を含んでなり、前記光学検出器が表面プラズモン共鳴によって、第1のタイプの微生物を検出するように構成される、請求項1に記載の装置。
- 前記光学検出器が、第1および第2のタグの量を計算するように構成される、請求項7に記載の装置。
- 前記高分子電解質が、ポリカチオンポリマーを含んでなる、請求項11に記載の装置。
- 前記ポリカチオンポリマーが、アミン成分を含んでなる、請求項33に記載の装置。
- 前記第1の捕捉剤が、ポリエチレングリコールおよびポリアクリルアミドからなるセットから選ばれるポリマーをさらに含んでなる、請求項12に記載の装置。
- 前記光学検出器が、生きている微生物と死んでいる微生物を区別するように構成される、請求項1に記載の装置。
- 前記チャンバーが、抗生物質、レクチン、死体染色および生体染色からなるセットから選ばれる染色をさらに含んでなる、請求項36に記載の装置。
- 前記チャンバーが、前記第1のタイプの微生物の成長を促す条件を与えるように構成される、請求項1に記載の装置。
- 前記チャンバーが、34〜40℃の温度でチャンバーを維持することができる熱調節成分を含む、請求項38に記載の装置。
- インプットポートを通して増殖培地を与えるようにさらに構成される、請求項38に記載の装置。
- 前記増殖培地が1ミリシーメンス/cm未満の伝導率を有しており、前記電気コントローラが、前記第1の電極と前記第2の電極との間に、100mVより大きい電位を維持する、請求項40に記載の装置。
- 前記増殖条件が、抗微生物剤をさらに含んでなる、請求項16に記載の装置。
- 前記光学検出器が、死体染色および生体染色からなるセットから選ばれる染色を用いて染色された、生きている微生物と死んでいる微生物を区別することができる、請求項16に記載の装置。
- 前記抗微生物剤が、セファロスポリン、ペニシリン、カルバペネム、モノバクタム、ベータ−ラクタム、ベータ−ラクタマーゼ阻害剤、フルオロキノロン、マクロライド、ケトライド、糖ペプチド、アミノグリコシド、フルオロキノロン、およびリファンピシンからなるセットより選ばれる、請求項42に記載の装置。
- 前記光学検出器が、第1の時間と第2の時間の前記第1のタイプの微生物の増殖の差を計算するように構成される、請求項38に記載の装置。
- 前記光学検出器が、前記第1のタイプの微生物の量を計算するように構成される、請求項1に記載の装置。
- 前記光学検出器が、個々の結合事象を計算するように構成される、請求項1に記載の装置。
- 第1の電極と第2の電極の間の電位差が、2ボルト未満である、請求項1に記載の装置。
- 前記電位差が、第3の基準電極と比較して測定される、請求項1に記載の装置。
- 前記記憶コントローラが、個々の微生物の数を決定するように構成される、請求項1に記載の装置。
- 前記記憶コントローラが、形態学を決定するように構成される、請求項1に記載の装置。
- 前記チャンバーが、水平方向に移動するように構成される、請求項1に記載の装置。
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