JP2002516068A - Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓａｕｒｅｕｓ遺伝子およびポリペプチド - Google Patents

Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓａｕｒｅｕｓ遺伝子およびポリペプチド

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JP2002516068A
JP2002516068A JP2000536845A JP2000536845A JP2002516068A JP 2002516068 A JP2002516068 A JP 2002516068A JP 2000536845 A JP2000536845 A JP 2000536845A JP 2000536845 A JP2000536845 A JP 2000536845A JP 2002516068 A JP2002516068 A JP 2002516068A
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アンドリュー ジェイ． ジー． シンプソン，
ギル エイチ． チョイ，
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    • A61P31/04—Antibacterial agents
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    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies

Abstract

(57)【要約】 本発明は、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ由来の１１個の新規な遺伝子およびそれらがコードするポリペプチドに関する。また、これらを産生するためのベクター、宿主細胞、抗体、および組換え方法が提供される。本発明はさらに、Ｓ．ａｕｒｅｕｓポリペプチド活性アゴニストおよびアンタゴニストを同定するためのスクリーニング法に関する。本発明はさらに、生物学的サンプルにおいて、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ核酸、ポリペプチド、および抗体を検出するための診断方法に関する。本発明はさらに、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓによる感染の予防または減弱のための新規なワクチンに関する。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】 （発明の分野） 本発明は、新規のＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ遺伝子（Ｓ．
ａｕｒｅｕｓ）核酸およびポリペプチドに関する。これらを産生するためのベク
ター、宿主細胞、および組換え法がまた、提供される。さらに、本発明のＳ．ａ
ｕｒｅｕｓ核酸およびポリペプチドに対する、プローブ、プライマー、および抗
体を使用しての、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓを検出するため
の診断方法が提供される。本発明はさらに、Ｓ．ａｕｒｅｕｓポリペプチド活性
のアゴニストおよびアンタゴニストを同定するためのスクリーニング方法、Ｓ．
ａｕｒｅｕｓ核酸およびポリペプチドを使用してのワクチンに関する。
【０００２】 （発明の背景） Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ属には、少なくとも２０個の異なる種が含まれ
る。（概説については、Ｎｏｖｉｃｋ，Ｒ．Ｐ．，Ｔｈｅ Ｓｔａｐｈｙｌｏｃ
ｏｃｃｕｓ ａｓ ａ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｓｙｓｔｅｍ
ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ ｔｈｅ Ｓｔａｐｈｙｌｏ
ｃｏｃｃｉ， １−３７（Ｒ．Ｎｏｖｉｃｋ編、ＶＣＨ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ
，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９９０）を参照のこと）。種は、ハイブリダイゼーショ
ン動力学によって８０％以上互いに異なるが、１つの種内の株は、同じ基準によ
り少なくとも９０％同一である。
【０００３】 種Ｓ．ａｕｒｅｕｓ、グラム陽性、通性好気性の、凝集形成球菌（ｃｌｕｍｐ
−ｆｏｒｍｉｎｇ ｃｏｃｃｉ）は、以下に簡単に記載されるように、ヒトにお
いて細菌感染の最も重要な病因学的因子の１つである。
【０００４】 （ヒトの健康およびＳ．ａｕｒｅｕｓ） Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓは、遍在性の病原である。例え
ば、Ｍｉｍｓら、ＭＥＤＩＣＡＬ ＭＩＣＲＯＢＩＯＬＯＧＹ（Ｍｏｓｂｙ−Ｙ
ｅａｒ Ｂｏｏｋ Ｅｕｒｏｐｅ Ｌｉｍｉｔｅｄ， Ｌｏｎｄｏｎ， ＵＫ
１９９３を参照のこと）。これは、重篤度において軽症から致死性までの範囲に
わたる種々の状態の病原因子である。Ｓ．ａｕｒｅｕｓ感染によって引き起こさ
れるより一般的な状態のいくつかは、熱傷、蜂窩織炎、眼瞼感染、食中毒、関節
感染、新生児新生児結膜炎、骨髄炎、皮膚感染、外科創傷感染、熱傷様皮膚症候
群、および中毒性ショック症候群であり、これらのいくつかは、以下にさらに記
載される。
【０００５】 熱傷：熱傷創傷は、一般に、最初は無菌である。しかし、それらは一般に感染
に対して物理的および免疫障壁を妥協し、液体および電解質の損失を引き起こし
、そして結果として局所または一般生理学的機能不全となる。冷却後、生存可能
な細菌との接触により、傷害部位で混合したコロニー形成が生じる。感染は、熱
傷表面（「焼痂」）上の非生存可能細片に制限され得、それは、全皮膚感染へと
進行し得、そして焼痂の下の生存可能な組織を侵襲し得、そしてそれは、皮膚の
下に到達し得、リンパ球および血液循環に進入し得、そして敗血症へと発達し得
る。Ｓ．ａｕｒｅｕｓは、熱傷創傷感染において代表的に見出される最も重要な
病原の１つである。それは、顆粒組織を破壊し得、そして重篤な敗血症を生じ得
る。
【０００６】 蜂巣炎：蜂巣炎は、代表的に表面的な起源から広がって皮膚層の下へと蔓延す
る皮膚の急性の感染であり、最も一般的には、Ｓ．ａｕｒｅｕｓによって、Ｓ．
ｐｙｒｏｇｅｎｅｓと組み合わせて引き起こされる。蜂巣炎は、全身性の感染を
導き得る。実際、蜂巣炎は、相乗的細菌壊疽の１つの局面であり得る。この状態
は、代表的には、Ｓ．ａｕｒｅｕｓおよび微好気性ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｉの
混合物によって引き起こされる。それは壊死を引き起こし、そして処置は、壊死
組織の切除に限定される。その状態は、しばしば致死性である。
【０００７】 眼瞼感染（ｅｙｅｌｉｄ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎｓ）：Ｓ．ａｕｒｅｕｓは、眼
感染においてとりわけ、新生児における、ものもらいおよび「粘着性眼（ｓｔｉ
ｃｋｙ ｅｙｅ」の原因である。代表的には、このような感染は、眼の表面に限
定され、そしてときどきその表面を貫通し、より重篤な結果を伴い得る。
【０００８】 食中毒：Ｓ．ａｕｒｅｕｓのいくつかの株は、胃および小腸の消化プロセスに
よって破壊されない５つの血清学的に異なる、熱および酸安定性の腸毒素（腸毒
素Ａ〜Ｅ）の１つ以上を産生する。十分な量における毒素の消化は、代表的には
、重篤な嘔吐を生じるが、下痢は生じない。その効果は、生存可能な細菌を必要
としない。毒素は公知であるが、その作用メカニズムは、理解されていない。
【０００９】 関節感染：Ｓ．ａｕｒｅｕｓは、骨関節に感染し、骨髄炎のような疾患を引き
起こす。例えば、Ｒ．Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍら（１９９６）Ｊ．Ｍｅｄ．Ｍｉｃ
ｒｏｂｉｏｌ．４４：１５７−１６４を参照のこと。
【００１０】 骨髄炎：Ｓ．ａｕｒｅｕｓは、血行性骨髄炎の最も一般的な原因因子である。
その疾患は、成人よりも子供および青年において生じる傾向があり、そして骨に
対する非貫通的傷害と関連する。感染は、代表的には、成長する骨の長い末端に
おいて生じ、従って、肉体的に未成熟の集団においてそれが発生するのである。
最もしばしば、感染は、長い成長する骨の末端における松果体成長板に隣接する
萌芽する毛細血管ループの近傍に局在する。
【００１１】 皮膚感染：Ｓ．ａｕｒｅｕｓは、膿瘍および腫脹のようなマイナーな皮膚感染
の最も一般的な病原である。このような感染は、しばしば通常宿主応答機構によ
って解決されるが、それらはまた、重篤な内部感染へと発達し得る。経鼻通過疫
病の再発性感染は、Ｓ．ａｕｒｅｕｓの経鼻保菌者に罹患する。
【００１２】 外科的創傷感染：外科的創傷は、しばしば身体の奥へと貫通する。従って、こ
のような創傷の感染は、患者に対して重篤な危険性を保有する。Ｓ．ａｕｒｅｕ
ｓは、外科的創傷における感染の最も重要な原因因子である。Ｓ．ａｕｒｅｕｓ
は、外科的創傷に侵襲することに異常に熟達している；縫合した創傷は、ずっと
少ないＳ．ａｕｒｅｕｓ細胞によって感染され得、次いで、正常皮膚における感
染を引き起こすことが必要である。外科創傷の侵襲は、重篤なＳ．ａｕｒｅｕｓ
敗血症を導き得る。Ｓ．ａｕｒｅｕｓによる血液流の侵襲は、内部器官、特に心
臓弁および骨の播種および感染へと導き得、心内膜炎および骨髄炎のような全身
性の疾患を引き起こす。
【００１３】 熱傷様皮膚症候群：Ｓ．ａｕｒｅｕｓは、「熱傷様皮膚症候群」（中毒性表皮
壊死症、リッター疾患、およびライエル病とも呼ばれる）の原因である。この疾
患は、より年長の子供において発症し、代表的には、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ株の開花
（ｆｌｏｗｅｒｉｎｇ）によって引き起こされる発生において、剥脱（ｅｘｆｏ
ｌｉａｔｉｏｎ）（熱傷様皮膚症候群とも呼ばれる）を産生する 。細菌は、最
初マイナーな病変のみに感染し得、その毒素は、細胞間結合を破壊し、上皮層に
広がり、そして感染にその皮膚の外層を貫通させ、その疾患を類型化する剥離を
生じる。皮膚の外層の分断は、一般に下部の正常皮膚を顕わにするが、その過程
で損失した流体は、それが適切に処置されなかった場合には、幼児において重篤
な傷害を生じ得る。
【００１４】 中毒性ショック症候群：中毒性ショック症候群は、いわゆる中毒性ショック症
候群毒素を産生するＳ．ａｕｒｅｕｓの株によって引き起こされる。その疾患は
、任意の部位でＳ．ａｕｒｅｕｓ感染によって引き起こされ得るが、タンポンを
使用する女性のみの疾患であるともっぱら間違って考えられることが多すぎる。
その疾患は、毒素血症および敗血症を包含し、そして致死性であり得る。
【００１５】 院内感染：１９８４年の国立院内感染監視調査（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｎｏｃｏ
ｓｏｍｉａｌ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ Ｓｕｒｖｅｉｌｌａｎｃｅ Ｓｔｕｄｙ（
「ＮＮＩＳ」）において、Ｓ．ａｕｒｅｕｓは、医薬、手術、産科学、小児科学
、および新生児を含む多くの病院サービスにおける外科創傷感染の最も流行性の
因子であった。
【００１６】 他の感染：Ｓ．ａｕｒｅｕｓが関与する他の型の感染、危険因子などは、以下
において議論されている：Ａ．Ｔｒｉｌｌａ（１９９５）Ｊ．Ｃｈｅｍｏｔｈｅ
ｒａｐｙ ３：３７−４３；Ｆ．Ｅｓｐｅｒｓｅｎ（１９９５）Ｊ．Ｃｈｅｍｏ
ｔｈｅｒａｐｙ ３：１１−１７；Ｄ．Ｅ．Ｃｒａｖｅｎ（１９９５）Ｊ．Ｃｈ
ｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ ３：１９−２８；Ｊ．Ｄ．Ｂｒｅｅｎら（１９９５）Ｉ
ｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．Ｃｌｉｎ．Ｎｏｒｔｈ Ａｍ．９（１）：１１−２４（そ
れぞれ、本明細書中にその全体が援用される）。
【００１７】 （Ｓ．ａｕｒｅｕｓ株の薬物への耐性） ペニシリンの導入前、Ｓ．ａｕｒｅｕｓに重篤に感染した患者についての予後
は、芳しくなかった。１９４０年代初期のペニシリンの導入後、最悪のＳ．ａｕ
ｒｅｕｓ感染でさえ、一般に、首尾良く処置され得た。しかし、まもなくＳ．ａ
ｕｒｅｕｓのペニシリン耐性株が出現した。今日、院内感染において遭遇するＳ
．ａｕｒｅｕｓの株のほとんどは、ペニシリンに反応しない；しかし、幸運にも
、コミュニティー感染において遭遇するＳ．ａｕｒｅｕｓについてはこの限りで
ない。
【００１８】 現在、Ｓ．ａｕｒｅｕｓのペニシリン耐性株は、ペニシリンをペニシリン酸（
ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎｏｉｃ ａｃｉｄ）に変換し、それにより抗生物質活性を
破壊するラクタマーゼを産生することが周知である。さらに、ラクタマーゼ遺伝
子は、しばしば、エピソーム、代表的にはプラスミド上に伝播し、そしてしばし
ば一緒になって多剤耐性を付与するエピソームエレメント上のいくつかの遺伝子
の唯一のものである。
【００１９】 メチシリンは、１９６０年代に導入され、Ｓ．ａｕｒｅｕｓにおけるペニシリ
ン耐性の問題をほとんど克服した。これらの化合物は、抗生物質活性の原因であ
るペニシリンの部分を保存し、そしてペニシリンをラクタマーゼを不活化するの
に良好な基質にする他の部分を修飾または改変する。しかし、メチシリン耐性は
、Ｓ．ａｕｒｅｕｓにおいて、アミノグリコシド系、テトラサイクリン系、クロ
ラムフェニコール系、マクロライド系、およびリンコサミド（ｌｉｎｃｏｄａｍ
ｉｄｅ）系を含む、この生物に対して効果的な多くの他の抗生物質に対する耐性
を伴って出現した。実際、Ｓ．ａｕｒｅｕｓのメチシリン耐性株は、一般に、多
剤耐性である。
【００２０】 メチシリン耐性Ｓ．ａｕｒｅｕｓ（ＭＲＳＡ）は、世界じゅうで最も重要な院
内病原の１つとなっており、重大な感染コントロール問題を提起する。今日、多
くの株が、バンコマイシン型グリコペプチド抗生物質を除いて、実質的に全ての
抗生物質に対して多剤耐性である。
【００２１】 腸球菌からＳ．ａｕｒｅｕｓへのバンコマイシン耐性遺伝子の移動が研究室に
おいて観察されたという最近の報告は、ＭＲＳＡがバンコマイシンに対しても耐
性となり得るという、一般的に公衆衛生災害を生じると考えられる状況に対する
危惧を有する。ＭＲＳＡは、実質的に全てのβラクタム抗生物質に対するその耐
性を、ｍｅｃＡ遺伝子によってコードされる特別なペニシリン結合タンパク質（
ＰＢＰ）２ａの発現に依っている。このさらなる非常に親和性の低いｐｂｐ（こ
れは、耐性株においてのみ見出される）は、通常のセットのＳ．ａｕｒｅｕｓ
ｐｂｐ１〜４を飽和させるに十分に高いβラクタム濃度での、細胞壁ペプチドグ
リカン合成においてなお機能する唯一のｐｂｐであるようである。１９８３年に
、ｍｅｃＡとは独立したいくつかのさらなる遺伝子が、ＭＲＳＡの高レベルのメ
チシリン耐性を保持するのに必要であることが、トランスポゾンＴｎ５５１を使
用して挿入変異誘発によって示された。これらの遺伝子の妨害は、ＰＢＰ２ａ発
現を妨害することによって耐性レベルに影響を及ぼさず、そしてそれゆえｆｅｍ
（メチシリン耐性の発現に必須である因子）またはａｕｘ（補助遺伝子）として
呼ばれた。
【００２２】 その間に、６つのｆｅｍ遺伝子（ｆｅｍＡ〜Ｆ）が記載され、そしてさらなる
ａｕｘ遺伝の最小数は、１０より多いと見積もられている。ｆｅｍＡおよびｆｅ
ｍＢでの妨害は、メチシリン耐性の強力な減少（ＰＢＰ２ａなしでの株の感受性
までもどる）をもたらす。これらのｆｅｍ遺伝子は、細胞壁合成の特定の段階に
関与する。結果として、ｆｅｍ因子の不活化は、すでに感受性である株において
βラクタム過感受性を誘導する。ｆｅｍＡおよびｆｅｍＢの両方は、ペプチドグ
リカンペンタグリシンペプチド間架橋形成に関与することが示されている。ｆｅ
ｍＡは、グリシン２およびグリシン３の形成を担い、そしてｆｅｍＢは、グリシ
ン４およびグリシン５の形成を担う。Ｓ．ａｕｒｅｕｓは、モノグリシンムロペ
プチド前駆体の形成に関与し得る。ｆｅｍＣ〜Ｆは、ペプチドグリカンステムペ
プチドのイソＤグルタミン酸残基のアミド化、Ｌアラニン（ペプチド間架橋の１
位のグリシンの代わりに）とのマイナーなムロペプチドの形成に影響を及ぼし、
なお未知の機能を実行するか、またはペプチドグリカン前駆体生合成の初期段階
（Ｌリジンの付加）に、それぞれ関与する。
【００２３】 これまでのところ、各々の新たな抗生物質は、耐性株を生じ、多剤耐性である
ものが出現し、そして耐性の漸増的にしつこい形態が出現し始める。Ｓ．ａｕｒ
ｅｕｓ感染の薬物耐性は、すでに、顕著な処置困難性を提示し、これは、新たな
治療剤が開発されない限り、さらに悪化する可能性が高い。Ｓ．ａｕｒｅｕｓは
、Ｓ．ａｕｒｅｕｓにおけるペプチドグリカン架橋の合成に関与しているようで
あるので、その遺伝子は、抗生物質耐性のメカニズムを研究するにおいて重要な
ツールを提供する。Ｓ．ａｕｒｅｕｓ遺伝子およびそのポリペプチドはまた、ア
ンタゴニストまたはアゴニストについての潜在的な標的であり、これは抗生物質
として有用であり得るか、または他の抗生物質に対する耐性をブロックすること
に有用である。すなわち、低分子のようなアンタゴニストまたはアゴニストは、
抗生物質自体として有用であり得、他の抗生物質と相加的に作用するか、または
他の抗生物質と協同的に作用する。
【００２４】 （発明の要旨） 本発明は、表１および配列番号１〜配列番号２２に示す、単離されたＳ．ａｕ
ｒｅｕｓポリヌクレオチドおよびポリペプチド（奇数の配列番号を有するポリヌ
クレオチド配列および偶数の配列番号を有するポリペプチド）を提供する。本発
明の１つの局面において、（ａ）表１に示されるヌクレオチド配列；（ｂ）表１
に示される任意のポリペプチドのアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列；
および（ｃ）（ａ）または（ｂ）における任意のヌクレオチド配列に相補的なヌ
クレオチド配列、からなる群から選択されるヌクレオチド配列を有するポリヌク
レオチドを含む単離された核酸分子を提供する。本発明はさらに、上記（ａ）、
（ｂ）、および（ｃ）の核酸分子のフラグメントを提供する。
【００２５】 本発明のさらなる実施態様には、上記の（ａ）、（ｂ）、または（ｃ）におけ
る任意のヌクレオチド配列に少なくとも９０％同一な核酸配列、およびより好ま
しくは、少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一な核酸
配列を有するポリヌクレオチド、あるいは、ストリンジェントなハイブリダイゼ
ーション条件下で、上記の（ａ）、（ｂ）、または（ｃ）におけるポリヌクレオ
チドにハイブリダイズするポリヌクレオチドを含む単離された核酸分子が含まれ
る。本発明のさらなる核酸の実施態様は、上記（ａ）のアミノ酸配列を有するＳ
．ａｕｒｅｕｓポリペプチドのエピトープ保有部分のアミノ酸配列をコードする
ポリヌクレオチドを含む単離された核酸分子に関する。
【００２６】 本発明はまた、本発明の単離された核酸分子を含む組換えベクター、およびそ
の組換えベクターを含有する宿主細胞、ならびにそのようなベクターおよび宿主
細胞を作製する方法に関する。本発明はさらに、組換え技術による、Ｓ．ａｕｒ
ｅｕｓのポリペプチドまたはペプチドの産生におけるこれらのベクターの使用に
関する。
【００２７】 本発明はさらに、表１に記載される任意のポリペプチドのアミノ酸配列からな
る群から選択されるアミノ酸配列を有する単離されたＳ．ａｕｒｅｕｓポリペプ
チド、またはそのフラグメントを提供する。
【００２８】 本発明のポリペプチドはまた、表１に記載されるものに対して、少なくとも７
０％の類似性、そしてより好ましくは、少なくとも７５％、８０％、８５％、９
０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の類似性を有するポリペ
プチド、ならびに上記の配列に少なくとも７０％同一、より好ましくは、少なく
とも７５％同一、そしてなおより好ましくは、８０％、８５％、９０％、９５％
、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％同一であるアミノ酸配列を有するポ
リペプチド；ならびにこのようなポリペプチドをコードする単離された核酸分子
を含む。
【００２９】 本発明はさらに、ワクチン、好ましくは、表１に記載されるＳ．ａｕｒｅｕｓ
のポリヌクレオチドまたはポリペプチド、あるいはそのフラグメントの１つ以上
を、薬学的に受容可能な希釈剤、キャリア、もしくは賦形剤とともに含む多成分
ワクチンを提供し、ここで、このＳ．ａｕｒｅｕｓポリペプチドは、Ｓｔａｐｈ
ｙｌｏｃｏｃｃｕｓ属のメンバーもしくは少なくともＳ．ａｕｒｅｕｓに対する
免疫応答を動物において誘発するのに有効な量で存在する。本発明のＳ．ａｕｒ
ｅｕｓポリペプチドはさらに、１つ以上の他のブドウ球菌もしくは非ブドウ球菌
生物の１つ以上の免疫源と組み合わせて、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ属のメ
ンバーに対する、そして必要に応じて１つ以上の非ブドウ球菌生物に対する、免
疫応答を惹起するように意図された多成分ワクチンを産生し得る。
【００３０】 本発明のワクチンは、ＤＮＡ形態（例えば、「裸の」ＤＮＡ）で投与され得、
ここで、このＤＮＡは、１つ以上のブドウ球菌ポリペプチドをコードし、そして
必要に応じて、１つ以上の非ブドウ球菌生物のポリペプチドをコードする。１つ
以上のポリペプチドをコードするＤＮＡは、これらのポリペプチドが融合タンパ
ク質として発現されるように構築され得る。
【００３１】 本発明のワクチンはまた、遺伝子操作された生物または宿主細胞の成分として
投与され得る。従って、１つ以上のＳ．ａｕｒｅｕｓポリペプチドを発現する遺
伝子操作された生物または宿主細胞は、動物に投与され得る。例えば、そのよう
な遺伝子操作された生物または宿主細胞は、１つ以上の本発明のＳ．ａｕｒｅｕ
ｓポリペプチドを細胞内に、その細胞表面に、またはその周囲空間に含み得る。
さらに、このような遺伝子操作された生物もしくは宿主細胞は、１つ以上のＳ．
ａｕｒｅｕｓポリペプチドを分泌し得る。本発明のワクチンはまた、免疫系調節
因子（例えば、ＣＤ８６およびＧＭ−ＣＳＦ）とともに動物に同時投与され得る
。
【００３２】 本発明はまた、動物においてＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ属の１つ以上のメ
ンバー、好ましくは、１つ以上のＳ．ａｕｒｅｕｓ種の単離体に対する免疫学的
応答を誘導する方法を提供し、この方法は、その動物に上記のワクチンを投与す
る工程を包含する。
【００３３】 本発明はさらに、動物においてＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ属のメンバー、
好ましくは、少なくともＳ．ａｕｒｅｕｓ種、による感染を予防、減弱、または
制御するのに十分な防御免疫応答を誘導する方法を提供し、この方法は、その動
物に、表１に記載される１つ以上のポリヌクレオチドもしくはポリペプチド、ま
たはそれらのフラグメントを含む組成物を投与する工程を包含する。さらに、こ
れらのポリペプチド、それらのフラグメントは、別の免疫原に結合体化され得る
か、そして／またはアジュバントとともに混合物として投与され得る。
【００３４】 本発明はさらに、１つ以上の本発明のＳ．ａｕｒｅｕｓポリペプチドを投与す
ることによって動物において惹起された抗体、およびこのような抗体およびその
フラグメントを産生するための方法に関する。本発明はさらに、組換え抗体およ
びそのフラグメント、ならびにそのような抗体およびそのフラグメントを産生す
るための方法に関する。
【００３５】 本発明はまた、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ属のメンバーによって、動物に
おいて、表１のポリヌクレオチドの発現を検出するための診断方法を提供する。
１つのこのような方法は、動物由来のサンプルにおいて、Ｓ．ａｕｒｅｕｓポリ
ペプチドをコードするポリヌクレオチドの発現についてアッセイする工程を包含
する。この発現は、直接的に（例えば、表１に記載されるアミノ酸配列に応答し
て惹起される抗体を使用するポリペプチドのレベルをアッセイすることによって
）か、または間接的に（例えば、表１に記載されるアミノ酸配列について特異性
を有する抗体についてアッセイすることによって）かのいずれかで、アッセイさ
れ得る。ポリペプチドの発現はまた、表１の核酸を検出することによってアッセ
イされ得る。このような方法の例は、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ核酸配列を
増幅および検出するためのポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）の使用を含む。
【００３６】 本発明はまた、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ核酸にストリンジェントな条件
下でハイブリダイズし得る表１に記載されるヌクレオチド配列（奇数の配列番号
）の全部または一部を有する核酸プローブに関する。本発明はさらに、動物から
得られた生物学的サンプル中の１つ以上のＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ核酸を
検出する方法に関し、このＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓポリペプチドをコード
するこの１つ以上の核酸は、以下を含む：（ａ）上記サンプルを１つ以上の上記
の核酸プローブと、ハイブリダイゼーションが生じるような条件下で接触させる
工程、および（ｂ）上記の１つ以上のプローブの、生物学的サンプルに存在する
Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ核酸へのハイブリダイゼーションを検出する工程
。
【００３７】 （本発明のポリヌクレオチドおよびポリペプチド） （ｆｅｍＸポリヌクレオチドおよびポリペプチドの特徴） 配列番号１に示されるヌクレオチド配列を、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ重複クローンＢ
ＴＥＦＳ７１およびＢＴＥＪＥ３９を配列決定することによって決定した。この
ヌクレオチド配列は、４１４アミノ酸残基を含み、そして推定分子量が約４９．
１ｋＤａであるｆｅｍＸポリペプチド（配列番号２）をコードするオープンリー
ディングフレームを含む。このオープンリーディングフレームは、ヌクレオチド
１６４〜１６６位のＮ末端メチオニンをコードする開始コドンを含む。
【００３８】 本発明のｆｅｍＸポリペプチドは、ペプチドグリカン架橋の形成に関与する公
知の遺伝子に対してアミノ酸配列相同性を有し、ｅｐｒおよびｆｅｍ遺伝子ファ
ミリーに特徴的な保存されたシステインパターンを含む。配列番号２のＳ．ａｕ
ｒｅｕｓ ｆｅｍＸポリペプチドは、コンピュータープログラムＢＬＡＳＴ（Ａ
ｌｔｓｃｈｕｌら（１９９０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−４１０
）を用いて、ｅｐｒ（Ｍ．Ｓｕｇａｉら（１９９７）Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．
１７９（１３）：４３１１−４３１８）ならびにＳｔａｐｈｌｏｃｏｃｃｕｓ種
由来のｆｅｍＡおよびｆｅｍＢタンパク質（Ａ．Ｍ．Ｓｔｒａｎｄｅｎら（１９
９７）Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７９（１）：９−１６；Ｇ．Ｔｈｕｍｍら、
（１９９７）Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．２３（６）：１２５１−１２６５；
Ｗ．Ｅ．Ａｌｂｏｒｎら（１９９６）Ｇｅｎｅ １８０（１−２）：１７７−１
８１）のアミノ酸配列と高度の局所配列同一性を共有することが見出された。
【００３９】 種間の強い相同性およびＳ．ａｕｒｅｕｓのｆｅｍタンパク質間の同一性は、
ｆｅｍＸが、ペプチドグリカン、ペプチド間架橋生合成に関与することを示す。
従って、本発明のポリペプチドは、それらの機能をブロックするアンタゴニスト
を作製するためのスクリーニング方法において有用である。アンタゴニストは、
例えば、抗生物質耐性Ｓ．ａｕｒｅｕｓまたは他のＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕ
ｓ種を処置するための抗生物質として、使用され得る。本発明のポリペプチドの
アンタゴニストは、ペプチドグリカン架橋の形成を測定することにより同定され
得る。より詳細には、ペプチドグリカン架橋のグリシン１〜５の合成は、Ａ．Ｍ
．Ｓｔｒａｎｄｅｎら（１９９７）Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７９（１）：９
−１６（その全体が本明細書中に援用される）により例示されるように測定され
得る。ｆｅｍＸのアンタゴニストは、ペプチドグリカン架橋形成を阻害するよう
に作用する。
【００４０】 本発明のｆｅｍＸポリペプチドの他の使用は、以下を含む：特に、免疫アッセ
イにおいてＳ．ａｕｒｅｕｓを検出するために、エピトープタグとして、ＳＤＳ
−ＰＡＧＥゲル上の分子量マーカーとして、分子篩ゲル濾過カラムのための分子
量マーカーとして、免疫アッセイにおけるＳ．ａｕｒｅｕｓの検出のためのＳ．
ａｕｒｅｕｓ ｆｅｍＸに特異的に結合する抗体を生成するために、Ｓ．ａｕｒ
ｅｕｓおよび他のＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ種に対する免疫応答を生成する
ために、ならびにＳ．ａｕｒｅｕｓおよび他のＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ種
に対するワクチンとして。
【００４１】 本発明の単離された核酸分子（特にＤＮＡ分子）は、遺伝子マッピングのため
、および例えば、サザンブロット分析およびノザンブロット分析による生物学的
サンプル中のＳ．ａｕｒｅｕｓを同定するためのプローブとして有用である。本
発明のｆｅｍＸポリヌクレオチドはまた、ｆｅｍＸポリヌクレオチドについての
プライマーを用いてＰＣＲによってＳ．ａｕｒｅｕｓを検出することにおいて有
用である。本発明の単離されたポリヌクレオチドはまた、本発明のポリペプチド
を作製することにおいて有用である。
【００４２】 （ｆｕｒＡ、ｆｕｒＢ、およびｆｕｒＣのポリヌクレオチドおよびポリペプチ
ドの特徴） ｆｕｒＡ、ｆｕｒＢ、およびｆｕｒＣのヌクレオチド配列を、Ｓ．ａｕｒｅｕ
ｓクローンＢＴＥＪＱ５０（配列番号３）、ＢＴＡＬＥ７０（配列番号５）、な
らびにＢＴＥＢＰ８０およびＢＴＥＦＤ６８（まとめて、配列番号７）を配列決
定することによって決定した。配列番号３のヌクレオチド配列は、１３６アミノ
酸残基を含み、そして推定分子量が約１５．９ｋＤａであるｆｕｒＡポリペプチ
ド（配列番号４）をコードするオープンリーディングフレームを含む。このオー
プンリーディングフレームは、ヌクレオチド１０１〜１０３位のＮ末端メチオニ
ンをコードする開始コドンを含む。
【００４３】 配列番号５のヌクレオチド配列は、１４８アミノ酸残基を含み、そして推定分
子量が約１７．２ｋＤａであるｆｕｒＢポリペプチド（配列番号６）をコードす
るオープンリーディングフレームを含む。このオープンリーディングフレームは
、ヌクレオチド１０１〜１０３位のＮ末端メチオニンをコードする開始コドンを
含む。
【００４４】 配列番号７のヌクレオチド配列は、１４９アミノ酸残基を含み、そして推定分
子量が約１７．２ｋＤａであるｆｕｒＣポリペプチド（配列番号８）をコードす
るオープンリーディングフレームを含む。このオープンリーディングフレームは
、ヌクレオチド１０１〜１０３位のＮ末端ロイシンをコードする開始コドンを含
む。
【００４５】 本発明のｆｕｒ（第二鉄（ｆｅｒｒｉｃ）取り込み調節因子）ポリペプチド（
ｆｕｒＡ、ｆｕｒＢ、およびｆｕｒＣ）は、鉄調節に関与する公知の遺伝子に対
してアミノ酸配列相同性を有する。配列番号２のＳ．ａｕｒｅｕｓ ｆｕｒＡポ
リペプチドは、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ由来の
ｆｕｒ遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ｇｎｌ|ＰＩＤ|ｅ２３６３８９）のアミ
ノ酸配列と高度の局所配列同一性を共有することが見出された。Ｃ．Ｈｅｉｄｒ
ｉｃｈら（１９９６）ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏ．Ｌｅｔｔｓ．１４０：２５３−２
５９を参照のこと。配列番号２のＳ．ａｕｒｅｕｓ ｆｕｒＢポリペプチドは、
Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ由来のｆｕｒファミリー遺伝子（ＧｅｎＢ
ａｎｋ登録番号ｇｎｌ|ＰＩＤ|ｅ２８１５８３）のアミノ酸配列と高度の局所配
列同一性を共有することが見出された。Ｎ．Ｊ．Ｃｕｍｍｉｎｇｓら（１９９７
）Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ １４３：１８５５−１８５９を参照のこと。配列
番号２のＳ．ａｕｒｅｕｓ ｆｕｒＣポリペプチドは、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕ
ｂｔｉｌｉｓ由来の別のｆｕｒファミリー遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ｇｎ
ｌ|ＰＩＤ|ｅ１１８５６２１）のアミノ酸配列と高度の局所配列同一性を共有す
ることが見出された。Ｆ．Ｋｕｎｓｔら（１９９７）Ｎａｔｕｒｅ ３９０：２
４９−２５６を参照のこと。
【００４６】 本発明のｆｕｒポリペプチドはまた、それら自身の間、ならびに、Ｂａｃｉｌ
ｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ｇｎｌ|ＰＩＤ|ｅ１１８５
７７７）、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ（ＧｅｎＢａｎｋ登
録番号ｇｉ|１６６７５１６）、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉ
ｓ（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ｇｉ|４３３２９９）、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｇｏ
ｎｏｒｒｈｅａｅ（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ｇｉ|３４９０１２）、Ｃａｍｐｌ
ｙｏｂａｃｔｅｒ ｕｐｓａｌｉｅｎｓｉｓ（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ｇｉ|１
２２８７７９）、Ｃａｍｐｌｙｏｂａｃｔｅｒ ｊｅｊｕｎｉ（ＧｅｎＢａｎｋ
登録番号ｇｉ|５１１１１３）、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕ
ｌｏｓｉｓ（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ｇｎｌ|ＰＩＤ|ｅ３１５１６３）、および
他の細菌種に由来の他のｆｕｒおよびｆｕｒ様遺伝子間で、同一性を共有する。
コンピュータープログラムＢＬＡＳＴ（Ａｌｔｓｃｈｕｌら（１９９０）Ｊ．Ｍ
ｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−４１０）を用いて同一性を比較した。
【００４７】 Ｓ．ａｕｒｅｕｓおよび他の細菌種のｆｕｒタンパク質間の強い相同性は、ｆ
ｕｒＡ、ｆｕｒＢ、ｆｕｒＣが、Ｓ．ａｕｒｅｕｓにおける鉄調節に関与するこ
とを示す。鉄はほとんどの微生物の増殖および増幅に必須であるので、本発明の
ポリペプチドは、それらの機能をブロックするアンタゴニストを作製するための
、スクリーニング方法において有用である。アンタゴニストは、例えば、Ｓ．ａ
ｕｒｅｕｓまたは他のＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ種の感染を処置するための
抗生物質として使用され得る。本発明のポリペプチドのアンタゴニストは、種々
の濃度での鉄の存在下での細菌の増殖能力を測定することにより同定され得る。
【００４８】 本発明のｆｕｒポリペプチドの他の使用は、以下を含む：特に、免疫アッセイ
においてＳ．ａｕｒｅｕｓを検出するために、エピトープタグとして、ＳＤＳ−
ＰＡＧＥゲル上の分子量マーカーとして、分子篩ゲル濾過カラムのための分子量
マーカーとして、免疫アッセイにおけるＳ．ａｕｒｅｕｓの検出のためにＳ．ａ
ｕｒｅｕｓ ｆｕｒＡ、ｆｕｒＢ、およびｆｕｒＣに特異的に結合する抗体を生
成するために、Ｓ．ａｕｒｅｕｓおよび他のＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ種に
対する免疫応答を生成するために、ならびにＳ．ａｕｒｅｕｓ、他のＳｔａｐｈ
ｙｌｏｃｏｃｃｕｓ種および他の細菌属に対するワクチンとして。
【００４９】 本発明の単離された核酸分子（特にＤＮＡ分子）は、遺伝子マッピングのため
、および例えば、サザンブロット分析およびノザンブロット分析による生物学的
サンプル中のＳ．ａｕｒｅｕｓを同定するためのプローブとして有用である。本
発明のｆｕｒポリヌクレオチドはまた、特定のｆｕｒポリヌクレオチドについて
のプライマーを用いてＰＣＲによってＳ．ａｕｒｅｕｓを検出することにおいて
有用である。本発明の単離されたポリヌクレオチドはまた、本発明のポリペプチ
ドを作製することにおいて有用である。
【００５０】 （ｆｍｔＢ、ｐｂｐＦ、およびｐｂｐＧのポリヌクレオチドおよびポリペプチ
ドの特徴） ｆｍｔＢ、ｐｂｐＦ、およびｐｂｐＧのヌクレオチド配列を、それぞれ、Ｓ．
ａｕｒｅｕｓクローンＢＴＥＤ Ａ２２およびＢＴＥＤ Ｖ１８（配列番号９）
、ＢＴＥＢ Ｇ７３（配列番号１１）およびＢＴＡＪ Ｏ７０（配列番号１１）
、ならびにＢＴＥＢ Ｕ５３およびＢＴＥＦ Ｂ５５（配列番号１３）を配列決
定することによって決定した。配列番号９のヌクレオチド配列は、４９８アミノ
酸残基を含み、そして推定分子量が約５６．４ｋＤａであるｆｍｔＢポリペプチ
ド（配列番号１０）をコードするオープンリーディングフレームを含む。このオ
ープンリーディングフレームは、ヌクレオチド１０１〜１０３位のＮ末端メチオ
ニンをコードする開始コドンを含む。
【００５１】 配列番号１１のヌクレオチド配列は、６９１アミノ酸残基を含み、そして推定
分子量が約７７．２ｋＤａであるｐｂｐＦポリペプチド（配列番号１２）をコー
ドするオープンリーディングフレームを含む。このオープンリーディングフレー
ムは、ヌクレオチド１０１〜１０３位のＮ末端ロイシンをコードする開始コドン
を含む。
【００５２】 配列番号１３のヌクレオチド配列は、３０１アミノ酸残基を含み、そして推定
分子量が約３４．５ｋＤａであるｐｂｐＧポリペプチド（配列番号１４）をコー
ドするオープンリーディングフレームを含む。このオープンリーディングフレー
ムは、ヌクレオチド１０１〜１０３位のＮ末端メチオニンをコードする開始コド
ンを含む。
【００５３】 本発明のｆｍｔＢ、ｐｂｐＦ、およびｐｂｐＧポリペプチドは、いくつかの種
間で公知のペニシリン結合タンパク質に対してアミノ酸配列相同性を有する。配
列番号１０のＳ．ａｕｒｅｕｓ ｆｍｔＢポリペプチドは、特に、Ｂａｃｉｌｌ
ｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ由来のペニシリン結合タンパク質遺伝子（ＧｅｎＢａｎ
ｋ登録番号ｇｎｌ|ＰＩＤ|ｅ１１８５２８６）のアミノ酸配列と局所配列同一性
を共有することが見出された。Ｆ．Ｋｕｎｓｔら（１９９７）Ｎａｔｕｒｅ ３
９０：２４９−２５６を参照のこと。ｆｍｔＢはまた、抗生物質耐性と関連した
別のＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓポリペプチド（ＧｅｎＢａｎ
ｋ登録番号ｇｎｌ|ＰＩＤ|ｄ１０２４９１８）と配列同一性を共有する。Ｈ．Ｋ
ｏｍａｔｓｕｚａｗａら（１９９７）Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．Ａｇｅｎｔｓ Ｃ
ｈｅｍｏｔｈｅｒ．４１：２３５５−２３６１を参照のこと。
【００５４】 配列番号１２のＳ．ａｕｒｅｕｓ ｐｂｐＦポリペプチドは、特にＢａｃｉｌ
ｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ｇｎｌ|ＰＩＤ|ｅ１１８１
９０３およびｇｎｌ|ＰＩＤ|ｅ１１８５７６７）およびＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃ
ｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ｇｉ|６４３５１０
）由来のペニシリン結合遺伝子のアミノ酸配列と局所配列同一性を共有すること
が見出された。
【００５５】 配列番号１４のＳ．ａｕｒｅｕｓ ｐｂｐＧポリペプチドは、特にＰｓｅｕｄ
ｏｍｏｎａｓ ｓｙｒｉｎｇａｅ（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ｇｉ|５５１９４０
）由来のペニシリン結合遺伝子のアミノ酸配列と局所配列同一性を共有すること
が見出された。Ｅ．Ｒｏｉｎｅら（１９９６）Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７８
：４１０−４１７、およびＢａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ（ＧｅｎＢａｎ
ｋ登録番号ｇｎｌ|ＰＩＤ|ｅ２６７５８８）を参照のこと。コンピュータープロ
グラムＢＬＡＳＴ（Ａｌｔｓｃｈｕｌら（１９９０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２
１５：４０３−４１０）を用いて同一性を比較した。
【００５６】 本発明のＳ．ａｕｒｅｕｓ ｆｍｔＢ、ｐｂｐＦ、およびｐｂｐＧポリペプチ
ドおよび他の細菌種由来のペニシリン結合タンパク質間の強い相同性は、ｆｍｔ
Ｂ、ｐｂｐＦ、およびｐｂｐＧが、Ｓ．ａｕｒｅｕｓにおける細胞壁合成および
β−ラクタム耐性に関与することを示す。従って、本発明のポリペプチドは、抗
生物質としての使用のためにそれらの機能を阻害する化合物を作成するために有
用である。本発明のポリペプチドのインヒビターは、種々の濃度での抗生物質の
存在下での細菌の増殖能力を測定することにより、または当該分野で公知の方法
を用いる細胞壁合成アッセイにより同定され得る。
【００５７】 本発明のｆｍｔＢ、ｐｂｐＦ、およびｐｂｐＧポリペプチドの他の使用は、以
下を含む：特に、免疫アッセイにおいてＳ．ａｕｒｅｕｓを検出するために、エ
ピトープタグとして、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上の分子量マーカーとして、分子篩
ゲル濾過カラムのための分子量マーカーとして、免疫アッセイにおけるＳ．ａｕ
ｒｅｕｓの検出のためにＳ．ａｕｒｅｕｓ ｆｍｔＢ、ｐｂｐＦ、またはｐｂｐ
Ｇに特異的に結合する抗体を生成するために、Ｓ．ａｕｒｅｕｓおよび他のＳｔ
ａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ種に対する免疫応答を生成するために、ならびにＳ．
ａｕｒｅｕｓ、他のＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ種および他の細菌属に対する
ワクチンとして。
【００５８】 本発明の単離された核酸分子（特にＤＮＡ分子）は、遺伝子マッピングのため
、および例えば、サザンブロット分析およびノザンブロット分析による生物学的
サンプル中のＳ．ａｕｒｅｕｓを同定するためのプローブとして有用である。本
発明のｆｍｔＢ、ｐｂｐＦ、およびｐｂｐＧポリヌクレオチドはまた、特定のｆ
ｍｔＢ、ｐｂｐＦ、またはｐｂｐＧポリヌクレオチドについてのプライマーを用
いてＰＣＲによってＳ．ａｕｒｅｕｓを検出することにおいて有用である。本発
明の単離されたポリヌクレオチドはまた、本発明のポリペプチドを作製すること
において有用である。
【００５９】 （ｃｂｒＡ、ｃｂｒＢ、およびｃｂｒＣのポリヌクレオチドおよびポリペプチ
ドの特徴） ｃｂｒＡ（配列番号１５）、ｃｂｒＢ（配列番号１７）、およびｃｂｒＣ（配
列番号１９）のヌクレオチド配列は、シングルオペロンを含み、そしてこれらを
、オペロンにわたるＳ．ａｕｒｅｕｓ重複クローンＢＴＡＣＡ４４およびＢＴＡ
ＧＪ５４を配列決定することによって決定した。配列番号１５のヌクレオチド配
列は、３３０アミノ酸残基を含み、そして推定分子量が約３６．８ｋＤａである
ｃｂｒＡポリペプチド（配列番号１６）をコードするオープンリーディングフレ
ームを含む。このオープンリーディングフレームは、ヌクレオチド７〜９位のＮ
末端メチオニンをコードする開始コドンを含む。
【００６０】 配列番号１７のヌクレオチド配列は、３３１アミノ酸残基を含み、そして推定
分子量が約３５．５ｋＤａであるｃｂｒＢポリペプチド（配列番号１８）をコー
ドするオープンリーディングフレームを含む。このオープンリーディングフレー
ムは、ヌクレオチド１９〜２１位のＮ末端ロイシンをコードする開始コドンを含
む。
【００６１】 配列番号１９のヌクレオチド配列は、３３２アミノ酸残基を含み、そして推定
分子量が約３５．７ｋＤａであるｃｂｒＣポリペプチド（配列番号２０）をコー
ドするオープンリーディングフレームを含む。このオープンリーディングフレー
ムは、ヌクレオチド９１〜９３位のＮ末端メチオニンをコードする開始コドンを
含む。
【００６２】 本発明のｃｂｒポリペプチド（ｃｂｒＡ、ｃｂｒＢ、およびｃｂｒＣ）は、鉄
調節に関与する公知の遺伝子に対してアミノ酸配列相同性を有する。Ｓ．ａｕｒ
ｅｕｓ ｃｂｒＡ（配列番号１６）、ｃｂｒＢ（配列番号１８）、およびｃｂｒ
Ｃ（配列番号２０）ポリペプチドは、それら自体の間で、ならびにＥｒｗｉｎｉ
ａ ｃｈｒｙｓａｎｔｈｅｍｉ由来のｃｂｒＡ、ｃｂｒＢ、およびｃｂｒＣ遺伝
子のアミノ酸配列と、局所配列同一性を共有することが見出された（それぞれＧ
ｅｎＢａｎｋ登録番号ｇｉ|８０９５４１、ｇｉ|８０９５４２、およびｇｉ|８
０９５４１）。Ｂ．Ｍａｈｅら（１９９５）Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１８
：３３−４３を参照のこと。本発明のｃｂｒＡ、ｃｂｒＢ、およびｃｂｒＣポリ
ペプチドはまた、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ（ＧｅｎＢａｎｋ登録番
号ｇｎｌ|ＰＩＤ|ｅ１１８２８４、ｇｎｌ|ＰＩＤ|ｅ１１８２８３５、およびｇ
ｎｌ|ＰＩＤ|ｅ１１８２８３６）を含む他の細菌種の鉄調節遺伝子と配列同一性
を共有する。Ｆ．Ｋｕｎｓｔら（１９９７）Ｎａｔｕｒｅ ３９０：２４９−２
５６およびＢａｃｉｌｌｕｓ ｉｎｔｅｒｍｅｉｕｓ（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号
ｇｎｌ|ＰＩＤ|ｅ２４５９３２）を参照のこと。コンピュータープログラムＢＬ
ＡＳＴ（Ａｌｔｓｃｈｕｌら（１９９０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０
３−４１０）を用いて同一性を比較した。
【００６３】 Ｓ．ａｕｒｅｕｓおよび他の細菌種のｃｂｒタンパク質間の強い相同性は、ｃ
ｂｒＡ、ｃｂｒＢ、およびｃｂｒＣが、Ｓ．ａｕｒｅｕｓにおける鉄調節に関与
することを示す。鉄はほとんどの微生物の増殖および増幅に必須であるので、本
発明のポリペプチドは、それらの機能をブロックするアンタゴニストを作製する
ためのスクリーニング方法において有用である。アンタゴニストは、例えば、Ｓ
．ａｕｒｅｕｓまたは他のＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ種の感染を処置するた
めの抗生物質として使用され得る。本発明のポリペプチドのアンタゴニストは、
種々の濃度での鉄の存在下での細菌の増殖能力を測定することにより同定され得
る。
【００６４】 本発明のポリペプチドの他の使用は、以下を含む：特に、免疫アッセイにおい
てＳ．ａｕｒｅｕｓを検出するために、エピトープタグとして、ＳＤＳ−ＰＡＧ
Ｅゲル上の分子量マーカーとして、分子篩ゲル濾過カラムのための分子量マーカ
ーとして、免疫アッセイにおけるＳ．ａｕｒｅｕｓの検出のために本発明のＳ．
ａｕｒｅｕｓポリペプチドに特異的に結合する抗体を生成するために、Ｓ．ａｕ
ｒｅｕｓおよび他のＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ種に対する免疫応答を生成す
るために、ならびにＳ．ａｕｒｅｕｓ、他のＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ種お
よび他の細菌属に対するワクチンとして。
【００６５】 本発明の単離された核酸分子（特にＤＮＡ分子）は、遺伝子マッピングのため
、および例えば、サザンブロット分析およびノザンブロット分析による生物学的
サンプル中のＳ．ａｕｒｅｕｓを同定するためのプローブとして有用である。本
発明のＳ．ａｕｒｅｕｓポリヌクレオチドはまた、特定のＳ．ａｕｒｅｕｓポリ
ヌクレオチドについてのプライマーを用いて、ＰＣＲによってＳ．ａｕｒｅｕｓ
を検出することにおいて有用である。本発明の単離されたポリヌクレオチドはま
た、本発明のポリペプチドを作製することにおいて有用である。
【００６６】 （エノラーゼポリヌクレオチドおよびポリペプチドの特徴） 配列番号２１に示されるヌクレオチド配列を、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ重複クローン
ＢＴＡＡＩ４４およびＢＴＡＧＥ１２を配列決定することによって決定した。こ
のヌクレオチド配列は、４３４アミノ酸残基を含み、そして推定分子量が約４７
．１ｋＤａであるエノラーゼポリペプチド（配列番号２２）をコードするオープ
ンリーディングフレームを含む。このオープンリーディングフレームは、ヌクレ
オチド１０３〜１０５位のＮ末端メチオニンをコードする開始コドンを含む。
【００６７】 本発明のエノラーゼポリペプチドは、他の細菌種由来の公知のエノラーゼ遺伝
子とアミノ酸配列同一性相同性を有する。配列番号２２のＳ．ａｕｒｅｕｓエノ
ラーゼポリペプチドは、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ（ＧｅｎＢａｎｋ
登録番号ｇｉ|４６０２５９およびｇｎｌ|ＰＩＤ|ｅ１１８６０７８）、Ｓｐｏ
ｎｇｉｌｌａ ｓｐ．（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ｇｉ|１８３９２０６）、Ｍｙ
ｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号
ｇｎｌ|ＰＩＤ|ｅ３０４５５７）、Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ ｊａｎｎａｓ
ｃｈｉｉ（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ｇｉ|１５９０９６７）、およびＣａｍｐｙ
ｌｏｂａｃｔｅｒ ｊｅｊｕｎｉ（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ｇｉ|４３７２７７
）を含む、他の細菌種由来のエノラーゼ遺伝子のアミノ酸配列と局所配列同一性
を共有する。
【００６８】 本発明のＳ．ａｕｒｅｕｓエノラーゼタンパク質を、ラミニン（ＬＮ）／ラミ
ニンレセプター（ＬＮＲｅｃ）相互作用に関与する分子として同定した。本発明
のＳ．ａｕｒｅｕｓエノラーゼタンパク質は、培養中のＳ．ａｕｒｅｕｓとＭＤ
ＣＫ細胞との間の架橋実験においてＬＮＲｅｃ活性を担うことが示されている。
本発明のＳ．ａｕｒｅｕｓエノラーゼ遺伝子を、まずＬＮＲｅｃ分子に対するモ
ノクローナル抗体を生成させ、そしてその抗体を使用することによりクローン化
し、続いてＬＮＲｅｃ分子を単離した。ＬＮＲｅｃ分子を精製し、そして部分的
に配列決定した。部分アミノ酸配列分析を使用して、本発明のＳ．ａｕｒｅｕｓ
エノラーゼ遺伝子をクローン化し、そして単離した。Ｓ．ａｕｒｅｕｓによる感
染の特徴的な特徴は、血流浸潤および広汎性の転移膿瘍形成である。従って、本
発明のＳ．ａｕｒｅｕｓエノラーゼポリペプチドは、ワクチンおよび抗生物質の
両方のための標的を提示する。本発明の抗生物質は、ペプチド、ポリペプチド、
抗体（およびそれらのフラグメント）、低分子、および本発明のＳ．ａｕｒｅｕ
ｓエノラーゼポリペプチド、またはエノラーゼ関連分子に結合する、そしてＳ．
ａｕｒｅｕｓのラミニンへの結合を防ぐ他の薬物を含む。本発明の遮断分子は、
エノラーゼポリペプチドのラミニンへの、またはエノラーゼ関連分子のラミニン
への結合を直接遮断することにより作用し得る。エノラーゼポリペプチドまたは
エノラーゼ関連分子への分子の結合を測定するためのアッセイ；Ｓ．ａｕｒｅｕ
ｓのラミニンへの結合を測定するためのアッセイ；およびＳ．ａｕｒｅｕｓの転
移活性を測定するためのアッセイは、Ｌｏｐｅｓら（１９８５）Ｓｃｉｅｎｃｅ
２２９：２７５−２７７に記載および引用されるアッセイ、Ｂｒｅｎｔａｎｉ
（１９８９）Ｏｎｃｏｇｅｎｅｓｉｓ １：２４７−２６０に記載および引用さ
れるアッセイ、当該分野で公知のアッセイ、および本明細書中に開示のアッセイ
を含む。
【００６９】 Ｓ．ａｕｒｅｕｓのエノラーゼポリペプチドおよび他の細菌種のエノラーゼポ
リペプチド間の構造的相同性および同一性は、Ｓ．ａｕｒｅｕｓのエノラーゼポ
リペプチドが、他の細菌エノラーゼポリペプチド（Ｂａｂｂｉｔｔら（１９９６
）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３５：１６４８９−１６５０１により記載される
エノラーゼポリペプチドを含む）由来のエノラーゼポリペプチドと同じ機能を共
有することを示す。本発明のエノラーゼポリヌクレオチドおよびポリペプチドは
、ワクチンとして使用するための変異体Ｓ．ａｕｒｅｕｓエノラーゼ遺伝子、ポ
リペプチド、および変異体Ｓ．ａｕｒｅｕｓ株を生産するため、および米国特許
第５，７０３，２１９号および同第５，７０３，２１９号に記載の方法を使用し
てヒトおよび他の動物において免疫応答を誘導するために有用である。米国特許
第５，７０３，２１９号および同第５，７０３，２１９号に記載の方法において
、Ｓ．ａｕｒｅｕｓエノラーゼポリペプチドおよびポリペプチドは、Ｈｅｌｉｃ
ｏｂａｃｔｅｒ ｐｙｌｏｒｉエノラーゼポリペプチドおよびポリペプチドの代
わりに置き換えられる。本発明のＳ．ａｕｒｅｕｓエノラーゼポリペプチドおよ
びポリペプチドを調整するための改変は、本明細書中に開示された情報および当
該分野で公知の情報を用いてなされる。
【００７０】 本発明のエノラーゼポリペプチドの他の使用は、以下を含む：特に、免疫アッ
セイにおいてＳ．ａｕｒｅｓを検出するために、エピトープタグとして、ＳＤＳ
−ＰＡＧＥゲル上の分子量マーカーとして、分子篩ゲル濾過カラムのための分子
量マーカーとして、免疫アッセイにおけるＳ．ａｕｒｅｕｓの検出のためにＳ．
ａｕｒｅｕｓエノラーゼに特異的に結合する抗体を生成するために、Ｓ．ａｕｒ
ｅｕｓおよび他のＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ種に対する免疫応答を生成する
ために、ならびに上記で議論したようにＳ．ａｕｒｅｕｓおよび他のＳｔａｐｈ
ｙｌｏｃｏｃｃｕｓ種に対するワクチンとして。
【００７１】 本発明の単離された核酸分子（特にＤＮＡ分子）は、遺伝子マッピングのため
、および例えば、サザンブロット分析およびノザンブロット分析による生物学的
サンプル中のＳ．ａｕｒｅｕｓを同定するためのプローブとして有用である。本
発明のエノラーゼポリヌクレオチドはまた、エノラーゼポリヌクレオチドについ
てのプライマーを用いてＰＣＲによってＳ．ａｕｒｅｕｓを検出することにおい
て有用である。本発明の単離されたポリヌクレオチドはまた、本発明のポリペプ
チドを作製することにおいて有用である。
【００７２】 （詳細な説明） 本発明は、組換えＳ．ａｕｒｅｕｓ核酸およびそのフラグメントに関する。本
発明はさらに、組換えＳ．ａｕｒｅｕｓポリペプチドおよびそのフラグメントに
関する。本発明はまた、これらのポリペプチドを使用して、免疫学的応答を生じ
、そしてＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ属のメンバー、少なくともＳ．ａｕｒｅ
ｕｓ属の単離物によって引き起こされる疾患に対する免疫学的防御を付与するた
めの方法に関する。本発明はさらに、抗原性Ｓ．ａｕｒｅｕｓポリペプチドをコ
ードする核酸配列、および生物学的サンプル中のＳ．ａｕｒｅｕｓ核酸およびポ
リペプチドを検出するための方法に関する。本発明はまた、本発明のポリペプチ
ドおよびペプチドに特異的な抗体、ならびに宿主動物において産生されるこのよ
うな抗体を検出するための方法に関する。
【００７３】 （定義） 以下の定義を提供して、本発明者らが本発明であると考える主題を明瞭にする
。 本明細書中で使用される句「病原性因子」は、動物において疾患状態または
病気を引き起こす因子を意味する。例えば、疾患状態を生じるか、または動物を
、疾患状態に感受性であるような生物に感染させる（例えば、二次感染）かのい
ずれかである、細菌、原生動物、真菌、ウイルス、および後生動物寄生生物がこ
の定義に含まれる。さらに、動物において疾患状態を生じるＳｔａｐｈｙｌｏｃ
ｏｃｃｕｓ属の種および系統が含まれる。
【００７４】 本明細書中で使用される用語「生物」は、それが病原性因子であるか否かにか
かわらず、任意の生存している生物学的系（ウイルスを含む）を意味する。
【００７５】 本明細書中で使用される用語「Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ」は、Ｓｔａｐ
ｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ属のメンバーである細菌の任意の種または系統を意味する
。そのような種および系統は、当業者に公知であり、そして病原性であるものお
よび病原性でないものを含む。
【００７６】 本明細書中で使用される句「本発明の１つ以上のＳ．ａｕｒｅｕｓポリペプチ
ド」は、表１（さらに、配列番号）において記載されるＳ．ａｕｒｅｕｓポリペ
プチドのうちの１つ以上のアミノ酸配列を含むポリペプチドを意味する。これら
のポリペプチドは、本発明のＳ．ａｕｒｅｕｓポリペプチドが、さらなるアミノ
酸配列（ブドウ球菌由来であってもよいし、非ブドウ球菌由来であってもよい）
に連結されている、融合タンパク質として発現され得る。この句はさらに、本発
明のＳ．ａｕｒｅｕｓポリペプチドのフラグメントを含むポリペプチドを含む。
さらなる定義は、本明細書中を通して提供される。
【００７７】 （表１の説明） 以下の表１は、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ由来の１１の遺伝子のヌクレオチド配列およ
びそれらがコードするポリペプチドの配列を示す。この表は、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ
遺伝子の名前、続いて配列同定番号（配列番号）、および遺伝子のヌクレオチド
配列またはポリペプチド配列を列挙する。この表はまた、そのヌクレオチド配列
を含むプラスミドクローンを列挙する。各遺伝子の実際のヌクレオチド配列また
はアミノ酸配列もまた、配列表の対応する配列番号の下に示される。
【００７８】 （表２の説明） 表２は、ＪａｍｅｓｏｎおよびＷｏｌｆ、（１９８８）Ｃｏｍｐ．Ａｐｐｌ．
Ｂｉｏｓｃｉ．４：１８１〜１８６のアルゴリズムを用いて本発明者らによって
推定されたような、表１に記載される各Ｓ．ａｕｒｅｕｓポリペプチドに存在す
る抗原性エピトープ保有フラグメントの抗原性エピトープを含む残基を列挙する
。Ｊａｍｅｓｏｎ−Ｗｏｌｆ抗原性分析を、コンピュータプログラムＰＲＯＴＥ
ＡＮ（Ｐｏｗｅｒ ＭａｃＩｎｔｏｓｈ バージョン３．１１、ＤＮＡＳＴＡＲ
，Ｉｎｃ．、１２２８ Ｓｏｕｔｈ Ｐａｒｋ Ｓｔｒｅｅｔ Ｍａｄｉｓｏｎ
，ＷＩ）を用いて行った。表１に示される各Ｓ．ａｕｒｅｕｓポリペプチドは、
表２に記載される残基を含む１つ以上の抗原性エピトープを有する。抗原決定基
を推定するために使用される分析基準に依存して、この決定基の正確な位置はわ
ずかに変化し得ることが理解される。表２に記載する示された残基および位置は
、表１および配列表に示される各遺伝子についてのアミノ酸配列に対応する。
【００７９】 （表３の説明） 本発明のＳ．ａｕｒｅｕｓポリペプチドは、表３に示されるような天然の変異
または人工操作由来の１つ以上の保存的アミノ酸置換を含み得る。変化は、好ま
しくはマイナーな性質のもの、例えば、タンパク質の折り畳みまたは活性に有意
に影響を及ぼさない保存的アミノ酸置換である。表３に示されるような以下の群
からの残基は、互いに置換され得る：芳香族、疎水性、極性、塩基性、酸性、お
よび低分子。
【００８０】 （核酸分子） 配列決定されたＳ．ａｕｒｅｕｓゲノムＤＮＡを、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ ＩＳＰ
３株から得た。Ｓ．ａｕｒｅｕｓ ＩＳＰ３株は、当業者にとって便利なように
、アメリカンタイプカルチャーコレクションに寄託した。Ｓ．ａｕｒｅｕｓ Ｉ
ＳＰ３株を、ＡＴＣＣ、１０８０１ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｂｌｖｄ．Ｍａｎ
ａｓｓａｓ，ＶＡ ２０１１０−２２０９に１９９８年４月７日に寄託し、そし
て受託番号２０２１０８を付与された。本明細書中の他の箇所で議論されるよう
に、本発明のポリヌクレオチドは、ＤＮＡをクローニングおよび配列決定するた
めの周知かつ標準的な手順の慣用的適用によって容易に入手され得る。例えば、
ライブラリーを得るため、および配列決定するための詳細な方法を以下に提供す
る。広範な種々のＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ株を使用して、
クローニングのため、ならびに本発明のポリヌクレオチドおよびポリペプチドを
入手するためにＳ．ａｕｒｅｕｓゲノムＤＮＡを調節し得る。広範な種々のＳｔ
ａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ株は、アメリカンタイプカルチャーコ
レクション（ＡＴＣＣ）のような認可された寄託機関から公に入手可能である。
核酸配列およびアミノ酸配列におけるマイナーな変動が、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ株に
よって予測され得ることが認識される。本発明は、すべてのＳｔａｐｈｙｌｏｃ
ｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ株由来の本発明の遺伝子（ポリヌクレオチドおよびポ
リペプチドの両方を含む）を提供する。すなわち、すべてのＳｔａｐｈｙｌｏｃ
ｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ株由来のｆｅｍＸ遺伝子、ｆｕｒＡ〜Ｃ遺伝子、ｆｍ
ｔＢ遺伝子、ｐｂｐＧ遺伝子およびｐｂｐＦ遺伝子、ならびにＣｂｒＡ〜Ｃ遺伝
子が本発明に含まれる。
【００８１】 他に示さない限り、本発明においてＤＮＡ分子を配列決定することによって決
定されるすべてのヌクレオチド配列は、自動化ＤＮＡ配列決定機（例えば、Ｍｏ
ｄｅｌ ３７３、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．、Ｆｏｓｔ
ｅｒ Ｃｉｔｙ、ＣＡより）を用いて決定され、そして本発明において決定され
たＤＮＡ分子によってコードされるポリペプチドのすべてのアミノ酸配列は、上
記で決定されたＤＮＡ配列の翻訳によって推定された。従って、この自動化アプ
ローチによって決定された任意のＤＮＡ配列について当該分野において公知であ
るように、本発明において決定された任意のヌクレオチド配列は、幾分の誤差を
含み得る。自動化により決定されたヌクレオチド配列は、配列決定されたＤＮＡ
分子の実際のヌクレオチド配列に対して代表的には少なくも約９０％同一、より
代表的には少なくとも約９５％〜少なくとも約９９．９％同一である。実際の配
列は、当該分野において周知の手動のＤＮＡ配列決定法を含む他のアプローチに
よってより正確に決定され得る。当該分野においてまた公知であるように、決定
されたヌクレオチド配列における、実際の配列と比較して単一の挿入または欠失
は、このヌクレオチド配列の翻訳におけるフレームシフトを生じ、その結果、決
定されたヌクレオチド配列によってコードされる推定アミノ酸配列は、そのよう
な挿入または欠失の位置で始まり、配列決定されたＤＮＡ分子によって実際にコ
ードされるアミノ酸とは完全に異なる。表１と、表１に列挙されるクローンの核
酸配列、または表１に列挙されるクローンによって発現されるタンパク質のアミ
ノ酸配列のいずれかとの間に矛盾が生じる場合、表１に列挙されるクローンが制
御（ｃｏｎｔｒｏｌｌｉｎｇ）である。核酸分子またはポリヌクレオチドの「ヌ
クレオチド配列」によって、ＤＮＡ配列またはＲＮＡ配列のいずれかを意味する
ことが意図される。本明細書中において提供される情報（例えば、表１における
ヌクレオチド配列）を用いて、Ｓ．ａｕｒｅｕｓポリペプチドをコードする本発
明の核酸分子は、開始物質としてゲノムＤＮＡを用いるＤＮＡをクローニングを
するための手順のような、標準的なクローニングおよびスクリーニング手順を用
いて入手され得る。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＣＬＯ
ＮＩＮＧ Ａ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ ＭＡＮＵＡＬ（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ
Ｈａｒｂｏｒ、Ｎ．Ｙ．第２版、１９８９）；Ａｕｓｕｂｅｌら、ＣＵＲＲＥ
ＮＴ ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ ＩＮ ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＢＩＯＬＯＧＹ（Ｊｏ
ｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ，Ｎ．Ｙ．１９８９）を参照のこと。
【００８２】
【表１】 本発明の例として、表１に記載される核酸分子は、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ ＩＳＰ３
ゲノムＤＮＡ由来のＤＮＡライブラリーにおいて発見された。
【００８３】 本発明の核酸分子は、ＲＮＡの形態（例えば、ｍＲＮＡ）、またはＤＮＡの形
態（例えば、クローニングによって得られるか、または合成的に生成されるＤＮ
ＡおよびゲノムＤＮＡを含む）であり得る。このＤＮＡは、二本鎖または一本鎖
であり得る。一本鎖ＤＮＡまたはＲＮＡは、センス鎖としても知られるコード鎖
であり得るか、またはこれはアンチセンス鎖とも呼ばれる非コード鎖であり得る
。
【００８４】 「単離された」ポリヌクレオチド配列によって、そのネイティブな環境から取
り出した、核酸分子、ＤＮＡまたはＲＮＡが意図される。これは、ネイティブな
染色体から単離された本発明のＳ．ａｕｒｅｕｓポリヌクレオチドを含むＤＮＡ
のセグメントを含む。これらのフラグメントは、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ ＤＮＡのみ
からなる単離されたフラグメント、およびベクター配列または他の外来ＤＮＡの
ような異種配列を含むフラグメントの両方を含む。例えば、部分的または実質的
に精製され得る、ベクター中に含まれる組換えＤＮＡ分子は、本発明の目的のた
めに単離されたとみなされる。単離されたＤＮＡ分子のさらなる例は、異種宿主
細胞または溶液中の（部分的にまたは実質的に）精製されたＤＮＡ分子に導入さ
れ、そして維持された組換えＤＮＡ分子を含む。単離されたＲＮＡ分子は、本発
明のＤＮＡ分子のインビボまたはインビトロＲＮＡ転写物を含む。本発明に従う
単離された核酸分子は、部分的にまたは実質的に精製され得る、合成的に生成さ
れるこのような分子をさらに含む。用語「単離された」は、その技術が本発明の
ポリヌクレオチド配列を識別する特徴を示さない場合、ゲノムライブラリーまた
はｃＤＮＡライブラリー、全細胞ｍＲＮＡ調製物、ゲノムＤＮＡ消化物（電気泳
動によって分離されたものを含む）、剪断された全細胞ゲノムＤＮＡ調製物、ま
たは他の組成物をいうのではない。
【００８５】 さらに、本発明の単離された核酸分子は、上記の核酸分子とは実質的に異なる
が、その遺伝コードの縮重に起因して、なおＳ．ａｕｒｅｕｓポリペプチドおよ
び本発明のペプチド（例えば、表１のポリペプチド）をコードする配列を含むＤ
ＮＡ分子を含む。つまり、本発明のＳ．ａｕｒｅｕｓポリペプチドをコードする
全ての可能なＤＮＡ配列である。これは、当該分野で公知である遺伝コードおよ
び種特異的なコドン優先性を含む。従って、上記の縮重改変体を生成して、例え
ば特定の宿主に対するコドン発現を最適化すること（例えば、細菌ｍＲＮＡにお
けるコドンを、哺乳動物または他の細菌宿主（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ）によって
好まれるコドンに変化させる）は、当業者にとっては慣用的である。
【００８６】 本発明はさらに、表１に示されるヌクレオチド配列を有する単離された核酸分
子または上記の配列の１つに相補的な配列を有する核酸分子を提供する。このよ
うな単離された分子（特にＤＮＡ分子）は、遺伝子マッピングのための、および
、例えば、ＰＣＲまたはノーザンブロット分析によって、生物学的サンプル中で
Ｓ．ａｕｒｅｕｓを同定するためのプローブとして有用である。特定の実施態様
において、本発明のポリヌクレオチドは、３００ｋｂ、２００ｋｂ、１００ｋｂ
、５０ｋｂ、１０ｋｂ、７．５ｋｂ、５ｋｂ、２．５ｋｂ、および１ｋｂより短
い。別の実施態様において、そのポリヌクレオチドは、本発明のポリペプチドの
コード配列を含む。
【００８７】 本発明はさらに、本明細書中に記載される（例えば、表、配列表に示されるか
、または寄託されたクローンに含まれる）ポリヌクレオチド配列の一部またはフ
ラグメントをコードする核酸分子に関する。本発明のポリヌクレオチドフラグメ
ントについての用途は、プローブ、プライマー、分子量マーカー、そして本発明
のポリヌクレオチドフラグメントを発現するための使用を含む。フラグメントは
、ポリヌクレオチド配列の部分、任意の２つの整数から選択される、少なくとも
１０の連続するヌクレオチドの長さであるヌクレオチドを含み、これらのうちの
１つは５’ヌクレオチド位置を示し、そしてこれらの第２のものは３’ヌクレオ
チド位置を示し、ここで各々の開示されたポリヌクレオチド配列についての第１
のヌクレオチド、すなわち５’の大部分のヌクレオチドは、１位である。すなわ
ち、長さが少なくとも１０の連続するヌクレオチドのフラグメントが占有し得る
５’および３’ヌクレオチド位置のすべての組み合わせは、個々の種として本発
明に含まれる。「少なくとも」は、フラグメントが、１０の連続する長さのヌク
レオチド塩基であり得るか、または１０と全体のヌクレオチド配列マイナス１の
長さとの間の任意の整数であり得ることを意味する。従って、本発明には、ポリ
ヌクレオチド配列の任意の５’および３’ヌクレオチド塩基位置によって特定さ
れる連続するフラグメントが含まれ、ここで、連続するフラグメントは、１０と
全体のヌクレオチド配列マイナス１の長さとの間の任意の整数である。５’およ
び３’位置によって特定されるポリヌクレオチドフラグメントは、上記の記載を
用いて直ちに予見され得、従って、単に明細書を不必要に長くしない目的のため
に、個々に列挙されない。しかし、上記の種の各々は、本発明に含まれることが
、具体的に指摘される。
【００８８】 さらに、本発明は、ヌクレオチドの位置ではなく、ヌクレオチドのサイズによ
って特定されるフラグメントの亜属を含むポリヌクレオチドを含む。本発明は、
１０と全体のヌクレオチド配列マイナス１の長さとの間の整数から選択される、
連続するヌクレオチド中の任意のフラグメントサイズを含む（ここで、１は各々
の開示されるポリヌクレオチド配列についての最初のヌクレオチドまたは最も５
’ヌクレオチドである）。連続するヌクレオチドフラグメントの好ましいサイズ
は、２０ヌクレオチド、３０ヌクレオチド、４０ヌクレオチド、５０ヌクレオチ
ド、６０ヌクレオチド、７０ヌクレオチド、８０ヌクレオチド、９０ヌクレオチ
ド、１００ヌクレオチド、１２５ヌクレオチド、１５０ヌクレオチド、１７５ヌ
クレオチド、２００ヌクレオチド、２５０ヌクレオチド、３００ヌクレオチド、
３５０ヌクレオチド、４００ヌクレオチド、４５０ヌクレオチド、５００ヌクレ
オチド、５５０ヌクレオチド、６００ヌクレオチド、６５０ヌクレオチド、７０
０ヌクレオチド、７５０ヌクレオチド、８００ヌクレオチド、８５０ヌクレオチ
ド、９００ヌクレオチド、９５０ヌクレオチド、１０００ヌクレオチドを含む。
診断プローブおよびプライマーとして有用であり得る、連続するポリヌクレオチ
ドフラグメントの他の好ましいサイズは、上記で議論したように、フラグメント
サイズが５０と３００ヌクレオチドとの間の各々の整数を表すフラグメントサイ
ズを含む５０〜３００ヌクレオチド長フラグメントを含む。配列表のポリヌクレ
オチド配列、または寄託されたクローンのポリヌクレオチド配列の大部分に（全
てでなければ）対応するより長いフラグメントもまた、本発明に従って、有用で
ある。好ましいサイズは、もちろん、例示を意味し、本発明を制限するものでは
ない。なぜなら、１０と、配列表または寄託されたクローンの全体のヌクレオチ
ド配列の長さマイナス１の長さとの間の任意の整数を表す全てのサイズのフラグ
メントが、本発明に含まれるからである。本発明のさらなる好ましい核酸フラグ
メントは、このポリペプチドのエピトープ保有部分をコードする核酸分子を含む
。
【００８９】 連続するヌクレオチドにおいて特定されたポリヌクレオチドフラグメントは、
上記の記載を用いてすぐに予見され得、従って、単に明細書を不必要に長くしな
い目的のために、個々に列挙されない。
【００９０】 本発明はまた、配列表または寄託されたクローンの任意のヌクレオチド配列に
ついて上記に記載されるような５’および３’塩基位置によって、またはヌクレ
オチド塩基のサイズによって特定される、任意のフラグメントの除外を提供する
。上記に示されるような、５’および３’塩基位置によって、またはヌクレオチ
ドのサイズによって特定されるヌクレオチド配列のフラグメントの任意の数は、
本発明から除外され得る。
【００９１】 別の局面において、本発明は、ストリンジェントはハイブリダイゼーション条
件下で、上記に記載した本発明の核酸分子中のポリヌクレオチドの一部（例えば
、表１のヌクレオチド配列または表１に列挙されたプラスミドクローンのＳ．ａ
ｕｒｅｕｓ配列）にハイブリダイズするポリヌクレオチドを含む、単離された核
酸分子を提供する。「ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件」によっ
て、以下：５０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ（１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１５ｍＭ
クエン酸三ナトリウム）、５０ｍＭ リン酸ナトリウム（ｐＨ ７．６）、５
×Ｄｅｎｈａｒｄｔ溶液、１０％ 硫酸デキストラン、および２０μｇ／ｍｌ
変性剪断サケ精子ＤＮＡを含む溶液中において４２℃で一晩のインキュベーショ
ン、続いて０．１×ＳＳＣ中での約６５℃でのフィルターの洗浄工程が意図され
る。
【００９２】 ポリヌクレオチドの「一部」にハイブリダイズするポリヌクレオチドによって
、参照ポリヌクレオチドの少なくとも約１５ヌクレオチド塩基、およびより好ま
しくは、少なくとも約２０ヌクレオチド塩基、なおより好ましくは、少なくとも
約３０ヌクレオチド塩基、およびなおより好ましくは、約３０〜７０（例えば、
５０）ヌクレオチド塩基にハイブリダイズするポリヌクレオチド（ＤＮＡまたは
ＲＮＡのいずれか）が意図される。これらは、上記で議論したように、診断プロ
ーブおよびプライマーとして有用である。「少なくとも２０ヌクレオチド塩基の
長さ」のポリヌクレオチドの一部によって、例えば、参照ポリヌクレオチド（例
えば、表１に示されるようなヌクレオチド配列）のヌクレオチド配列からの２０
以上の連続するヌクレオチド塩基のヌクレオチドが意図される。プローブおよび
プライマーとして使用され得る、表１のヌクレオチド配列にハイブリダイズする
ポリヌクレオチドの一部はまた、５’および３’塩基位置によって、または上記
のヌクレオチド塩基におけるサイズによって正確に特定され得るか、または同様
の様式で正確に除外され得る。
【００９３】 Ｓ．ａｕｒｅｕｓポリペプチドをコードする本発明の核酸分子は、以下をコー
ドする核酸：表１の全長Ｓ．ａｕｒｅｕｓポリペプチド、表１に列挙されたプラ
スミドクローンによって発現される全長ポリペプチド、ならびに表１のＳ．ａｕ
ｒｅｕｓポリペプチドおよび表１に列挙されたプラスミドクローンによって発現
されるポリペプチドの一部を含み得るが、これらに限定されない。上記の全長配
列をコードする核酸もまた本発明に含まれ、そして、さらに、さらなる配列（例
えば、プレタンパク質配列、またはプロタンパク質配列、またはプレプロタンパ
ク質配列のような付加された分泌リーダー配列をコードする配列）が含まれる。
上記の全長配列およびその一部をコードする核酸は、さらに本発明に含まれ、そ
してさらに、異なる供給源由来の核酸配列によってコードされるさらなる異種ア
ミノ酸配列をさらに含む。
【００９４】 例えば、非コード５’および３’配列を含むがそれに限定されない、さらなる
非コード配列とともに上記のタンパク質配列をコードする核酸もまた、本発明に
含まれる。これらの配列は、転写およびｍＲＮＡプロセシングにおいて役割（例
えば、ｍＲＮＡのリボソーム結合および安定性）を果たし得る、転写された非翻
訳配列を含む。さらなる機能性を提供するさらなるコード配列もまた、本発明に
含まれる。
【００９５】 従って、ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、融合されたポリペプ
チドの精製を容易にするペプチドをコードする配列のような、マーカー配列に融
合され得る。本発明のこの局面の特定の好ましい実施態様において、マーカーア
ミノ酸配列は、とりわけ、ヘキサヒスチジンペプチド（例えば、ｐＱＥベクター
（ＱＩＡＧＥＮ，Ｉｎｃ．，９２５９ Ｅｔｏｎ Ａｖｅｎｕｅ，Ｃｈａｔｓｗ
ｏｒｔｈ，ＣＡ，９１３１１）において提供されるタグ）であり、これらの多く
は市販されている。例えば、ヘキサヒスチジンは、融合タンパク質の簡便な精製
を提供する。Ｇｅｎｔｚら（１９８９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ
．８６：８２１〜２４を参照のこと。「ＨＡ」タグは、インフルエンザ赤血球凝
集素タンパク質由来のエピトープに対応する、精製に有用な別のペプチドである
。Ｗｉｌｓｏｎら、（１９８４）Ｃｅｌｌ ３７：７６７を参照のこと。以下に
議論するように、他のこのような融合タンパク質は、Ｎ末端またはＣ末端におい
てＦｃに融合したＳ．ａｕｒｅｕｓを含む。
【００９６】 （改変体および変異体ポリヌクレオチド） 本発明はさらに、表１のＳ．ａｕｒｅｕｓポリペプチドの一部、アナログ、も
しくは誘導体をコードする核酸分子の改変体、または表１に列挙されたプラスミ
ドクローンによってコードされる核酸分子の改変体、ならびにＳ．ａｕｒｅｕｓ
ポリペプチドの一部、アナログ、および誘導体を含むその改変体ポリペプチドに
関する。改変体は、天然に存在し得る（例えば、天然の対立遺伝子改変体）。「
対立遺伝子改変体」によって、生物の染色体上の所定の遺伝子座を占める遺伝子
のいくつかの代替的な型の１つが意図される。例えば、Ｂ．Ｌｅｗｉｎ、Ｇｅｎ
ｅｓ ＩＶ（１９９０）を参照のこと。天然に存在しない改変体は、当該分野で
公知の変異誘発技術を用いて産生され得る。
【００９７】 このような核酸改変体は、ヌクレオチドの置換、欠失、または付加によって産
生された改変体を含む。置換、欠失、または付加は、１つ以上のヌクレオチドを
含み得る。改変体は、コード領域中で、非コード領域中で、またはその両方で変
化され得る。コード領域中での変化は、保存性または非保存性のアミノ酸置換、
欠失、または付加を産生し得る。これらの中で特に好ましいものは、サイレント
な置換、欠失、または付加であり、これらは、本発明のＳ．ａｕｒｅｕｓタンパ
ク質またはその一部の特性および活性を変化させない。この点に関してまた特に
好ましいものは、保存性置換である。
【００９８】 このようなポリペプチド改変体は、アミノ酸置換、欠失、または付加によって
産生される改変体を含む。その置換、欠失、または付加は、１つ以上の残基を含
み得る。変化は、保存性または非保存性のアミノ酸置換、欠失、または付加を産
生し得る。これらの中で特に好ましいものは、サイレントな置換、欠失、または
付加であり、これらは、本発明のＳ．ａｕｒｅｕｓタンパク質またはその一部の
特性および活性を変化させない。この点に関してまた特に好ましいものは、保存
性置換である。
【００９９】 本発明はまた、本発明の単離された核酸分子を含む組換えベクター、およびこ
の組換えベクターを含む宿主細胞、ならびにこのようなベクターおよび宿主細胞
の作製方法、および組換え技術によるＳ．ａｕｒｅｕｓポリペプチドまたはペプ
チドの産生のためにそれらを使用するための方法に関する。
【０１００】 本出願は、表１に示された核酸分子に対して、または表１に列挙されたプラス
ミドクローンの核酸配列に対して少なくとも９０％。９５％、９６％、９７％、
９８％、もしくは９９％同一である核酸分子に関する。上記の核酸配列は、それ
らがＳ．ａｕｒｅｕｓ活性を有するポリペプチドをコードするか否かに拘らず、
含まれる。このことは、特定の核酸分子が、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ活性を有するポリ
ペプチドをコードしない場合においてさえ、当業者はなおその核酸分子の使用法
（例えば、ハイブリダイゼーションプローブとしての使用法）を知っているから
である。Ｓ．ａｕｒｅｕｓ活性を有するポリペプチドをコードしない本発明の核
酸分子の使用は、とりわけ、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ遺伝子またはその対立遺伝子改変
体をＤＮＡライブラリーから単離する工程、およびＳ．ａｕｒｅｕｓ ｍＲＮＡ
発現サンプル、Ｓ．ａｕｒｅｕｓを含むことが疑われる環境サンプルをノーザン
ブロット分析によって検出する工程を含む。
【０１０１】 好ましいのは、実際に、Ｓ．ａｕｒｅｕｓタンパク質活性を有するポリペプチ
ドをコードしている、表１に示される核酸配列に対して、または表１に列挙され
たプラスミドクローンの核酸配列に対して、少なくとも９０％、９５％、９６％
、９７％、９８％、もしくは９９％同一である配列を有する核酸分子である。「
Ｓ．ａｕｒｅｕｓ活性を有するポリペプチド」によって、類似の活性を示すが、
特定のタンパク質の活性を測定することに適切な特定の生物学的アッセイにおい
て測定される場合、本発明のＳ．ａｕｒｅｕｓタンパク質の活性に対して同一で
あることが必要ではないポリペプチドが意図される。
【０１０２】 もちろん、遺伝コードの縮重に起因して、当業者は、表１に列挙されたプラス
ミドクローンの核酸配列、または表１に示された核酸配列に少なくとも９０％、
９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％同一である配列を有する核酸
分子の大多数が、Ｓ．ａｕｒｅｕｓタンパク質活性を有するポリペプチドをコー
ドすることをすぐに認識する。実際、これらのヌクレオチド配列の縮重改変体は
、すべて同一のポリペプチドをコードするので、このことは、上記に記載された
比較アッセイを実行することさえなしに、当業者には明らかである。当該分野に
おいて、縮重改変体でないこのような核酸分子について、妥当な数がまた、Ｓ．
ａｕｒｅｕｓタンパク質活性を有するポリペプチドをコードすることがさらに認
識される。このことは、当業者が、以下にさらに記載するように、タンパク質機
能により少ない効果を与えるようであるか、または有意に効果を与えないようで
あるかのいずれかのアミノ酸置換（例えば、１つの脂肪族アミノ酸の第２の脂肪
族アミノ酸への置換）に十分に熟知しているからである。
【０１０３】 少なくとも、例えば、本発明の参照ヌクレオチド配列に９５％「同一」である
ヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドによって、ポリヌクレオチド配列が
Ｓ．ａｕｒｅｕｓポリペプチドをコードする参照ヌクレオチド配列の各１００ヌ
クレオチドあたり５までの点変異を含み得ること以外は、ポリヌクレオチドのヌ
クレオチド配列は、参照配列に対して同一であることが意図される。言い換えれ
ば、参照ヌクレオチド配列に少なくとも９５％同一なヌクレオチド配列を有する
ポリヌクレオチドを得るために、参照配列中の５％までのヌクレオチドが、欠失
され得、挿入され得、または別のヌクレオチドと置換され得る。問い合わせ配列
は表１に示される配列の全体、ＯＲＦ（オープンリーディングフレーム）または
本明細書中に記載されるような特定された任意のフラグメントであり得る。
【０１０４】 実際問題として、任意の特定の核酸分子またはポリペプチドが、本発明のヌク
レオチド配列に対して少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、も
しくは９９％同一であるか否かは、公知のコンピュータープログラムを使用して
従来的に決定され得る。問い合わせ配列（本発明の配列）と対象配列との間の最
も良好な全体的な適合性（全体的な配列アラインメントとしてもまた参照される
）を決定するための好ましい方法は、Ｂｒｕｔｌａｇらのアルゴニズムに基づく
ＦＡＳＴＤＢコンピュータープログラムを使用して決定され得る。Ｂｒｕｔｌａ
ｇら、（１９９０）Ｃｏｍｐ．Ａｐｐ．Ｂｉｏｓｃｉ．６：２３７−２４５を参
照のこと。配列アラインメントにおいて、問い合わせ配列および対象配列は、両
方共にＤＮＡ配列である。ＲＮＡ配列は、最初にＵをＴに転換することによって
比較され得る。この全体的な配列アラインメントの結果は、同一性パーセントで
ある。ＤＮＡ配列のＦＡＳＴＤＢアラインメントにおいて同一性パーセントを計
算するために使用される好ましいパラメーターは：Ｍａｔｒｉｘ＝Ｕｎｉｔａｒ
ｙ、ｋ−ｔｕｐｌｅ＝４、Ｍｉｓｍａｔｃｈ Ｐｅｎａｌｔｙ＝１、Ｊｏｉｎｉ
ｎｇ Ｐｅｎａｌｔｙ＝３０、Ｒａｎｄｏｍｉｚａｔｉｏｎ Ｇｒｏｕｐ Ｌｅ
ｎｇｔｈ＝０、Ｃｕｔｏｆｆ Ｓｃｏｒｅ＝１、Ｇａｐ Ｐｅｎａｌｔｙ＝５、
Ｇａｐ Ｓｉｚｅ Ｐｅｎａｌｔｙ＝０．０５、Ｗｉｎｄｏｗ Ｓｉｚｅ＝５０
０または対象ヌクレオチド配列の長さ、どちらかより短い方。
【０１０５】 対象配列が、５’末端または３’末端の欠失のために（内部欠失のためにでは
なく）問い合わせ配列よりも短い場合、手動の補正が結果に対してなされなけれ
ばならない。これは、同一性パーゼントを計算する場合に、ＦＡＳＴＤＢプログ
ラムが対象配列の５’末端および３’末端を考慮しないからである。５’末端お
よび３’末端で切断されている対象配列について、問い合わせ配列について、同
一性パーセントは、問い合わせ配列の総塩基のパーセントとして、一致／整列し
ない対象配列の５’および３’側である問い合わせ配列の塩基の数を計算するこ
とによって補正される。ヌクレオチドが一致／整列しているか否かは、ＦＡＳＴ
ＤＢ配列アラインメントの結果によって決定される。次いで、このパーセントは
、同一性パーセントから差し引かれ、上記のＦＡＳＴＤＢプログラムによって特
定のパラメーターを使用して計算され、最終的な同一性パーセントのスコアに到
達する。この補正されたスコアが、本発明の目的のために使用されるものである
。ＦＡＳＴＤＢアラインメントによって示されるように、問い合わせ配列と一致
／整列していない対象配列の５’および３’の外側のヌクレオチドのみが、同一
性パーセントのスコアを手動で調整する目的で計算される。
【０１０６】 例えば、９０ヌクレオチドの対象配列は、同一性パーセントを決定するために
１００ヌクレオチドの問い合わせ配列と整列される。欠失は、対象配列の５’末
端で生じ、従って、ＦＡＳＴＤＢアラインメントは、５’末端での最初の１０ヌ
クレオチドの一致／整列を示さない。１０個の不対合ヌクレオチドは、配列の１
０％（一致していない５’および３’末端でのヌクレオチドの数／問い合わせ配
列中のヌクレオチドの総数）を示し、ゆえにＦＡＳＴＤＢプログラムによって計
算される同一性パーセントのスコアから１０％が差し引かれる。残りの９０ヌク
レオチドが完全に一致した場合、最終的な同一性パーセントは９０％である。別
の例において、９０ヌクレオチドの対象配列が、１００ヌクレオチドの問い合わ
せ配列と比較される。この場合、欠失は内部欠失であり、そのため問い合わせ配
列と一致／整列しない対象配列の５’または３’のヌクレオチドは存在しない。
この場合、ＦＡＳＴＤＢによって計算される同一性パーセントは、手動で補正さ
れない。再び、問い合わせ配列と一致／整列しない対象配列の５’および３’ヌ
クレオチドのみが、手動で補正される。他の手動の補正は、本発明の目的のため
にはなされない。
【０１０７】 （ベクターおよび宿主細胞） 本発明はまた、本発明の単離されたＤＮＡ分子を含むベクター、組換えベクタ
ーを含む宿主細胞、および宿主細胞によって発現される本発明のＳ．ａｕｒｅｕ
ｓポリペプチドおよびペプチドの産生に関する。
【０１０８】 組換え構築物は、感染、形質導入、トランスフェクション、トランスベクショ
ン（ｔｒａｎｓｖｅｃｔｉｏｎ）、エレクトロポレーション、および形質転換の
ような、周知の技術を用いて宿主細胞に導入され得る。ベクターは、例えば、フ
ァージ、プラスミド、ウイルス、またはレトロウイルスベクターであり得る。レ
トロウイルスベクターは、複製コンピテントであるか、または複製欠損であり得
る。後者の場合、ウイルス増殖は一般的に相補する宿主においてのみ起こり得る
。
【０１０９】 ポリヌクレオチドは、宿主中で増殖のために選択マーカーを含むベクターに結
合され得る。一般的に、プラスミドベクターは、沈澱物（例えば、リン酸カルシ
ウム沈澱物）中、または荷電した脂質を有する複合体中で導入され得る。ベクタ
ーがウイルスである場合、それは、適切なパッケージング細胞株を用いてインビ
トロでパッケージングされ得、次いで宿主細胞に形質導入され得る。
【０１１０】 好ましいのは、目的のポリヌクレオチドに対するシス作動制御領域を含むベク
ターである。適切なトランス作動因子は、宿主によって供給され得、補完するベ
クターによって提供され得、または宿主への導入に際してベクターそれ自体によ
って供給され得る。
【０１１１】 この点における好ましい特定の実施態様において、ベクターは、誘導性であり
得るか、および／または細胞型特異的であり得る特定の発現を提供する。このよ
うなベクターの中で特に好ましいものは、操作が容易な環境因子（例えば、温度
および栄養添加物）によって誘導性のベクターである。
【０１１２】 本発明において有用な発現ベクターには、染色体由来ベクター、エピソーム由
来ベクター、およびウイルス由来ベクター（例えば、細菌プラスミド、バクテリ
オファージ、酵母エピソーム、酵母染色体エレメント、ウイルス（例えば、バキ
ュロウイルス、パポバウイルス、ワクシニアウイルス、アデノウイルス、家禽の
ポックスウイルス、仮性狂犬病ウイルス、およびレトロウイルス）由来のベクタ
ー）、ならびにそれらの組み合わせ由来のベクター（例えば、コスミドおよびフ
ァージミド）が挙げられる。
【０１１３】 ＤＮＡインサートは、適切なプロモーター（少数の例を挙げれば.、例えば、
ファージλＰＬプロモーター、Ｅ．ｃｏｌｉ ｌａｃ、ｔｒｐおよびｔａｃプロ
モーター、ＳＶ４０初期および後期プロモーター、ならびにレトロウイルスＬＴ
Ｒのプロモーター）に作動可能に連結されるべきである。他の適切なプロモータ
ーは、当業者に公知である。発現構築物は、転写開始領域、終結領域、および転
写される領域内に、翻訳のためのリボソーム結合部位をさらに含む。この構築物
によって発現される成熟転写物のコード部分は、好ましくは、翻訳されるポリペ
プチドの最初に翻訳開始部位を、そしてそのポリペプチドの最後に適切に配置さ
れた終結コドン（ＵＡＡ、ＵＧＡ、またはＵＡＧ）を含む。
【０１１４】 示されるように、発現ベクターは、好ましくは少なくとも１つの選択マーカー
を含む。このようなマーカーには、真核細胞培養については、ジヒドロ葉酸レダ
クターゼまたはネオマイシン耐性遺伝子、Ｅ．ｃｏｌｉおよび他の細菌の培養に
ついては、テトラサイクリン、カナマイシン、またはアンピシリンの耐性遺伝子
が挙げられる。適切な宿主の代表的な例には、細菌細胞（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ
細胞、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ細胞およびＳａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉ
ｍｕｒｉｕｍ細胞）；真菌細胞（例えば、酵母細胞）；昆虫細胞（例えば、Ｄｒ
ｏｓｏｐｈｉｌａ Ｓ２およびＳｐｏｄｏｐｔｅｒａ Ｓｆ９細胞）；動物細胞
（例えば、ＣＨＯ細胞、ＣＯＳ細胞、およびＢｏｗｅｓメラノーマ細胞）；なら
びに植物細胞が挙げられるが、これらに限定されない。上記の宿主細胞について
の適切な培養培地および条件は、当該分野で公知である。
【０１１５】 細菌における使用のために好ましいベクターの中には、Ｑｉａｇｅｎから市販
されているｐＱＥ７０、ｐＱＥ６０、およびｐＱＥ９、ｐＱＥ１０；Ｓｔｒａｔ
ａｇｅｎｅから市販されているｐＢＳベクター、Ｐｈａｒｇｅｓｃｒｉｐｔベク
ター、Ｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔベクター、ｐＮＨ８Ａ、ｐＮＨ１６ａ、ｐＮＨ１８
Ａ、ｐＮＨ４６Ａ；Ｎｏｖａｇｅｎから市販されているｐＥＴシリーズのベクタ
ー；ならびにＰｈａｒｍａｃｉａより市販されているｐｔｒｃ９９ａ、ｐＫＫ２
３３−３、ｐＫＫ２３３−３、ｐＤＲ５４０、ｐＲＩＴ５が含まれる。好ましい
真核生物ベクターには、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅより市販されているｐＷＬＮＥＯ
、ｐＳＶ２ＣＡＴ、ｐＯＧ４４、ｐＸＴ１、およびｐＳＧ；ならびにＰｈａｒｍ
ａｃｉａより市販されているｐＳＶＫ３、ｐＢＰＶ、ｐＭＳＧ、およびｐＳＶＬ
がある。他の適切なベクターは、当業者に容易に明らかである。
【０１１６】 本発明における使用のために適切な公知の細菌プロモーターの中には、Ｅ．ｃ
ｏｌｉ ｌａｃＩおよびｌａｃＺプロモーター、Ｔ３、Ｔ５、およびＴ７プロモ
ーター、ｇｐｔプロモーター、λＰＲおよびＰＬプロモーター、ならびにｔｒｐ
プロモーターが含まれる。適切な真核生物プロモーターには、ＣＭＶ前初期プロ
モーター、ＨＳＶチミジンキナーゼプロモーター、初期および後期ＳＶ４０プロ
モーター、レトロウイルスＬＴＲのプロモーター（例えば、ラウス肉腫ウイルス
（ＲＳＶ）のプロモーター）、ならびにメタロチオネインプロモーター（例えば
、マウスメタロチオネイン−Ｉプロモーター）が含まれる。
【０１１７】 構築物の宿主細胞への導入は、リン酸カルシウムトランスフェクション、ＤＥ
ＡＥ−デキストラン媒介トランスフェクション、カチオン性脂質媒介トランスフ
ェクション、エレクトロポレーション、形質導入、感染、または他の方法によっ
て行われ得る。このような方法は、多くの標準的な実験室マニュアルに記載され
ている（例えば、Ｄａｖｉｓら、Ｂａｓｉｃ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｉｎ Ｍｏｌｅ
ｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（１９８６））。
【０１１８】 高等真核生物による本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡの転写は、ベク
ター中にエンハンサー配列を挿入することによって増加し得る。エンハンサーは
、所定の細胞型においてプロモーターの転写活性を増加させるように作用する、
ＤＮＡのシス作動エレメントであり、通常約１０〜３００ヌクレオチドである。
エンハンサーの例は、ＳＶ４０エンハンサー（これは、ヌクレオチド１００〜２
７０の複製起点の後の側に位置する）、サイトメガロウイルス初期プロモーター
エンハンサー、複製起点の後の側に存在するポリオーマエンハンサー、およびア
デノウイルスエンハンサーが含まれる。
【０１１９】 小胞体のルーメンへの、細胞膜周辺腔への、または細胞外環境への翻訳された
ポリペプチドの分泌のために、適切な分泌シグナル（例えば、アミノ酸配列ＫＤ
ＥＬ）が、発現されたポリペプチドに組み込まれ得る。シグナルは、ポリペプチ
ドに対して内因性であり得るか、または異種のシグナルであり得る。
【０１２０】 ポリペプチドは、修飾された形態（例えば、融合タンパク質）で発現され得、
そして分泌シグナルを含むだけではなく、また、さらなる異種の機能的領域を含
み得る。例えば、さらなるアミノ酸の領域、特に荷電したアミノ酸が、ポリペプ
チドのＮ末端に付加されて、精製の間の、またはその後の操作および保存の間の
宿主細胞中での安定性および持続性を改善し得る。また、ペプチド部分が、精製
を容易にするためにポリペプチドに付加され得る。このような領域は、ポリペプ
チドの最終調製に先立って除去され得る。分泌もしくは排出を生じるための、安
定性を改善するための、および精製を容易にするための、ポリペプチドへのペプ
チド部分の付加は、とりわけ、当該分野においてよく知られた、そして慣用的な
技術である。好ましい融合タンパク質は、タンパク質を可溶化させるために有用
な免疫グロブリン由来の異種領域を含む。例えば、ＥＰ−Ａ−Ｏ ４６４ ５３
３（カナダ国対応特許２０４５８６９）は、別のヒトタンパク質またはその一部
とともに、免疫グロブリン分子の定常領域の種々の部分を含む融合タンパク質を
開示する。多くの場合において、融合タンパク質におけるＦｃ部分は、治療およ
び診断における使用のために完全に有利であり、従って、例えば、改善された薬
物動態学的な特性を生じる（ＥＰ−Ａ ０２３２ ２６２）。他方、いくつかの
使用については、融合タンパク質が、記載された有利な様式で発現され、検出さ
れ、そして精製された後で、Ｆｃ部分の除去が可能であることが望ましい。これ
は、Ｆｃ部分が治療および診断における使用のために障害であることがわかった
ときのような場合である（例えば、融合タンパク質が免疫のための抗原として使
用される場合）。薬物の探索において、例えば、ヒトタンパク質、例えば、ｈＩ
Ｌ−５レセプターは、ｈＩＬ−５のアンタゴニストを同定するための高スループ
ットスクリーニングアッセイの目的のためにＦｃ部分と融合された。Ｂｅｎｎｅ
ｔｔ，Ｄ．ら（１９９５）Ｊ．Ｍｏｌｅｃ．Ｒｅｃｏｇｎ．８：５２〜５８およ
びＪｏｈａｎｓｏｎ，Ｋ．ら、（１９９５）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７０（
１６）：９４５９〜９４７１を参照のこと。
【０１２１】 Ｓ．ａｕｒｅｕｓポリペプチドは、精製のために用いられる、硫酸アンモニウ
ムまたはエタノール沈澱、酸抽出、アニオン交換クロマトグラフィーまたはカチ
オン交換クロマトグラフィー、ホスホセルロースクロマトグラフィー、疎水性相
互作用クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、ヒドロキシア
パタイトクロマトグラフィー、レクチンクロマトグラフィー、および高速液体ク
ロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を含む周知の方法によって、組換え細胞培養から
回収および精製され得る。本発明のポリペプチドは、天然に精製された産物、化
学合成手順の産物、および原核生物宿主または真核生物宿主（例えば、細菌細胞
、酵母細胞、高等植物細胞、昆虫細胞、および哺乳動物細胞を含む）から組換え
手順によって産生された産物を含む。
【０１２２】 （ポリペプチドおよびフラグメント） 本発明はさらに、表１に列挙されたプラスミドクローンによってコードされる
アミノ酸配列、または表１のアミノ酸配列、または上記のポリペプチドの一部を
含むペプチドもしくはポリペプチドを有する単離されたＳ．ａｕｒｅｕｓポリペ
プチドを提供する。
【０１２３】 （改変体および変異体ポリペプチド） 本発明のＳ．ａｕｒｅｕｓポリペプチドの特性を改善または変化させるために
、タンパク質操作が行われ得る。当業者に公知の組換えＤＮＡ技術が、単一もし
くは複数のアミノ酸置換、欠失、付加、または融合タンパク質を含む、新規な変
異体タンパク質すなわちムテインを作製するために使用され得る。このような修
飾されたポリペプチドは、例えば、活性の増強または安定性の増加を示し得る。
さらに、これらのポリペプチドは、対応する天然のポリペプチドよりも、少なく
とも特定の精製および保存条件下において、より高い収率で精製され得、そして
より良好な安定性を示し得る。
【０１２４】 （Ｎ末端およびＣ末端欠失変異体） １つ以上のアミノ酸が、生物学的機能を実質的に損失することなく、Ｎ末端ま
たはＣ末端から欠失され得ることが当該分野で公知である。例えば、Ｒｏｎら、
Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６８：２９８４−２９８８（１９９３）は、３、
８、または２７Ｎ末端アミノ酸残基が欠失した場合でさえ、ヘパリン結合活性を
有する改変ＫＧＦタンパク質を報告した。従って、本発明は、表１に示されるＳ
．ａｕｒｅｕｓポリペプチドのアミノ酸配列のアミノ末端から欠失した１つ以上
の残基を有するポリペプチド、およびそのようなポリペプチドをコードするポリ
ヌクレオチドを提供する。
【０１２５】 同様に、生物学的に機能的なＣ末端欠失ムテインの多くの例が公知である。例
えば、インターフェロンγは、タンパク質のカルボキシ末端から８から１０アミ
ノ酸残基を欠失させることによって、１０倍までより高い活性を示す（例えば、
Ｄｏｂｅｌｉら、（１９８８）Ｊ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ７：１９９−
２１６を参照のこと。従って、本発明は、表１に示されるＳ．ａｕｒｅｕｓポリ
ペプチドのアミノ酸配列のカルボキシ末端から１つ以上の残基を有するポリペプ
チドを提供する。本発明はまた、以下に記載されるようなアミノ末端およびカル
ボキシ末端の両方から１つ以上のアミノ酸が欠失したポリペプチドを提供する。
【０１２６】 本発明は、本明細書に記載されるアミノ酸配列の部分またはフラグメントをコ
ードするポリヌクレオチド、ならびに本明細書に記載される単離されたアミノ酸
配列の部分またはフラグメントにさらに関する。フラグメントは、表、配列表に
記載されるアミノ酸配列、および寄託されたｃＤＮＡクローンによってコードさ
れるアミノ酸配列の部分を含み、その部分は、長さが少なくとも７個の連続する
アミノ酸であり、その一方がＮ末端位置を表し、そして他方がＣ末端位置を表す
任意の２つの整数から選択される。本明細書に開示された各ポリペプチドの第１
の、または最もＮ末端のコドンは、１位である。任意の所定のアミノ酸配列上で
長さが少なくとも７個の連続するアミノ酸残基が占有し得るＮ末端およびＣ末端
の位置の全ての組み合わせは、個々の種として本発明に含まれる。少なくともは
、フラグメントが、長さが７個の連続するアミノ酸残基であり得るか、または７
と全長アミノ酸配列中の残基の数マイナス１との間の任意の整数であることを意
味する。従って、本発明に含まれるのは、配列表に示されるか、または寄託され
たｃＤＮＡクローンによってコードされるアミノ酸配列の任意のＮ末端およびＣ
末端位置によって特定される連続するフラグメントの種であり、ここで、その連
続するフラグメントは、７と全長配列における残基の数マイナス１との間の任意
の整数である。Ｎ末端およびＣ末端位置によって特定されるポリペプチドフラグ
メントは、上記の記載を使用して即座に認識され得、そしてそれゆえ明細書を不
必要に長文にしないという目的のみによって個々には列挙していない。しかし、
上記の種の各々が本発明に含まれるということが特に指摘される。
【０１２７】 さらに、本発明は、Ｎ末端およびＣ末端位置によってではなくむしろ、アミノ
酸残基のサイズにより特定されるフラグメントの亜属を含む。本発明は、７と全
長配列における残基の数マイナス１との間の整数から選択される連続するアミノ
酸残基の任意のフラグメントサイズを含む。連続するポリペプチドフラグメント
の好ましいサイズは、少なくとも７アミノ酸残基、少なくとも１０アミノ酸残基
、少なくとも２０アミノ酸残基、少なくとも３０アミノ酸残基、少なくとも４０
アミノ酸残基、少なくとも５０アミノ酸残基、少なくとも７５アミノ酸残基、少
なくとも１００アミノ酸残基、少なくとも１２５アミノ酸残基、少なくとも１５
０アミノ酸残基、少なくとも１７５アミノ酸残基、少なくとも２００アミノ酸残
基、少なくとも２２５アミノ酸残基、少なくとも２５０アミノ酸残基、少なくと
も２７５アミノ酸残基、少なくとも３００アミノ酸残基、少なくとも３２５アミ
ノ酸残基、少なくとも３５０アミノ酸残基、少なくとも３７５アミノ酸残基、少
なくとも４００アミノ酸残基、少なくとも４２５アミノ酸残基、および少なくと
も４５０アミノ酸残基を含む。好ましいサイズは、７と全長配列における残基の
数マイナス１との間の任意の整数を表す全てのサイズのフラグメントが本発明に
含まれるので、当然に、本発明を例示することを意味するが、限定することを意
味しない。
【０１２８】 本発明のアミノ酸残基のサイズによって特定される連続するポリペプチドフラ
グメントは、上記の記載を使用して即座に認識され得、そしてそれゆえ、明細書
を不必要に長文にしないという目的のみによって個々には列挙していない。
【０１２９】 本発明はまた、Ｎ末端およびＣ末端の位置によって、または上記のアミノ酸残
基のサイズによって特定される任意のフラグメントを除外することを提供する。
Ｎ末端およびＣ末端位置によって、または上記のアミノ酸残基のサイズによって
特定される任意の数のフラグメント。
【０１３０】 上記のフラグメントは、活性である必要はないことを特に指摘する。なぜなら
、それらは、例えば、免疫アッセイにおいて、エピトープマッピングにおいて、
エピトープタグ化において、ポリペプチドの特定の部分に対する抗体を惹起する
ために、ワクチンとして、および分子量マーカーとして有用であるからである。
【０１３１】 構造または機能的ドメインによって特徴づけられるポリペプチドおよびポリヌ
クレオチドフラグメントがまた好ましい。例えば、αへリックスおよびαへリッ
クス形成領域、βシート、およびβシート形成領域、ターン、およびターン形成
領域、コイルおよびコイル形成領域、親水性領域、疎水性領域、α両親媒性領域
、β両親媒性領域、可撓性領域、表面形成領域、基質結合領域、ならびに高抗原
性指標領域を含むフラグメントである。
【０１３２】 他の好ましいフラグメントは、生物学的に活性なフラグメントである。生物学
的に活性なフラグメントは、本発明のポリペプチドの活性と類似の、しかし必ず
しも同一である必要のない、活性を示すフラグメントである。フラグメントの生
物学的活性は、改善された所望の活性、または減少した所望でない活性を含み得
る。
【０１３３】 （他の変異体） 上記で議論したタンパク質のＮおよびＣ末端欠失形態に加えて、Ｓ．ａｕｒｅ
ｕｓポリペプチドのいくつかのアミノ酸配列が、そのタンパク質の構造または機
能の有意な効果なしに変更され得ることがまた、当業者によって理解される。配
列におけるこのような差異が考慮される場合、活性を決定するタンパク質上の重
要な領域が存在することが思い出されるべきである。
【０１３４】 従って、本発明はさらに、実質的にＳ．ａｕｒｅｕｓポリペプチド活性を示す
か、または以下に記載するタンパク質部分のようなＳ．ａｕｒｅｕｓタンパク質
の領域を含む、Ｓ．ａｕｒｅｕｓポリペプチドの改変を含む。このような変異体
には、活性にほとんど影響を及ぼさないように、当該分野で公知の一般規則に従
って選択される欠失、挿入、逆位、反復、および型置換が含まれる。例えば、表
現型サイレントなアミノ酸置換を作成する方法に関するガイダンスが提供される
。アミノ酸配列の変化に対する抵抗性を研究するための２つの主要なアプローチ
が存在する。Ｂｏｗｉｅ，Ｊ．Ｕ．ら（１９９０），Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４７：
１３０６−１３１０を参照のこと。第１の方法は、変異が自然選択によって受容
されるかまたは拒絶されるかのいずれかである、進化のプロセスに依存する。第
２のアプローチは、クローン化遺伝子の特定の部位にアミノ酸変化を導入するた
めの遺伝子操作、および機能性を維持する配列を同定するための選択またはスク
リーニングを使用する。
【０１３５】 これらの研究は、タンパク質が、アミノ酸置換に対して驚くほど抵抗性である
ことを明らかにした。これらの研究は、どのアミノ酸変化が、タンパク質の特定
の位置で許容される傾向があるかを示す。例えば、最も埋包されたアミノ酸残基
は、非極性の側鎖を必要とするが、一方、表面側鎖の特徴は、一般にほとんど保
存されない。他のこのような表現型サイレント置換は、Ｂｏｗｉｅら（前出）お
よびそこに引用される参考文献によって記載される。代表的に保存的置換として
考えられるのは、脂肪族アミノ酸Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、およびＩｌｅの間の
１つの残基と別の残基の置換；水酸基を有する残基ＳｅｒとＴｈｒとの交換、酸
性残基ＡｓｐとＧｌｕとの交換、アミド残基ＡｓｎとＧｌｎとの間の置換、塩基
性残基ＬｙｓとＡｒｇとの交換、および芳香族性残基Ｐｈｅ、Ｔｙｒの間の置換
である。
【０１３６】 従って、表１のポリペプチドのフラグメント、誘導体、アナログ、またはホモ
ログ、あるいは表１に列挙されるプラスミドによってコードされるものは、（ｉ
）１つ以上のアミノ酸残基が、保存されたかまたは保存されていないアミノ酸残
基（好ましくは、保存されたアミノ酸残基）によって置換され、そしてそのよう
な置換されたアミノ酸残基は、遺伝子コードによってコードされ得るか、または
されないかもしれないもの；あるいは（ｉｉ）１つ以上のアミノ酸残基が、置換
基を含むもの；あるいは（ｉｉｉ）Ｓ．ａｕｒｅｕｓポリペプチドが、別の化合
物（例えば、そのポリペプチドの半減期を増大させる化合物（例えば、ポリエチ
レングリコール））に融合したもの；あるいは（ｉｖ）さらなるアミノ酸が上記
の形態のポリペプチドに融合したもの（例えば、ＩｇＧ Ｆｃ融合領域ペプチド
またはリーダーまたは分泌配列または上記の形態のポリペプチドもしくはプロタ
ンパク質配列の精製に使用される配列）であり得る。このようなフラグメント、
誘導体、およいびアナログは、本明細書の教示から当業者の技術範囲内であると
解釈される。
【０１３７】 従って、本発明のＳ．ａｕｒｅｕｓポリペプチドは、天然の変異もしくはヒト
操作のいずれかに由来する１つ以上のアミノ酸置換、欠失、または付加を含み得
る。示されるように、変化は、好ましくは、そのタンパク質の折り畳みまたは活
性に有意に影響を与えない保存的アミノ酸置換のようなマイナーな性質のもので
ある（表３を参照のこと）。
【０１３８】
【表３】 機能に必須である本発明のＳ．ａｕｒｅｕｓタンパク質中のアミノ酸は、当該
分野で公知の方法（例えば、部位特異的変異誘発またはアラニンスキャニング変
異誘発）によって同定され得る。例えば、Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍら（１９８９）
Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４４：１０８１−１０８５を参照のこと。後者の手順は、そ
の分子中の全ての残基位置で単一アラニン置換を導入する。次いで、得られる変
異体分子は、特定のタンパク質の機能を測定するために適切なアッセイを使用し
て生物学的活性について試験される。
【０１３９】 高度に所望される改善された特徴（例えば、凝集しにくい）を有するタンパク
質を産生し得る他の荷電したかまたは天然のアミノ酸での荷電アミノ酸の置換が
特に興味深い。凝集は、活性を減少し得るのみでなく、薬学的処方物を調製する
際には問題でもあり得る。なぜなら、凝集体は免疫原性であり得るからである。
例えば、Ｐｉｎｃｋａｒｄら（１９６７）Ｃｌｉｎ．Ｅｘｐ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．
２：３３１−３４０；Ｒｏｂｂｉｎｓら（１９８７）Ｄｉａｂｅｔｅｓ ３６：
８３８−８４５；Ｃｌｅｌａｎｄら（１９９３）Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｔｈｅｒａ
ｐｅｕｔｉｃ Ｄｒｕｇ Ｃａｒｒｉｅｒ Ｓｙｓｔｅｍｓ １０：３０７−３
７７を参照のこと。
【０１４０】 本発明のポリペプチドは、好ましくは、単離された形態で提供され、そして好
ましくは、実質的に精製されている。Ｓ．ａｕｒｅｕｓポリペプチドの組換え産
生されたバージョンは、Ｓｍｉｔｈら（１９８８）Ｇｅｎｅ ６７：３１−４０
に記載される１ステップ法によって実質的に精製され得る。本発明のポリペプチ
ドはまた、天然または組換えの供給源から、タンパク質精製の分野で周知の方法
において、本発明のポリペプチドに対する抗体を使用して、精製され得る。
【０１４１】 本発明はさらに、（ａ）表１に示される完全アミノ酸配列を有する全長Ｓ．ａ
ｕｒｅｕｓポリペプチドのアミノ酸配列；（ｂ）表１に示される、Ｎ末端メチオ
ニンを除く完全アミノ酸配列を有する全長Ｓ．ａｕｒｅｕｓポリペプチドのアミ
ノ酸配列；（ｃ）表１に列挙されるプラスミドによってコードされる完全アミノ
酸配列；ならびに（ｄ）表１に列挙されるプラスミドによってコードされるＮ末
端メチオニンを除く完全アミノ酸配列、からなる群から選択されるアミノ酸配列
を含む単離されたＳ．ａｕｒｅｕｓポリペプチドを提供する。本発明のポリペプ
チドはまた、上記（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、および（ｄ）に記載されるものに、
少なくとも８０％同一、より好ましくは、少なくとも９０％同一、そしてなおよ
り好ましくは、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるアミ
ノ酸配列を有するポリペプチドを包含する。
【０１４２】 本発明のさらなるポリペプチドには、上記のものに対して、少なくとも９０％
類似性、より好ましくは、少なくとも９５％類似性、そしてなおより好ましくは
、少なくとも９６％、９７％、９８％、または９９％類似性を有するポリペプチ
ドが含まれる。
【０１４３】 本発明のさらなる実施態様は、少なくとも１つの保存的アミノ酸置換を含むが
、５０を超えない保存的アミノ酸置換、４０を超えない保存的アミノ酸置換、３
０を超えない保存的アミノ酸置換、そして２０を超えない保存的アミノ酸置換を
含むアミノ酸配列を有するＳ．ａｕｒｅｕｓポリペプチドのアミノ酸配列を含む
ポリペプチドに関する。少なくとも１つを有するが、１０、９、８、７、６、５
、４、３、２、または１を超えない保存的アミノ酸置換を有するＳ．ａｕｒｅｕ
ｓポリペプチドのアミノ酸配列を含むポリペプチドもまた提供される。
【０１４４】 本発明の問い合わせアミノ酸配列に対して例えば、少なくとも９５％「同一」
なアミノ酸配列を有するポリペプチドにより、対象ポリペプチド配列が、問い合
わせアミノ酸配列の各１００アミノ酸ごとに５つまでのアミノ酸変化を有し得る
ことを除いて、対象ポリペプチドのアミノ酸配列が問い合わせ配列に対して同一
であることが意図される。換言すれば、問い合わせアミノ酸配列に対して少なく
とも９５％同一なアミノ酸配列を有するポリペプチドを得るために、対象配列に
おける５％までのアミノ酸残基が、別のアミノ酸配列で、挿入、欠失、（消去）
、または置換され得る。参照配列中のこれらの変化は、参照アミノ酸配列のアミ
ノ末端またはカルボキシ末端位置で生じ得るか、またはこれらの末端位置の間の
どこかで、参照配列の残基の間に個々に、もしくは参照配列内の１つ以上の連続
する基においてのいずれかで、挟まれて、生じ得る。
【０１４５】 実際問題として、任意の特定のポリぺプチドが、例えば、表１に示されるアミ
ノ酸配列、または表１に列挙されるプラスミドによりコードされるアミノ酸配列
に対して少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同
一であるか否かは、公知のコンピュータープログラムを使用して従来的に決定さ
れ得る。問い合わせ配列（本発明の配列）と対象配列との間の最も良好な全体的
な適合性（全体的な配列整列としてもまた参照される）を決定するための好まし
い方法は、Ｂｒｕｔｌａｇら（Ｃｏｍｐ．Ａｐｐ．（１９９０）Ｂｉｏｓｃｉ．
６：２３７−２４５）のアルゴリズムに基づくＦＡＳＴＤＢコンピュータープロ
グラムを使用して決定され得る。配列整列において、問い合わせ配列および対象
配列は、両方ともにアミノ酸配列である。この全体的な配列整列の結果は、同一
性パーセント（％）で示される。ＦＡＳＴＤＢアミノ酸整列において使用される
好ましいパラメーターは：Ｍａｔｒｉｘ＝ＰＡＭ ０、ｋ−ｔｕｐｌｅ＝２、Ｍ
ｉｓｍａｔｃｈ Ｐｅｎａｌｔｙ＝１、Ｊｏｉｎｉｎｇ Ｐｅｎａｌｔｙ＝２０
、Ｒａｎｄｏｍｉｚａｔｉｏｎ Ｇｒｏｕｐ Ｌｅｎｇｔｈ＝０、Ｃｕｔｏｆｆ
Ｓｃｏｒｅ＝１、Ｗｉｎｄｏｗ Ｓｉｚｅ＝配列長、Ｇａｐ Ｐｅｎａlｔｙ
＝５、Ｇａｐ Ｓｉｚｅ Ｐｅｎａｌｔｙ＝０．０５、Ｗｉｎｄｏｗ Ｓｉｚｅ
＝５００または参照アミノ酸配列の長さ（どちらかより短い方）である。
【０１４６】 対象配列が、Ｎ末端またはＣ末端欠失のために（内部欠失のためではなく）問
い合わせ配列より短い場合、手動の補正が同一性パーセントの結果に対してなさ
れなけらばならない。これは、全体的同一性パーセントを計算する場合に、ＦＡ
ＳＴＤＢプログラムが対象配列のＮ末端およびＣ末端切断を考慮しないからであ
る。Ｎ末端およびＣ末端で切断される対象配列について、問い合わせ配列に対し
て、同一性パーセントは、問い合わせ配列の総塩基のパーセントとして、対応す
る参照残基と一致／整列しない対象配列のＮ末端およびＣ末端側である問い合わ
せ配列の残基の数を計算することによって補正される。残基が一致／整列されて
いるか否かは、ＦＡＳＴＤＢ配列整列の結果によって決定される。次いで、この
パーセントは、同一性パーセントから差し引かれ、上記のＦＡＳＴＤＢプログラ
ムによって特定のパラメーターを使用して計算され、最終的な同一性パーセント
のスコアに到達する。この最終的な同一性パーセントのスコアは、本発明の目的
で使用されるものである。問い合わせ配列と一致／整列していない対象配列のＮ
末端およびＣ末端側の残基のみが、同一性パーセントのスコアを手動で調整する
目的で考慮される。すなわち、対象配列の最も遠いＮ末端およびＣ末端残基の外
側の問い合わせアミノ酸残基位置のみである。
【０１４７】 例えば、９０アミノ酸残基の対象配列は、同一性パーセントを決定するために
１００残基の問い合わせ配列と整列される。欠失は、対象配列のＮ末端で生じ、
従ってＦＡＳＴＤＢ整列は、Ｎ末端での最初の１０残基の一致／整列を示さない
。１０個の不対合残基は、配列の１０％（一致していないＮ末端およびＣ末端で
の残基の数／問い合わせ配列中の残基の総数）を表し、その結果ＦＡＳＴＤＢプ
ログラムによって計算される同一性パーセントのスコアから１０％が差し引かれ
る。残りの９０残基が完全に一致した場合、最終的な同一性パーセントは９０％
である。別の例において、９０残基の対象配列が、１００残基の問い合わせ配列
と比較される。この場合、欠失は、内部欠失であり、そのため問い合わせ配列と
一致／整列しない対象配列のＮ末端またはＣ末端の残基は存在しない。この場合
、ＦＡＳＴＤＢによって算出される同一性パーセントは、手動で補正されない。
再び、ＦＡＳＴＤＢ整列において示される、問い合わせ配列と一致／整列しない
対象配列のＮ末端およびＣ末端の外の残基位置のみが手動で補正される。他の手
動の補正は、本発明の目的のためにはなされない。
【０１４８】 上記のポリペプチド配列は、それらがその正常な生物学的活性を有するか否か
にかかわらず含まれる。なぜなら、特定のポリペプチド分子が生物学的活性を有
さない場合でさえ、当業者はなお、ポリペプチドの使用方法（例えば、ワクチン
として、または抗体の作製のために）について知っているからである。Ｓ．ａｕ
ｒｅｕｓ活性を有さない本発明のポリペプチドの他の使用としては、当業者に公
知の方法を用いて、特に、エピトープタグとして、エピトープマッピングにおい
て、そしてＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルまたは分子ふるいゲル濾過カラム上の分子量マ
ーカーとしての使用が挙げられる。
【０１４９】 以下に記載のように、本発明のポリペプチドはまた、ポリクローナル抗体およ
びモノクローナル抗体を惹起するために用いられ得る。これらの抗体は、Ｓ．ａ
ｕｒｅｕｓタンパク質発現を検出するためのアッセイにおいて、またはＳ．ａｕ
ｒｅｕｓのタンパク質機能を増強もしくは阻害し得るアゴニストおよびアンタゴ
ニストとして有用である。さらに、このようなポリペプチドは、Ｓ．ａｕｒｅｕ
ｓタンパク質結合タンパク質（これは、また本発明による候補アゴニストおよび
候補アンタゴニストである）を「捕捉」するための酵母ツーハイブリッド系にお
いて用いられ得る。例えば、Ｆｉｅｌｄｓら（１９８９）Ｎａｔｕｒｅ ３４０
：２４５〜２４６を参照のこと。
【０１５０】 （エピトープ保有部位） 別の局面において、本発明は、本発明のポリペプチドのエピトープ保有部分を
含むペプチドおよびポリペプチドを提供する。これらのエピトープは、本発明の
ポリペプチドの免疫原性エピトープまたは抗原性エピトープである。「免疫原性
エピトープ」は、本発明のポリペプチド全体またはそのフラグメントが免疫原で
ある場合、インビボにおいて抗体応答を誘発するタンパク質の部分と定義される
。一方では、抗体が結合し得るポリペプチドの領域は、「抗原決定基」または「
抗原性エピトープ」と定義される。タンパク質の免疫原性エピトープのインビボ
の数は、一般に、抗原性エピトープの数より少ない。例えば、Ｇｅｙｓｅｎら、
（１９８３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８１：３９９８
−４００２を参照のこと。しかし、抗体は、それが免疫原性エピトープであるか
否かにかかわらず、ファージ提示のような方法を用いることにより、任意の抗原
性エピトープを生じ得る。例えば、Ｐｅｔｅｒｓｅｎ Ｇ．ら（１９９５）Ｍｏ
ｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．２４９：４２５〜４３１を参照のこと。従って、免疫
原性エピトープおよび抗原性エピトープの両方が本発明に含まれる。
【０１５１】 本発明の免疫原性エピトープを含む例証的なアミノ酸配列の一覧表を本明細書
に記載する。これらの説明は、ＪａｍｅｓｏｎおよびＷｏｌｆ（１９８８）Ｃｏ
ｍｐ．Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｓｃｉ．４：１８１〜１８６（この参考文献はその全体
が参考として援用される）のアルゴリズムを用いて、最高程度の抗原性を有する
と予想されるエピトープを含むアミノ酸残基を単に列挙することが示される。Ｊ
ａｍｅｓｏｎ−Ｗｏｌｆ抗原性分析は、デフォルトパラメーターを用いる、コン
ピュータープログラムＰＲＯＴＥＡＮを用いて実行された（Ｐｏｗｅｒ Ｍａｃ
Ｉｎｔｏｓｈ用（バージョン３．１１），ＤＮＡＳＴＡＲ，Ｉｎｃ．，１２２８
Ｓｏｕｔｈ Ｐａｒｋ Ｓｔｒｅｅｔ Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）。他の免疫原
性エピトープを含むアミノ酸残基は、Ｊａｍｅｓｏｎ−Ｗｏｌｆ分析に類似のア
ルゴリズムを用いて、または当該分野で公知の方法を用いる抗原性応答のための
インビボ試験により、日常的に決定され得る。例えば、Ｇｅｙｓｅｎら、前出；
米国特許第４，７０８，７８１号；同第５，１９４，３９２号、同第４，４３３
，０９２号；および同第５，４８０，９７１号（これらの参考資料はその全体が
参考として援用される）を参照のこと。
【０１５２】 この記載されたエピトープ性アミノ酸配列は、免疫原性エピトープを含むこと
が特に示される。表２は、Ｊａｍｅｓｏｎ−Ｗｏｌｆ分析により決定された免疫
原性エピトープの重要な残基のみを列挙する。従って、Ｎ末端、Ｃ末端またはＮ
末端およびＣ末端の両方のいずれかに隣接するさらなる残基が、配列に付加され
、本発明のエピトープ保有ポリペプチドを生成し得る。従って、免疫原性エピト
ープは、さらなるＮ末端またはＣ末端アミノ酸残基を含み得る。さらなる隣接ア
ミノ酸残基は、本発明のポリペプチド（異種ポリペプチド配列）由来の連続して
隣接するＮ末端および／またはＣ末端配列であり得るか、または本発明のポリペ
プチド由来の連続隣接配列および異種ポリペプチド配列の両方を含み得る。
【０１５３】 免疫原性エピトープまたは抗原性エピトープを含む本発明のポリペプチドは、
少なくとも７アミノ酸残基長である。「少なくとも」とは、免疫原性エピトープ
または抗原性エピトープを含む本発明のポリペプチドが、７アミノ酸残基長であ
り得るか、７アミノ酸と本発明の完全長ポリペプチドのアミノ酸残基数との間の
任意の整数であり得ることを意味する。免疫原性エピトープまたは抗原性エピト
ープを含む好ましいポリペプチドは、少なくとも１０、１５、２０、２５、３０
、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０
、９５または１００アミノ酸残基長である。しかし、７と完全長ポリペプチドの
アミノ酸残基数との間のそれぞれの整数およびあらゆる整数が本発明に含まれる
ことが示される。
【０１５４】 免疫原性エピトープ保有フラグメントおよび抗原性エピトープ保有フラグメン
トは、上記のような連続するアミノ酸残基の数によって特定化され得るか、また
は配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０または２２の
アミノ酸配列上のこれらのフラグメントのＮ末端およびＣ末端位置によりさらに
特定化され得るかのいずれかである。フラグメント（例えば、少なくとも７また
は少なくとも１５連続アミノ酸残基長）が配列番号２のアミノ酸配列を占め得る
Ｎ末端位置およびＣ末端位置のあらゆる組み合わせが本発明に含まれる。再度、
「少なくとも７連続アミノ酸残基長」とは、７アミノ酸残基長または７アミノ酸
と本発明の完全長ポリペプチドのアミノ酸残基数との間の任意の整数を意味する
。特に７と全長ポリペプチドのアミノ酸残基数との間のそれぞれの整数およびあ
らゆる整数が本発明に含まれる。
【０１５５】 本発明の免疫原性エピトープ保有ポリペプチドおよび抗原性エピトープ保有ポ
リペプチドは、例えば、本発明のポリペプチドを特異的に結合する抗体を作製す
るため、および本発明のポリペプチドを検出するためのイムノアッセイにおいて
有用である。この抗体は、例えば、本発明のポリペプチドのアフィニティー精製
において有用である。この抗体はまた、当該分野で公知の方法を用いる、種々の
定性的イムノアッセイまたは定量的イムノアッセイにおいて（特に本発明のポリ
ペプチドのために）慣用的に用いられ得る。例えば、Ｈａｒｌｏｗら、Ａｎｔｉ
ｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒ
ｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ；第２版、１９８８
）を参照のこと。
【０１５６】 本発明のエピトープ保有ポリペプチドは、当該分野で公知の合成方法および組
換え方法を含むポリペプチド作製のための任意の従来の手段により産生され得る
。例えば、エピトープ保有ペプチドは、化学合成の公知の方法を用いて合成され
得る。例えば、Ｈｏｕｇｈｔｅｎは、多数のペプチド（例えば、２４８の個々の
１０〜２０ｍｇ）およびＨＡ１ペプチドのセグメントの単一アミノ酸改変体を示
す別個の１３残基ペプチド（そのすべては、４週間未満で調製されそして特徴付
けられた（ＥＬＩＳＡ型の結合研究により））の合成のための簡易な方法を記載
している（Ｈｏｕｇｈｔｅｎ，Ｒ．Ａ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ
．ＵＳＡ ８２：５１３１〜５１３５（１９８５））。この「Ｓｉｍｕｌｔａｎ
ｅｏｕｓ Ｍｕｌｔｉｐｌｅ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（ＳＭＰＳ
）」プロセスは、Ｈｏｕｇｈｔｅｎおよび共同研究者（１９８６）の米国特許第
４，６３１，２１１号にさらに記載される。この手順において、種々のペプチド
の固相合成のための個々のレジンは、別々の溶媒透過性パケットに含まれ、固相
方法に関与する多数の同一反復工程の最適使用を可能にする。完全に手動手順は
、５００〜１０００以上の合成が同時に実行されることを可能にする（Ｈｏｕｇ
ｈｔｅｎら（１９８５）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８２：５１３
１〜５１３５の５１３４）。
【０１５７】 本発明のエピトープ保有ポリペプチドは、インビボ免疫化、インビトロ免疫化
およびファージ提示方法を含むがこれらに限定されない、当該分野で周知の方法
による抗体を誘導するために用いられる。例えば、Ｓｕｔｃｌｉｆｆｅら、前出
；Ｗｉｌｓｏｎら、前出、およびＢｉｔｔｌｅら（１９８５）Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉ
ｒｏｌ．６６：２３４７〜２３５４を参照のこと。インビボ免疫化が用いられる
場合、動物は遊離のペプチドで免疫化され得る；しかし、抗ペプチド抗体力価は
、高分子キャリア（例えば、キーホールリンペットヘモシニアン（ＫＬＨ）また
は破傷風毒素）へのペプチドの結合によりブーストされ得る。例えば、システイ
ン残基を含むペプチドは、マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミ
ドエステル（ＭＢＳ）のようなリンカーを用いてキャリアに結合され得、一方、
他のペプチドは、グルタルアルデヒドのような、より一般的な結合剤を用いてキ
ャリアに結合され得る。ウサギ、ラットおよびマウスのような動物は、遊離のペ
プチドまたはキャリア結合ペプチドのいずれかを用いて、例えば、約１００μｇ
のペプチドまたはキャリアタンパク質およびフロイントアジュバントを含有する
乳濁液の腹腔内および／または皮内注射によって免疫される。いくつかのブース
ター注射は、有用な力価の抗ペプチド抗体（例えば、固相に吸着する遊離のペプ
チドを用いるＥＬＩＳＡアッセイにより検出され得る）を提供するために、例え
ば、約２週間の間隔で、必要であり得る。免疫された動物由来の血清における抗
ペプチド抗体の力価は、抗ペプチド抗体の選択により（例えば、当該分野で周知
の方法による、固体支持体上のペプチドへの吸着および選択した抗体の溶出によ
り）上昇され得る。
【０１５８】 当業者が理解するように、そして上記で考察したように、免疫原性エピトープ
または抗原性エピトープを含む本発明のポリペプチドが、異種のポリペプチド配
列に融合され得る。例えば、本発明のポリペプチドは、免疫グロブリン（ＩｇＡ
、ＩｇＥ、ＩｇＧ、ＩｇＭ）の定常ドメインまたはその部分（ＣＨ１、ＣＨ２、
ＣＨ３、ドメイン全体およびドメインの部分の両方を含むその任意の組み合わせ
）と融合し、キメラポリペプチドを生じ得る。これらの融合タンパク質は、精製
を容易にし、そしてインビボにおける半減期の延長を示す。このことは、例えば
、ヒトＣＤ４ポリペプチドの最初の２つのドメイン、および哺乳動物免疫グロブ
リンの重鎖または軽鎖の定常領域の種々のドメインからなるキメラタンパク質に
ついて示されている。例えば、ＥＰＡ０，３９４，８２７；Ｔｒａｕｎｅｃｋｅ
ｒら（１９８８）Ｎａｔｕｒｅ ３３１：８４〜８６を参照のこと。ＩｇＧ部分
に起因するジスルフィド結合二量体構造を有する融合タンパク質はまた、単量体
ポリペプチドまたはそのフラグメント単独よりも他の分子を結合および中和する
ことにおいてより効果的であり得る。例えば、Ｆｏｕｎｔｏｕｌａｋｉｓら（１
９９５）Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２７０：３９５８〜３９６４を参照のこと。上記
のエピトープをコードする核酸はまた、発現されるポリペプチドの検出および精
製において補助するためのエピトープタグとして目的の遺伝子で組み換えられ得
る。
【０１５９】
【表２】 （抗体） 本発明はさらに、本発明のポリペプチドに特異的に結合する抗体およびＴ細胞
抗原レセプター（ＴＣＲ）に関する。本発明の抗体としては、ＩｇＧ（ＩｇＧ１
、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３およびＩｇＧ４を含む）、ＩｇＡ（ＩｇＡ１およびＩｇＡ
２を含む）、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、およびＩｇＹが挙げられる。本明細書中
で使用される場合、用語「抗体」（Ａｂ）は、単鎖抗体全体、およびこれらの抗
原結合フラグメントを含む、抗体全体を含むことを意味する。最も好ましくは、
抗体は、本発明のヒト抗原結合抗体フラグメントであり、Ｆａｂ、Ｆａｂ’およ
びＦ（ａｂ’）２、Ｆｄ、単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）、単鎖抗体、ジスルフィド結合
化Ｆｖ（ｓｄＦｖ）、ならびにＶLドメインまたはＶHドメインのいずれかを含む
フラグメントを含むがこれらに限定されない。これらの抗体は、鳥類および哺乳
動物を含む任意の動物起源由来であり得る。好ましくは、これらの抗体はヒト、
ネズミ、ウサギ、ヤギ、モルモット、ラクダ、ウマ、またはニワトリの抗体であ
る。
【０１６０】 抗原結合抗体フラグメント（単鎖抗体を含む）は、可変領域単独、または以下
の全体もしくは一部との組合せを含み得る：ヒンジ領域、ＣＨ１ドメイン、ＣＨ
２ドメイン、およびＣＨ３ドメイン。本発明内には、可変領域とヒンジ領域、Ｃ
Ｈ１ドメイン、ＣＨ２ドメイン、およびＣＨ３ドメインとの任意の組合せもまた
含まれる。本発明はさらに、本発明のポリペプチドを特異的に結合する、キメラ
抗体、ヒト化抗体、ならびにヒトモノクローナル抗体およびヒトポリクローナル
抗体を含む。本発明はさらに、本発明の抗体に対して抗イディオタイプである抗
体を含む。
【０１６１】 本発明の抗体は、単一抗原特異的、二抗原特異的、三抗原特異的またはより多
くの多抗原特異的であり得る。多抗原特異的な抗体は、本発明のポリペプチドの
異なるエピトープに特異的であり得るか、または本発明のポリペプチドならびに
異種組成物（例えば、異種ポリペプチドもしくは固体支持材料）の両方に特異的
であっても良い。例えば、ＷＯ９３／１７７１５；ＷＯ９２／０８８０２；ＷＯ
９１／００３６０；ＷＯ９２／０５７９３；Ｔｕｔｔ．Ａら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏ
ｌ．１４７：６０〜６９（１９９１）；米国特許第５，５７３，９２０号、同第
４，４７４，８９３号、同第５，６０１，８１９号、同第４，７１４，６８１号
、同第４，９２５，６４８号；Ｋｏｓｔｅｌｎｙ．Ｓ．Ａ．ら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎ
ｏｌ．１４８：１５４７〜１５５３（１９９２）を参照のこと。
【０１６２】 本発明の抗体は、抗体によって認識されるかまたは特異的に結合される本発明
のポリペプチドのエピトープまたは部分について記載または特定され得る。この
エピトープまたはポリペプチド部分は、本明細書中に記載されるように、例えば
、Ｎ末端位置およびＣ末端位置によって、連続するアミノ酸残基のサイズによっ
て、または表および図に列挙されるように特定され得る。本発明の任意のエピト
ープまたはポリペプチドを特異的に結合する抗体はまた、除外され得る。従って
、本発明は、本発明のポリペプチドを特異的に結合する抗体を含み、そしてその
抗体の除外を可能にする。
【０１６３】 本発明の抗体はまた、これらの交差反応性について記載または特定され得る。
本発明のポリペプチドの任意の他のアナログ、オーソログ（ｏｒｔｈｏｌｏｇ）
、またはホモログを結合しない抗体は、含まれる。本発明のポリペプチドに対し
て、９５％未満、９０％未満、８５％未満、８０％未満、７５％未満、７０％未
満、６５％未満、６０％未満、５５％未満、および５０％未満の同一性（当該分
野で公知の方法、および本明細書中に記載される方法を使用して計算されるよう
に）を有するポリペプチドを結合しない抗体もまた、本発明に含まれる。本発明
において、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件（本明細書中に記載
されるような）下において本発明のポリヌクレオチドにハイブリダイズするポリ
ヌクレオチドによってコードされるポリペプチドのみを結合する抗体が、さらに
含まれる。本発明の抗体はまた、これらの結合親和性について記載または特定さ
れ得る。好ましい結合親和性としては、５×１０-6Ｍ、１０-6Ｍ、５×１０-7Ｍ
、１０-7Ｍ、５×１０-8Ｍ、１０-8Ｍ、５×１０-9Ｍ、１０-9Ｍ、５×１０-10
Ｍ、１０-10Ｍ、５×１０-11Ｍ、１０-11Ｍ、５×１０-12Ｍ、１０-12Ｍ、５×
１０-13Ｍ、１０-13Ｍ、５×１０-14Ｍ、１０-14Ｍ、５×１０-15Ｍ、および１
０-15Ｍ未満の解離定数またはＫｄを有する結合親和性が挙げられる。
【０１６４】 本発明の抗体は、本発明のポリペプチドを精製、検出、および標的化する、当
該分野で公知の方法を含むがこれらに限定されない使用を有し、これは、インビ
トロおよびインビボの両方の診断方法ならびに治療方法を含む。例えば、これら
の抗体は、生物学的サンプルにおいて本発明のポリペプチドのレベルを定性的お
よび定量的に測定するための免疫アッセイにおける使用を有する。例えば、Ｈａ
ｒｌｏｗら、ＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ：Ａ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ ＭＡＮＵＡＬ
（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ
、第２版、１９９８）を参照のこと（これらの全体が参考として援用される）。
【０１６５】 本発明の抗体は、単独で、または他の組成物と組み合わせて使用され得る。こ
れらの抗体はさらに、Ｎ末端もしくはＣ末端で異種ポリペプチドに対して組換え
的に融合され得るか、またはポリペプチドもしくは他の組成物に対して化学的に
結合体化され得る（共有結合および非共有結合体化を含む）。例えば、本発明の
抗体は、異種ポリペプチド、薬物、または毒素のような、検出アッセイにおける
標識、およびエフェクター分子として有用である分子に組換え的に融合され得る
か、または結合体化され得る。例えば、ＷＯ９２／０８４９５；ＷＯ９１／１４
４３８；ＷＯ８９／１２６２４；米国特許第５，３１４，９９５号；およびＥＰ
０ ３９６ ３８７を参照のこと。
【０１６６】 本発明の抗体を、当該分野において公知である任意の適切な方法により調製し
得る。例えば、本発明のポリペプチドまたはその抗原性フラグメントは、ポリク
ローナル抗体を含む血清の産生を誘導するために動物に投与され得る。モノクロ
ーナル抗体は、ハイブリドーマ技術および組換え技術の使用を含む、当該分野に
おいて公知である広範な技術を使用して調製され得る。例えば、Ｈａｒｌｏｗら
、ＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ：Ａ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ ＭＡＮＵＡＬ、（Ｃｏｌ
ｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ．第２版
、１９８８）：Ｈａｍｍｅｒｌｉｎｇら、：ＭＯＮＯＣＬＯＮＡＬ ＡＮＴＩＢ
ＯＤＩＥＳ ＡＮＤ Ｔ−ＣＥＬＬ ＨＹＢＲＩＤＯＭＡＳ ５６３〜６８１（
Ｅｌｓｅｖｉｅｒ、Ｎ．Ｙ．、１９８１）（上記の参考文献は、その全体が参考
として援用される）を参照のこと。
【０１６７】 ＦａｂおよびＦ（ａｂ’）２フラグメントは、パパイン（Ｆａｂフラグメント
を産生するため）またはペプシン（Ｆ（ａｂ’）２フラグメントを産生するため
）のような酵素を使用して、タンパク質分解性切断によって産生され得る。
【０１６８】 あるいは、本発明の抗体は、当該分野で公知である方法を使用する、組換えＤ
ＮＡ技術の適用を通じてかまたは合成化学を通じて産生され得る。例えば、本発
明の抗体は、当該分野で公知である種々のファージディスプレイ法を使用して調
製され得る。ファージディスプレイ法では、機能的な抗体ドメインは、それらを
コードするポリヌクレオチド配列を運ぶファージ粒子の表面上に提示される。所
望の結合特性を有するファージは、抗原（代表的には固体表面またはビーズに結
合されたかまたは捕捉された抗原）を用いて直接的に選択することによって、レ
パートリーまたはコンビナトリアル抗体ライブラリー（例えば、ヒトまたはマウ
ス、から選択される。これらの方法で使用されるファージは、代表的には、Ｆａ
ｂを有するｆｄおよびＭ１３を含む糸状ファージである。Ｆｖまたはジスルフィ
ドで安定化されたＦｖ抗体ドメインは、ファージ遺伝子ＩＩＩまたは遺伝子ＶＩ
ＩＩタンパク質のいずれかに組換え融合される。本発明の抗体を作製するために
使用され得るファージディスプレイ法の例は、Ｂｒｉｎｋｍａｎ Ｕ．ら、Ｊ．
Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ １８２：４１〜５０（１９９５）：Ａｍｅｓ
，Ｒ．Ｓ．ら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ １８４：１７７〜１８６
（１９９５）：Ｋｅｔｔｌｅｂｏｒｏｕｇｈ．Ｃ．Ａ．ら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍ
ｕｎｏｌ．２４：９５２〜９５８（１９９４）；Ｐｅｒｓｉｃ，Ｌ．ら、Ｇｅｎ
ｅ １８７：９〜１８（１９９７）；Ｂｕｒｔｏｎ，Ｄ．Ｒ．ら、Ａｄｖａｎｃ
ｅｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ５７：１９１〜２８０（１９９４）；ＰＣ
Ｔ／ＧＢ９１／０１１３４；ＷＯ９０／０２８０９；ＷＯ９１／１０７３７；Ｗ
Ｏ９２／０１０４７；ＷＯ９２／１８６１９；ＷＯ ９３／１１２３６；ＷＯ
９５／１５９８２；ＷＯ ９５／２０４０１；および米国特許第５，６９８，４
２６号、同第５，２２３，４０９号、同第５，４０３，４８４号、同第５，５８
０，７１７号、同第５，４２７，９０８号、同第５，７５０，７５３号、同第５
，８２１，０４７号、同第５，５７１，６９８号、同第５，４２７，９０８号、
同第５，５１６，６３７号、同第５，７８０，２２５号、同第５，６５８，７２
７号および同第５，７３３，７４３号（上記の参考文献は、それらの全体が参考
として援用される）に開示されるものを含む。
【０１６９】 上記の参考文献に記載されるように、ファージ選択の後、ファージからの抗体
コード領域を単離し得、そして使用し、抗体全体（ヒト抗体を含む）、または任
意の他の所望される抗原結合フラグメントを生成し、そして任意の所望される宿
主（哺乳動物細胞、昆虫細胞、植物細胞、酵母、および細菌を含む）中で発現す
る。例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’およびＦ（ａｂ’）２フラグメントを組換え産生
するための技術もまた、当該分野で公知の方法（例えば、ＷＯ９２／２２３２４
；Ｍｕｌｌｉｎａｘ．Ｒ．Ｌ．ら、ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ １２（６）：
８６４〜８６９（１９９２）；およびＳａｗａｉ．Ｈ．ら、ＡＪＲＩ ３４：２
６〜３４（１９９５）；ならびにＢｅｔｔｅｒ，Ｍ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４
０：１０４１〜１０４３（１９８８）に開示される方法）（上記の参考文献は、
それらの全体が参考として援用される）を使用して用いられ得る。
【０１７０】 単鎖Ｆｖおよび抗体を産生するために使用され得る技術の例は、米国特許第４
，９４６，７７８号および同第５，２５８，４９８号；Ｈｕｓｔｏｎら（１９９
１）Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ ２０３：４６〜８８；Ｓｈ
ｕ，Ｌ．ら（１９９３）ＰＮＡＳ ９０；７９９５〜７９９９；およびＳｋｅｒ
ｒａ，Ａ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４０：１０３８〜１０４０（１９８８）に記
載されるものを含む。ヒトにおける抗体のインビボでの使用およびインビトロで
の検出アッセイを含む、いくつかの使用については、キメラ、ヒト化、またはヒ
ト抗体を使用することは、好ましくあり得る。キメラ抗体を産生するための方法
は、当該分野において公知である。例えば、Ｍｏｒｒｉｓｏｎ、Ｓｃｉｅｎｃｅ
２２９：１２０２（１９８５）；Ｏｉら、ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ４：
２１４（１９８６）；Ｇｉｌｌｉｅｓ，Ｓ．Ｄ．ら（１９８９）Ｊ．Ｉｍｍｕｎ
ｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ １２５：１９１〜２０２；および米国特許第５，８０７
，７１５号を参照のこと。抗体は、ＣＤＲグラフト化（ｇｒａｆｔｉｎｇ）（Ｅ
Ｐ ０ ２３９ ４００；ＷＯ ９１／０９９６７；米国特許第５，５３０，１
０１号；および同第５，５８５，０８９号）、被膜化（ｖｅｎｅｅｒｉｎｇ）ま
たは再表面化（ｒｅｓｕｒｆａｃｉｎｇ）（ＥＰ ０ ５９２ １０６；ＥＰ
０ ５１９ ５９６；Ｐａｄｌａｎ Ｅ．Ａ．、（１９９１）Ｍｏｌｅｃｕｌａ
ｒ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ２８（４／５）：４８９〜４９８；Ｓｔｕｄｎｉｃ
ｋａ Ｇ．Ｍ．ら（１９９４）Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ７（
６）：８０５〜８１４；Ｒｏｇｕｓｋａ Ｍ．Ａ．ら（１９９４） ＰＮＡＳ
９１：９６９〜９７３）、ならびに鎖シャッフリング（米国特許第５，５６５，
３３２号）を含む、種々の技術を使用してヒト化され得る。ヒト抗体は、上記の
ファージディスプレイ法を含む、当該分野で公知の種々の方法によって作製され
得る。米国特許第４，４４４，８８７号、同第４，７１６，１１１号、同第５，
５４５，８０６号、および同第５，８１４，３１８号；ならびにＷＯ ９８／４
６６４５（上記の参考文献は、それらの全体が参考として援用される）もまた参
照のこと。
【０１７１】 さらに、本発明において、本発明のポリペプチドに組換え融合されたかまたは
化学的に結合体化された抗体が（共有結合性および非共有結合性の両方の結合体
を含む）含まれる。この抗体は、本発明のポリペプチド以外の抗原に特異的であ
り得る。例えば、抗体を使用し、本発明のポリペプチドを、インビトロまたはイ
ンビボのいずれかで、本発明のポリペプチドを特定の細胞表面レセプターに特異
的な抗体に融合させるかまたは結合させることによって、特定の細胞型に標的化
し得る。本発明のポリペプチドに融合されたかまたは結合体化された抗体はまた
、当該分野で公知の方法を使用してインビトロイムノアッセイおよび精製方法に
て使用され得る。例えば、Ｈａｒｂｏｒら、前出およびＷＯ ９３／２１２３２
；ＥＰ ０ ４３９ ０９５；Ｎａｒａｍｕｒａ，Ｍ．ら、Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｌ
ｅｔｔ．３９：９１〜９９（１９９４）；米国特許第５，４７４，９８１号：Ｇ
ｉｌｌｉｅｓ，Ｓ．Ｏ．ら（１９９２）ＰＮＡＳ ８９：１４２８〜１４３２；
Ｆｅｌｌ，Ｈ．Ｐ．ら、（１９９１）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ． １４６：２４４６
〜２４５２（上記の参考文献は、それらの全体が参考として援用される）を参照
のこと。
【０１７２】 本発明はさらに、可変領域以外の抗体のドメインに融合されたかまたは結合さ
れた本発明のポリペプチドを含む組成物を含む。例えば、本発明のポリペプチド
を、抗体のＦｃ領域、またはその部分に融合または結合し得る。本発明のポリペ
プチドに融合された抗体部分は、ヒンジ領域、ＣＨ１ドメイン、ＣＨ２ドメイン
、およびＣＨ３ドメイン、あるいはそのドメイン全体または部分の任意の組合せ
を含み得る。本発明のポリペプチドは、このポリペプチドのインビボの半減期を
増加するためか、または当該分野で公知の方法を使用してイムノアッセイにおけ
る使用のために上記の抗体部分に融合または結合され得る。このポリペプチドは
また、マルチマーを形成するように上記の抗体部分に融合または結合され得る。
例えば、本発明のポリペプチドに融合されたＦｃ部分は、Ｆｃ部分の間でジスル
フィド結合を通じて二量体を形成し得る。より高次なマルチマー型は、このポリ
ペプチドをＩｇＡおよびＩｇＭの部分に融合することにより作製され得る。本発
明のポリペプチドを抗体部分に融合または結合するための方法は、当該分野にお
いて公知である。例えば、米国特許第５，３３６、６０３号、同第５，６２２，
９２９号、同第５，３５９，０４６号、同第５，３４９，０５３号、同第５，４
４７，８５１号、同第５，１１２，９４６号；ＥＰ ０ ３０７ ４３４、ＥＰ
０ ３６７ １６６；ＷＯ ９６／０４３８８；ＷＯ ９１／０６５７０；Ａ
ｓｈｋｅｎａｚｉ，Ａ．ら（１９９１）ＰＮＡＳ ８８：１０５３５〜１０５３
９；Ｚｈｅｎｇ，Ｘ．Ｘ．ら（１９９５）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５４：５５９
０〜５６００；およびＶｉｌ，Ｈ．ら（１９９２）ＰＮＡＳ ８９；１１３３７
〜１１３４１（上記の参考文献は、それらの全体が参考として援用される）を参
照のこと。
【０１７３】 本発明はさらに、本発明のポリペプチドのアゴニストまたはアンタゴニストと
して作用する抗体に関する。例えば、本発明は部分的にかまたは完全にかのいず
れかで、本発明のポリペプチドとのレセプター／リガンド相互作用を妨害する抗
体を含む。レセプター特異的抗体およびリガンド特異的抗体の両方が含まれる。
リガンド結合を妨害しないが、レセプター活性化を妨害するレセプター特異的抗
体が含まれる。レセプター活性化（すなわち、シグナル伝達）は、本明細書中に
記載される技術または当該分野において公知の技術によって決定され得る。リガ
ンド結合およびレセプター活性化の両方を妨害するレセプター特異的抗体もまた
含まれる。同様に、リガンドに結合し、そしてこのレセプターに対するリガンド
の結合を妨害する中和抗体、ならびにこのリガンドに結合し、それによってレセ
プター活性化を妨害するが、このリガンドがこのレセプターに結合することを妨
害しない抗体が含まれる。さらに、このレセプターを活性化する抗体が含まれる
。これらの抗体は、リガンド媒介性レセプター活性化により影響される、全てか
または全てよりも小さい生物学的活性のいずれかに対するアゴニストとして作用
し得る。この抗体は、本明細書中に開示される比活性を含む生物学的活性に対し
てアゴニストまたはアンタゴニストとして特定され得る。上記の抗体のアゴニス
トは、当該分野において公知である方法を使用して作製され得る。例えば、ＷＯ
９６／４０２８１；米国特許第５，８１１，０９７号；Ｄｅｎｇ，Ｂ．ら（１
９９８）Ｂｌｏｏｄ ９２（６）：１９８１〜１９８８；Ｃｈｅｎ，Ｚ．ら（１
９９８）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５８（１６）：３６６８〜３６７８；Ｈａｒｒ
ｏｐ，Ｊ．Ａ．ら（１９９８）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６１（４）：１７８６〜
１７９４；Ｚｈｕ，Ｚ．ら（１９９８）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５８（１５）：
３２０９〜３２１４；Ｙｏｏｎ，Ｄ．Ｙ．ら（１９９８）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．
１６０（７）：３１７０〜３１７９；Ｐｒａｔ，Ｍ．ら（１９９８）Ｊ．Ｃｅｌ
ｌ．Ｓｃｉ．１１１（Ｐｔ２）：２３７〜２４７；Ｐｉｔａｒｄ，Ｖ．ら（１９
９７）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ２０５（２）：１７７〜１９０；
Ｌｉａｕｔａｒｄ，Ｊ．ら（１９９７）Ｃｙｔｏｋｉｎｄｅ ９（４）：２３３
〜２４１；Ｃａｒｌｓｏｎ，Ｎ．Ｇ．ら（１９９７）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．
２７２（１７）：１１２９５〜１１３０１；Ｔａｒｙｍａｎ，Ｒ．Ｅ．ら（１９
９５）Ｎｅｕｒｏｎ １４（４）：７５５〜７６２；Ｍｕｌｌｅｒ，Ｙ．Ａ．ら
（１９９８）Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ６（９）：１１５３〜１１６７；Ｂａｒｔｕ
ｎｅｋ，Ｐ．ら（１９９６）Ｃｙｔｏｋｉｎｅ ８（１）：１４〜２０（上記の
参考文献は、それらの全体が参考として援用される）を参照のこと。
【０１７４】 （診断アッセイ） 本発明はさらに、本発明のＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓポリペプチドをコー
ドする遺伝子の発現を検出することにより動物におけるＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃ
ｃｕｓ感染をアッセイする方法に関する。この方法は、動物からの組織または体
液を、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ特異的抗体、核酸、またはタンパク質につ
いて分析する工程を包含する。Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓに特異的な核酸の
分析は、本発明の核酸配列をハイブリダイゼーションプローブまたはプライマー
のいずれかとして用いる、ＰＣＲまたはハイブリダイゼーション技術によってア
ッセイされる。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｌｏｎｉ
ｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈ
ａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、第２版、１９８９、５４頁の
参考文献）：Ｅｒｅｍｅｅｖａら（１９９４）Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏ
ｌ．３２：８０３〜８１０（ＰＣＲ増幅したＤＮＡの制限フラグメント長の多形
性の分析による、点在する熱群のＲｉｃｋｅｔｔｓｉａｅ種間の差違を記載する
）、およびＣｈｅｎら、１９９４ Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．３２：
５８９〜５９５（ＰＣＲによってＢ．ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ核酸を検出する）
を参照のこと。
【０１７５】 Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓによる感染に関連する疾患状態の診断がすでに
なされている場合、本発明は、この疾患状態の進行または退行をモニタリングす
るために有用である。それによって、増強したＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ遺
伝子発現を示す患者は、より低いレベルでこれらの遺伝子を発現する患者と比較
して、より悪い臨床結果を経験する。
【０１７６】 「生物学的サンプル」によって、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓポリペプチド
、ｍＲＮＡまたはＤＮＡを含む動物、細胞株、組織培養物、または他の供給源か
ら得られる任意の生物学的サンプルが意図される。生物学的サンプルとしては、
Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓのポリペプチドまたは核酸を含むことが推測され
る体液（例えば、唾液、血液、血漿、尿、粘液、滑液など）、組織（例えば、筋
肉、皮膚、および軟骨）ならびに任意の他の生物学的供給源が挙げられる。組織
のような生物学的サンプルを得るための方法は、当該分野で周知である。
【０１７７】 本発明は、動物におけるＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ感染に関連する疾患を
検出するために有用である。好ましい動物としては、サル（ｍｏｎｋｅｙ）、人
猿（ａｐｅ）、ネコ、イヌ、鳥類、ウシ、ブタ、マウス、ウマ、ウサギ、および
ヒトが挙げられる。特に好ましいのはヒトである。
【０１７８】 総ＲＮＡは、Ｃｈｏｍｅｚｙｎｓｋｉら（１９８７）Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅ
ｍ．１６２：１５６〜１５９（１９８７）に記載される一工程のグアニジン−チ
オシアネート−フェノール−クロロホルム方法のような任意の適切な技術を使用
して、生物学的サンプルから単離され得る。次いで、相補配列間のハイブリダイ
ゼーションについて可能にするように表１において同定される核酸配列に対して
十分な相同性を有するＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓポリペプチドをコードする
ｍＲＮＡが、任意の適切な方法を使用してアッセイされる。これらの方法として
は、ノーザンブロット分析、Ｓ１ヌクレアーゼマッピング、ポリメラーゼ連鎖反
応（ＰＣＲ）、ポリメラーゼ連鎖反応との組み合わせにおける逆転写（ＲＴ−Ｐ
ＣＲ）、およびリガーゼ連鎖反応との組み合わせにおける逆転写（ＲＴ−ＬＣＲ
）が挙げられる。
【０１７９】 ノーザンブロット分析は、Ｈａｒａｄａら（１９９０）Ｃｅｌｌ ６３：３０
３〜３１２に記載されるように実施され得る。簡潔にいうと、総ＲＮＡを、上記
のような生物学的サンプルから調製する。ノーザンブロット分析のために、この
ＲＮＡを適切な緩衝液（例えば、グリオキサール／ジメチルスルホキシドリン酸
緩衝液）中で変性させ、アガロースゲル電気泳動に供し、そしてニトロセルロー
スフィルター上に移す。このＲＮＡがＵＶリンカーによってフィルターに連結さ
れた後、このフィルターを、ホルムアミド、ＳＳＣ、デンハルト溶液、変性サケ
精子、ＳＤＳ、およびリン酸ナトリウム緩衝液を含む溶液中でプレハイブリダイ
ズする。任意の適切な方法（例えば、32ＰをマルチプライムされるＤＮＡ標識系
（Ａｍｅｒｓｈａｍ））に従って標識された、表１に示されるＳ．ａｕｒｅｕｓ
ポリペプチドのＤＮＡ配列を、プローブとして使用する。一晩のハイブリダイゼ
ーションの後、このフィルターを洗浄し、そしてＸ線フィルムに曝露する。本発
明に従ってプローブとして使用するＤＮＡは、上記の節において記載し、そして
それは、好ましくは少なくとも１５ヌクレオチド長である。
【０１８０】 Ｓ１マッピングは、Ｆｕｊｉｔａら（１９８７）Ｃｅｌｌ ４９：３５７〜３
６７に記載されるように実施され得る。Ｓ１マッピングにおける使用のためのプ
ローブＤＮＡを調製するために、本発明の上記のＳ．ａｕｒｅｕｓ ＤＮＡ配列
のセンス鎖をテンプレートとして使用して、標識されたアンチセンスＤＮＡを合
成する。次いで、このアンチセンスＤＮＡを適切な制限エンドヌクレアーゼを使
用して消化して、所望される長さのさらなるＤＮＡプローブを生成する。このよ
うなアンチセンスプローブは、標的ｍＲＮＡ（すなわち、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏ
ｃｃｕｓポリペプチドをコードするｍＲＮＡ）に対応する、可視化された保護バ
ンドのために有用である。
【０１８１】 ＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓポリペプチドをコードするｍＲＮＡのレベルは
、例えば、Ｍａｋｉｎｏら（１９９０）Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ ２：２９５〜３０
１に記載されるＲＴ−ＰＣＲ方法を使用してアッセイされる。この方法によって
、ポリアクリルアミドゲルバンド中の「アンプリコン（ａｍｐｌｉｃｏｎ）」の
放射能は、標的ｍＲＮＡの初期濃度に直線的に関連する。簡潔にいうと、この方
法は、ＲＴプライマーおよび適切な緩衝液を含む反応混合物中の生物学的サンプ
ルから単離される、さらなる総ＲＮＡを含む。プライマーのアニーリングのため
のインキュベーションの後、この混合物にＲＴ緩衝液、ｄＮＴＰ、ＤＴＴ、ＲＮ
アーゼインヒビターおよび逆転写酵素が補充され得る。ＲＮＡの逆転写を達成す
るためのインキュベーションの後、次いで、このＲＴ産物を標識されたプライマ
ーを使用してＰＣＲに供する。あるいは、標識されたプライマーよりもむしろ、
標識されたｄＮＴＰが、このＰＣＲ反応混合物中に含まれ得る。ＰＣＲ増幅は、
従来の技術に従って、ＤＮＡサーマルサイクラーで実施され得る。増幅を達成す
るための適切な数の回数の後、このＰＣＲ反応混紡物をポリアクリルアミドゲル
上で電気泳動する。このゲルを乾燥した後、適切なバンド（本発明のＳｔａｐｈ
ｙｌｏｃｏｃｃｕｓポリペプチドをコードするｍＲＮＡに対応する）の放射能を
、画像分析機を使用して定量する。ＲＴおよびＰＣＲ反応成分および条件、試薬
およびゲル濃度、ならびに標識方法は、当該分野で周知である。ＲＴ−ＰＣＴ方
法における改変は、当業者に明らかである。本発明の核酸を検出し得る他のＰＣ
Ｒ方法は、ＰＣＲ ＰＲＩＭＥＲ：Ａ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ ＭＡＮＵＡＬ（
Ｃ．Ｗ．Ｄｉｅｆｆｅｎｂａｃｈら編、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ
Ｌａｂ Ｐｒｅｓｓ、１９９５）において見出され得る。
【０１８２】 本発明のポリヌクレオチド（ＤＮＡおよびＲＮＡの両方を含む）は、バイオチ
ップ技術を使用して本発明のポリヌクレオチドまたはＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃ
ｕｓ種（Ｓ．ａｕｒｅｕｓを含む）を検出するために用いられ得る。本発明は、
高密度のチップアレイ（１ｃｍ2あたり１０００より多いオリゴヌクレオチド）
および低密度のチップアレイ（１ｃｍ2あたり１０００未満のオリゴヌクレオチ
ド）の両方を含む。本発明のポリヌクレオチドのアレイを含むバイオチップは、
生物学的サンプルおよび環境的サンプルにおいて、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕ
ｓ種（Ｓ．ａｕｒｅｕｓを含む）を検出するために、およびＳ．ａｕｒｅｕｓ感
染または他のＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ感染を有する動物（ヒトを含む）を
診断するために、使用され得る。本発明のバイオチップは、迅速な示唆的な病原
体の検出および診断を迅速に用いるために、本発明のポリヌクレオチド配列に加
えて、他の病原体のポリヌクレオチド配列（細菌、ウイルス、寄生生物、および
真菌のポリヌクレオチド配列を含む）を含み得る。このバイオチップはまた、Ｓ
．ａｕｒｅｕｓ感染および他のＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ感染をモニターす
るために、ならびに診療所における薬物治療に対する遺伝的変化（欠失、挿入、
ミスマッチなど）および研究室における薬物の開発をモニターするために、使用
され得る。本発明のポリヌクレオチドのアレイを含むバイオチップ技術はまた、
本発明の遺伝子を含む、複数の遺伝子の発現を同時にモニターするために使用さ
れ得る。さらに、本発明のバイオチップは、本発明のポリヌクレオチドに結合す
る多数のペプチド、ポリペプチド、抗体、低分子および他の薬物化合物をスクリ
ーニングするために使用され得る。このバイオチップはまた、ペプチド、ポリペ
プチド、抗体、低分子および他の薬物化合物の、本発明のポリヌクレオチドに対
する相対的な結合および結合親和性（オンレート（ｏｎ−ｒａｔｅ）またはオフ
レート（ｏｆｆ−ｒａｔｅ）を測定するために使用され得る。選択されるアレイ
を含むこのポリヌクレオチドは、フラグメントについて同じ様式（すなわち、連
続する塩基対およびそれを含む５‘および３’位置ならびに長さ）で特定され得
る。バイオチップ技術を用いてＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ種（Ｓ．ａｕｒｅ
ｕｓを含む）を検出するための本発明のポリヌクレオチドの方法および特定の使
用は、当該分野で公知の方法および使用、ならびに以下の方法および使用を含む
：米国特許第５３２４６３３号、同第５５１０２７０号、同第５５４５５３１号
、同第５４４５９３４号、同第５６７７１９５号、同第５５３２１２８号、同第
５５５６７５２号、同第５５２７６８１号、同第５４５１６８３号、同第５４２
４１８６号、同第５６０７６４６号、同第５６５８７３２号および国際特許第Ｗ
Ｏ／９７１０３６５、同第ＷＯ／９５１１９９５、同第ＷＯ／９７４３４４７、
同第ＷＯ／９５３５５０５、これらの各々は、これら全体が本明細書中に援用さ
れる）。
【０１８３】 本発明のポリヌクレオチドを使用するバイオセンサはまた、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ
または他のＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ種およびその感染を検出、診断、なら
びにモニターするために使用され得る。本発明のポリヌクレオチドを使用するバ
イオセンサはまた、本発明の特定のポリヌクレオチドを検出するために使用され
得る。本発明のポリヌクレオチドを使用するバイオセンサはまた、診療所におけ
る薬物治療に対する遺伝的変化（欠失、挿入、ミスマッチなど）および研究室に
おける薬物の開発をモニターするために使用され得る。さらに、本発明のバイオ
センサは、本発明のポリヌクレオチドに結合する多数のペプチド、ポリペプチド
、抗体、低分子および他の薬物化合物をスクリーニングするために使用され得る
。本発明のバイオセンサはまた、ペプチド、ポリペプチド、抗体、低分子および
他の薬物化合物の、本発明のポリヌクレオチドに対する相対的な結合および結合
親和性（オンレートまたはオフレート）を測定するために使用され得る。バイオ
センサを用いてＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ種（Ｓ．ａｕｒｅｕｓを含む）を
検出するための本発明のポリヌクレオチドの方法および特定の使用は、当該分野
で公知の方法および使用、ならびに以下の方法および使用を含む：米国特許第５
７２１１０２号、同第５６５８７３２号、同第５６３１１７０号、および国際特
許第ＷＯ／９７３５０１１、同第ＷＯ／９７２０２０３、これらの各々は、これ
ら全体が本明細書中に援用される）。
【０１８４】 従って、本発明は、本発明のポリヌクレオチドを含むバイオチップおよびバイ
オセンサの両方、ならびにそれらの使用の方法を包含する。
【０１８５】 生物学的サンプル中のＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓポリペプチドレベルをア
ッセイする工程は、抗体に基づく技術のような任意の技術分野で公知の方法を使
用して生じ得る。例えば、組織中のＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓポリペプチド
発現は、古典的な免疫組織学的方法で研究され得る。これにおいて、特定の認識
が一次抗体（ポリクローナルまたはモノクローナル）によって提供されるが、二
次抗体検出系は、蛍光、酵素、または二次抗体に結合体化される他のものを利用
し得る。結果として、病原体試験のために組織片の免疫組織学的染色が得られる
。組織をまた、ウエスタンブロットまたはドット／スロットアッセイのためのＳ
ｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓポリペプチドの遊離のために、例えば、尿素および
中性界面活性剤で抽出し得る。例えば、Ｊａｌｋｎｅｎ，Ｍ．ら（１９８７）Ｊ
．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１０１：９７６〜９８５；Ｊａｌｋｎｅｎ，Ｍ．ら（１
９８５）Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１０５：３０８７〜３０９６を参照のこと。
この技術において、この技術はカチオン性固相の使用に基づき、Ｓｔａｐｈｙｌ
ｏｃｏｃｃｕｓポリペプチドの定量は、単離されたＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕ
ｓポリペプチドを標準として使用して達成され得る。この技術はまた、体液に対
して適用され得る。
【０１８６】 Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓポリぺプチド遺伝子の発現の検出に有用な、他
の抗体に基づく方法としては、ＥＬＩＳＡおよびラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ
）ようなイムノアッセイが挙げられる。例えば、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ
ポリぺプチドに特異的なモノクローナル抗体は、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ
ポリぺプチドを検出し、そして定量するために、免疫吸着剤としておよび抗体標
識プローブとしての両方で使用され得る。サンプル中に存在するＳｔａｐｈｙｌ
ｏｃｏｃｃｕｓポリぺプチドの量は、直線回帰コンピューターアルゴリズムを使
用して標準調製物中に存在する量に関して算出され得る。このようなＥＬＩＳＡ
は、Ｉａｃｏｂｅｌｌｉら（１９８８）Ｂｒｅａｓｔ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅ
ａｒｃｈ ａｎｄ Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ １１：１９−３０に記載される。別の
ＥＬＩＳＡアッセイでは、２つの異なる特異的のモノクローナル抗体を使用して
体液中のＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓポリぺプチドを検出し得る。このアッセ
イでは、抗体の一方が免疫吸着剤として、そして他方が酵素標識プローブとして
使用される。
【０１８７】 上記の技術は、基本的に「１工程」アッセイもしくは「２工程」アッセイとし
て行われ得る。「１工程」アッセイは、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓポリぺプ
チドを固定化抗体と接触させ、そして洗浄を伴わないでこの混合物を標識化抗体
と接触させる工程を包含する。「２工程」アッセイは、この混合物を標識化抗体
と接触させる工程の前の洗浄を包含する。他の従来の技術もまた適切なように使
用され得る。通常、アッセイシステムの１つの成分を支持体に固定することが所
望される。それにより、このシステムの他の成分が、この成分と接触することを
可能にし、ならびにこのサンプルから容易に除去されることを可能にする。上記
の改変方法および本発明に含まれる他の免疫学的な方法はまた、Ｈａｒｌｏｗら
，ＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ：Ａ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ ＭＡＮＵＡＬ，（Ｃｏｌ
ｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，第２版
１９８８）に見出され得る。
【０１８８】 適切な酵素標識としては、例えば、オキシダーゼ群由来の標識が挙げられる。
オキシダーゼは、基質と反応することによって過酸化水素の生成を触媒する。グ
ルコースオキシダーゼは、それが優れた安定性を有し、そしてその基質（グルコ
ース）が容易に入手可能であるので、特に好ましい。オキシダーゼ標識の活性は
、酵素標識抗体／基質反応により形成される過酸化水素の濃度を測定することに
よってアッセイされ得る。酵素に加えて、他の適切な標識としては、放射性同位
元素（例えば、ヨウ素（125Ｉ、121Ｉ）、炭素（14Ｃ）、硫黄（35Ｓ）、トリチ
ウム（3Ｈ）、インジウム（112Ｉｎ）、およびテクネチウム（99mＴｃ））、お
よび蛍光標識（例えば、フルオレッセインおよびローダミン）、ならびにビオチ
ンが挙げられれる。
【０１８９】 本発明のＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓポリぺプチドの特異的抗体のためのさ
らなる適切な標識は、以下に提供される。適切な酵素標識の例としては、リンゴ
酸デヒドロゲナーゼ、ブドウ球菌ヌクレアーゼ、δ−５−ステロイドイソメラー
ゼ、酵母アルコールデヒドロゲナーゼ、α−グリセロールリン酸デヒドロゲナー
ゼ、トリオースホスフェートイソメラーゼ、ペルオキシダーゼ、アルカリホスフ
ァターゼ、アスパラギナーゼ、グルコースオキシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ
、リボヌクレアーゼ、ウレアーゼ、カタラーゼ、グルコース−６−リン酸デヒド
ロゲナーゼ、グルコアミラーゼ、およびアセチルコリンエステラーゼが挙げられ
る。
【０１９０】 適切な放射性同位元素の例としては、3Ｈ、111Ｉｎ、125Ｉ、131Ｉ、32Ｐ、35 Ｓ、14Ｃ、51Ｃｒ、57Ｔｏ、58Ｃｏ、59Ｆｅ、75Ｓｅ、152Ｅｕ、90Ｙ、67Ｃｕ
、217Ｃｉ、211Ａｔ、212Ｐｂ、47Ｓｃ、109Ｐｄなどが挙げられる。インビボ画
像処理を使用する場合、111Ｉｎが好ましい同位元素である。なぜなら、111Ｉｎ
は、125Ｉもしくは131Ｉ標識のモノクローナル抗体の肝臓による脱ハロゲン化の
問題を避けるからである。さらに、この放射ヌクレオチド（ｒａｄｉｏｎｕｃｌ
ｅｏｔｉｄｅ４）は、画像処理のためにより都合よいγ放出エネルギーを有する
。例えば、Ｐｅｒｋｉｎｓら（１９８５）Ｅｕｒ．Ｊ．Ｎｕｃｌ．Ｍｅｄ．１０
：２９６−３０１；Ｃａｒａｓｑｕｉｌｌｏら（１９８７）Ｊ．Ｎｕｃｌ．Ｍｅ
ｄ．２８：２８１−２８７を参照のこと。例えば、１−（Ｐ−イソチオシアネー
トベンジル）−ＤＰＴＡを有するモノクローナル抗体にカップリングされた111
Ｉｎは、非腫瘍組織、特に肝臓にほとんど取り込みを示さず、従って、腫瘍局在
化の特異性を増大する。Ｅｓｔｅｂａｎら（１９８７）Ｊ．Ｎｕｃｌ．Ｍｅｄ．
２８：８６１−８７０を参照のこと。
【０１９１】 適切な非放射活性同位体標識の例としては、157Ｇｄ、55Ｍｎ、162Ｄｙ、52Ｔ
ｒ、および56Ｆｅが挙げられる。
【０１９２】 適切な蛍光標識の例としては、152Ｅｕ標識、フルオレッセイン標識、イソチ
オシアネート標識、ローダミン標識、フィコエリトリン標識、フィコシアニン標
識、アロフィコシアニン標識、ｏ−フタルデヒド標識、およびフルオレサミン標
識が挙げられる。
【０１９３】 適切な毒素標識の例としては、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ毒素、ジフテリア毒素
、リシン、およびコレラ毒素が挙げられる。
【０１９４】 化学発光標識の例としては、ルミナル標識、イソルミナル標識、芳香族アクリ
ジニウムエステル標識、イミダゾール標識、アクリジニウム塩標識、シュウ酸エ
ステル標識、ルシフェリン標識、ルシフェラーゼ標識、およびエクオリン標識が
挙げられる。
【０１９５】 核磁気共鳴対照試薬の例としては、重金属（例えば、Ｇｄ、Ｍｎ、および鉄）
が挙げられる。
【０１９６】 上記に記載した標識を抗体に結合するための代表的な技術は、Ｋｅｎｎｅｄｙ
ら（１９７６）Ｃｌｉｎ．Ｃｈｉｍ．Ａｃｔａ ７０：１−３１、およびＳｃｈ
ｕｒｓら（１９７７）Ｃｌｉｎ．Ｃｈｉｍ．Ａｃｔａ ８１：１−４０に提供さ
れる。以下で言及されるカップリング技術は、グルタールアルデヒド法、過ヨウ
素酸法、ジマレイミド法、ｍ−マレイミドベンジル−Ｎ−ヒドロキシ−スクシン
イミドエステル法であり、これらの全ての方法は、本明細書中に参考として援用
される。
【０１９７】 関連した局面において、本発明は、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ感染に対して特異的な抗
体を含む血清のスクリーニングにおける使用のための診断キットを包含する。こ
のようなキットは、少なくとも１つの抗Ｓ．ａｕｒｅｕｓ抗体と特異的に免疫反
応性であるエピトープを含む単離されたＳ．ａｕｒｅｕｓ抗原を含み得る。この
ようなキットはまた、上記の抗体の抗原への結合を検出するための手段を含む。
特定の実施態様において、このキットは、組換え的に生成されたまたは化学的に
合成された、ペプチド抗原もしくはポリペプチド抗原を含み得る。このペプチド
抗原もしくはポリペプチド抗原は、固相支持体に付着され得る。
【０１９８】 さらに特定の実施態様において、上記のキットの検出手段は、上記のペプチド
抗原もしくはポリペプチド抗原が付着される固相支持体を含む。このようなキッ
トはまた、付着されていないレポーター標識された非ヒト抗体を含み得る。この
実施態様において、この抗体のＳ．ａｕｒｅｕｓ抗原への結合は、レポーター標
識した抗体の抗Ｓ．ａｕｒｅｕｓポリペプチド抗体への結合により検出され得る
。
【０１９９】 関連した局面において、本発明は、被験体におけるＳ．ａｕｒｅｕｓ感染を検
出する方法を包含する。この検出方法は、被験体由来の体液、好ましくは血清を
、単離したＳ．ａｕｒｅｕｓ抗原と反応させる工程、および結合した抗体の存在
についてこの抗原を試験する工程を包含する。特定の実施態様において、この方
法は、固相支持体に付着されたポリペプチド抗原を含み、そして血清をこの支持
体と反応させる。続いて、この支持体を、レポーター標識された抗ヒト抗体と反
応させる。次いで、レポーター標識された抗体の存在についてこの支持体を試験
する。
【０２００】 上記のアッセイおよびキットにおいて使用される固体表面試薬は、タンパク質
材料を固相支持体材料（例えば、ポリマー性ビーズ、ディップスティック、９６
ウェルプレートまたはフィルター材料）に付着するための公知の技術により調製
される。これらの付着方法は、一般的に、タンパク質の支持体への非特異的な吸
着、またはタンパク質の固相支持体上の化学反応基（例えば、活性化したカルボ
キシル基、ヒドロキシル基、またはアルデヒド基）への共有結合的な付着（代表
的に、遊離アミン基を介して）を包含する。あるいは、ビオチン化抗原と共に、
ストレプトアビジン被覆プレートが使用され得る。
【０２０１】 本発明のポリペプチドおよび抗体（それらのフラグメントを含む）は、バイオ
チップおよびバイオセンサー技術を使用して、ブドウ球菌種（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ
を含む）を検出するために使用され得る。本発明のバイオチップおよびバイオセ
ンサーは、ブドウ球菌種（Ｓ．ａｕｒｅｕｓを含む）を特異的に認識する抗体を
検出するための本発明のポリペプチドを含み得る。本発明のバイオチップおよび
バイオセンサーはまた、ブドウ球菌種（Ｓ．ａｕｒｅｕｓを含む）または本発明
の特定のポリペプチドを検出するために、本発明のポリペプチドを特異的に認識
する抗体を含み得る。本発明のポリペプチドおよび抗体を含むバイオチップまた
はバイオセンサーは、生物学的サンプルおよび環境サンプル中のブドウ球菌種（
Ｓ．ａｕｒｅｕｓを含む）を検出するため、ならびにＳ．ａｕｒｅｕｓ感染もし
くは他のブドウ球菌感染を有する動物（ヒトを含む）を診断するために使用され
得る。従って、本発明は、本発明のポリペプチドまたは抗体を含むバイオチップ
およびバイオセンサー、ならびにそれらの使用方法の両方を包含する。
【０２０２】 上記で議論した本発明のバイオチップは、迅速な示差的な病原検出および診断
における使用のために、本発明のポリペプチド配列に加えて、細菌、ウイルス、
寄生生物、および真菌のポリペプチド配列を含む他の病原体のポリペプチド配列
をさらに含み得る。本発明のバイオチップは、迅速な示差的な病原検出および診
断における使用のために、本発明の抗体またはそれらのフラグメントに加えて、
細菌、ウイルス、寄生生物、および真菌のポリペプチド配列を含む他の病原体に
特異的な抗体またはそれらのフラグメントをさらに包含し得る。本発明のバイオ
チップおよびバイオセンサーはまた、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ感染もしくは他のブドウ
球菌感染をモニターするため、および研究所での治療開発および薬物開発におい
て薬物治療に応じる遺伝的変化（アミノ酸欠損、挿入、置換など）をモニターす
るために使用され得る。本発明のポリペプチドまたは抗体を包含するバイオチッ
プおよびバイオセンサーはまた、本発明のポリペプチドを含む多数のポリペプチ
ドの発現を同時にモニターするため使用され得る。さらに、本発明のバイオチッ
プおよびバイオセンサーは、本発明のポリペプチドに結合する、膨大な数のポリ
ヌクレオチド、ペプチド、ポリペプチド、抗体、低分子、および他の薬物化合物
をスクリーニングするために使用され得る。このバイオチップはまた、ポリヌク
レオチド、ペプチド、ポリペプチド、抗体、低分子および他の薬物化合物の本発
明のポリペプチドに対する相対的な結合または結合親和性（オン速度またはオフ
速度）を測定するために使用され得る。本発明のバイオチップおよびバイオセン
サーを構成するために使用されるポリぺプチドは、フラグメントについてと同じ
様式で（すなわち、それらの連続したアミノ酸残基中のＮ末端位およびＣ末端位
または長さによって）特定化され得る。バイオチップおよびバイオセンサー技術
を使用してブドウ球菌種（Ｓ．ａｕｒｅｕｓを含む）または特定のポリペプチド
を検出するための本発明のポリヌクレオチドおよび抗体の方法ならびに特定の使
用は、当該分野に公知の技術、本発明のポリぺプチドを使用するバイオチップお
よびバイオセンサーについて上記に列挙した米国特許および世界特許の技術、お
よび以下の技術を含む：米国特許第５３２４６３３号、同第５６５８７３２号、
同第５１３５８５２号、同第５５６７３０１号、同第５６７７１９６号、同第５
６９０８９４号、同第５５２７６８１号、同第５５１０２７０号、同第５５４５
５３１号、同第５４４５９３４号、同第５６７７１９５号、同第５５３２１２８
号、同第５５５６７５２号、同第５４５１６８３号、同第５４２４１８６号、同
第５６０７６４６号、および世界特許第ＷＯ／９７２９３６６号、同第ＷＯ／９
６１２９５７号、同第ＷＯ／９７１０３６５号、同第ＷＯ／９５１１９９５号、
同第ＷＯ／９７４３４４７号、同第ＷＯ／９５３５５０５号が挙げられ、各々は
それらの全体において本明細書中に援用される。
【０２０３】 （処置） （アゴニストおよびアンタゴニスト−アッセイおよび分子） 本発明はまた、本発明のＳ．ａｕｒｅｕｓポリペプチドの生物学的活性を増強
またはブロックする化合物を同定するために、化合物をスクリーニングする方法
を提供する。本発明はさらに、Ｓ．ａｕｒｅｕｓを殺傷もしくは増殖を遅延させ
る化合物を提供する。Ｓ．ａｕｒｅｕｓアンタゴニスト（Ｓ．ａｕｒｅｕｓリガ
ンドを含む）が抗生物質耐性を予防的もしくは治療的にブロックする能力は、当
業者により容易に試験され得る。例えば、Ｓｔｒａｎｄｅｎら（１９９７）Ｊ
Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７９（１）：９−１６を参照のこと。
【０２０４】 アゴニストは、天然の生物学的機能を増大する化合物、または本発明のポリペ
プチドと類似する様式で機能する化合物であるが、アンタゴニストはそのような
機能を減少または排除する。可能性のあるアンタゴニストとしては、本発明のポ
リペプチドに結合し、それによって、それらの活性を阻害または排除する小有機
分子、ペプチド、ポリペプチド、および抗体が挙げられる。
【０２０５】 アンタゴニストは、例えば、ペプチドグリカン架橋形成を阻害するために使用
され得る。Ｓ．ａｕｒｅｕｓに対する抗体は、抗生物質耐性を処置するために、
Ｓ．ａｕｒｅｕｓに結合し、そしてＳ．ａｕｒｅｕｓ活性を阻害するために使用
され得る。上記のアンタゴニストのいずれかは、薬学的に受容可能なキャリアと
共に組成物中に使用され得る。
【０２０６】 （ワクチン） 本発明はまた、本発明の１つ以上のポリペプチドを含むワクチンを提供する。
ワクチンの組成物における異質性は、本発明のＳ．ａｕｒｅｕｓポリペプチドを
組み合わせることによって提供され得る。この型の多成分ワクチンは、Ｓｔａｐ
ｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ属の多数の種および株に対する防御免疫応答の惹起におい
て、単一ポリペプチドワクチンよりも効果的であると思われるので、所望され得
る。
【０２０７】 多成分ワクチンは、多数の免疫原性成分に対する抗体産生を惹起することが当
該分野で公知である。例えば、Ｄｅｃｋｅｒら（１９９６）Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔ．
Ｄｉｓ．１７４：Ｓ２７０−２７５を参照のこと。さらに、最近、Ｂ型肝炎、ジ
フテリア、破傷風、百日咳四種混合（ｔｅｔｒａｖａｌｅｎｔ）ワクチンは、ヒ
ト乳児において４つ全ての病原性因子に対する防御レベルの抗体を惹起すること
が実証された。例えば、Ａｒｉｓｔｅｇｕｉ，Ｊ．ら（１９９７）Ｖａｃｃｉｎ
ｅ １５：７−９を参照のこと。
【０２０８】 本発明は、単一成分ワクチンに加えて、多成分ワクチンを包含する。これらの
ワクチンは、１つより多いポリペプチド、免疫原または抗原を含む。従って、多
成分ワクチンは、１つより多い本発明のＳ．ａｕｒｅｕｓポリペプチドを含むワ
クチンである。
【０２０９】 さらに、全細胞および全ウイルスワクチンは、本発明の範囲内である。このよ
うなワクチンは組換え的に生成され得、そして表１に記載される１つ以上のＳ．
ａｕｒｅｕｓポリペプチドの発現を包含し得る。例えば、本発明のＳ．ａｕｒｅ
ｕｓポリペプチドは、細胞内部に、細胞表面上、またはペリプラズム空間中に分
泌させられるかまたは局在させられるかのいずれかであり得る。さらに、組換え
ウイルスが使用される場合、本発明のＳ．ａｕｒｅｕｓポリペプチドは、例えば
、ウイルスエンベロープ、キャプシド表面上、またはキャプシド内部に局在化さ
れ得る。異質性タンパク質を発現する細胞を使用する全細胞ワクチンは、当該分
野で公知である。例えば、Ｒｏｂｉｎｓｏｎ，Ｋ．ら（１９９７）Ｎａｔｕｒｅ
Ｂｉｏｔｅｃｈ．１５：６５３−６５７；Ｓｉｒａｒｄ，Ｊ．ら（１９９７）
Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．６５：２０２９−２０３３；Ｃｈａｂａｌｇｏｉｔ
ｙ，Ｊ．ら（１９９７）Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．６５：２４０２−２４１２
を参照のこと。これらの細胞は生きたままで投与され得るか、または投与前に殺
傷され得る。例えば、Ｃｈａｂａｌｇｏｉｔｙ，Ｊ．ら（前出）は、扁形動物脂
肪酸結合タンパク質の一部分を、その細胞表面上で融合タンパク質として発現す
る、生きている弱毒化Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａワクチン株のマウスにおける首尾の
良い使用を報告している。
【０２１０】 多成分ワクチンはまた、当該分野に公知の技術を使用して、本発明の１つ以上
のＳ．ａｕｒｅｕｓポリぺプチド、またはそれらのフラグメントをさらなる非ブ
ドウ球菌成分（例えば、ジフテリア毒素もしくは破傷風毒素、および／または免
疫応答を惹起することが公知の他の成分）と組み合わせることによって調製され
得る。このようなワクチンは、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ属および非ブドウ
球菌病原性因子の両方のメンバーに対する防御免疫応答の惹起に有用である。
【０２１１】 本発明のワクチンはまた、ＤＮＡワクチンを包含する。ＤＮＡワクチンは、現
在、多くの感染性疾患について開発中である。例えば、Ｂｏｙｅｒら（１９９７
）Ｎａｔ．Ｍｅｄ．３：５２６−５３２；Ｓｐｉｅｒ，Ｒ．（１９９６）Ｖａｃ
ｃｉｎｅ １４：１２８５−１２８８の概説を参照のこと。このようなＤＮＡワ
クチンは、本ポリペプチドの発現を可能にする様式に配向された、本発明の１つ
以上のＳ．ａｕｒｅｕｓポリぺプチドをコードするヌクレオチド配列を含む。例
えば、Ｂ．ｂｕｒｇｄｏｒｇｅｒｉ ＯｓｐＡをコードするプラスミドＤＮＡの
直接投与は、ボレリアチャレンジに対してマウスにおいて防御免疫を惹起するこ
とが示された。Ｌｕｋｅら（１９９７）Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．１７５：９
１−９７を参照のこと。
【０２１２】 本発明はまた、免疫応答を調節し得る分子と同時投与されるワクチンの投与に
関する。例えば、Ｋｉｍら（１９９７）Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ．１５：
６４１−６４６は、ＤＮＡ免疫により生じる免疫応答は、免疫応答を刺激する分
子をコードするＤＮＡ配列を同時投与した場合に増大されることを報告している
。同様の様式において、本発明のワクチンは、免疫調節因子をコードする核酸ま
たは免疫調節因子自身のいずれかと同時投与され得る。これらの免疫調節因子と
しては、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ‐ＣＳＦ）およびＣＤ８
６が挙げられる。
【０２１３】 本発明のワクチンは、受動免疫またはの能動免疫のいずれかによってブドウ球
菌感染に対する耐性を与えるために使用され得る。本発明のワクチンが、ブドウ
球菌感染に対する耐性を与えるために能動免疫を介して使用される場合、本発明
のワクチンは、ブドウ球菌感染の防止または弱毒化のいずれかの防御免疫応答を
惹起するために動物に投与される。本発明のワクチンが、ブドウ球菌感染に対す
る耐性を与えるために受動免疫を介して使用される場合、このワクチンは、宿主
動物（例えば、ヒト、イヌ、またはマウス）に提供され、そしてこの抗血清によ
り惹起された抗血清が回収され、そしてＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ属のメン
バーにより引き起こされる感染を有する疑いのあるレシピエントに直接的に提供
される。
【０２１４】 抗体、または抗体のフラグメントを毒素分子で標識できることは、受動免疫が
行われる場合のブドウ球菌感染を処置するためのさらなる方法を提供する。この
実施態様において、本明細書中に開示されるＳ．ａｕｒｅｕｓポリぺプチド、ま
たはそれらのフラグメント、ならびに他のＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓタンパ
ク質を認識し得る抗体、または抗体のフラグメントは、患者への投与前に毒素分
子で標識される。このような毒素誘導体化抗体がＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ
細胞に結合する場合、毒素部分はこれらの細胞に局在化され、そしてそれらの死
を引き起こす。
【０２１５】 従って、本発明は、本発明のポリぺプチドに応じて産生される抗血清によって
認識されそして結合される抗原を有する生物体から生じるブドウ球菌感染を、予
防または弱毒化する手段に関連しそしてその手段を提供する。本明細書において
使用されるように、ワクチンの動物への投与が、疾患の症状もしくは状態の全体
的な弱毒化もしくは部分的な弱毒化（すなわち、抑制）、または疾患に対する動
物の全体的な免疫もしくは部分的な免疫のいずれかを生じる場合に、ワクチンは
疾患を予防または弱毒化したといわれる。
【０２１６】 ワクチン（またはそれが惹起する抗血清）の投与は、「予防」目的または「治
療」目的のいずれかのためであり得る。予防的に提供される場合、この化合物は
、ブドウ球菌感染の任意の症状より前に提供される。化合物の予防的な投与は、
引き続く任意の感染を予防または弱毒化するために使用される。治療的に提供さ
れる場合、化合物は、動物がＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ属のメンバーに感染
したかもしれないことを示す症状を検出した際に、または検出した後に提供され
る。化合物の治療的投与は、実際の任意の感染を弱毒化するために使用する。従
って、本発明のＳ．ａｕｒｅｕｓポリぺプチド、およびそれらのフラグメントは
、感染の発症前（予想される感染を防止または弱毒化するために）または実際の
感染の開始後のいずれかで提供され得る。
【０２１７】 本発明のポリぺプチドは、ネイティブなタンパク質の一部分またはそれらの機
能的な誘導体をコードするか否かに関わらず、純粋な形態で投与され得るか、ま
たは高分子キャリアとカップリングさせられ得る。このようなキャリアの例は、
タンパク質および炭水化物である。本発明のポリぺプチドの免疫原性を増大する
ための高分子キャリアとして作用し得る適切なタンパク質としては、キーホール
リンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）破傷風毒素、百日咳毒素、ウシ血清アルブミ
ン、およびオボアルブミンが挙げられる。本発明のポリぺプチドをこのような高
分子キャリアにカップリングするための方法は、Ｈａｒｌｏｗら，ＡＮＴＩＢＯ
ＤＩＥＳ：Ａ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ ＭＡＮＵＡＬ，（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎ
ｇ Ｈａｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，第二版、１９８８）に開
示される。
【０２１８】 レシピエント動物が組成物投与に耐性を示し得るか、さもなければ組成物がこ
の動物への投与に適している場合、組成物は、「薬学的にまたは生理学的に受容
可能」であるといわれる。このような薬剤は、投与される用量が生理学的に有意
である場合、「治療的に有効量」で投与されるといわれる。薬剤は、その存在が
、レシピエント患者の生理機能において検出可能な変化を生じる場合、生理学的
に有意である。
【０２１９】 全ての場合において、本発明のワクチンは薬学的に受容可能な化合物として投
与されるが、当業者は、薬学的に受容可能な化合物の組成物は、投与される動物
に伴い変化することを認識する。例えば、ヒトのために意図されるワクチンは、
一般に、フロイントアジュバントと共に同時投与されない。さらに、本発明のＳ
．ａｕｒｅｕｓポリぺプチドの純度のレベルは、通常、ヒト以外の動物に投与さ
れるときよりもヒトに投与されるときの方がより高い。
【０２２０】 当業者によって理解されるように、本発明のワクチンが動物に提供される場合
、ワクチンは、塩、緩衝液、アジュバント、または組成物の効力の改善に所望さ
れる他の物質を含み得る組成物中に存在し得る。アジュバントは、特異的な免疫
応答を特異的に増大させるために使用され得る物質である。これらの物質は、一
般に、２つの機能を果たす：（１）投与後に迅速に代謝されることから抗原を防
御する、および（２）免疫応答を非特異的に刺激する。
【０２２１】 通常、アジュバントおよび組成物は免疫系に提示される前に混合されるか、ま
たは別々にであるが免疫される動物の同じ部位に提示される。アジュバントは、
これらの組成物に基づいて、大別していくつかのグループに分けられ得る。これ
らのグループには、オイルアジュバント（例えば、フロイント完全アジュバント
およびフロイント不完全アジュバント）、無機塩（例えば、ＡｌＫ（ＳＯ4）2、
ＡｌＮａ（ＳＯ4）2、ＡｌＮＨ4（ＳＯ4）、シリカ、カオリン、および炭素）、
ポリヌクレオチド（例えば、ポリＩＣ酸およびポリＡＵ酸）および特定の天然物
質（例えば、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ由来のワ
ックスＤ、ならびにＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｐａｒｖｕｍ、またはＢ
ｏｒｄｅｔｅｌｌａ ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ、およびＢｒｕｃｅｌｌａ属のメンバ
ーに見出された物質）が含まれる。アジュバントとして有用な他の物質は、例え
ば、Ｑｕｉｌ Ａ（Ｓｕｐｅｒｆｏｓ Ａ／Ｓ，Ｄｅｎｍａｒｋ）のようなサポ
ニンである。本発明の使用に好ましいアジュバントとしては、アルミニウム塩（
例えば、ＡｌＫ（ＳＯ4）2、ＡｌＮａ（ＳＯ4）2、およびＡｌＮＨ4（ＳＯ4））
が挙げられる。ワクチン組成物における使用に適した材料の例は、ＲＥＭＩＮＧ
ＴＯＮ’Ｓ ＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴＩＣＡＬ ＳＣＩＥＮＣＥＳ １３２４−１
３４１（Ａ．Ｏｓｏｌ編，Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ，Ｅａｓｔｏ
ｎ，ＰＡ，（１９８０）（本明細書中に参考として援用される）に提供される。
【０２２２】 本発明の治療的組成物は、注射、急速注入（ｒａｐｉｄ ｉｎｆｕｓｉｏｎ）
、鼻咽頭吸着（鼻腔内（ｉｎｔｒａｎａｓｏｐｈａｒａｎｇｅａｌｌｙ））、経
皮吸着（ｄｅｒｍｏａｂｓｏｒｐｔｉｏｎ）により非経口的に投与され得るか、 または経口的に投与され得る。あるいは、組成物は、筋肉内、または静脈内に投 与され得る。非経口投与のための組成物は、滅菌水性溶液もしくは滅菌非水性の 溶液、懸濁液、およびエマルジョンを包含する。非水性溶媒の例は、プロピレン グリコール、ポリエチレングリコール、植物油（例えば、オリーブオイル）、お よび注射可能な有機エステル（例えば、オレイン酸エチル）である。キャリアま たは密封包帯を使用して皮膚透過性を増大し得、そして抗原の吸収を増大し得る 。経口投与のための液体投薬形態は、一般に、液体投薬形態を含むリポソーム溶 液を包含し得る。リポソーム懸濁に適した形態としては、当該分野において使用 される不活性希釈液（例えば、精製水）を含むエマルジョン、懸濁液、溶液、シ ロップ、および通常、エリキシルが挙げられる。不活性希釈液に加えて、このよ うな組成物はまた、アジュバント、湿潤剤、乳化剤および懸濁剤、または甘味料 、香味料、もしくは香料を含み得る。
【０２２３】 本発明の治療的組成物は、カプセル化形態で投与され得る。例えば、ポリ（Ｄ
Ｌ−ラクチド−コ（ｃｏ）−グリコリド）から構成される生分解性のミクロスフ
ェア中にカプセル化されたワクチンを使用する鼻腔内免疫。Ｓｈａｈｉｎ，Ｒ．
ら（１９９５）Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．６３：１１９５−１２００を参照の
こと。同様に、経口投与カプセル化Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉ
ｕｍ抗原もまた使用され得る。Ａｌｌａｏｕｉ−Ａｔｔａｒｋｉ，Ｋら（１９９
７）Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．６５：８５３−８５７。本発明のカプセル化ワ
クチンは、ワクチンと粘膜との接触を伴う経路（例えば、鼻腔内、結腸内、十二
指腸内）を含む種々の経路で投与され得る。
【０２２４】 多回投与レジメを利用する場合、免疫の時間的調整のために、様々な多くの技
術が存在する。免疫された動物により発現される免疫グロブリンレパートリーの
発現のレベルおよび多様性を増大するために、本発明の組成物を一度より多く使
用することが可能である。代表的に、多数回の免疫が与えられる場合、組成物は
１〜２ヶ月あけて与えられる。
【０２２５】 本発明によれば、治療的組成物の「有効量」は、所望の生物学的効果を達する
のに十分な量である。一般に、有効量の組成物を提供するのに必要とされる投薬
量は、動物またはヒトの年齢、状態、性別、および疾患の程度のような因子、（
あれば）および当業者により調節可能であり得る他の可変因子に依存して変化す
る。
【０２２６】 本発明の抗原性調製物は、有効量の単回投薬または多数回投薬のいずれかによ
り投与され得る。本発明の組成物の有効量は、１投薬あたり０．０１〜１，００
０μｇ／ｍｌ、より好ましくは１投薬あたり０．１〜５００μｇ／ｍｌ、そして
最も好ましくは１投薬あたり１０〜３００μｇ／ｍｌで変化し得る。
【０２２７】 （実施例） （実施例１：寄託サンプルからの選択されたＤＮＡクローンの単離） 本発明のポリヌクレオチドを含むＳ．ａｕｒｅｕｓクローンを、Ｓ．ａｕｒｅ
ｕｓゲノムＤＮＡライブラリーから単離するために、３つのアプローチを使用し
得る。Ｓ．ａｕｒｅｕｓ株ＩＳＰ３は、当該分野において広範な種々のＳ．ａｕ
ｒｅｕｓ株が使用され得るが、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ株を得るための簡便的な供給源
として寄託されている。
【０２２８】 Ｓ．ａｕｒｅｕｓゲノムＤＮＡを、以下の方法を使用して調製する。リッチな
培地（例えば、Ｔｒｙｐｔｉｃａｓｅ Ｓｏｙ Ｂｒｏｔｈ，Ｂｒａｉｎ Ｈｅ
ａｒｔ Ｉｎｆｕｓｉｏｎ ｂｒｏｔｈまたはＳｕｐｅｒ ｂｒｏｔｈ）で一晩
増殖させた細菌培養物をペレット化し、ＴＥＳ（３０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ｐＨ８．
０，２５ｍＭ ＥＤＴＡ，５０ｍＭ ＮａＣｌ）で２回洗浄し、そして５ｍｌの
高塩濃度のＴＥＳ（２．５Ｍ ＮａＣｌ）中に再懸濁する。リソスタフィンを、
最終濃度が約５０μｇ／ｍｌになるまで添加して、そしてプロトプラスト細胞を
作製するために、その混合物を３７℃にて１時間穏やかに旋回した。次いで、こ
の溶液をインキュベーター中に配置（または振盪ウォーターバス中に配置）し、
そして５５℃まで暖める。次いで、５００μｌのＴＥＳ中２０％ サルコシル（
ｓａｒｃｏｓｙｌ）（最終濃度２％）を添加して細胞を溶解する。次に、グアニ
ジンＨＣｌを最終濃度が７Ｍ（５．５ｍｌ中３．６９ｇ）まで添加する。この混
合物を、５５℃にて６０〜９０分間穏やかに攪拌する（溶液は透明になる）。次
いで、２．０ｍｌの５．７Ｍ ＣｓＣｌを使用してＳＷ４１ウルトラクリアチュ
ーブ中にＣｓＣｌ勾配を設定し、そして２．８５Ｍ ＣｓＣｌを重層する。この
勾配にＤＮＡ含有ＧｕＨＣｌ溶液を注意深く重層する。この勾配を、３０，００
０ｒｐｍ、２０℃、２４時間遠心し、そして下位のＤＮＡバンドを収集する。容
量をＴＥ緩衝液で５ｍｌまで増加させる。次いで、このＤＮＡをプロテアーゼＫ
（１０μｇ／ｍｌ）で３７℃にて一晩処理し、そしてエタノールで沈殿させる。
この沈殿したＤＮＡを、所望の緩衝液中に再懸濁する。
【０２２９】 第１の方法では、プラスミドを、本発明のポリヌクレオチドに対応するポリヌ
クレオチドプローブを使用して、プラスミドＳ．ａｕｒｅｕｓゲノムＤＮＡライ
ブラリーをスクリーニングすることにより直接的に単離する。特に、３０〜４０
ヌクレオチドの特定のポリヌクレオチドを、報告された配列に従って、Ａｐｐｌ
ｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ＤＮＡシンセサイザーを使用して合成する。こ
のオリゴヌクレオチドを、例えば、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼを使用して32 Ｐ−γ−ＡＴＰで標識し、そして通常の方法に従って精製する。（例えば、Ｍａ
ｎｉａｔｉｓら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏ
ｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ，Ｃ
ｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ，ＮＹ（１９８２）を参照のこと。）ライブラリーを、当
業者に公知の技術を使用して上記に記載されるような適切な宿主（例えば、ＸＬ
−１ Ｂｌｕｅ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ））に形質転換する。例えば、Ｓａｍｂ
ｒｏｏｋら、ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＣＬＯＮＩＮＧ：Ａ ＬＯＢＯＲＡＴＯＲＹ
ＭＡＮＵＡＬ（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．第２版、１
９８９）；Ａｕｓｕｂｅｌら、ＣＵＲＲＥＮＴ ＰＲＯＴＯＣＡＬＳ ＩＮ Ｍ
ＯＬＥＣＵＬＡＲ ＢＩＯＬＯＧＹ（Ｊｏｈｎ ＷｉｌｅｙおよびＳｏｎｓ，Ｎ
．Ｙ．１９８９）を参照のこと。形質転換体を、１．５％寒天プレート（適切な
選択薬剤（例えば、アンピシリン）を含有する）上に、プレートあたり約１５０
の形質転換体（コロニー）の密度でプレートする。細菌コロニースクリーニング
のための通常の方法に従って、これらのプレートをナイロン膜を使用してスクリ
ーニングする。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＣＬＯＮＩ
ＮＧ：Ａ ＬＯＢＯＲＡＴＯＲＹ ＭＡＮＵＡＬ（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈ
ａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．第２版、１９８９）；Ａｕｓｕｂｅｌら、ＣＵＲＲＥＮＴ
ＰＲＯＴＯＣＡＬＳ ＩＮ ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＢＩＯＬＯＧＹ（Ｊｏｈｎ
ＷｉｌｅｙおよびＳｏｎｓ，Ｎ．Ｙ．１９８９）、または当業者に公知の他の
技術を参照のこと。
【０２３０】 あるいは、表１のポリヌクレオチドの５’末端および３’末端に由来する１５
〜２５ヌクレオチドの２つのプライマーを合成して、そしてこれを用いてテンプ
レートとしてＳ．ａｕｒｅｕｓゲノムＤＮＡ調製物（例えば、寄託されたＳ．ａ
ｕｒｅｕｓ ＩＳＰ３）を使用するＰＣＲによって、所望のＤＮＡを増幅する。
ＰＣＲを通常の条件、例えば、０．５μｇの上記のＤＮＡテンプレートを含む２
５μｌの反応混合物中で実行する。好都合な反応混合物は、１．５〜５ｍＭ Ｍ
ｇＣｌ2、０．０１％（ｗ／ｖ）ゼラチン、２０μＭの各ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、
ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ、２５ｐｍｏｌの各プライマーおよび０．２５ユニットのＴ
ａｑポリメラーゼである。Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ Ｃｅｔｕｓ自動サーマル
サイクラーを用いて、３５サイクルのＰＣＲ（９４℃で１分の変性；５５℃で１
分のアニーリング；７２℃で１分の伸長）を行う。増幅した産物をアガロースゲ
ル電気泳動により分析し、そして予期した分子量のＤＮＡバンドを切り出しそし
て精製する。ＤＮＡ産物をサブクローニングしそして配列決定することにより、
このＰＣＲ産物が選択した配列であることを確認する。
【０２３１】 最後に、表１のＤＮＡ配列の重複オリゴを合成し得、そして当該分野で公知の
ＰＣＲ法を使用して所望の長さのヌクレオチド配列を生成するために使用し得る
。
【０２３２】 （実施例２（ａ）：Ｅ．ｃｏｌｉにおけるｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓのポ
リペプチドの発現および精製） 細菌発現ベクターｐＱＥ６０を、本実施例における細菌発現に用いる。（ＱＩ
ＡＧＥＮ，Ｉｎｃ．，９２５９ Ｅｔｏｎ Ａｖｅｎｕｅ，Ｃｈａｔｓｗｏｒｔ
ｈ，ＣＡ，９１３１１）。ｐＱＥ６０は、アンピシリン抗生物質耐性（「Ａｍｐ
ｒ」）をコードし、そして細菌性複製起点（「ｏｒｉ」）、ＩＰＴＧ誘導プロモ
ーター、リボゾーム結合部位（「ＲＢＳ」）、ニッケル−ニトリロ−トリ−酢酸
（「Ｎｉ−ＮＴＡ」）アフィニティー樹脂（ＱＩＡＧＥＮ，Ｉｎｃ．，前出）を
用いるアフィニティー精製を可能にするヒスチジン残基をコードする６つのコド
ンおよび適切な単一の制限酵素切断部位を含む。これらのエレメントを配置し、
それによってポリペプチドをコードする挿入されたＤＮＡフラグメントが、この
ポリペプチドのカルボキシル末端に共有的に結合された６個のＨｉｓ残基（すな
わち、「６×Ｈｉｓタグ」）を有するこのポリペプチドを発現する。
【０２３３】 本発明のＳ．ａｕｒｅｕｓタンパク質の所望の部分をコードするＤＮＡ配列を
、Ｓ．ａｕｒｅｕｓポリヌクレオチドの一部をコードする５’配列および３’配
列にアニーリングするＰＣＲオリゴヌクレオチドプライマーを用いて、Ｓ．ａｕ
ｒｅｕｓゲノムＤＮＡからか、または寄託されたＤＮＡクローンから増幅する。
ｐＱＥ６０ベクターへのクローニングを容易にするための制限部位を含む、さら
なるヌクレオチドを、５’配列および３’配列にそれぞれ加える。
【０２３４】 成熟タンパク質をクローニングするために、５’プライマーは、適切な制限部
位に続いて表１において所望のＳ．ａｕｒｅｕｓポリヌクレオチド配列のアミノ
末端コード配列のヌクレオチドを含む配列を有する。５’プライマーおよび３’
プライマーが始まるタンパク質コード配列中の点を変更し、成熟形態よりもより
短いかまたはより長い完全なタンパク質の任意の所望の部分をコードするＤＮＡ
セグメントを増幅し得ることを当業者は理解する。３’プライマーは、適切な制
限部位に続いて表１の所望のコード配列の３’末端（終止コドンを除く）に相補
的なヌクレオチドを含む配列を有し、そのコード配列は、そのリーディングフレ
ームをｐＱＥ６０ベクター中の６つのＨｉｓコドンのリーディングフレームを有
するように保持するように制限部位と整列される。
【０２３５】 増幅したＳ．ａｕｒｅｕｓ ＤＮＡフラグメントおよびベクターｐＱＥ６０を
、プライマー中の部位を認識する制限酵素を用いて消化し、次いで消化したＤＮ
Ａを互いに連結する。Ｓ．ａｕｒｅｕｓ ＤＮＡを、ＩＰＴＧ誘導プロモーター
から下流にかつ開始ＡＵＧおよび６つのヒスチジンコドンとインフレームにＳ．
ａｕｒｅｕｓタンパク質コード領域を配置する様式で、制限化したｐＱＥ６０ベ
クターに挿入する。
【０２３６】 この連結混合物を、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、前出、によって記載されるような標
準的手順を用いて、コンピテントＥ．ｃｏｌｉ細胞に形質転換する。プラスミド
ｐＲＥＰ４（ｌａｃリプレッサーを発現しそしてカナマイシン耐性（「Ｋａｎｒ
」）を与える）の複数のコピーを含む、Ｅ．ｃｏｌｉ株Ｍ１５／ｒｅｐ４を、本
明細書中に記載される例証的な実施例を実行するのに用いる。この株（これは、
Ｓ．ａｕｒｅｕｓポリペプチドを発現するのに適している多くの１つにすぎない
）は、市販されている（ＱＩＡＧＥＮ，Ｉｎｃ．，前出）。形質転換体を、アン
ピシリンおよびカナマイシン存在下のＬＢプレート上で増殖する能力によって同
定する。プラスミドＤＮＡを耐性コロニーから単離し、そしてクローニングした
ＤＮＡの正体を、制限分析、ＰＣＲおよびＤＮＡ配列決定によって確認する。
【０２３７】 所望の構築物を含むクローンを、アンピシリン（１００μｇ／ｍｌ）およびカ
ナマイシン（２５μｌ／ｍｌ）の両方を補充したＬＢ培地中の液体培養物におい
て一晩（「Ｏ／Ｎ」）増殖する。Ｏ／Ｎ培養物を用いて、約１：２５から１：２
５０の希釈度で、大培養に接種する。細胞を、６００ｎｍ（「ＯＤ６００」）で
０．４と０．６との間の光学濃度まで増殖させる。次いで、イソプロピル−β−
Ｄ−チオガラクトピラノシド（「ＩＰＴＧ」）を、１ｍＭの最終濃度まで添加し
、ｌａｃＩリプレッサーを不活性にすることによって、ｌａｃリプレッサー感受
性プロモーターからの転写を誘発する。続いて、細胞を、さらに３〜４時間イン
キュベートする。次いで、細胞を遠心分離によって収集する。
【０２３８】 次いで、細胞を、６Ｍの塩酸グアニジン（ｐＨ８）中で、４℃にて３〜４時間
攪拌する。細胞片を、遠心分離によって取り除き、そしてＳ．ａｕｒｅｕｓポリ
ペプチドを含む上清を、ニッケル−ニトリロ−トリ酢酸（「Ｎｉ−ＮＴＡ」）ア
フィニティー樹脂カラム（ＱＩＡＧＥＮ，Ｉｎｃ．，前出）へ充填する。６×Ｈ
ｉｓタグを有するタンパク質は、高いアフィニティーでＮｉ−ＮＴＡ樹脂へ結合
する。そしてこのタンパク質を単純な１工程の手順において精製し得る（詳細に
ついては：Ｔｈｅ ＱＩＡｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｉｓｔ，１９９５，ＱＩＡＧＥ
Ｎ，Ｉｎｃ．，前出、を参照のこと）。手短に言えば、上清を、６Ｍ塩酸グアニ
ジン（ｐＨ８）中でカラムへ充填し、このカラムを、初めに１０容量の６Ｍ塩酸
グアニジン（ｐＨ８）を用いて洗浄し、次いで、１０容量の６Ｍ塩酸グアニジン
（ｐＨ６）用いて洗浄し、そして最後にＳ．ａｕｒｅｕｓポリペプチドを６Ｍ塩
酸グアニジン（ｐＨ５）を用いて溶出する。
【０２３９】 次いで、精製したタンパク質を、リン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）または２
００ｍＭ ＮａＣｌを加えた５０ｍＭ 酢酸ナトリウム（ｐＨ６）緩衝溶液に対
してタンパク質を透析することによって再生する。あるいは、タンパク質を、Ｎ
ｉ−ＮＴＡカラム上に固定する間に首尾良く再び折り畳み得る。推奨される条件
は、以下である：プロテアーゼインヒビターを含む５００ｍＭ ＮａＣｌ、２０
％ グリセロール、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ（ｐＨ７．４）中で６Ｍ〜１Ｍ
の尿素の直線勾配を用いて再生する。再生を、１．５時間以上の時間にわたり行
うべきである。再生後、このタンパク質を、２５０ｍＭ イミダゾールの添加に
よって溶出し得る。イミダゾールを、ＰＢＳ、または２００ｍＭ ＮａＣｌを加
えた５０ｍＭ 酢酸ナトリウム（ｐＨ６）緩衝溶液に対する最後の透析工程によ
って取り除く。精製したタンパク質を、４℃で保管するかまたは−８０℃で凍結
する。
【０２４０】 あるいは、本発明のポリペプチドを、変性しない方法によって生成し得る。こ
の方法において、細胞を遠心分離によって収集した後、各々１Ｌの培養物からの
細胞ペレットを、２５ｍｌの溶解緩衝液Ａ中に４℃にて再懸濁する（溶解緩衝液
Ａ＝５０ｍｌの緩衝溶液あたり１錠のＣｏｍｐｌｅｔｅ ＥＤＴＡ−ｆｒｅｅ
プロテアーゼインヒビターカクテル（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ
＃１８７３５８０）を有する、５０ｍＭ リン酸ナトリウム、３００ｍＭ Ｎａ
Ｃｌ、１０ｍＭ ２メルカプトエタノール、１０％ グリセロール、ｐＨ７．５
）。５５０ｎｍでの吸光度は、約１０〜２０ Ｏ．Ｄ．／ｍｌである。次いで、
この懸濁液を、−７０℃（エタノール−ドライアイス浴を用いる）から室温まで
の３回の凍結／解凍サイクルに通す。この細胞を、氷上に保ちながら約８０Ｗに
て短い１０秒の破壊を３分間にわたって、超音波処理によって溶解する。次いで
、この超音波処理したサンプルを４℃にて３０分間１５，０００ＲＰＭで遠心分
離する。上清を、１．０ｍｌのＣＬ−４Ｂ樹脂を含むカラムに通し、アガロース
に非特異的に結合し得るいかなるタンパク質のサンプルもあらかじめ取り除き、
そして素通りの分画を収集する。
【０２４１】 この事前明澄化した素通りを、ニッケル−ニトリロ−トリ−酢酸（「Ｎｉ−Ｎ
ＴＡ」）アフィニティー樹脂カラム（Ｑｉａｇｅｎ，Ｉｎｃ．，前出）へ適用す
る。６×Ｈｉｓタグを有するタンパク質は、高い親和性でＮｉ−ＮＴＡ樹脂と結
合し、そして単純な１工程手順において精製され得る。手短に言えば、この上清
を、溶解緩衝液Ａ中にて４℃でカラムへ充填し、このカラムを、始めに１０容量
の溶解緩衝液Ａを用いて、溶出物のＡ２８０がベースラインに戻るまで洗浄する
。次いで、このカラムを、５容量の４０ｍＭ イミダゾール（９２％溶解緩衝液
Ａ／８％緩衝液Ｂ）を用いて洗浄する（緩衝液Ｂ＝５０ｍＭ リン酸Ｎａ、３０
０ｍＭ ＮａＣｌ、１０％ グリセロール、１０ｍＭ ２−メルカプトエタノー
ル、５００ｍＭ イミダゾール、最終緩衝液のｐＨは７．５にすべきである）。
このタンパク質を、緩衝液Ｂに対する溶解緩衝液Ａの比率を調整することによっ
て作製した一連の漸増イミダゾール溶液を用いて、カラムから溶出する。３つの
異なる濃度を用いる：３容量の７５ｍＭ イミダゾール、３容量の１５０ｍＭ
イミダゾール、５容量の５００ｍＭ イミダゾール。精製したタンパク質を含む
画分を、タンパク質サイズに依存して８％、１０％、または１４％ＳＤＳ−ＰＡ
ＧＥを用いて分析する。次いで、精製したタンパク質を、容易に作業可能な緩衝
液中にそれを置くためにリン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）に対して２回透析す
る。この精製したタンパク質を、４℃で保管するか、または−８０℃で凍結する
。
【０２４２】 以下は、Ｓ．ａｕｒｅｕｓが封入体の形態で存在する場合に、Ｅ．ｃｏｌｉに
おいて発現されたＳ．ａｕｒｅｕｓを精製するために用いられ得る別の代替的方
法である。他で指定しない限り、全ての以下の工程を、４〜１０℃で行う。
【０２４３】 Ｅ．ｃｏｌｉ発酵の生成段階の完了時に、細胞培養物を、４〜１０℃に冷却し
、そして細胞を１５，０００ｒｐｍで連続遠心分離（Ｈｅｒａｅｕｓ Ｓｅｐａ
ｔｅｃｈ）によって収集する。細胞ペーストの単位重量あたりのタンパク質の予
想収量、および必要とされる精製タンパク質の量に基づいて、細胞ペーストの適
切な量（重量で）を、１００ｍＭ Ｔｒｉｓ、５０ｍＭ ＥＤＴＡ（ｐＨ７．４
）を含む緩衝溶液中に懸濁する。この細胞を、高剪断ミキサーを用いて均質な懸
濁液へと分散させる。
【０２４４】 次いで、マイクロフルイダイザー（Ｍｉｃｒｏｆｕｉｄｉｃｓ，Ｃｏｒｐ．ま
たは ＡＰＶ Ｇａｕｌｉｎ，Ｉｎｃ．）に４０００〜６０００ｐｓｉで２回、
溶液を通過させることによって、細胞を溶解する。次いで、このホモジネートを
、ＮａＣｌ溶液を用いて０．５Ｍ ＮａＣｌの最終濃度まで混合し、続いて、７
０００×ｇにて１５分間遠心分離する。得られたペレットを、０．５Ｍ ＮａＣ
ｌ、１００ｍＭ Ｔｒｉｓ、５０ｍＭ ＥＤＴＡ（ｐＨ７．４）を用いて再び洗
浄する。
【０２４５】 得られた洗浄した封入体を、１．５塩酸グアニジン（ＧｕＨＣｌ）を用いて２
〜４時間、可溶化する。１５分間の７０００×ｇの遠心分離後、ペレットを捨て
、そしてＳ．ａｕｒｅｕｓポリペプチド含有上清を４℃にて一晩インキュベート
し、さらなるＧｕＨＣｌ抽出を可能にする。
【０２４６】 不溶性粒子を取り除くための高速遠心分離（３０，０００×ｇ）に続き、Ｇｕ
ＨＣｌ可溶化タンパク質を、激しく撹拌することによって５０ｍＭ ナトリウム
（ｐＨ４．５）、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、２ｍＭ ＥＤＴＡを含む２０容量の緩
衝液とＧｕＨＣｌ抽出物を迅速に混合することにより再折り畳みさせる。再折り
畳みをした希釈したタンパク質溶液を、さらなる精製工程の前に、混合せずに１
２時間４℃で保存する。
【０２４７】 再折り畳みしたＳ．ａｕｒｅｕｓポリペプチド溶液を清澄化するため、予め調
製した、適切な表面領域を有し、４０ｍＭ 酢酸ナトリウム（ｐＨ６．０）を用
いて平衡化した０．１６μｍメンブランフィルターを備えた接線濾過ユニット（
例えば、Ｆｉｌｔｒｏｎ）を、使用する。濾過したサンプルを、カチオン交換樹
脂（例えば、Ｐｏｒｏｓ ＨＳ−５０，Ｐｅｒｓｅｐｔｉｖｅ Ｂｉｏｓｙｓｔ
ｅｍｓ）へ充填する。このカラムを、４０ｍＭ 酢酸ナトリウム（ｐＨ６．０）
を用いて洗浄し、そして同一緩衝液中で２５０ｍＭ、５００ｍＭ、１０００ｍＭ
、および１５００ｍＭのＮａＣｌを用いて、段階的な様式において、溶出する。
溶出液の２８０ｎｍでの吸光度を、連続的にモニタリングする。画分を収集し、
そしてＳＤＳ−ＰＡＧＥによってさらに分析する。
【０２４８】 次いで、Ｓ．ａｕｒｅｕｓポリペプチドを含む画分をプールし、そして４容量
の水と混合する。次いで、希釈したサンプルを、以前に調製した、強力なアニオ
ン（Ｐｏｒｏｓ ＨＱ−５０，Ｐｅｒｓｅｐｔｉｖｅ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）
交換樹脂および弱いアニオン（Ｐｏｒｏｓ ＣＭ−２０，Ｐｅｒｓｅｐｔｉｖｅ
Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）交換樹脂の直列カラムのセットへ充填する。このカラ
ムを、４０ｍＭ 酢酸ナトリウム（ｐＨ６．０）を用いて平衡化する。両方のカ
ラムを、４０ｍＭ 酢酸ナトリウム（ｐＨ６．０）、２００ｍＭ ＮａＣｌを用
いて洗浄する。次いで、ＣＭ−２０カラムを、１０カラム容量の、０．２Ｍ Ｎ
ａＣｌ、５０ｍＭ 酢酸ナトリウム（ｐＨ６．０）から１．０Ｍ ＮａＣｌ、５
０ｍＭ 酢酸ナトリウム（ｐＨ６．５）までの範囲の直線勾配を用いて溶出する
。画分を、溶出液の一定のＡ280のモニタリング下で収集する。次いで、Ｓ．ａ
ｕｒｅｕｓポリペプチドを含む画分（例えば、１６％ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって
決定した）をプールする。
【０２４９】 得られたＳ．ａｕｒｅｕｓポリペプチドは、上記の再折り畳み工程および精製
工程の後に９５％を超える純度を示す。５μｇの精製したタンパク質を充填した
場合、クーマシーブルー染色した１６％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルから、主要な混入
物バンドは、観察されない。この精製したタンパク質をまた、エンドトキシン／
ＬＰＳ混入について試験する。代表的に、ＬＰＳ含有量は、ＬＡＬアッセイによ
り０．１ｎｇ／ｍｌ未満である。
【０２５０】 （実施例２（ｂ）：Ｅ．ｃｏｌｉにおけるｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓのポ
リペプチドの発現および精製） あるいは、ベクターｐＱＥ１０を用いて、本発明のポリペプチドをクローニン
グおよび発現し得る。違いは、ポリペプチドをコードする挿入したＤＮＡフラグ
メントが、このポリペプチドのアミノ末端に共有結合した６つのＨｉｓ残基（す
なわち、「６×Ｈｉｓタグ」）を有するこのポリペプチドを発現することである
。細菌性発現ベクターｐＱＥ１０（ＱＩＡＧＥＮ，Ｉｎｃ．，９２５９ Ｅｔｏ
ｎ Ａｖｅｎｕｅ，Ｃｈａｔｓｗｏｒｔｈ，ＣＡ，９１３１１）を、本実施例に
用いる。ｐＱＥ１０プラスミドの構成成分を、本発明のポリペプチドをコードす
る挿入したＤＮＡ配列が、アミノ末端に共有結合した６つのＨｉｓ残基（すなわ
ち、「６×Ｈｉｓタグ」）を有するポリペプチドを発現するように配置する。
【０２５１】 表１のポリペプチドの所望の部分をコードするか、または表１に列挙したプラ
スミドによって発現されるＤＮＡ配列を、ゲノムＳ．ａｕｒｅｕｓ ＤＮＡまた
は本発明の表１のクローン中に列挙したプラスミドクローン由来のＤＮＡのいず
れかに由来のＰＣＲオリゴヌクレオチドプライマーを用いて増幅する。これらの
ＰＣＲプライマーは、本発明のポリペプチドの所望のアミノ酸配列をコードする
ヌクレオチド配列にアニーリングする。ｐＱＥ１０ベクターにおけるクローニン
グを容易にするための制限部位を含むさらなるヌクレオチドを、５’プライマー
配列および３’プライマー配列に、それぞれ加える。
【０２５２】 本発明のポリペプチドをクローニングするために、５’プライマーおよび３’
プライマーを、それぞれのヌクレオチドコード配列を増幅するために選択する。
当業者は、５’プライマー配列および３’プライマー配列が始まるタンパク質コ
ード配列中の点を、本発明のポリペプチドの任意の所望の部分をコードするＤＮ
Ａセグメントを増幅するために変化し得ることを理解する。６×Ｈｉｓタグのコ
ード配列のリーディングフレームが、Ｓ．ａｕｒｅｕｓポリペプチドのリーディ
ングフレームを有するように維持するために、６×Ｈｉｓタグのコード配列が制
限部位と整列するように、５’プライマーを設計する。３’プライマーを、終止
コドンを含むように設計する。次いで、増幅したＤＮＡフラグメントを、ｐＱＥ
６０プラスミドについて上に記載されたように、クローニングし、そしてタンパ
ク質を発現する。
【０２５３】 表１のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列をまた、クローニングし得、そし
て直前に記載されたのに類似したプロトコルによって融合タンパク質として発現
し得る。ここで、ｐＥＴ−３２ｂ（＋）ベクター（Ｎｏｖａｇｅｎ，６０１ Ｓ
ｃｉｅｎｃｅ Ｄｒｉｖｅ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ ５３７１１）を、ｐＱＥ１
０の代わりに優先的に用いる。
【０２５４】 （実施例２（ｃ）：Ｅ．ｃｏｌｉにおけるＳｔａｈｐｈｉｌｏｃｏｃｃａｌポ
リペプチドの発現および精製） 細菌性発現ベクターｐＱＥ６０を本実施例での細菌性発現のために用いる（Ｑ
ＩＡＧＥＮ，Ｉｎｃ．，９２５９ Ｅｔｏｎ Ａｖｅｎｕｅ，Ｃｈａｔｓｗｏｒ
ｔｈ，ＣＡ，９１３１１）。しかし、本実施例において、６つのＨｉｓコドンの
翻訳を阻止し、従って、６×Ｈｉｓタグを有さないペプチドを生成するように、
ポリペプチドコード配列を挿入する。
【０２５５】 Ｓ．ａｕｒｅｕｓアミノ酸配列の所望の部分をコードするＤＮＡ配列を、所望
の部分のＳ．ａｕｒｅｕｓポリペプチドの対応する５’ヌクレオチド配列および
３’ヌクレオチド配列へアニーリングするＰＣＲオリゴヌクレオチドプライマー
を用いてＳ．ａｕｒｅｕｓゲノムＤＮＡプレップから増幅する。ｐＱＥ６０ベク
ターにおけるクローニングを容易にするための制限部位を含むさらなるヌクレオ
チドを、５’プライマー配列および３’プライマー配列へ加える。
【０２５６】 本発明のＳ．ａｕｒｅｕｓポリペプチドをクローニングするために、５’プラ
イマーおよび３’プライマーを、それぞれのヌクレオチドコード配列を増幅する
ために選択する。当業者は、５’プライマー配列および３’プライマー配列が始
まるタンパク質コード配列中の点は、本発明のポリペプチドの任意の所望の部分
をコードするＤＮＡセグメントを増幅するために変化し得ることを理解する。３
’プライマーおよび５’プライマーは、適切な制限部位に続いてコード配列の５
’末端および３’末端にそれぞれ相補的なヌクレオチドを含む。３’プライマー
は、さらに、インフレーム終止コドンを含むように設計される。
【０２５７】 増幅したＳ．ａｕｒｅｕｓ ＤＮＡフラグメントおよびベクターｐＱＥ６０を
、プライマー中の部位を認識する制限酵素を用いて消化し、次いで消化したＤＮ
Ａを互いに連結する。制限化したｐＱＥ６０ベクターへのＳ．ａｕｒｅｕｓ Ｄ
ＮＡの挿入は、ＩＰＴＧ誘導プロモーターから下流かつ開始ＡＵＧにインフレー
ムにその関連した終止コドンを含む、Ｓ．ａｕｒｅｕｓタンパク質コード領域を
配置する。この関連した終止コドンは、挿入部位の下流の６つのヒスチジンコド
ンの転写を阻止する。
【０２５８】 この連結混合物を、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、によって記載されるような標準的手
順を用いて、コンピテントＥ．ｃｏｌｉ細胞に形質転換する。プラスミドｐＲＥ
Ｐ４（ｌａｃリプレッサーを発現しそしてカナマイシン耐性（「Ｋａｎｒ」）を
与える）の複数のコピーを含み、Ｅ．ｃｏｌｉ株Ｍ１５／ｒｅｐ４を、本明細書
中に記載される例証的な実施例を実行するのに用いる。この株（これは、Ｓ．ａ
ｕｒｅｕｓポリペプチドを発現するのに適している多くの１つにすぎない）は、
市販されている（ＱＩＡＧＥＮ，Ｉｎｃ．，前出）。形質転換体を、アンピシリ
ンおよびカナマイシン存在下のＬＢプレート上で増殖する能力によって同定する
。プラスミドＤＮＡを耐性コロニーから単離し、そしてクローニングしたＤＮＡ
の正体を、制限分析、ＰＣＲおよびＤＮＡ配列決定によって確認する。
【０２５９】 所望の構築物を含むクローンを、アンピシリン（１００μｇ／ｍｌ）およびカ
ナマイシン（２５μｌ／ｍｌ）の両方を補充したＬＢ培地の液体培養物において
一晩（「Ｏ／Ｎ」）増殖する。Ｏ／Ｎ培養物を用いて、約１：２５から１：２５
０の希釈度で、大培養に接種する。細胞を、６００ｎｍ（「ＯＤ６００」）で０
．４と０．６との間の光学濃度まで増殖する。次いで、イソプロピル−β−Ｄ−
チオガラクトピラノシド（「ＩＰＴＧ」）を、１ｍＭの最終濃度まで添加し、ｌ
ａｃＩリプレッサーを不活性にすることによって、ｌａｃリプレッサー感受性プ
ロモーターからの転写を誘発する。続いて、細胞を、さらに３〜４時間インキュ
ベートする。次いで、細胞を遠心分離によって収集する。
【０２６０】 Ｓ．ａｕｒｅｕｓポリペプチドを精製するために、次いで、細胞を、６Ｍの塩
酸グアニジン（ｐＨ８）中で、４℃にて３〜４時間攪拌する。細胞片を、遠心分
離によって取り除き、そしてＳ．ａｕｒｅｕｓポリペプチドを含む上清を、２０
０ｍＭ ＮａＣｌを補充した５０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．０）に対
して透析する。あるいは、このタンパク質をプロテアーゼインヒビターを含む５
００ｍＭ ＮａＣｌ、２０％グリセロール、２５ｍＭ Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ（ｐＨ
７．４）に対してそれを透析することによって首尾よく再折り畳みし得る。再生
後、このタンパク質を、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマ
トグラフィーおよびサイズ排除クロマトグラフィーによって精製し得る。あるい
は、抗体カラムのようなアフィニティークロマトグラフィー工程を用いて、純粋
なＳ．ａｕｒｅｕｓポリペプチドを得ることが可能である。この精製したタンパ
ク質を、４℃で保管するか、または−８０℃で凍結する。
【０２６１】 以下の代替的方法を用いて、Ｓ．ａｕｒｅｕｓポリペプチドが、封入体の形態
で存在する場合に、Ｅ．ｃｏｌｉにおいて発現されるＳ．ａｕｒｅｕｓポリペプ
チドを精製する。他に明記しない限り、全ての以下の工程は、４〜１０℃で行わ
れる。
【０２６２】 Ｅ．ｃｏｌｉ発酵の生成段階の完了時に、細胞培養物を、４〜１０℃に冷却し
、そして細胞を１５，０００ｒｐｍで連続遠心分離（Ｈｅｒａｅｕｓ Ｓｅｐａ
ｔｅｃｈ）によって収集する。細胞ペーストの単位重量あたりのタンパク質の予
想収量、および必要とされる精製タンパク質の量に基づいて、細胞ペーストの適
切な量（重量で）を、１００ｍＭ Ｔｒｉｓ、５０ｍＭ ＥＤＴＡ（ｐＨ７．４
）を含む緩衝溶液中に懸濁する。この細胞を、高剪断ミキサーを用いて均質な懸
濁液へと分散させる。
【０２６３】 次いで、マイクロフルイダイザー（Ｍｉｃｒｏｆｕｉｄｉｃｓ，Ｃｏｒｐ．ま
たはＡＰＶ Ｇａｕｌｉｎ，Ｉｎｃ．）に４０００〜６０００ｐｓｉで２回、溶
液を通過させることによって、細胞を溶解した。次いで、このホモジネートを、
ＮａＣｌ溶液と０．５Ｍ ＮａＣｌの最終濃度まで混合し、続いて、７０００×
ｇにて１５分間遠心分離する。得られたペレットを、０．５Ｍ ＮａＣｌ、１０
０ｍＭ Ｔｒｉｓ、５０ｍＭ ＥＤＴＡ（ｐＨ７．４）を用いて再び洗浄する。
【０２６４】 得られた洗浄した封入体を、１．５塩酸グアニジン（ＧｕＨＣｌ）を用いて２
〜４時間、可溶化する。１５分間の７０００×ｇの遠心分離後、ペレットを捨て
、そしてＳ．ａｕｒｅｕｓポリペプチド含有上清を４℃にて一晩インキュベート
し、さらにＧｕＨＣｌ抽出させる。
【０２６５】 不溶性粒子を取り除くための高速遠心分離（３０，０００×ｇ）に続き、Ｇｕ
ＨＣｌ可溶化タンパク質を、激しく撹拌することによって５０ｍＭ ナトリウム
（ｐＨ４．５）１５０ｍＭ ＮａＣｌ、２ｍＭ ＥＤＴＡを含む２０容量の緩衝
液とＧｕＨＣｌ抽出物を迅速に混合することにより再折り畳みさせる。再折り畳
みをした希釈したタンパク質溶液を、さらなる精製工程の前に１２時間、混合せ
ずに４℃で保存する。
【０２６６】 再折り畳みしたＳ．ａｕｒｅｕｓポリペプチド溶液を清澄化するため、以前に
調製した、適切な表面領域（例えば、Ｆｉｌｔｒｏｎ）を有する（４０ｍＭ 酢
酸ナトリウム（ｐＨ６．０）を用いて平衡化した）０．１６μｍメンブランフィ
ルターを備えた接線濾過ユニット（例えば、Ｆｉｌｔｒｏｎ）を、使用する。濾
過したサンプルを、カチオン交換樹脂（例えば、Ｐｏｒｏｓ ＨＳ−５０，Ｐｅ
ｒｓｅｐｔｉｖｅ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）へ充填する。このカラムを、４０ｍ
Ｍ 酢酸ナトリウム（ｐＨ６．０）を用いて洗浄し、そして同一緩衝液中で２５
０ｍＭ、５００ｍＭ、１０００ｍＭ、および１５００ｍＭのＮａＣｌを用いて、
段階的な様式において、溶出する。溶出液の２８０ｎｍでの吸光度を、連続的に
モニタリングする。画分を収集し、そしてＳＤＳ−ＰＡＧＥによってさらに分析
する。
【０２６７】 次いで、Ｓ．ａｕｒｅｕｓポリペプチドを含む画分をプールし、そして４容量
の水と混合する。次いで、希釈したサンプルを、以前に調製した、強力なアニオ
ン（Ｐｏｒｏｓ ＨＱ−５０，Ｐｅｒｓｅｐｔｉｖｅ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）
交換樹脂および弱いアニオン（Ｐｏｒｏｓ ＣＭ−２０，Ｐｅｒｓｅｐｔｉｖｅ
Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）交換樹脂の直列型カラムのセットへ充填する。このカ
ラムを、４０ｍＭ 酢酸ナトリウム（ｐＨ６．０）を用いて平衡化する。両方の
カラムを、４０ｍＭ 酢酸ナトリウム（ｐＨ６．０）、２００ｍＭ ＮａＣｌを
用いて洗浄する。次いで、ＣＭ−２０カラムを、１０カラム容量の、０．２Ｍ
ＮａＣｌ、５０ｍＭ 酢酸ナトリウム（ｐＨ６．０）から１．０Ｍ ＮａＣｌ、
５０ｍＭ 酢酸ナトリウム（ｐＨ６．５）までの範囲の直線勾配を用いて溶出す
る。画分を、溶出液の一定のＡ280のモニタリング下で収集する。次いで、Ｓ．
ａｕｒｅｕｓポリペプチドを含む画分（例えば、１６％ＳＤＳ−ＰＡＧＥによっ
て決定した）をプールする。
【０２６８】 得られたＳ．ａｕｒｅｕｓポリペプチドは、上記の再折り畳み工程および精製
工程の後に９５％を超える純度を示す。５μｇの精製したタンパク質を充填する
場合、クーマシーブルー染色した１６％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルから、重大な混入
物バンドは、観察されなかった。この精製したタンパク質をまた、エンドトキシ
ン／ＬＰＳ混入について試験した。代表的に、ＬＰＳ含有量は、ＬＡＬアッセイ
により０．１ｎｇ／ｍｌ未満である。
【０２６９】 （実施例２（ｄ）：他の細菌中におけるＳ．ａｕｒｅｕｓのクローニングおよ
び発現） Ｓ．ａｕｒｅｕｓポリペプチドをまた、以下において生成し得る：Ｓ．Ｓｋｉ
ｎｎｅｒら、（１９８８）Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．２：２８９−２９７ま
たはＪ．Ｍｏｒｅｎｏ（１９９６）Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｐｒ．Ｐｕｒｉｆ．８
（３）：３３２−３４０の方法を用いてＳ．ａｕｒｅｕｓ中で；Ｃ．Ｒｕｓｈら
、１９９７年４月、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．４７（５）：
５３７−５４２の方法を用いてＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ中で；またはＣｈａ
ｎｇらの、米国特許第４，９５２，５０８号の方法を用いてＢａｃｉｌｌｕｓ
ｓｕｂｔｉｌｉｓを中で。
【０２７０】 （実施例３：ＣＯＳ細胞におけるクローニングおよび発現） Ｓ．ａｕｒｅｕｓ発現プラスミドを、Ｓ．ａｕｒｅｕｓポリペプチドをコード
するＤＮＡの一部を発現ベクターｐＤＮＡＩ／ＡｍｐまたはｐＤＮＡＩＩＩ（こ
れらは、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｉｎｃ．から入手し得る）へクローニングする
ことによって作製する。発現ベクターｐＤＮＡＩ／Ａｍｐは、以下を含む：（１
）Ｅ．ｃｏｌｉおよび他の原核生物細胞における増殖に有効なＥ．ｃｏｌｉの複
製起点；（２）プラスミドを含む原核生物細胞の選択のためのアンピシリン耐性
遺伝子；（３）真核生物細胞における増殖のためのＳＶ４０の複製起点；（４）
ＣＭＶプロモーター、ポリリンカー、ＳＶ４０イントロン；（５）赤血球凝集素
フラグメントをコードするいくつかのコドン（すなわち、精製を容易にする「Ｈ
Ａ」タグ）、続いてＤＮＡをＣＭＶプロモーターの発現制御下に都合の良く配置
し、そしてポリリンカー中の制限部位によってＳＶ４０イントロンおよびポリア
デニル化シグナルと作動可能に連結し得るように配置した、終止コドンおよびポ
リアデニル化シグナル。このＨＡタグは、Ｗｉｌｓｏｎら、１９８４、Ｃｅｌｌ
３７：７６７によって記載されるインフルエンザ赤血球凝集素タンパク質に由
来するエピトープに対応する。標的タンパク質へのＨＡタグの融合は、ＨＡエピ
トープを認識する抗体を用いた組換えタンパク質の容易な検出および回収を可能
にする。ｐＤＮＡＩＩＩは、さらに、選択可能なネオマイシンマーカーを含む。
【０２７１】 Ｓ．ａｕｒｅｕｓポリペプチドをコードするＤＮＡフラグメントをベクターの
ポリリンカー領域にクローニンして、組換えタンパク質発現をＣＭＶプロモータ
ーによって指向させる。プラスミド構築ストラテジーは、以下の通りである。Ｓ
．ａｕｒｅｕｓゲノムＤＮＡプレップ由来のＤＮＡを、Ｅ．ｃｏｌｉにおけるＳ
．ａｕｒｅｕｓの発現のためのベクターの構築について上に記載されるのとほと
んど同じように、都合の良い制限部位を含むプライマーを用いて増幅する。５’
プライマーは、Ｋｏｚａｋ配列、ＡＵＧ開始コドン、およびＳ．ａｕｒｅｕｓポ
リペプチドの５’コード領域のヌクレオチドを含む。３’プライマーは、Ｓ．ａ
ｕｒｅｕｓ ＤＮＡの３’コード配列に相補的なヌクレオチド、終止コドン、お
よび都合の良い制限部位を含む。
【０２７２】 ＰＣＲ増幅したＤＮＡフラグメントおよびベクターｐＤＮＡＩ／Ａｍｐを、適
切な制限酵素を用いて消化し、次いで連結する。この連結混合物を、ＳＵＲＥTM （Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｌａ Ｊｏｌｌａ
，ＣＡ ９２０３７）のような適切なＥ．ｃｏｌｉ株に形質転換し、この形質転
換した培養物を、アンピシリン培地プレートにプレートし、次いで、これを、イ
ンキュベートし、アンピシリン耐性コロニーの増殖をさせる。プラスミドＤＮＡ
を耐性コロニーから単離し、そして制限分析または他の手段によって、Ｓ．ａｕ
ｒｅｕｓポリペプチドをコードするフラグメントの存在について試験する。
【０２７３】 組換えＳ．ａｕｒｅｕｓポリペプチドの発現のために、ＣＯＳ細胞を、上に記
載されるような発現ベクターを用いて、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、（前出）
によって記載されるように、ＤＥＡＥ−デキストランを使用してトランスフェク
トする。細胞を、ベクターによるＳ．ａｕｒｅｕｓの発現のための条件下でイン
キュベートする。
【０２７４】 Ｓ．ａｕｒｅｕｓ−ＨＡ融合タンパク質の発現を、例えば、Ｈａｒｌｏｗら、
前出、において記載される方法を用いて放射性標識および免疫沈降によって検出
する。この目的のために、トランスフェクションの２日後、細胞を35Ｓ−システ
インを含む培地中で、８時間インキュベーションすることによって標識する。細
胞および培地を収集し、細胞を洗浄し、そして界面活性剤を含むＲＩＰＡ緩衝液
（Ｗｉｌｓｏｎら（前出）によって記載されるように、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、
１％ＮＰ４０、０．１％ＳＤＳ、１％ＮＰ−４０、０．５％ＤＯＣ、５０ｍＭ
ＴＲＩＳ（ｐＨ７．５））を用いて溶解する。タンパク質を、ＨＡに特異的なモ
ノクローナル抗体を用いて、細胞溶解物および培養培地から沈殿させる。次いで
、沈殿したタンパク質を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびオートラジオグラフィーによ
って分析する。予想されるサイズの発現産物が、細胞溶解物において見られる。
これは、陰性コントロールにおいて見られていない。
【０２７５】 （実施例４：ＣＨＯ細胞におけるクローニングおよび発現） ベクターｐＣ４を、本実施例におけるＳ．ａｕｒｅｕｓポリペプチドの発現の
ために用いる。プラスミドｐＣ４は、プラスミドｐＳＶ２−ｄｈｆｒ（ＡＴＣＣ
受諾番号３７１４６）の誘導体である。このプラスミドは、ＳＶ４０初期プロモ
ーターの制御下にあるマウスＤＨＦＲ遺伝子を含む。これらのプラスミドを用い
てトランスフェクトされたジヒドロ葉酸活性を欠くチャイニーズハムスター卵巣
細胞または他の細胞を、化学療法薬剤メトトレキセートを補充した選択培地（α
マイナスＭＥＭ，Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）中で細胞を増殖するこ
とによって、選択し得る。メトトレキセート（ＭＴＸ）に対して耐性の細胞にお
けるＤＨＦＲ遺伝子の増幅は、十分に考証されている。例えば、Ａｌｔら、１９
７８，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５３：１３５７−１３７０；Ｈａｍｌｉｎら
、１９９０、Ｂｉｏｃｈｅｍ．ｅｔ Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ，１０９７：１
０７−１４３；Ｐａｇｅら、１９９１，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ９：６４
−６８。漸増濃度のＭＴＸにおいて増殖した細胞は、ＤＨＦＲ遺伝子の増幅の結
果として標的酵素であるＤＨＦＲを過剰産生することによって、薬物に対する耐
性を発現させる。第２の遺伝子をＤＨＦＲ遺伝子に連結する場合、通常、この第
２の遺伝子を同時増幅しそして過剰産生する。このアプローチを用いて、１００
０コピーを超える増幅した遺伝子を保有する細胞株を発生することは、当該分野
で公知である。続いて、メトトレキセートを取り除く場合、細胞株を、宿主細胞
の１つ以上の染色体に組み込まれた増幅した遺伝子を含む細胞株から得る。
【０２７６】 プラスミドｐＣ４は、目的のポリペプチドを発現するために、ラウス肉腫ウイ
ルスの長末端反復配列（ＬＴＲ）の強力なプロモーター（Ｃｕｌｌｅｎら、（１
９８５）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．５：４３８−４４７）；およびヒトサイ
トメガロウイルス（ＣＭＶ）の最初期の遺伝子のエンハンサーから単離したフラ
グメント（Ｂｏｓｈａｒｔら、１９８５，Ｃｅｌｌ ４１：５２１−５３０）を
含む。このプロモーターの下流は、遺伝子の組込みを可能にする以下の単一の制
限酵素切断部位である：Ｂａｍ ＨＩ、Ｘｂａ Ｉ、およびＡｓｐ ７１８。こ
れらのクローニング部位の後ろに、このプラスミドは、ラットプレプロインシュ
リン遺伝子の３’イントロンおよびポリアデニル化部位を含む。他の効率の高い
プロモーターをまた、発現のために使用し得る（例えば、ヒトβアクチンプロモ
ーター、ＳＶ４０早期または後期プロモーター、もしくは他のレトロウイルス（
例えば、ＨＩＶおよびＨＴＬＶＩ）由来の長末端反復配列）。Ｃｌｏｎｔｅｃｈ
のＴｅｔ−ＯｆｆおよびＴｅｔ−Ｏｎ遺伝子発現システムおよび類似のシステム
を用いて、哺乳動物細胞中で調節された様式でＳ．ａｕｒｅｕｓポリペプチドを
発現し得る（Ｇｏｓｓｅｎら、１９９２、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃ
ｉ．ＵＳＡ８９：５５４７−５５５１）。ｍＲＮＡのポリアデニル化のために、
他のシグナル（例えば、ヒト成長ホルモンまたはグロビン遺伝子）をもまた使用
し得る。染色体中に組み込まれた目的の遺伝子を保有する安定な細胞株をまた、
ｇｐｔ、Ｇ４１８またはハイグロマイシンのような選択マーカーを用いて同時ト
ランスフェクトの際に選択し得る。初めに、１つを超える選択マーカー（例えば
、Ｇ４１８およびメトトレキセート）を使用することが有利である。
【０２７７】 プラスミドｐＣ４を、制限酵素を用いて消化し、次いで当該分野で公知の手順
によって仔ウシ腸ホスファターゼを用いて脱リン酸化する。次いで、このベクタ
ーを１％アガロースゲルから単離する。Ｓ．ａｕｒｅｕｓポリペプチドをコード
するＤＮＡ配列を、この遺伝子の所望の部分の５’および３’配列の対応するＰ
ＣＲオリゴヌクレオチドプライマーを用いて増幅する。制限部位、Ｋｏｚａｋ配
列、ＡＵＧ開始コドンおよびＳ．ａｕｒｅｕｓポリペプチドの５’コード配列の
ヌクレオチドを含む５’プライマーを合成し、そして使用する。制限部位、終止
コドン、およびＳ．ａｕｒｅｕｓポリペプチドの３’コード配列に相補的なヌク
レオチドを含む３’プライマーを合成しそして使用する。増幅したフラグメント
を制限エンドヌクレアーゼを用いて消化し、次いで１％アガロースゲル上で再び
精製する。次いで、単離したフラグメントおよび脱リン酸化したベクターを、Ｔ
４ＤＮＡリガーゼを用いて連結する。次いで、Ｅ．ｃｏｌｉ ＨＢ１０１細胞ま
たはＸＬ−１ Ｂｌｕｅ細胞を形質転換し、そして例えば、制限酵素分析を用い
て、プラスミドｐＣ４に挿入したフラグメントを含む細菌を、同定する。
【０２７８】 活性ＤＨＦＲ遺伝子を欠くチャイニーズハムスター卵巣細胞を、トランスフェ
クトに用いる。５μｇの発現プラスミドｐＣ４を、ＬｉｐｏｆｅｃｔｉｎTMまた
はＬｉｐｏｆｅｃｔＡＭＩＮＥTM（ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｇａｉ
ｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、ＭＤ）のような、脂質媒介トランスフェクション試薬を用
いて、０．５μｇのプラスミドｐＳＶｎｅｏを用いて同時トランスフェクトする
。このプラスミドｐＳＶ２−ｎｅｏは、優位な選択マーカーである、Ｇ４１８を
含む抗生物質のグループに対して耐性を与える酵素をコードするＴｎ５由来のｎ
ｅｏ遺伝子を含む。この細胞を、１ｍｇ／ｍｌのＧ４１８を補充したαマイナス
ＭＥＭに播種する。２日後、この細胞をトリプシン処理し、そして１０、２５、
または５０ｎｇ／ｍｌのメトトレキセートおよび１ｍｇ／ｍｌＧ４１８を補充し
たαマイナスＭＥＭにおいてハイブリドーマクローニングプレート（Ｇｒｅｉｎ
ｅｒ，Ｇｅｒｍａｎｙ）に播種する。１０〜１４日後、単一コロニーをトリプシ
ン処理し、次いで異なる濃度のメトトレキセート（５０ｎＭ、１００ｎＭ、２０
０ｎＭ、４００ｎＭ、８００ｎＭ）を用いて６ウェルペトリ皿または１０ｍｌフ
ラスコに播種する。次いで、最も高い濃度のメトトレキセートで増殖するクロー
ンを、さらに高い濃度のメトトレキセート（１μＭ、２μＭ、５μＭ、１０ｍＭ
、２０ｍＭ）を含む新しい６ウェルプレートへ移す。同じ手順を、１００〜２０
０μＭの濃度で増殖するクローンを得るまで繰り返す。所望の遺伝子産物の発現
を、例えばＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウェスタンブロットによってか、または逆相
ＨＰＬＣ分析によって分析する。
【０２７９】 （実施例５：Ｓ．ａｕｒｅｕｓに関する定量的マウス軟部組織感染モデル） ポリペプチドおよびペプチドを含む本発明の組成物を、以下の定量的マウス軟
部組織感染モデルを用いて、ワクチンとしての機能する能力か、または細菌種（
例えば、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）に対して免疫応答を増強／刺激する能力についてア
ッセイする。マウス（例えば、ＮＩＨ Ｓｗｉｓｓ雌マウス、およそ７週齢）を
、生物学的防御に有効な量を用いるか、または上に議論されるような、当該分野
で公知の方法を用いて、免疫増強する／刺激するのに有効な量の本発明の組成物
を用いて初めに処理する。例えば、Ｈａｌｒｏｗら、ＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ：Ａ
ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ ＭＡＮＵＡＬ，（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂ
ｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、第２版、１９８８）を参照のこと。
適切な開始用量の例は、１動物あたり２０μｇである。
【０２８０】 マウスをチャレンジするのに用いる所望の細菌種（例えば、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ
）を、一晩培養物として増殖する。この培養物を、適切な培地において、５×１
０8ｃｆｕ／ｍｌの濃度まで希釈し、よく混合し、連続的に希釈し、そして滴定
する。所望の用量を、滅菌ＰＢＳ（３ｇ／１００ｍｌ）中に事前に膨潤させた滅
菌Ｃｙｔｏｄｅｘ３マイクロキャリアビーズで１：２にさらに希釈する。マウス
を従順（しかしまだ動いている）になるまで一時的に麻酔し、そして０．２ｍｌ
のＣｙｔｏｄｅｘ３ビーズ／細菌混合物を、各動物の鼠径部に皮下注射する。４
日（注射の日を１日目として数える）後、マウスを屠殺し、そして膿瘍の内容物
を摘出し、１．０ｍｌの滅菌ＰＢＳを含む１５ｍｌコニカルチューブ中へ置く。
次いで、膿瘍の内容物を酵素的に処理し、そして以下のようにプレートする。
【０２８１】 膿瘍を、初めに、チューブの中に置いた滅菌ガラスビーズと共にボルッテクス
することによって破壊しする。次いで、３．０ｍｌの調製した酵素混合物（１．
０ｍｌコラゲナーゼＤ（４．０ｍｇ／ｍｌ）、１．０ｍｌトリプシン（６．０ｍ
ｇ／ｍｌ）および８．０ｍｌＰＢＳ）を、各チューブに加え、続いて２０分間３
７℃でインキュベーションする。次いで、この溶液を遠心分離し、そしてこの上
清を捨てる。次いで、０．５ｍｌ ｄＨ２０を加え、そしてこのチューブをボル
テックスし、次いで１０分間、室温でインキュベートする。次いで、０．５ｍｌ
の培地を加え、そしてサンプルを連続的に希釈し、そして寒天プレート上にプレ
ーティングし、そして３７℃で一晩増殖させる。次いで、別個でかつ分離したコ
ロニーを有するプレートを計数し、陽性および陰性コントロールサンプルと比較
し、そして定量する。この方法を用いて、組成物を同定し、そして本発明の組成
物の有効な用量を、マウスおよびヒトの両方において有効であることが当該分野
で公知の組成物と比較することによって、ヒトおよび他の動物について適切かつ
有効な用量を決定する。本発明の組成物を用いてのヒトおよび他の動物の有効な
処置のための用量を、マウスの上記の実験からのデータを用いて推定する。ヒト
および他の動物におけるさらなる研究が、当該分野で公知の臨床試験の方法を用
いて、最も有効な用量を決定するために必要であり得ることが理解される。
【０２８２】 （実施例６：Ｓ．ａｕｒｅｕｓ感染に関するマウス全身性好中球減少症モデル
） ポリペプチドおよびペプチドを含む本発明の組成物を、以下の定性的マウス全
身性好中球減少症モデルを用いて、ワクチンとしての機能する能力か、または細
菌種（例えば、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）に対して免疫応答を増強／刺激する能力につ
いてアッセイする。マウス（例えば、ＮＩＨ Ｓｗｉｓｓ雌マウス、およそ７週
齢）を、生物学的防御に有効な量を用いるか、または上に議論されるような、当
該分野で公知の方法を用いて、免疫増強する／刺激するのに有効な量の本発明の
組成物を用いて初めに処理する。例えば、Ｈａｌｒｏｗら、ＡＮＴＩＢＯＤＩＥ
Ｓ：Ａ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ ＭＡＮＵＡＬ，（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈ
ａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、第２版、１９８８）を参照の
こと。適切な開始用量の例は、１動物あたり２０μｇである。次いで、マウスに
、２５０〜３００ｍｇ／ｋｇのシクロホスファミドを腹腔内注射する。Ｃ．Ｐ．
注射の日を１日目として計数し、このマウスを、ＰＭＮＬの回復が始まるまで、
５日間未処置のままにしておく。
【０２８３】 マウスをチャレンジするのに用いた所望される細菌種（例えば、Ｓ．ａｕｒｅ
ｕｓ）を、一晩培養物として増殖する。この培養物を、適切な培地において、５
×１０8ｃｆｕ／ｍｌの濃度まで希釈し、よく混合し、連続的に希釈し、そして
滴定する。所望される用量を、培地中の４％ビール酵母中で１：２にさらに希釈
する。
【０２８４】 マウスに、細菌／ビール酵母チャレンジを腹腔内注射する。ビール酵母溶液単
独をコントロールとして用いる。次いで、マウスをチャレンジ後の最初の一週間
、１日２回、そして次の一週間１日１回、罹患率および死亡率を確認するためモ
ニターする。実験の最後まで残っているマウスを屠殺する。この方法を用いて、
組成物を同定し、そして本発明の組成物の有効な用量を、マウスおよびヒトの両
方において有効であることが当該分野で公知の組成物と比較することによって、
ヒトおよび他の動物について適切かつ有効な用量を決定する。本発明の組成物を
用いてのヒトおよび他の動物の有効な処置のための用量を、マウスの上記の実験
からのデータを用いて推定する。ヒトおよび他の動物におけるさらなる研究が、
当該分野で公知の臨床試験の方法を用いて、最も有効な用量を決定するために必
要であり得ることが理解される。
【０２８５】 本明細書中で引用される全ての刊行物（特許、特許出願、学術論文、実験マニ
ュアル、本、または他の文書）の開示は、その全体が参考として援用される。
【０２８６】 本発明は、本明細書中に記載される特定の実施態様によって範囲を限定される
べきではなく、これらは、本発明の個々の局面の個々の例証として解釈される。
機能的に等価な方法および構成成分は、本明細書中に示されるおよび記載される
ものに加えて、本発明の範囲内にあり、そしてこのことは先の記述および添付す
る図面から当業者に明らかとなる。このような改変は、添付の特許請求の範囲の
範囲内にあると解釈される。
【０２８７】
【表４】
【配列表】
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｐ 31/04 Ｃ０７Ｋ 16/12 ４Ｃ０８５ Ｃ０７Ｋ 14/31 Ｃ１２Ｎ 1/15 ４Ｈ０４５ 16/12 1/19 Ｃ１２Ｎ 1/15 1/21 1/19 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ 1/21 Ｃ１２Ｑ 1/68 Ａ 5/10 Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｎ Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:445） Ｃ１２Ｑ 1/68 (Ｃ０７Ｋ 14/31 Ｇ０１Ｎ 33/53 //(Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡ Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ Ｃ１２Ｒ 1:445） Ａ６１Ｋ 37/02 (Ｃ０７Ｋ 14/31 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ａ (31)優先権主張番号 ６０／０８４，６７４ (32)優先日 平成10年５月７日(1998．5．7) (33)優先権主張国 米国（ＵＳ） (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，Ｅ Ａ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＧＨ，Ｇ Ｍ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ， ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，Ｍ Ｘ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ， ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＷ (71)出願人 9410 Ｋｅｙ Ｗｅｓｔ Ａｖｅｎｕｅ， Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ， Ｍａｒｙｌａｎ ｄ 20850， Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅ ｓ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａ (71)出願人 ルドウィグ インスティチュート フォー キャンサー リサーチ ブラジル国 サン パウロ， シーイーピ ー−01590−010 サン パウロ， アンダ ー 109−40， ルア プロフェッサー アントニオ プルデンテ (72)発明者 シンプソン， アンドリュー ジェイ． ジー． ブラジル国 サン パウロ， シーイーピ ー−04619−005 サン パウロ， カンポ ベロ， ルア ガブリエル ダヌンジオ 1409， アパートメント 101 (72)発明者 チョイ， ギル エイチ． アメリカ合衆国 メリーランド 20850， ロックビル， ポトマック オークス ドライブ 11429 Ｆターム(参考） 4B024 AA01 AA11 BA07 BA31 BA41 CA03 CA09 DA02 DA06 GA11 HA08 HA12 HA17 4B063 QA01 QA18 QA19 QQ02 QQ06 QQ42 QR32 QR56 QR62 QS25 QS34 4B064 AG01 AG27 CA10 CA19 CA20 CC24 DA01 DA13 4B065 AA53Y AA90X AA91X AB01 AB02 BA02 BA08 CA24 CA25 CA44 CA45 CA46 4C084 AA02 AA06 AA13 CA53 DC22 NA10 ZB352 4C085 AA03 AA13 AA14 BA13 BB22 BB23 DD63 DD88 GG02 GG03 GG04 GG05 4H045 AA10 AA11 AA20 AA30 BA10 CA11 DA75 DA76 EA31 EA52 FA72 FA74 GA26

Claims (29)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 以下からなる群から選択されるヌクレオチド配列を有するポ
    リヌクレオチドを含む、単離された核酸分子： （ａ）表１に示されるポリペプチドのアミノ酸配列のいずれか１つをコードす
    るヌクレオチド配列；または （ｂ）（ａ）におけるヌクレオチド配列のいずれか１つに相補的なヌクレオチ
    ド配列； （ｃ）表１に示されるヌクレオチド配列のいずれか１つに少なくとも９５％同
    一であるヌクレオチド配列；または （ｄ）表１に示されるヌクレオチド配列のいずれか１つに相補的なヌクレオチ
    ド配列に少なくとも９５％同一であるヌクレオチド配列。
  2. 【請求項２】 請求項１に記載の（ａ）または（ｂ）におけるヌクレオチド
    配列に同一なヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドにストリンジェントな
    ハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドを含む、
    単離された核酸分子。
  3. 【請求項３】 請求項１に記載の（ａ）におけるポリペプチドのエピトープ
    保有部分をコードするポリヌクレオチドを含む、単離された核酸分子。
  4. 【請求項４】 請求項３に記載の単離された核酸分子であって、前記ポリペ
    プチドのエピトープ保有部分が表２に列挙されるアミノ酸配列を含む、単離され
    た核酸分子。
  5. 【請求項５】 組換えベクターを作製するための方法であって、請求項１に
    記載の単離された核酸分子をベクターに挿入する工程を包含する、方法。
  6. 【請求項６】 請求項５に記載の方法によって作製された、組換えベクター
    。
  7. 【請求項７】 請求項６に記載のベクターを含む、宿主細胞。
  8. 【請求項８】 ポリペプチドを産生する方法であって、以下： （ａ）請求項７に記載の宿主細胞を増殖させ、該細胞によってタンパク質が発
    現される工程；および （ｃ）発現されたｆｅｍＸポリペプチドを回収する工程、 を包含する、方法。
  9. 【請求項９】 以下からなる群から選択されるポリペプチドを含む単離され
    たポリペプチド： （ａ）表１の完全アミノ酸配列の１つからなるポリペプチド； （ｂ）Ｎ末端残基を除く表１の完全アミノ酸配列の１つからなるポリペプチド
    ； （ｃ）生物学的活性を有する（ａ）のポリペプチドのフラグメント；および （ｄ）（ａ）のポリペプチドに特異的な抗体に結合する（ａ）のポリペプチド
    のフラグメント。
  10. 【請求項１０】 前記ポリペプチドが（ａ）である、請求項９に記載の単離
    されたポリペプチド。
  11. 【請求項１１】 前記ポリペプチドが（ｂ）である、請求項９に記載の単離
    されたポリペプチド。
  12. 【請求項１２】 前記ポリペプチドが（ｃ）である、請求項９に記載の単離
    されたポリペプチド。
  13. 【請求項１３】 前記ポリペプチドが（ｄ）である、請求項９に記載の単離
    されたポリペプチド。
  14. 【請求項１４】 請求項９に記載のポリペプチドに特異的な、単離された抗
    体。
  15. 【請求項１５】 請求項１０に記載のポリペプチドに特異的に結合する、単
    離された抗体。
  16. 【請求項１６】 請求項１１に記載のポリペプチドに特異的に結合する、単
    離された抗体。
  17. 【請求項１７】 請求項１２に記載のポリペプチドに特異的に結合する、単
    離された抗体。
  18. 【請求項１８】 請求項１３に記載のポリペプチドに特異的に結合する、単
    離された抗体。
  19. 【請求項１９】 請求項８に記載の方法によって産生される、ポリペプチド
    。
  20. 【請求項２０】 表１におけるいずれか１つのポリペプチドのアミノ酸配列
    からなる群から選択される配列に少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を含
    む、単離されたポリペプチド。
  21. 【請求項２１】 表２に示すＳ．ａｕｒｅｕｓエピトープのアミノ酸配列を
    含む、単離されたポリペプチド抗原。
  22. 【請求項２２】 請求項９に記載のポリペプチドをコードするヌクレオチド
    配列を有するポリヌクレオチドを含む、単離された核酸分子。
  23. 【請求項２３】 請求項１４〜１８のいずれか１項に記載の抗体を産生する
    ハイブリドーマ。
  24. 【請求項２４】 以下を含むワクチン： （１）表１において同定されるアミノ酸配列を含むポリペプチドからなる群か
    ら選択される１つ以上のＳ．ｐｎｕｅｍｏｎｉａｅポリペプチド、またはそのフ
    ラグメント；および （２）薬学的に受容可能な希釈剤、キャリア、もしくは賦形剤； であって、ここで該ポリペプチドが、動物においてＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕ
    ｓ属のメンバーに対する防御的抗体を惹起するのに有効な量で存在する、 ワクチン。
  25. 【請求項２５】 動物においてＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ属のメンバー
    によって引き起こされる感染を予防または減弱する方法であって、該動物に請求
    項９に記載のポリペプチドを投与する工程を包含し、ここで該ポリペプチドが、
    該感染を予防もしくは減弱するのに有効量投与される、方法。
  26. 【請求項２６】 サンプル中のＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓポリペプチド
    をコードする１つ以上の核酸配列をアッセイすることを包含する、動物から得ら
    れた生物学的サンプルにおいてＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ核酸を検出する方
    法であって、以下： （ａ）ハイブリダイゼーションが起こる条件下で、該サンプルを１つ以上の上
    記核酸プローブと接触させる工程、および （ｂ）該生物学的サンプル中に存在する該１つ以上のＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃ
    ｃｕｓ核酸配列への該１つ以上のプローブのハイブリダイゼーションを検出する
    工程、 を包含する、方法。
  27. 【請求項２７】 動物から得られた生物学的サンプル中のＳｔａｐｈｙｌｏ
    ｃｏｃｃｕｓ核酸を検出する方法であって、以下： （ａ）該サンプル中の１つ以上のＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ核酸配列を、
    ポリメラーゼ連鎖反応を使用して増幅する工程、および （ｂ）該増幅されたＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ核酸を検出する工程、 を包含する、方法。
  28. 【請求項２８】 動物から得られた生物学的サンプル中のＳｔａｐｈｙｌｏ
    ｃｏｃｃｕｓ抗体を検出するためのキットであって、以下： （ａ）固体支持体に結合した請求項９のポリペプチド；および （ｂ）検出手段、 を包含する、キット。
  29. 【請求項２９】 動物から得られた生物学的サンプル中のＳｔａｐｈｙｌｏ
    ｃｏｃｃｕｓ抗体を検出する方法であって、以下： （ａ）該サンプルを請求項９に記載のポリペプチドと接触させる工程；および （ｂ）抗体−抗原複合体を検出する工程、 を包含する、方法。
JP2000536845A 1998-03-20 1999-03-18 Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓａｕｒｅｕｓ遺伝子およびポリペプチド Withdrawn JP2002516068A (ja)

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