JPS5934154A - 免疫分析素子測定法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は流体試料中の微量成分測定法に関し更に詳しく
は定量免疫分析素子の測定法に関する。

流体（特に生物学的流体試料）中に微量しか存在しない
物質の定量法として免疫学的反応が種々用いられてきた
。免疫学的反応は流体試料中の免疫活性物質（例えば抗
原）と該活性物質と特異的に結合する物質（例えは抗体
）の特異的な結合反応であシ、この原理を利用し種々の
分析反応の開発がなされてきた。

特に１９５８　／ＰＢｅｒｓｏｎとＹａｌｌｏｗが放射
性ヨード１３１■で標識したインシュリンと糖尿病患者
の血清からとシだしたインシーリン抗体を用いて血清中
のインシーリンを測定する事に成功した。

該放射免疫測定法（ラジオイムノアッセイ、ＲＩＡと略
す）は高い感度を廟する良好な定量分析法であるが、標
識化合物に放射性同位元素を用いる為、特殊な施設が必
要で、通常の夫験ヱでは使用が困難であること、又溌液
にも細心の配慮が必要であること、半減期の短かい放射
性同位元素の場合長時間保存ができないこと等々の欠点
も有する。

このため放射性同位元素を他の標識で置きかえた方法が
注目されはじめた。そのψ１」としては標識物質として
酵素、バクテリオファージ、金属及び有機金属の錯体、
補酵素、酵素基質、酵素阻害物質、循環反応体、有機補
欠分子族、化学発光性反応体及び螢光性分子等が挙げら
れる。これらの中で現在実際に測定に使用されているも
のは酵素を用いた酵素イムノアッセイ（ＥＩＡ　）、螢
光性分子を用いた螢光イムノアッセイ（ＦＩＡ　）等で
ある。

しかしながら通用しているこれら前記の免疫分析方法で
は、下記に示す種々の欠点を有している。

１）典型的には１０乃至２００μｔの流体試料を用いる
慣用の化学分析又は血液分析と比較して、比較的多量（
例えば、０．１乃至ｉ、ｏｔｙ）の流体試料が必要であ
る。

２）試験混合物の特異的結合反応に多大の時間が必要で
ある。（例えば数時間乃至１晩）３）反応終了後に抗原
−抗体結合複合体と未結合体の物理的分離（Ｂ／Ｆ分離
という）が必要である。

４）免疫分析反応を完了させるためには多くの工程が必
要であり、又その工程は個々別々に行なわねばならない
（例えば試料添加、インキ−ベート、分離、ラベル（標
識体）の定量等の工程）。

５）自動化システムへの適合が困難である。

一方これらの欠点を克服することが可能な乾燥系の化学
（ドライ・ケミストリー）を用いる分析系が特開昭５５
−９０８５９号に開示されている。この方法は、可撓性
プラスチック支持体上に篩分子重合体ビーズからなる構
造層（レジストレーション層と称する）に抗体を不動化
した着色高分子重合体ビーズからなる構造層を順次塗布
したものに代表される免疫分析素子に未ラベル抗原（流
体試料）と一定量の螢光ジベル抗原を混合した試料を一
定量適用することによシ未ラベル抗原とラベル抗原が抗
体に対して競合結合し、レジストレーション層へ泳動し
た未反応のラベル抗原量をｎｔ＋ｊ定することによシ流
体試料中の抗原を定量するものである。

しかしながらこの方法では、Ａ）レジストレーション層
へ泳動した未結合ラベル抗原の検出（１・゛検出と称す
）又は、Ｂ）不動化抗体へ結合した結合ラベル抗原の検
出（Ｂ検出と称す）により流体試料中の未ラベル抗原の
量を決定するが、ＦおよびＢどちらか一方の検出によシ
、未ラベル抗原の量を決定するため、必然的に大きな誤
差を含む可能性があるという欠点を有している。これは
特に極微量しか存在しない成分を検出する際に著しい。

即゛ち極微量成分の検出結果はラベル抗＃蛍のばらつき
、非特異的結合の生成混入、或は塗布膜厚のばらつき、
測定条件の変動（例えは光源輝度等）に起因する誤差を
含むという欠点を有し、定量値の信頼性を低くしている
。

本発明の目的は、上記した種々の欠点を有しない免疫分
析素子測定法を提供することにある。

本発明者らは鋭意横割を重ねた結果、多孔性媒体から成
る第−検知層、遮蔽層及び第二検知Ｊ−の少くとも３層
を順次積層して有し、かつ第１検知層又は第２検知層の
いずれか一方にのみ流体試料中の免疫活生物質と特異的
に結合する物質を含有した免疫分析用分析素子を用い、
免疫反応終了後に免疫反応量に対応した検知量を第−検
知層及び第二検知層の両方から測定する事を特徴とする
免疫分析素子測定法によシ上記欠点を克服することがで
きた。

以下に本発明の詳細な説明する。

本発明は免疫分析において例えはラベル抗原と抗体が結
合した複合体（Ｂｏａｎｄ、Ｂと略す）と未結合のラベ
ル抗原（Ｆｒｅｅ、　Ｆと略す）を同時に測定し、流体
試料中の未知の抗原量を決定することから成るものであ
るが、まづこの免疫分析系子（以後誤を犯す恐のないと
きには、分）ｄｒ索子、更に素子と略すことがある）を
用いる測定原理について説明する。未知の抗原の分析を
すべき流体試料をラベル抗原の存在下で素子と接触させ
る。ラベル抗原を次のような、いくつかの方法の１つに
より免疫分析素子と協働させることができる。

即ち、■流体試料（未ラベル抗原を含む）へラベル抗原
を直接添加し、次いでラベル抗原を含む流体試料を分析
のために免疫分析素子に通用する。

■免疫分析素子へ、ラベル抗原及び流体試料を個別的に
添加する（たとえば（イ）流体試料添加の直前又は直後
のラベル抗原の添加並びに（ロフラベル抗原を素子へ添
加し、続いて乾燥し、そして流体試料添加の際素子を再
湿側させる）。■流体試料ｒ単に適用することによシ分
析開始可能にするようにラベル抗原を免疫分析素子に組
み入れる。たとえばラベル抗原を素子の遮蔽層及び検知
層か、又は不動化抗体を含み抗原抗体反応を行なう素子
構成費素層に組み入れることが出来る。どの場合もラベ
ル抗原を素子に組み入れる時は、ラベル抗原を不動化抗
体と離して保持し、２ペル抗原の抗体への時期尚早の結
合を回避するよう注意を払わねばならない。

前述のような協働ラベル抗原の存在下で液体試料を免疫
分析素子と接触させる時ラベル抗原及び未ラベル抗原（
試料中に存在し、そして測定すべき未知物である）は、
素子内の抗原−抗体反応を行わせる層に不動化して存在
する抗体へ肋合結合する。

その結果分析素子の一方の側から測定すれば、未反応の
ラベル抗原量■他方の側から測定すれば、反応したラベ
ル抗原量（Ｂ）（実際には未反応のラベル抗原その他非
特異的結合も存在するがＦの値から補正する事が可能で
ある。）を測定することができる。

本発明に係る分析素子は同時にＦとＢを測定することが
できる。流体試料中の未ラベル抗原の量は、測定値Ｆと
Ｂを用いて精度良く決宇すること孔性媒体であれば用い
ることが０ｊ能である。本発明におけるパ多孔性媒体”
とは、検体である流体試料を単位面積当９一定量収納す
る事が可能であシ、かつ該媒体内及び媒体層間の流体試
料の自由な移動が可能であシ、更に媒体層の界面に流体
試料が自由に接触する事が可能でろるものをいう。

例工ば、メンブレンフィルター、布、濾紙或は、ガラス
繊維濾紙が挙げられる。更に他の多孔性媒体としては特
開昭５５−９０８５９号及び特願昭５５−１７９６１３
号、同５５−１７９６１４号に記載されたものが挙げら
れる。特開昭５５−９０８５９号に於る方法は前述の如
く流体に対して非膨潤性かつ不浸透性の熱安定性有機高
分子粒子と該粒子とは異種の有機ポリマーから成る接着
剤により三次元格子を形成するものである。又特願昭５
５−１７９６１３号に於る粒子結合体は表面に官能基を
有する流体試料に対して非膨潤性かつ不浸透性の熱安定
性有機高鼾粒子単位を低分子化合物を介して結合させた
粒子結合体であり、特願昭５５−１７９６１４号に於て
は表面に官能基を有する流体試料に対して非膨潤性か上
記引用例は本発明に係る多孔性媒体から成る層として有
用に用いる事が可能である。

他の好ましい多孔性媒体として特願昭５６−１８９７８
４号及び特願昭５７−６５０５号等に記載のものが挙げ
られる。前者は媒体の構成素材である各個の粒子表面に
官能基を有する有機高分子重合体粒子を核とし該粒子表
面に親水性重合体な殻として有する核殻多層構造の機能
的な粒子単位から成るものであシ、後者は核部分がガラ
ス、無機物質であるものである。

前記の親水性殻部分を構成する素材としては、例えばゼ
ラチン、酸処理のゼラチンの如き、ゼラチン類、カルボ
キシメチルセルロース、ヒト四キシエチルセルロース等
の水Ｍ　性セルロース誌病体類、プルラン、カルボキシ
メチルプルランＡＴ、のフールラン誘導体類、ホリビニ
ルアルコール、ホリビニルビロリドン、ポリアクリルア
ミド、ポリアクリルアミド等の水浴性ビニルポリマー用
鵠・か４′１ノられる。

史に前述の粒子単位の栽水性殻−ａ１１目こは′ｒＬ翻
性散性放射線光による架橋性′自能基を冴人する句１が
１ｙＪ能である。これら官能基は舶公１１ｊｊ　５６　
５７６１＋バ同５６−５７６２号及び同５６−５７６３
号に杵卸１に記載されている。

更に前述の核殻多廓構造を南するオｖ子単位は該粒子の
親水性殻部分に、少なくとも−４１１の試薬を含鳴する
事が可能である。ここにおける試薬とは基質又は合成基
質色原体等及びラベル体と協動し７て有意な検出系を形
成することが”Ｊｉｌｉｉな物質例えば希土類原子イオ
ン等が芋げられる。

前述の粒子単位の合成は前記特許等にｉｆ（”細にｉ記
載されている。これらに従えば容易に合成する牛が可能
である。本発明の粒子単位表面には児差″活性物質例え
は、抗原又は抗体等を担持する墨が出来る。相持の方法
は例えば物理吸液による方法及び化学結合により抗原又
は抗体を担持する方法がある。

物理吸湘法としては抗原又は抗体を水又は過当な緩衝液
に俗解さゼ、これに本発明の粒子単位又は粒子単位を粒
子結合体としたものを浸漬して成層させる事が出来る。

この際緩衝液は０．０１乃至ＬＭ程贋の過当な緩衝液を
用いる事が出来る０又吸漸させるｖ／ＪＪＢの磁度吸着
させる。

上記吸盾の為の温度は室温又はそれ以下が好ましく、時
間はｌＯ乃至１００時間が好ましい。

得られた粒子単位又は粒子結合体は、浸漬液から分離し
た抜水又は緩徊液で洗浄し吸着にあづからなかったヤ抗
原又は抗体をとシさる事が好ましい。

化学結合を用いる方法としては抗原又は抗体を本発明の
粒子単位表面上の官能基と直接又は多官能性試薬を用い
て結合する牛が０Ｊｔ１１式である。これらの方法は、
例えは、千畑一部桐１固定化酵素」（１９７５年講談社
刊）に記載されている酔素等の固定化技術を応用する事
が出来る。−９ｌＪを挙けれはジアゾ化法、アミド化法
、アルギル化法及びグルタルアルデヒド、ヘキザメチレ
ンジインシアネート等を用いる方法がある。

当然の事ながら抗原又は抗体の矛４．付は不発ψ］に係
るイＶ子単位に結合ちぜてから粒子結合体を作製する事
も又あらかじめ粒子結合体を１１・表した佐抗原又は抗
体を結合する事も−ｔｊＪ舵である。

更に該粒子単位には必要に応じて免役反応における非特
異的反応を排除する目的で、（１４１１定ずべき免役反
応に関与しない蛋白負を担持する事が可能である。これ
らの代表的な例としては咄乳動物の正常血清タンパク質
、アルブミン、ゼラチン及びその分解物等が挙げられる
。

これら担持方法は前述と同じように物理吸着法及び化学
結合法を適宜用いる事が出来る。

以上詳述した素材方法を用いて本発明に係る多孔性媒体
から成る第−及び第二検知層を構成することができる。

まだ第−検知層若しくは第二検知層のいづれかにのみ免
疫反応に与る試薬或は物質を付帯させることができ、ラ
ベル物質との協働の下に免疫反応を検知する様式に対応
した検知量が測定される。

また本発明に係る遮蔽層は前述の検知層と同様のものを
用いる事が可能でめる。その際第−及び第二検知層の検
知量測定に於て相互に干渉し合わないようにする為に過
敏剤として棟々の加科、染料又は全域微粉末を金山する
事が必須である。この際の顔料又は染料は検知の様式に
よって選択されるものである。例えば、可視又は紫外ｓ
’９Ｍ域における反射磁度を用いる場合その用いられる
顔料又は染料は二酸化チタン硫酸マグネシウム等の白色
が用いられる。又螢光強度によって定量する場合、用い
る螢光物質から出る螢光を吸収する顔料又は染料が用い
られる。これらは用いられる螢光物質の発螢光の波長に
よシ適宜選択されるべきであるが、例えばリーガル■３
００（カボット社）、ウットング■レッドＢピグメント
（デュポン社）的種々のものが摩げられる。又放射性同
位フし素を用いる場合鉛等の放射性遮蔽剤を含４コする
牛が可能である。

上記顔料又は染料は例えば布、濾紙、ミクロフィルター
の如きあらかじめ多孔性を＋＋しているものは後から染
色しても良いしイ１ｉであれは紡糸の際に紡糸液中に混
合する事も可能でりり、又ミクロフィルターにおいては
、製造時に必安景を宮准しあらかじめ液位されたものを
用いる事も可能である。又特開昭５５−９０８５９号、
特Ａ＋ｉ＋昭５５−１７９６１３号、同５５−１７９６
１４号、同５６　１８９７８４　＋−ｆ及び同５７−６
５０５号等に記載の粒子結合体はあらかじめ製造時に粒
子単位内に顔料又は染料を言１ｒｑする事は容易であシ
それらの詳細については同上公報或は明細書に開示され
ている。

本発明に係る遮蔽剤は遮蔽層を十Ｎ成するＡ（量の約Ｏ
６ｌ乃至約２５重量パーセント含有する事が出来る０ 更に本発明に係る遮蔽層も前述の検知層と同様に免疫反
応における非特異的結合反応を防止する為にその表面に
非免疫性蛋白質例えば正常なセキライ動物の血清蛋白質
やウシ血清アルブミン等を担持する事が出来る。

本発明に用いられる分析素子は少なくとも第一層してな
ｐかつ各々が前記した多孔性媒体から形成され、史に第
−検知層又は第二検知層のいづれか一方に抗原又は抗体
を担持したものである。

例えばあらかじめ多孔性の構造を有するものは親水性の
茜分子例えばゼラチンの如きものの水溶液を接着剤とし
て各々の層を互層する事によ多積層する事が出来る。

更に塗布によって積層する事も可能である。例えば前述
の特開昭５５−９０８５９号、特願昭５５−１７９６１
３号、同５５−１７９６１４号、同５６−１８９７８４
号及び同５７−６５０５号等の粒子単位は塗布によって
前述の各層を形成する事が出来る。

前記粒子単位は、棹々の方法を用いて塗布する事が可能
である。好ましい方法の１つとして下記の工程を挙げる
事ができる。

（１）前記粒子単位を、該粒子を浴）η′しない数体キ
ャリヤーに分散し安定な分散液をｉＡ　ＩＪ　Ｌ（２）
　　この安定な分散液を支持体に制用し、でして（３）
該粒子単位を適当な温度で、該范Ｖ子単位同志の結合を
起こさせなから数体キャリヤーを除去する。

”安定な分散液”とは、粒子単位同志が疑氷塊を形成す
る墨なくキャリヤー中に存在する串を意味する。前述の
各層を製造するだめに有用な分散液は、同分散液を支持
体上に適゛用するに十分な時間、安定である必要がある
。

このような安定な分散液を製造するためには、多くの方
法を単独又は組合わせて用いる事が可能である。例えば
有用な方法の一つとして、界面活性剤を液体キャリヤー
へ添加し粒子単位の分散液中における分布及び安定化を
促進する事ができる。

使用可能な代表的な界面活性剤の例としては、トライト
ン■Ｘ−１００（・−ムアンド・・−ス社製；オクチル
フェノキシポリエトキシエタノール）サーファクタント
ＬＯＧ■（オリーン社製；ニルフーノキシポリグリシド
ール）等の非イオン性界面活性剤がある０ 上記界面活性剤は広範に逆択された量を用いる事が可能
でめるが、電合体粒子単位の亘′量に対して、１０ＭＭ
ｇパーセント乃至０．００５重１ノ（−セント好１しく
は６亘量）く−セント乃至０．０５重量ノ（−セント用
いる事ができる。更に別の方法として該粒子単位と液体
キャリヤーの音阪処理、物理的混合、及び物理的撹拌処
理、ｐＨ調１１．がある。これらは前記の方法と赳合わ
ぜる事によシ、さらに有用である。

本発明に係る粒子単位は分散液の献体キャリヤーを除去
する除に販粒子単位同志の接触界面で結合させる事で多
孔性の層を製造するものであるカニ、結合を起こさせる
触媒、たとえば酸アルカリを分散液中に存在させる事も
有用である。特に酸触媒のうち揮発性酸触媒（例えば酢
酸等）その他を用いる事は有用である。又液体キャリヤ
ーを除去する操作は、粒子単位の熱安定性温１ｉ以下及
び免役活性物質と特異的に結合する！Ｉ２！Ｉ負の失活
する温度以下である墨が望捷しいが、好ましくは１０乃
至００℃の温度によシ実施する事ができる。

前記分散液の冷体キャリヤーは、水１ｉ１−？＜＞一体
を月ｊいることができる。しかしながら、該粒子（μ位
がキャリヤーに年齢性であり、ｔＬってそれらの粒状特
性が保持されるという条件で神々のＩｓ’　４Ｔｈ　ｉ
秋体のような他の液体キャリヤーも使用可能である０水
以外の代表的な液体キャリヤーには、水晶４１１性有機
溶媒、水と水混和性有様溶媒の水性混オｌ」物及び適当
なメ４和性有機溶媒゛がある。水混和性廟機溶媒には、
低級アルコール（即ち、アルキル基の炭素数１乃至４個
のアルコール）、アセトン及びテトラヒドロンランがあ
る。水不混和性沿線には、酢酸エチルの如き低級アルキ
ルエステル、及びハロゲン化炭化水素（例えばクロロホ
ルム、塩化メチレン及び四塩化炭素等）の如きノ・ロゲ
ン化有機沿線がある。

本発明に係る粒子単位を塗布して成る層を治する分析素
子は例えば浸酸塗布法、エアーナイフ法、カーテン粗布
法又は米国特許第２，６８１，２９４七明糺俳に記載の
如きホッパーを用いる押し７出し塗布法等谷独の地布法
で塗２１ｉする事が可能であシ、Ｆ９Ｔ望によシ、二層
又はそれ以上の層を米し！！１％訂第２，７６１，７９
１号及び英国特許第８３７，０９５号明細曹に記載の方
法で同時に塗布する墨も出来る。

本発明に係る素子に用いられる支持体としては液体不浸
透性ものであれば良い。但し、免役分析における最終の
検知量測定が分光学的測定例えば、可視又は紫外狽域に
おける良度あるいは螢光光度測定及び発光反応における
発光強度測定等の場合支持体は光透過性である事が必要
である。この時検知量測定に心安な波長領域以外の波長
に対しては光不透過性であっても不都合はない。

更に放射性同位元素による放射能計測を検出する場合に
は光透過性でなくてもあっても良い事は百うまでもない
。

用いられる支持体の一例として、三酢酸セルロース、ポ
リエチレンテレフタレート、ポリカーボネート、ポリ塩
化ビニル、ポリスチレン等の合成高分子又はガラス金属
等稚々のものか４・りられる０次に本発明に係る素子の
態様を１実施例の断面図を用いて説明する。第１図は線
図をボす。１は第−検知増であって粒子結合体による多
孔性媒体とし、粒子単位に免疫反Ａる特異反応物質を伯
蛍させた。２は遮蔽層であシ、粒子ね合体の粒子単位に
蓮蔽剤を含有させている。３は同じく粒子軸合体よシな
る第二検知ノ曽である。４は支持体である０ 前記３棟のノ曽は各々単−Ｊｈｊであってもよいし板数
１曽であってもよい。また各層独自に１だ稍）曽構成層
は自己の形体を保持する岡り性（自己支持性）を有する
故に支持体４は必ずしも心安で６ない。

また前記３釉の層は予め個別の鴻鳩としておき、測定条
件に最適の厚みに複数枚ＩＬわで圧接し層を構成して分
析素子として使用する形態としてもよい０ 本発明係る免疫分析素子に適用する事が口」能なイムノ
アッセイは、その検知様式の如（１’Ｊにかかわらず、
全て用いる事が可能である。例を挙げれば放射免＆測定
法（ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ　））、６％　’Ａ
　免＆測定法（エンザイムイムノアッセイ（ＥＩＡ　）
）　、螢光免＆　ｌｌｉ定法（フルオロイムノアッセイ
（ＦＩＡ）　）等があけられる。

又反応の検出様式も、競合法、サンドイッチ法二ワシ体
法等釉々のものが皐けられる。同上記の釉々の検知？ｌ
ａ＋定法及び独々の反応検出様式を所望に応じて組合わ
せて用いる事が可能である。これらについては釉々の成
嬬・又は総祝に詳卸ｉに説明がなされているが、例えは
、入江實蝙［ラジオイムノアッセイｊ　（１９７４年刊
講談社）石川栄治、狗合忠、颯井源蝙集［酔集免投測定
法Ｊ　（１９７８年刊医学書院）に詳細に記載されてい
る。

本発明に係る免役分析素子を用いた測定法は、Ｂｏｕｎ
ｄとＦｒ　ｅｅを両方測定する事によυ免役分析の精度
をよシ向上さぜるものである。以下に本発明を実施例を
もって説明するが、本発明はこれによって何ら駆足され
るものではない。

−白 実施例１ 平均粒径２１μｍのポリ（スチレン−ツーｎ−ブチルメ
タクリレート−コークリシジルメタクリレ−）　（７５
：　１５　：　１０重量パーセント）の石１．子１０亜
足部を非イオン性界面宿性剤Ｔｒｉｔｏｎ■ｘ−ｉｏｏ
（ロームアンドハース社製）　０．５ｍ　Ｍ’＞　６１
４　、十皿消アルブミン（和光純系■）０．１重量部を
ちむか［舷抜仲」剤（０゜ＯＬＭ　、　ＰＨ７，０）浴
液に熱流させ、心、濁液をホリエチレンテレ７タレート
支拘体（ｈ厚１８０μｍ）土に該粒子に関し塗布量を１
．６　ｆ／ｄ扉に制御して飯布した後、フィルムドライ
ヤーで４２℃３０分向乾燥８せ第１検知鳩を作成した。

この検知層上に同様にして連蔽地・、第２検知層を塗布
によシ形成して、ヒトα−フェトプロティン測定用分析
素子を作成した。

遮蔽層、第２検知層は以下の辿りである。

遮蔽層： リーガル３００■（ガボット社製）を２％ル、量だけ分
散含梅するポリ（スチレンーコーｎ−ブチルメタクリレ
ート−コークリシジルメタクリレート）（７５：　１５
　：　１０重量パーセント）の平均粒径２１μｍの黒色
粒子　　　　塗布！　０．８　ｒ／ｄｔｒｔ′第２検知
層： 第１検知層に用いたのと同様の粒子にウサギ抗ヒトα−
フェトプロティン抗体（デンマークダコバツク社）を吸
漸させた粒子　塗布量１．６　？／ｄｎ？この分桁素子
に正画成人血清から免役吸着体を用いてα−フェトプロ
ティンを除いた血清に対して、ラベル抗原としてＦＩＴ
Ｃラベル（ンルオレセインインチオシアネート）α−フ
ェトプロティンｌＸ１０’Ｍ及び禾ラベル抗原として０
〜１×１０−６Ｍにいたる種々のα−フェトプロティン
を含む試その後４８５　ｎｍに励起フィルター、５２５
ｎｍに発光フィルターを有する反射螢光光度計を用いて
第１検知層側、第２検知層側からフルオレセインの螢光
−１ 表かられかるように第１検知層、第２検知層のみの測定
だけでも各濃度のα−フェトプロティンを識別可能であ
るが、第１検知層側と第２検知層側の測定値の和は一定
していない。

これは螢光測定時の光源の変動等の独々の要因に起因す
ると考えられるが、片方のみの側層では測定値に常にこ
のような誤差を含んでいる危険性があシ又その程度を知
る手段もない。本発明の如く両方から測定することによ
って初めて、辿］定値の信頼性を確認することが可能で
ある。

実施例２ 実施例１０分ル「索子にラベル抗原としてＦ’ＩＴＣ−
α−７エトフロテイン１×１０−７Ｍ１未ラベヤ抗原と
してＩ　Ｘ　１０　’ＩＶｌの試験血清１０μｔを滴下
し３７℃２０分間インキュベートし、実施例１と同様に
螢光強度を測定したＪツを表−２に示す結果を得た０表
　−２ ここで、Ｆ／Ｂ＋Ｆ、　Ｂ／Ｂ＋Ｆ　をそれぞれについ
て計算すると（変動分の補正） Ｆ／Ｂ十Ｆで　変動係数　４．１４％ Ｂ／Ｂ＋Ｆで　　　　１．３８％ が得られた。

このように本発明の第１検知／ｉ！、；・、第２検知層
の両方から測定し１．上記のような補正を加えることに
よって再現性が高まるとと！ｔ：１　！、！ＩＪらかで
ある。

【図面の簡単な説明】

第１図は本発明に保る分栢素子の１実７／Ｌ！Ｉψりの
断面図である。 １・・・・・・・・・・・・・・・・・・第一検知ｊ曽
２・・・・・・・・・・・・・・・・・・趣蔽ノ曽３・
・・・・・・・・・・・・・・・・・第二検知Ｊｌ！ｉ
４・・・・・・・・・・・・・・・・・・支持体５・・
・・・・・・・・・・・・・・・・検知測定力向代理人
　　　桑　原　義　美

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. 多孔性媒体から成る第−検知層、逗撤層及び第二検知層
   の少くとも３層を順次積層して有し、かつ第−検知層又
   は第二検知層のいずれか一方にのみ流体試料中の免役活
   性物質と特異的に結合する物質を含有した免疫分析素子
   を用い、免疫反応終了後に免疫反応量に対応した検知量
   を第−検知層及び第二検知層の両方から測定する事を％
   徴とする免疫分析素子測定法。