KR20170132856A - 신속한 미생물 동정 및 항균제 감수성 시험을 위한 기기 및 시스템 - Google Patents

신속한 미생물 동정 및 항균제 감수성 시험을 위한 기기 및 시스템 Download PDF

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KR20170132856A
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오스틴 애쉬비
매튜 케터러
케빈 마샬
조쉬 해리슨
매튜 메테
폴 리차드
웨인 쇼월터
재스민 코트
필립 씨. 할버트
솔렌 부르주아
스티븐 더블유. 메츠거
켄 한스
메간 멘색
칼로스 미쉘
엘케 앨러스
둘리니 가마지
랜던 프리스브레이
올레그 구샤틴
알레나 샴샤이바
벤 텅
앤드류 구손
커트 라인하르트
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액셀러레이트 다이어그노스틱스, 아이엔씨.
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Abstract

시약 카트리지, 시약 스테이지, 카세트, 카세트, 스테이지, 피펫터 조립체, 광학 검출 시스템 및 제어기를 포함하는 자동화된 미생물 동정 및 항생제 감수성 테스트용 시스템이 개시된다. 이 시스템은 열 부하를 제어하기 위해 모터 유휴 토크를 동적으로 조정하고 개별 미생물의 실제 초점 위치를 결정하기 위해 빠른 초점 프로세스를 채택하도록 설계되었다. 또한 이 시스템은 동적 희석을 사용하여 샘플에서 생존 가능한 미생물의 상대적 존재량을 정량화 할 수 있으며 신속하고 정확한 항균제 감수성 테스트를 위해 맞춤형 미생물의 미생물 성장을 촉진 할 수 있다.

Description

신속한 미생물 동정 및 항균제 감수성 시험을 위한 기기 및 시스템
본 발명은 미생물 확인 및 항균 감수성 테스트를 수행하기 위한 장치 및 시스템에 관한 것이다.
혈액 샘플과 같은 환자 샘플은 환자의 질병의 원인을 평가하고 그 질병을 치료하기 위해 적절한 치료 과정을 결정하기 위한 주요 생물학적 출발점이다. 이환율과 사망률 감소의 핵심은 가능한 한 빨리 적절한 복용량 처방으로 중환자 환자의 적절한 치료를 시작하는 것이다. 이 과정에서 역사적으로 취약한 점은 미생물 집단의 충분한 배양으로 병원균의 존재를 확인하고 어떤 항균 화합물이 병원균이 치료에 반응 하는지를 결정하는 것이다. 환자 샘플에서 미생물 (들)을 적절하게 확인하고 약물 감수성을 평가하는 데 필요한 분석 시간을 줄이는 것이 환자의 생존 확률을 높이는 데 중요하다.
많은 경우에 있어서, 환자 샘플은 상이한 속 (genera), 종 (species) 및 심지어 균주 ("다균"샘플로도 공지 됨)로부터의 박테리아의 혼합물과 같은 다수 유형의 미생물을 함유한다. 진단 정확도는 전통적으로 민감도와 특이성 측면에서 표현된다. 민감도는 실제로 진단 검사를 양성으로 지정할 확률을 나타내며, 양성 및 항생제 감수성 과정을 혼동하는 양성이다. 민감도에 대한 역은 특이성이며, 이는 위 음성 테스트 결과를 얻는 비율이다. 알려지지 않은 미생물을 확인하는 현재의 방법은 위양성 및 위음성 모드 모두에서 실패하는 경향이다. 민감도 및 특이성을 가진 이러한 어려움은 일반적으로 잡음, 누화, 경계선 저항 등과 같은 샘플 탐지를 방해하는 요인에 의해 촉진된다. 전통적인 분석 방법은 종종 미생물 확인의 특이성에 대한 검출 민감도를 교환한다. 다른 응용 프로그램에서는 정확한 미생물 동정보다 민감성에 우선 순위를 두고 그 반대가 사실이다. 그러나 효율성을 극대화하고 따라서 환자에게 더 나은 치료 결과를 얻을 확률을 높이려면 신속한 자동 테스트 시스템을 사용할 때 감도와 특이성을 균형 있게 개선해야 한다.
임상 샘플로부터의 유기체의 ID (identification) 및 항균제 감수성 검사 (AST)를 위한 통상적 인 방법은 전형적으로 생화학적 검정에 기초한 동정 전에 개개의 종을 분리하기 위해 하룻밤 계대 배양 (subculturing)하고, 이어서 다양한 항균제의 존재 하에 분리 된 유기체를 성장시키기 위해 감수성을 결정해야 한다. 분자 식별 방법은 저항 마커 검출뿐만 아니라 임상 샘플에서 직접 유기체 식별을 몇 시간 내에 제공 할 수 있지만 이러한 방법은 임상 의사가 치료 결정을 알리는 데 필요한 항균제 감수성 정보를 제공하지 않는다. 전혈 및 호흡기 샘플을 포함한 다양한 샘플 유형을 사용할 수 있는 가능성을 입증하는 연구가 보고 되었지만 샘플 준비 기술은 더 세밀화가 필요한 실정이다. 현재의 빠른 분자 기반 진단 방법은 확인 및 유전형 마커 결과만을 보고한다. 몇 시간 만에 사용할 수 있는 반면, 이 결과는 부분적인 답을 제공한다. 이것은 치료사를 조정하기 전에 통상적 인 항생제 감수성 검사 결과에 대해 2-4 일 동안 기다리는 동안 임상의가 지나치게 광범위한 스펙트럼 경험 치료를 처방하도록 남겨둔다. 몇 일과 반대로 5 시간 이내에 항균제 감수성 검사 결과를 얻을 수 있기 때문에 적절한 치료법을 투여하기가 지연되어 중환자 환자의 이환율과 사망률을 잠재적으로 감소시킬 수 있다. 또한 광범위 스펙트럼 경험 치료에서 표적 특정 항균제로 신속하게 디에스컬레이션(de-escalation)하면 항생제 청지기의 노력으로 다중 약물 내성 유기체(multi-drug resistant organisms)(MDROs)의 출현과 확산을 줄일 수 있다.
확인 및 유전자형 마커 검출을 위한 신속한 방법이 현재 존재한다. 그러나 항균제 감수성 검사의 신속한 방법이 없다면 임상의는 그러한 검사로부터 실행 가능한 결과가 부족하다. 이종 vancomycin-intermediate S. aureus (hVISA), 확장 된 스펙트럼 β-lactamase (extended-spectrum beta-lactamase, ESBL), Klebsiella pneumoniae carbapenemase (KPC)와 같은 추가적인 저항성 표현형의 검출에 대한 분석이 보고되었다. 그럼에도 불구하고, 당해 기술 분야에 공지 된 이러한 공정은 환자 시료, 특히 다균 개체군에서 미생물 개체군을 효율적이고 정확하게 동정하기에는 불충분하다. 특히 동정 과정이 직접 시료 채취 방식으로 수행되는 경우 특히 그러하다.
이러한 문제점을 해결하기 위해, 대규모 실시 예에서 약 1 시간 동안 박테리아 / 효모 동정을 수행 할 수있는 완전 자동화되고 현미경에 기초한 방법으로서 대량 다중화된 자동화 단일 세포 디지털 현미경 검사법이 개발되었고, 약 5 시간 동안 항균제 감수성 검사가 수행되었다 임상 샘플에서 직접 5 시간 또는 그보다 더 짧은 시간. 본 명세서에 개시된 다양한 실시 형태는 표적 샘플이 단일 표적 서열 또는 단일 - 미생물 집단 또는 혼합, 다균 집단으로 구성되는지 여부에 관계없이 환자 샘플에서 미생물의 동정을 위해 Fluorescence In Situ Hybridization(FISH) 기반 검출 프로토콜을 적용하는 공정을 사용하는 대량 다중화된 자동화 단일 세포 디지털 현미경 검사 시스템을 개시한다. 자동화된 검출 시스템에서 이를 달성하기 위해, 시스템은 FISH 분석에 전형적인 환자 샘플에 대한 기준 기대치를 설정하기 위해 "훈련"되기 위해 전형적 또는 "기대되는"참조 샘플 미생물 집단(알려진 미생물의 참조 패널)에 대한 충분한 정보를 사용한다. 일단 교육을 받으면 자동화된 시스템은 미생물 세포가 샘플 오염 물질로부터 확인 될 수 있다는 충분한 확신을 가지고 미지의 성분의 환자 샘플을 평가하기 위한 기본 매개 변수를 적용 할 수 있다. 샘플에서 미지의 미생물과 참조 패널 구성원 간의 관련성을 통계적으로 평가한다. 따라서 FISH 영상에 고유한 동정 알고리즘을 적용하여 미지의 미생물의 신원을 환자 샘플에 존재하는 미생물의 유형 또는 유형에 대한 사전 지식 없이 얻을 수 있다. 그리고 이 공정은 공개 된 단일 기기에 로드 된 여러 샘플에서 수행 할 수 있어 미생물 동정을 매우 정확하고 효율적으로 만든다.
상기한 문제를 해결하기위한 본 발명의 일 실시 예에 따른 신속한 미생물 동정 및 항균제 감수성 시험을 위한 기기는, 다수의 웰을 포함하는 시약 카트리지, 시약 스테이지, 상기 시약 스테이지는 내부 개구를 규정하는 환형을 포함하고, 상기 시약 스테이지는 제 1 평면에서 회전하도록 구성되며 상기 시약 스테이지는 상기 시약 카트리지를 수용하도록 구성되고, 샘플을 수용하도록 구성된 복수의 미세 유체 샘플 채널을 포함하는 카세트, 상기 복수의 미세 유체 샘플 채널은 피펫팁을 수용하도록 구성된 입구 포트를 포함하고; 상기 시약 스테이지의 내부 개구 내에 위치되는 카세트 스테이지, 상기 카세트 스테이지는 상기 카세트를 수용하도록 구성되며, 상기 카세트 스테이지는 상기 제 1 평면에서 회전하여 좌우로 이동하도록 구성되고; 상기 시약 카트리지의 다수의 웰들과 상기 다수의 미세 유체 채널들 각각의 유입 포트들 사이에서 복수의 시약들을 이동 시키도록 구성된 피펫터 조립체; 상기 복수의 미세 유체 샘플 채널에 포함 된 하나 이상의 미생물의 암시야 및 형광 현미경 사진을 얻도록 구성되는 광학 검출 시스템; 및 시스템의 작동을 지시하고 상기 광학 검출 시스템에 의해 얻어진 현미경 사진으로부터 유도된 미생물 정보를 처리하도록 구성된 제어기;를 포함하는 자동화된 미생물 동정 및 항생제 감수성 시험을 위한 시스템을 포함할 수 있다.
본원에 기술 된 방법 및 시스템은 미지 미생물의 FISH 라벨링 및 시스템 트레이닝에 의해 확립 된 확률 분포를 사용하여 베이지안 통계 방법론에 의한 그 바인딩의 분석을 결합하는 공정을 통해 미생물 동정을 제공한다. 이러한 접근법은 보다 전통적인 방법론에 의해 제공되는 것보다 간섭 소음 및 / 또는 다른 미생물로부터 관심 있는 미생물을 더 잘 동정 할 수 있게 한다. 이러한 이점은 검출 감도 또는 특이성을 손상시키지 않으면 서 실현된다. 이 향상된 기술은 많은 함정을 피하기 위해 "자주 사용되는"논리를 사용하고, 유형 1 오류(실제로 NULL가설이 참일 때 거부 함)와 유형 2 오류(실제로 대안 가설이 사실일 때, NULL 가설을 거부하지 않음)를 최소화하기 위해 차별적 값을 설정한다. 본 명세서에 개시된 방법 및 시스템은 미생물을 종 및 / 또는 유형에 의해 동정 및 / 또는 동정 할 수 있는 방법을 제공한다. 이러한 목적을 달성하기 위해, 다양한 실시 예는 표적화된 미생물을 시각화하기 위한 도구로서 FISH를 이용한다. 베이지안 분석(Bayesian analysis)은 미생물 동정 및 민감도 테스트에 사용되는 특성 / 기술자(descriptor)를 정의하기 위해 방대한 데이터 세트를 축적하여 얻은 모델과 결합된다. 알려지지 않은 유기체의 정체성은 부분적으로 알려지지 않은 유기체의 서열이 알려진 참조 유기체 서열로 향하는 FISH 프로브와 상보적일 가능성을 결정하기 위한 확률을 계산함으로써 부분적으로 평가된다. 평가는 환자 샘플에서 미지의 유기체의 관찰 된 프로브 결합이 주어지면 하나 이상의 기준 미생물에 대한 사후 확률을 부여하는 것을 포함한다. 상기 확률은 본질적으로 미지의 미생물의 동일성의 가능성을 평가하는 베이지안일 수 있다. 일단 환자 샘플에서 미생물 병원균이 확인되면, FISH 결과 (카운트와 실제 사후 확률 모두)가 AST 서브 인구 분석을 조정하거나 지시한다.
본 발명의 양태에서, 환자 샘플로부터 직접 수 시간 내에 동정 및 감수성 결과를 제공하는 ID / AST 시스템 (동정 / 항균제 감수성 테스트)이 제공된다. 일부 실시 예에서, 개시된 ID / AST 시스템은 적시에 환자 치료 결정을 내리기 위한 임상의 정보를 제공한다. 일부 실시 양태에서, 본원에 기재된 바와 같은 ID / AST 시스템은 항균 청지기의 노력을 도울 수 있고 개선 된 환자 결과를 유도 할 수 있다.
본 발명의 특정 양태에서, 메티 실린 내성 황색 포도상 구균 (MRSA), 메티 실린 내성 포도상 구균 (MRS), 마크로 라이드 - 린코 사마이드 - 스트렙토 조그만 저항 (MLSb) 및 고차 아미노 글리코 시드 내성 (HLA)을 검출하기 위한 분석은, 제공된다.
본 개시의 주제는 특히 명세서의 결론 부분에서 지적되고 명백하게 청구된다. 그러나, 본 개시 물의보다 완전한 이해는 동일한 도면 부호가 동일한 요소를 나타내는 도면과 관련하여 고려 될 때 상세한 설명 및 청구 범위를 참조함으로써 가장 잘 얻어 질 수있다.
도 1은 기기의 사시도이다.
도 2는 개방 위치에 도어가 있는 기기의 사시도이다.
도 3은 후방 측으로부터의 기기의 사시도이고 기기의 하부로부터 제거 된 상부 외장을 도시한다.
도 4는 하부 커버가 제거 된 기기의 하부의 사시도이다.
도 5 및 도 6은 시약 스테이지의 사시도이다.
도 7은 시약 스테이지의 단면도이다.
도 8A는 시약 스테이지 및 카세트 스테이지의 사시도이다.
도 8B는 카세트 스테이지를 히터에 대해 도시 한 정 단면도이다.
도 9 및 도 10은 시약 스테이지 및 카세트 스테이지의 단면 사시도이다.
도 11은 카세트 스테이지의 정면 단면도이다.
도 12는 피펫터가 보이는 기기 일부분의 사시도이다.
도 13은 피펫터의 사시도이다.
도 14A는 조명 시스템의 개략도이다.
도 14b는 조명이 보이는 기기의 사시도이다.
도 15는 조명 및 구동 장치의 사시도이다.
도 16은 조명의 사시도이다.
도 17은 조명의 측면도이다.
도 18A는 도 17의 라인 18A-18A를 따라 취한 입면도에서의 조명의 단면도이다.
도 18b, 도 18c 및 도 18d는 조명의 다른 부분의 사시도로서, 도 17의 각각의 선을 따라 취하고 상이한 각도로 도시한 것이다.
도 19는 광학 시스템의 사시도이다.
도 20은 하측을 도시하는 광학 시스템의 다른 사시도이다.
도 21은 광학시스템의 분해 사시도이다.
도 22는 하우징이 제거 된 광학 시스템의 사시도이다.
도 23은 도 22 광학 시스템의 평면도이다.
도 24는 광학 시스템의 저면도이다.
도 25는 광학 시스템의 단부도이다.
도 26은 시약 카트리지의 사시도이다.
도 27은 시약 카트리지를 포함하는 시약 카트리지 키트의 사시도이다.
도 28은 시약 카트리지 키트의 단면도이다.
도 29는 시약 카트리지 키트의 반대편 정면도이다.
도 30은 시약 카트리지 키트의 측면도이다.
도 31은 시약 웰, GEF 웰 및 다른 구성 요소를 포함하는 다양한 시약 카트리지 구성 요소를 보여주는 시약 카트리지 키트의 분해도이다.
도 32는 시약 카트리지의 하부 하우징 구성 요소의 평면도이다.
도 33은 상부 하우징 구성 요소가 제거 된 시약 카트리지의 사시도이다.
도 34는 카세트 및 피펫 팁 랙(pipette tip rack) 위의 밀봉부를 도시 한 시약 카트리지의 사시도이다.
도 35는 카세트 상부의 사시도이다.
도 36은 저면을 나타내는 카세트 윗면의 사시도이다.
도37A 내지도 37C는 카세트의 특징의 단면도 및 상세도의 집합이다.
도 38-40은 각각 유리 지지체의 평면도, 측면도 및 사시도이다.
도 41은 카세트의 평면도이다.
도 42는 카세트의 측면도이다.
도 43은 카세트의 저면도이다.
도 44는 상면을 나타내는 카세트의 사시도이다.
도 45는 저면을 나타내는 카세트의 다른 사시도이다.
도 46은 카세트 상부, 유리 지지체 및 라미네이트 층을 도시하는 분해 사시도이다.
도 47A는 정렬된 기준 구멍의 상세를 보여주는 카세트의 평면도이다.
도 47B는 도 47의 기준 구멍 상세의 확대도이다.
도 48A는 카세트의 평면도로서, 유리 지지체 및 라미네이트 층상의 정렬 된 기준 마크의 상세를 도시한다.
도 48B는도 48A의 상세를 확대 한 도면이다.
도 49는 유리 지지체의 입면도이다.
도 50 및 도 51은 라미네이트 층을 보여주기 위해 유리 지지체가 제거 된 카세트의 사시도이다.
도 52A 및 도 53A는 이젝터 패드가 제거되기 전후의 카세트를 도시하는 부분 사시도이다.
도 52B 및 도 53B는 포켓이 추가되기 전후의 카세트를 도시하는 부분 사시도이다.
도 52C 및 도 53C는 챔퍼(Champers)가 추가되기 전후의 카세트를 도시하는 부분 사시도이다.
도 54는 제 1 두께를 갖는 라미네이트 층의 사시도이다.
도 55는 제 2 두께를 갖는 라미네이트 층의 사시도이다.
도 56 내지 도 58은 카세트의 일부를 확대하여 유로의 상세를 나타내는 평면도이다.
도 59 및 도 60은 2 가지 구현 예에 따른 카세트 채널의 입면도의 개략적 인 단면도이다.
도 61은 카세트 상부 및 라미네이트에서 채널을 나타내는 카세트의 평면도이다.
도 62는 라미네이트에서의 채널만을 도시하는 카세트의 평면도이다.
도 63은 도 61의 카세트의 저면도이다.
도 64는 도 62의 카세트의 저면도이다.
도 65는 최종 조립 후의 카세트의 평면도이다.
도 66은 기기로 취득한 대표적인 FISH ID 이미지 데이터를 나타내는 일련의 이미지이다.
67은 네 가지 다른 시간에따른 감수성과 내성 미생물에 대한 일련의 이미지이다.
도 68은 미생물 생장 곡선을 나타내는 일련의 그래프이다.
도 69-75는 다양한 실시 예에 따른 시스템 및 동작 방법에 대한 시스템 아키텍처 및 프로세스 흐름도이다.
도 76은 대안적인 광학 시스템의 개략도이다.
도 77은 목표 위치에 대해 플롯 된 분해능의 그래프이다.
도 78은 주목 샘플 특징 (예를 들어, 미생물)에 대한 이미지면의 일 측면상의 점 소스 이미지를 도시하는 도면이다.
도 79는 도 78과 유사한 도면이나, 샘플 특징에 대한 이미지면의 반대 측면 상에 점 소스 이미지를 도시한다.
도 80A 및 도80B는 스폿 면적 대 초점 위치 및 강도 가중 대 초점 위치의 그래프이다.
도 80C는 자동 초점을 위해 사용 된 데이터를 생성하기 위한 탐색 단계를 위한 방법의 흐름도이다.
도 81A는 외장 온도의 피드백 제어를 도시하는 그래프이다.
도 81B는 일 실시 예에 따른 스테퍼 모터를 사용하여 외장 온도를 제어하기 위한 흐름도이다.
도 82A는 일 실시 예에 따른 포커싱 알고리즘의 흐름도이다.
도 82B는 다른 실시 예에 따른 포커싱 알고리즘의 흐름도이다.
도 82C는 또 다른 실시 예에 따른 포커싱 알고리즘의 흐름도이다.
도 83은 Klebsiella pneumoniae의 출력 범위에 대한 일련의 검정 곡선으로 단순 선형 희석 곡선, 동적 희석으로 계산 된 곡선 및 20 % 성장 인자를 포함한 동적 희석으로 계산 된 곡선을 보여준다.
도 84A 내지도 84D는 Acinetobacter baumannii (도 84A)에 대한 단순 선형 희석 곡선 (● 및 ○)의 샘플 희석 효과와 성장 인자 (Δ 및 ▲)를 이용한 3 점 희석 곡선의 효과를 비교하는 일련의 정상 확률 그래프이고, Pseudomonas aeruginosa (도 84B), Klebsiella pneumoniae (도 84C) 및 Serratia marcescens (도 84D).
도 85A 내지 도 85F는 피 페라 실린 / 타조 박탐 항생제 존재 하에서 영양 결핍 배지에서 슈도모나스 균주의 성장을 나타낸 일련의 그래프이다. 또한, 도 85A-85C는 박테리아 암상 강도 대 시간의 로그를 도시한다. 또한, 도 85A 및 85B는 표준 Mueller-Hinton 배지에서의 성장과 비교하여, Mueller Hinton 영양소의 약 87 % 감소를 갖는 배지에서의 성장을 나타낸다 (도 85C). 또한, 도 85D 내지도 85F는도 73 및 도 74에 도시 된 데이터의 정량적 표현을 도시한다. 도 85A-85C는 박테리아 세포 분열 속도로 나타냈다.
도 86은 자동화된 샘플 준비, ID (동정), AST (항균제 감수성 테스트) 및 보고를 포함하는 완전 자동화된 멀티 플렉스 자동화 디지털 현미경 시스템 워크 플로우를 도시하는 다이어그램이다.
도 87A 내지 도 87C는 자동화된 겔 전기 여과를 사용하여 박테리아 / 효모 세포로부터 용균 된 혈액 세포 및 파편과 같은 샘플 불순물의 분리를 도시한다. 87A: 세균 / 효모 세포보다 작은 세공이 있는 겔에 시료를 넣음. 87B: 전압이 가해지면 파편이 박테리아 / 효모를 남기고 젤로 이동함. 87C: 음전하를 띤 박테리아 / 효모가 회수의 용이성을 위해 웰의 중앙으로 이동하도록 전압을 잠시 반전시킴.
도 88A 내지 88B는 전기 동력학적 농도에 의한 플로우 셀의 하부 표면상의 세균 / 효모 세포의 포획 (측면도)을 도시한다. 88A: 샘플 접종물이 플로우셀에 도입된다. 88B: 전기장이 가해질 때, 음전하를 띠는 박테리아 / 효모 세포는 하부 표면으로 이동하여 플로우 셀의 하부 표면에 양전하를 띤 폴리 -L- 라이신 포획 코팅에서 포획된다. 인듐 주석 산화물 (ITO) 전극층은 폴리 -L- 라이신 코팅과 유리 바닥 표면 사이에 있다.
도 89는 대장균 및 프로테우스 속 (Proteus spp.)을 표적으로하는 프로브를 갖는 2 개의 상이한 시험 채널에서 대장균 샘플의 대표적인 이미지를 도시한다. 이미지는 dark-field, 647 nm (universal bacterial probe) 및 532 nm (target probe)에서 촬영된다. 범용 박테리아 프로브는 박테리아와 파편을 구별하기 위해 모든 박테리아 세포에 결합한다. 보편적 표적 신호와 표적 프로브 신호의 동일 지역화는 표적 박테리아를 확인한다. 이미지는 개별 세포를 보기 위해 확대된다. 오른쪽 아래 이미지의 눈금 막대는 10 μm이다.
도 90은 0, 1.5, 3 및 4.5 시간에 세폭 틴에서 성장하는 methicillin-susceptible S. aureus(MSSA) 및 methicillin-resistant S. aureus(MRSA) 분리 물의 저속 영상을 도시한다. 4.5 시간이 지나면, 내성 클론이 계속 자라는 동안 감수성이 있는 클론이 붙들거나 용해된다. 이미지는 개별 박테리아 복제를 보여주기 위해 확대된다. 오른쪽 아래 이미지의 스케일 막대는 20 μm이다.
도 91은 개별 선조 박테리아 세포 (상부 패널)가 딸 세포의 클론으로 성장할 때 및 다중 분할 사이클 (하부 패널) 후에 컴퓨터를 이용한 클론 추적을 도시한다.
도 92는 Staphylococcus aureus(SA), Acinetobacter baumannii(AB) 및 녹농균 (Pseudomonas aeruginosa) (PA)의 현미경 이미지를 도시한다. 세포 형태학의 차이는 종 사이에서 분명히 볼 수 있으며 소프트웨어가 감지 할 수 있다. 상기 소프트웨어는 상기 특징 및 다른 몰포키네틱(morphokinetic) 특징을 사용하여 다균 샘플에서 여러 종을 구별한다.
도 93A는 19 개의 미생물에 대한 분포 결과의 추론에 대한 우도 함수를 도시한다. CGL, (Candida glabrata); KLE, Klebsiella spp. (K. pneumoniae, K. oxytoca, 분화되지 않음); SPN, Streptococcus pneumoniae; STR, Streptococcus spp. (S. mitis, S. gallolyticus, S. agalactiae, S. pneumoniae, 분화되지 않음); CAL, Candida albicans; PRO, Proteus spp. (Proteus vulgaris, Proteus mirabilis, 분화되지 않음); CNS, coagulase negative Staphylococcus; EFS, Enterococcus faecalis; SMA, Serratia marcescens; ENT, Enterobacter spp. (Enterobacter aerogenes, Enterobacter cloacae, 분화되지 않음); EFM, Enterococcus faecium 및 기타 Enterococcus spp. (Enterococcus faecalis를 제외하고는 분화되지 않음); SAG, Streptococcus agalactiae; ECO, Escherichia coli; ABA, Acinetobacter baumannii; SLU, Streptococcus lugdunensis; SPY, Streptococcus pyogenes; CIT, Citrobacter spp. (Citrobacter freundii, Citrobacter koseri, 분화되지 않음); PAE, Pseudomonas aeruginosa; SAU, Staphylococcus aureus; AO, acridine orange.
도 93B는 미생물을 동정하는 방법의 흐름도이다.
도 93C는 미생물을 동정하기 위한 다른 실시 예의 흐름도이다.
도 94는 도 93A에 제시된 미생물에 대한 신호 분포 데이터를 도시한다. 도 93A에서, x- 축을 따라 타겟 프로브 신호 및 y- 축을 따라 범용 프로브 신호를 플로팅한다. 어두운 점은 신호를 나타내고 밝은 점은 노이즈를 나타낸다.
도 95는 이 미생물에 고유한 최대 우도 추정 모델에 도달하기 위해 기기 훈련 중 엔테로박터(Enterobacter) 분포 실험의 5 세트의 조합을 도시한다.
도 96은 엔테로박터 확률론적 모델에 대한 양호한 경우를 보여주는 시험 시행의 예시이다.
도 97은 엔테로박터 확률론적 모델에 대한 드문 경우를 보여주는 시험 시행을 도시한다.
도 98은 엔테로박터 확률론적 모델에 대한 소형 케이스를 도시 한 시험 시행을 도시한다.
도 99는 엔테로박터 확률 모델에 대한 열악한 경우를 보여주는 테스트 런을 도시하며, 대부분의 이미지는 노이즈로부터 발산된다.
도 100은 분포 기대 모델의 업데이트 된 버전을 도시한다. 추가 미생물은 도 94에 도시 된 이전 버전에 비해 참조 패널에 포함된다.
도 101은 기술된 혁신이 구현 될 수 있는 적합한 컴퓨팅 환경의 일반화된 예를 나타낸다.
도 102는 표적 희석을 사용하여 샘플을 동적 희석 및 희석을 사용하여 표적 희석 계수를 결정하는 예시적인 방법의 흐름도이다.
도 103은 성장 인자를 사용하여 샘플에 대한 표적 희석 계수를 결정하는 예시적인 방법의 흐름도이다.
본 명세서의 예시적인 실시 예의 상세한 설명은 예시적인 실시 예 및 그들의 최상의 모드를 나타내는 첨부 된 도면을 참조한다. 이러한 예시적인 실시 예가 당업자가 본 발명을 실시 할 수 있도록 충분히 상세하게 설명되었지만, 다른 실시 예가 실현 될 수 있고, 논리적, 화학적 및 기계적 변경이 본 발명의 사상 및 범위를 벗어나지 않고 이루어질 수 있음을 이해해야 한다. 발명의 따라서, 본 명세서의 상세한 설명은 예시의 목적으로 제시된 것이지 한정하기 위한 것이 아니다. 예를 들어, 임의의 방법 또는 프로세스 설명에 열거 된 단계는 임의의 순서로 실행될 수 있으며, 제시된 순서에 반드시 제한되는 것은 아니다. 또한, 단수에 대한 임의의 언급은 복수의 실시 예를 포함하고, 하나 이상의 구성 요소 또는 단계에 대한 임의의 참조는 단수의 실시 예 또는 단계를 포함 할 수 있다. 또한, 부착 된, 고정 된, 접속 된 등의 언급은 영구, 제거 가능, 임시, 부분, 완전 및 / 또는 임의의 다른 가능한 부착 옵션을 포함 할 수 있다. 또한, 비 접촉 (또는 유사한 구)에 대한 언급은 접촉 감소 또는 접촉 최소화를 포함 할 수 있다.
본 명세서에서 '식별'과 '동정'은 동일한 의미 또는 상호간 치환될 수 있는 의미로 해석될 수 있다.
본 명세서에 사용 된 "AST"는 항균제 감수성 검사, 항균제 감수성 검사 또는 항생제 감수성 검사이다.
본 명세서에서 사용되는 "FISH"는 형광계내 (in situ) 하이브리드 화이다.
본 명세서에 사용 된 "EKC"는 동 전기 학적 농도이다. EKC는 액체에 부유 된 미생물 세포에 전기장을 가하여 양전극 표면으로 세포가 이동하는 과정이다.
본 명세서에 사용 된 "GEF"는 겔 전기 여과이다. GEF는 시료에 존재하는 시료 파편이 미생물 세포로부터 분리되도록 하기 위해 전기장의 적용에 의존하는 시료 준비 과정이다.
본 명세서에 사용 된 바와 같이, "ID"는 예를 들어 FISH를 사용하여 미생물의 종의 동일성을 결정하는 공정과 같은 동정이다.
본 명세서에 사용 된 "ITO"는 인듐 주석 산화물이다.
본 명세서에 사용 된 "LED"는 발광 다이오드이다.
본 명세서에 사용 된 "MHA"는 뮐러 힌튼 한천이다.
본 명세서에 사용 된 "MLSb"는 macrolide-lincosamide-streptogramin B resistance이다.
본 명세서에 사용 된 "MRS"는 메티 실린 내성 포도상 구균(methicillin-resistant Staphylococci)이다.
본원에 사용 된 "MRSA"는 메티 실린 내성 황색 포도상 구균(methicillin-resistant Staphylococcus aureus)이다.
방법 및 시스템의 개관
개시된 시스템은 신속하고 정확한 미생물 동정 및 항생제 민감성 시험 결과를 제공하도록 설계된 자동화 현미경 시스템이다. 이러한 자동화된 현미경 검사 시스템은 다수의 웰을 포함하는 시약 카트리지; 내부 개구를 규정하는 환형 형상을 포함하는 시약 스테이지가 제 1 평면에서 회전하도록 구성되고, 상기 시약 스테이지는 상기 시약 카트리지를 수용하도록 구성됨; 다수의 미세 유체 채널을 포함하는 카세트로서, 상기 다수의 미세 유체 채널 각각은 피펫 팁을 수용하도록 구성된 유입 포트를 포함 함 -; 상기 카세트 스테이지는 상기 카세트를 수용하도록 구성되며, 상기 카세트 스테이지는 상기 제 1 평면에서 회전하여 좌우로 이동하도록 구성되며, 상기 카세트 스테이지는 상기 카세트 스테이지의 내부 개구 내에 위치되며, 상기 시약 카트리지의 다수의 웰과 상기 다수의 미세 유체 채널 각각의 유입구 사이에서 복수의 시약을 이동 시키도록 구성된 피펫터 조립체; 상기 복수의 미세 유체 채널에 포함 된 미생물의 암시야 형광 현미경 사진을 획득하도록 구성된 광학 검출 시스템; 및 상기 시스템의 작동을 지시하고 상기 광학 검출 시스템에 의해 얻어진 현미경 사진으로부터 유도 된 미생물 정보를 처리하도록 구성된 제어기를 포함할 수 있다.
상기 시스템은 약 500 ms 내에 주어진 위치에서 개별적인 미생물의 가상의 실제 초점 위치를 계산하는 신속한 초점 알고리즘을 포함하는 광학 검출 시스템을 더 포함 할 수 있으며, 이는 한 주기의 시간동안 반복 된 이미징을 통해, 환경 조건에 대한 미생물의 반응 확인을 가능하게 할 수 있다. 개시된 시스템은 상보적인 박테리아 서열을 인식하고 결합하는 형광 표지 된 프로브와 같은 형광 라벨로 표지 된 미생물을 이미징하는데 사용될 수있다. 일 실시 예에서, 시스템은 맞춤형 이미지 분석 소프트웨어를 이용하여 라벨링 된 프로브에 결합 된 개별 미생물에 독특한 공간 XY 좌표를 할당하고 이들의 특성을 식별하는 것을 포함하는 공정에서 이를 수행한다. 포착 된 이미지로부터 획득 된 형태학적 데이터 및 다른 데이터는 분포의 확률 기대 모델에 입력되어 환자 샘플에서 하나 이상의 미생물을 동정한다. 상기 시스템은 열 부하를 제어하기 위해 모터 유휴 토크를 동적으로 조정하는 비례 - 적분 - 미분 (PID) 제어기 알고리즘을 더 포함 할 수 있다. 더욱이, 미생물의 동정 이후에, 시스템은 확인 된 미생물을 항균제 감수성 분석에 영향을 미칠 수 있다. 예를 들어, 미생물은 뮬러 - 힌튼(Mueller-Hinton) 영양소 결핍 배지에서 재배되어 항균제 내성 세포와 섬유상의 항균제 감수성 세포를 구분할 수 있는데, 종종 성장 후 약 12 시간 이내에 발생한다. 마찬가지로, 까다로운 미생물은 항균제 감수성 및 / 또는 항균제의 최소 억제 농도를 결정하기 위해 1 % phytone tryptose Mueller Hinton Agar에서 재배 될 수 있다. 상기 시스템은 표적 농도로 상기 샘플의 희석을 달성하기 위해 샘플 희석 인자를 결정하는 동적 희석 알고리즘(시야 영역 당 세포수 또는 시야 콜로니당 복제수와 같은)을 포함하는 시스템을 더 포함 할 수 있다.
시스템 개요
본 명세서에 개시된 시스템은 Accelerate Diagnostics Instrument Model AD-1 ( "AD-1")에 의해 다양한 실시 예에서 예시 될 수 있다. 개시된 AD-1 기기는 혈액 (또는 혈장 또는 혈청과 같은 일부분), 호흡기 샘플 (기관지 폐포 세척액, 가래, 구강 인두 면봉 또는 비 인두 면봉)과 같은 다양한 유형의 생물학적 샘플로부터 유도 된 샘플을 분석하고, (항생제 감수성 검사 또는 "AST") 패널로부터 다양한 항생제에 대한 박테리아의 감수성을 결정할 뿐만 아니라 샘플에 존재하는 박테리아 종의 동정 (ID)을 수행 할 수 있다. 개시된 기기는 샘플의 준비 및 분석 실행의 개시 이후 사용자 개입을 필요로 하지 않는 자동화된 방식으로 신속하게 이러한 공정을 수행하도록 구성된다. 상기 기기는 외부 하우징과 베이스 조립체로 구성된다. 베이스 조립체는 시약 스테이지, 카세트 스테이지, 유체 취급을 위한 피펫터 조립체, 및 샘플을 이미징하기 위한 조명 및 광학 조립체를 지지한다. 첨부 된 시스템 제어기는 입력을 수신하고 출력을 제공하고, 기기를 실행하고, 시스템에 의해 획득 된 이미지 데이터를 저장 및 처리하도록 구성된다. 이 시스템은 또한 시동 동안 기기에 필요한 모든 시약 및 소모품뿐만 아니라 ID 및 AST 단계를 수행하고 기기의 조명 및 광학 조립체에 의한 미생물 시각화 및 이미지 수집을 용이하게 하는 카세트를 포함하는 시약 카트리지를 포함한다. 작동 중에, 사용자는 시스템을 사용하여 분석 될 샘플을 준비하고 시약 카트리지의 일부로서 제공된 샘플 바이알(vial)에 샘플의 일부를 위치시킨다. 사용자는 샘플을 담고 있는 샘플 바이알을 카트리지에 넣고, 카세트를 카세트 스테이지에 삽입하고, 기기의 버튼을 눌러 ID 및 AST 분석 기기 및 시스템은 일반적으로 약 5 시간 미만 (예 : 4-8 시간, 4-6 시간 또는 5-6 시간)과 같이 8 시간 이내에 완료 할 수 있다.
기기 구성 요소 및 개별 시스템 구성 요소의 각각뿐만 아니라 기기 및 시스템의 작동 방법은 아래에서보다 상세히 설명된다.
외부 외장(Enclosure) 및 베이스 조립체
도 1을 참조하면, 다양한 실시 예에 따른 기기(100)의 사시도가 도시되어있다. 상기 외장(110)는 조명, 피펫터 및 제어기와 같은 많은 구성 요소를 둘러싸고 보호 할 수 있다. . 상부 외장(110)은 플라스틱, 알루미늄 또는 복합 재료와 같은 단단하고 가벼운 재료를 포함 할 수 있다. 상부 외장(110)은 일반적으로 둥근 모서리를 갖는 직사각형 일 수 있다. 그러나, 당업자는 상부 외장 (110)이 임의의 적합한 형상 일 수 있다는 것을 이해할 것이다. 상부 외장(110)은 편평한 상부 측면 (112)을 포함 할 수 있다.
상부 외장(110)는 도어(130) 용 개구를 포함 할 수 있다. 다양한 실시 예에서, 도어(130)는 대체로 원통형 또는 원추형 일 수 있다. 기기(100)는 도어(130)를 개폐 시키게 하는 버튼(150)을 포함 할 수 있다. 버튼(150)은 사용자가 버튼(150)을 누르는 것에 응답하여, 도어(130)(예를 들어, 도어 개방 위치로 회전 할 수 있다.
도 2를 참조하면, 개방 위치에 있는 도어(130)를 갖는 기기(100)의 사시도가 다양한 실시 예에 따라 도시된다. 도어 (130)는 열리거나 닫히기 위해 회전 할 수 있다. 도어 (130)는 전기 모터에 의해 구동 될 수 있다. 도어 (130)는 시약 및 시편을 포함하는 카트리지를 수용하도록 구성된 절개 부 (232)를 포함 할 수 있다. 사용자는 개방 도어 (130)를 통해 카세트를 삽입 할 수 있다. 사용자는 도어 (130)의 절개 부 (232)를 통해 카트리지 및 카세트를 삽입하고 버튼 (150)을 눌러 도어 (130)를 닫을 수 있다. 다양한 실시 예에서, 도어 (130)를 닫을 때 ID / AST 프로세스를 자동으로 시작한다.
도 3을 참조하면, 다양한 실시 예에 따라 상부 외장 (110)의 후면 (314)의 사시도가 도시된다. (310)를 포함 할 수 있다. 배기 포트 (316)는 배기 팬 (320)이 상부 외장 (110) 내부로부터 공기를 배출하게 할 수 있다. 배기 팬 (320)은 필요에 따라 기기 (100)에 냉각을 제공 할 수 있다. 정확한 온도 유지. 다양한 실시 예에서, 상부 외장 (110)은 기기 (100)의 내부로부터의 열 탈출을 감소 시키도록 구성된 절연 층을 포함 할 수 있다.
존재할 수 있는 주위 실험실 온도의 실질적인 변화를 고려하여, 배기 팬만을 사용하여 기기의 외장 온도를 엄격하게 제어하는 것은 매우 어려울 수 있다. 주변 실험실 온도는 지리적 위치, 건물 냉난방 제어 및 기타 요소에 따라 예를 들어 약 16 ° C ~ 32 ° C 범위 일 수 있다. 또한 밀폐형 기기에서 열을 방출하는 하나 이상의 모터 및 / 또는 히터의 존재는 일반적으로 기기 냉각에 필요한 것보다 더 큰 배기 팬의 사용을 필요로 한다. 더 큰 배기 팬을 포함 시키면 기기의 전체 크기가 커져 제조 비용이 증가한다. 사용하지 않을 때 열 발생 요소를 설정된 유휴 수준으로 줄임으로써 표준 열 부하를 줄 이도록 기기를 조정하더라도 적절한 온도가 유지되도록 기기의 내부 온도가 충분히 낮아지지 않을 수 있다. 개시된 기기의 다양한 실시 예는 기기 자체의 구성 요소에 의해 방출되는 폐열의 제어를 통해 기기 외장의 열부하를 동적으로 조정함으로써 이러한 열 문제에 대한 해결책을 제공한다.
일부 실시 예에서, 기기는 열 생성 요소 (예를 들어, 모터 및 히터) 및 필요하다면 비례 - 적분 - 미분 (PID) 제어기 알고리즘을 갖는 배기 팬을 제어함으로써 이 열 문제를 극복한다. 다른 실시 예에서, 발열 부품 만이 PID 제어기 알고리즘에 의해 동적 제어를 받아야 기기의 하우징 온도가 변경 될 수 있다. 각 발열 구성 요소는 독립적이며, 각각에 대한 PID 값은 함께 추가되어 기기에 필요한 전체 열 제어를 결정한다. 환언하면, 본 개시의 실시 예는 PID 알고리즘의 조합이 기기 하우징 내의 전체 열 출력에 대해 조정되도록 각각의 열 발생 기기 부품이 동적으로 제어되는 피처임을 제공한다. 본질적으로, 기기 작동 중에 열을 발생시키는 모든 부품은 PID 알고리즘 제어를 받을 수 있다. 따라서 예를 들어 기기의 각 모터가 주어진 샘플 실행 중에 작업을 완료하면 모터 제어는 외장 온도를 고려하여 포기 될 수 있다. 이 시나리오에서, 각 모터의 활동은 필요에 따라 증가 또는 감소되어 전체 기기 하우징 온도를 제어 할 수 있다. 폐열을 발생시키는 것은 기기 카메라조차도 이러한 유형의 제어를 받을 수 있다. 따라서, 기기의 폐열 제어를 더욱 정교화하기 위해, 카메라는 기기 하우징 내의 온도를 제어하는 데 필요한 만큼 더 많은 열을 내뿜도록 조작 될 수 있다. 한 번에 며칠 또는 몇 주 동안 기기를 방치 할 수 있고, 유휴 시간 동안 여러 구성 요소의 폐열을 조작 할 수 있으므로 전체적인 주택 온도를 보다 세밀하게 제어 할 수 있으므로 이 열 제어 요소가 중요하다. 이렇게 하면 기기 구성 요소는 유휴 모드에 있을 때 일반적으로 전력 사용을 줄여 기기의 전반적인 에너지 효율을 향상시킨다. 이러한 방식으로 여러 기기 구성 요소의 폐열을 활용하면 모터 및 팬의 사이클링이 줄어들어 수명이 연장된다. 배기 팬이 사이클링을 줄이면 공기 흡입이 줄어들어 기기 내부에 쌓인 먼지가 줄어 든다.
기기 내의 각각의 모터가 그 작업을 완료하면, 이들 구성 요소는 유휴 전력 레벨로 되돌아 가서, 후속 샘플 실행에서 기능하기 위해 호출 될 때까지 남아있을 수 있다. 기기의 모터는 움직이지 않을 때보다 더 많은 전력을 사용한다. 그러나 유휴 모드는 전력 사용이 임의의 수준에서 정적으로 유지된다는 것을 의미하지는 않는다. 기기 모터는 예를 들어, 31 ° C의 세트 포인트를 세트 포인트를 일치시키기 위해 냉각 또는 필요에 따라 기기를 따뜻하게 유휴에 많은 약 45 와트로 약 25w에서 자신의 전력 소모를 변경할 수 있다. 20-25 와트의 변화는 폐열의 약 100-125 % 증가와 동일하다. 다양한 실시 예에서, PID 제어기 알고리즘은 + 100 %에서 -100 %까지 확장하는 전력 범위를 사용한다. 각각의 스텝퍼 모터 (또는 임의의 다른 열 발생 구성 요소)를 위해 열 제어를 위한 0 % -100 % 범위에 맞게 조절 될 수 있는 최대 및 최소 유휴 토크가 확립되어 있을 수 있다. 다양한 실시 예에서, 기기의 배기 팬은 이 범위의 양의 영역에서 작동하고 스테퍼 모터의 아이들 토크는 이 범위의 음의 영역에서 활성화된다. 따라서, 예를 들면, 서늘한 주변 실험실 온도(가열이 필요)의 경우에, 스테퍼 모터의 아이들 토크가 설정 온도에 도달 할 때까지 기기 내 발열 활성화한다. 기기의 바람직한 설정 온도가 초과되면 배기 팬이 활성화되어 배기 포트를 통해 가열 된 공기를 방출한다.
상기 개념은 16°C 32°C 사이의 주변 실험실 온도를 시뮬레이션하는 환경 챔버에서 기기에 대한 열 응력 시험 결과를 그래픽으로 나타낸 도 81A에 더 도시된다. 이 그래프는 기기 외장 전원을 왼쪽 y 축의 직류 전류와 시간의 x 축을 따라 몇 시간에 대해 플롯한다. 오른쪽 y- 축은 서미스터(thermistor)로 부터의 피드백을 사용하여 실험 전반에 걸쳐 측정되고 제어되는 기기의 외장 온도를 나타낸다. 초기 베이스 라인 평형 기간 후, 2 시간 모의 분석을 상기 범위 내의 각각의 평형 온도에서 실행하였고, 시험 온도는 도 81A의 상자에 기재 하였다. 기기의 외장 온도는 바닥선에 표시된 대로 실험실 환경 온도 18 ° C에서 30 ° C에 노출되었을 때 31 ° C의 설정 값에서 안정적으로 유지되었다. 외장 온도 제어의 손실은 시뮬레이션 된 실험실 온도 32 ° C에서 발생했다. 이 온도는 상단 라인이 100 % 외장 전원 표시에 도달하여 고정되어 시각화되었다. 실험실 온도가 22 ° C 이하인 곳에서 기기 외장 온도는 PID 알고리즘을 통해 스테퍼 모터 유휴 토크를 변조하여 제어되었다. 냉각기 주변 온도는 모터 유휴 토크 (그래프에서 음의 외장 전력)를 증가시키고 31 ° C의 설정 온도를 유지하기 위해 기기의 배기 팬을 가동하지 않아도 그 열을 유지하면서 추가 열이 발생해야 했다. 대조적으로, 22 ° C 이상의 실험실 온도에서 동일한 PID 알고리즘이 기기의 배기 팬 속도를 증가시켜 가열 공기 배출을 유도했다(그래프에서 양의 외장 전원). 그래프에서 분명히 알 수 있듯이 대부분의 테스트 온도에서 주변 온도가 임계 값에 도달하면 배기 팬이 외장 설정 온도를 부드럽게 유지하여 기기 구성 요소의 열 출력을 줄이고 배기 팬을 통해 가열 된 공기를 제거한다. 이러한 쌍으로 된 동적 활동은 훨씬 더 극적인 온도 상승을 경험하는 기기에서 볼 수 있듯이 팬의 켜고 끄기를 끊임없이 전환 할 필요성을 없앴다. 따라서 기기는 하우징 온도를 유지하기 위해 모터 토크를 동적으로 조정하므로 합리적인 주변 온도 범위 내에서 느리고 점진적인 온도 변화를 촉진한다. 전체적인 결과는 더 작은 팬이 배기 기능을 수행 할 수 있는 능력으로, 더 작은 주거 공간에서 기기를 구성 할 있게 한다.
예를 들어, 모터의 조절 가능한 유지 토크에 의해 발생 된 폐열을 동적으로 변경함으로써, 보다 적은 부품 및 / 또는 보다 작은 부품이 기기 (예를 들어, 더 적은 히터 및 / 또는 보다 작은 팬)에 통합되어, 기기의 신뢰성을 향상시킬 수 있다. 또한 필요에 따라 폐열을 이용함으로써 열원을 동적으로 제어하지 않는 기기에 비해 전력 소비가 줄어들어 에너지 효율성이 향상된다. 따라서, 기기의 예시적인 실시 예는 전력 소비를 최소화하면서 외장 온도에 대한 운동을 제어한다.
도 4를 참조하면, 다양한 실시 예에 따라 하부 외장(120)이 베이스 조립체 (140)로부터 분리 된 상태에서 거꾸로 된 기기(100)의 사시도가 도시된다. 하부 외장 (120)은 다양한 광학 시스템 구성 요소와 같은 다양한 구성 요소를 둘러싸고 보호 할 수 있다. 하부 외장 (120)은 베이스 조립체 (140)의 하부 측면 (442)에 결합 될 수 있다. 하부 외장 (120)은 기기(100)를 지지하는 댐핑 피트(damping feet)(444)를 수용할 수 있는 복수의 구멍(422)을 포함할 수 있다. 상기 하부 외장(120)은 견고하고 경량의 재료인 플라스틱, 알루미늄 또는 합성 물질로 이루어질 수 있다. 하부 외장 (120)은 일반적으로 둥근 모서리를 갖는 직사각형 일 수 있다. 그러나, 당업자는 하부 외장 (120)이 임의의 적합한 형상 일 수 있음을 인식 할 것이다. 하부 외장 (120) 및 상부 외장 (110)은 복수의 스크류 (410)를 통해 베이스 조립체 (140)에 결합 될 수 있다. 그러나, 하부 외장 (120) 및 상부 외장 (110)은 다양한 적절한 부착 메커니즘에 의해 결합될 수 있다.
복수의 댐핑 피트 (444)가 베이스 조립체 (140)에 결합 될 수 있다. 댐핑 피트 (444)은 고무 또는 진동을 감쇠시키는 중합체 물질을 포함 할 수 있다. 시약 스테이지, 카세트 스테이지, 광학 시스템, 피펫터 및 조명과 같은 다양한 기기 구성 요소가 베이스 조립체 (140)에 결합 될 수 있다. 따라서, 베이스 조립체 (140), 시약 및 카세트 스테이지, 광학 시스템, 피펫터 및 조명은 외부 진동에 기인 한 구성 요소들 사이의 상대 이동이 제한되도록 진동 결합 될 수 있다.
베이스 조립체 (140)는 직사각형 부분 (446) 및 원형 부분 (448)을 포함 할 수 있다. 피펫터, 조명기 및 광학 시스템은 직사각형 부 (446)에 결합 될 수 있다. 시약 스테이지 및 카세트 스테이지는 따라서 원형 부분 (448)은 도어 (130)와 동축 일 수 있다. 따라서, 도어 (130)가 개방 될 때, 사용자는 카트리지 및 카세트를 도어 (130)를 통해 시약 스테이지 및 카세트 스테이지에 각각 삽입 할 수 있다.
예를 들어, 베이스 조립체 (140)는 전원 입력, 통신 포트, 및 카메라 출력 포트를 포함 할 수 있다. 접속 포트 (460)는 명령 및 출력 데이터 및 이미지 데이터 또는 기기 상태 정보와 같은 다른 정보를 수신하기 위해 기기 (100)가 컴퓨터 또는 다른 프로세서와 통신 할 수 있게 한다. 다양한 실시 예에서, 연결 포트 (460)는 다수의 기기가 서로 통신 할 수 있게 한다.
시약 단계
기기 (100)는 샘플을 포함하여 작동 중에 사용되는 모든 시약과 샘플을 포함하는 사용자가 삽입한 시약 카트리지를 수용하는 시약 스테이지를 포함 할 수 있다. 도 2에 도시 된 바와 같이, 시약 스테이지 (500)는 베이스 조립체 (140)의 상부 측에 결합된다. 시약 스테이지 (500)는 도어 (130)에 의해 둘러 싸여 질 수 있다. 시약 스테이지 (500)는 시약을 피펫터에 닿을 수 있게 움직이도록 중심 축을 중심으로 회전 가능할 수 있다.
도 5를 참조하면, 다양한 실시 예에 따라 기기 (100)로부터 제거 된 시약 스테이지 (500)의 사시도가 도시된다. 시약 스테이지 (500)는 외부 원주 (510) 및 내부 원주 (520)를 갖는 일반적으로 환상의 형상을 포함 할 수 있다. 한 쌍의 정렬 벽 (530)이 시약 스테이지 (500)의 상부 측면 (502)에 결합 될 수 있다. 정렬 벽 (530)은 사용자에 의해 시약 스테이지 (500) 내로 삽입 될 때 카트리지를 정렬하도록 구성될 수 있다. 정렬 벽 (530)은 카트리지가 삽입 될 때 카트리지를 적절한 위치로 향하게 하는 만곡 된 안내면 (532)을 포함 할 수 있다. 하나 이상의 유지 형상 부 (534)는 카트리지의 정확한 정렬을 위해 그리고 시약 스테이지 (500)에 대해 카트리지를 제 위치에 유지시키기 위해 정렬 벽 (530)에 결합 될 수 있다. 보유 형상 부 (534)는 카트리지가 완전히 삽입 될 때 카트리지가 완전히 삽입되었음을 사용자에게 가청 및 물리적 표시로 제공한다. 정렬 벽 (530)은 하나 이상의 티칭 웰 (536)을 포함 할 수 있다. 티칭 웰 (536)은 정렬 벽 (530) 내의 원통형 함몰 부일 수 있다. 티칭 웰 (536)은 피펫터에 의해 카트리지와 관련하여 기준점으로서 사용되어 시스템이 카트리지의 모든 시약 웰을 정확하게 찾을 수 있게 한다. 그러나, 다양한 실시 예에서, 피펫터는 카트리지에서만, 정렬 벽에서만, 또는 카트리지와 정렬 벽 양자 모두에서 티칭 웰을 사용할 수 있다.
시약 스테이지 (500)는 복수의 GEF 접촉부 (540)를 포함 할 수 있다. GEF 접촉부 (540)는 카트리지가 사용자에 의해 삽입 될 때 카트리지 상의 한 쌍의 슬라이딩 접촉부와 결합하도록 구성된 스프링 접촉부 일 수 있다. GEF 접촉부 (540)은 GEF 프로세스를 위한 전력을 제공하기 위해 슬라이딩 접촉부에 DC 전압을 공급할 수 있다.
시약 스테이지 (500)는 하나 이상의 가열 요소 또는 히터를 포함 할 수 있다. 히터는 시약 온도를 유지하기 위해 카트리지의 영역과 접촉 할 수 있다. 각각의 히터는 그것의 바닥면에 연결된 인쇄 회로 형 발열체를 갖는 평판을 포함 할 수 있다. 온도 제어를 위한 피드백을 제공하기 위해 정밀 서미스터가 플레이트에 내장 될 수 있다. 다양한 실시 예에서, 히터는 항생제 히터 (550) 및 한천 히터 (560)를 포함 할 수 있다. 항생제 히터 (550)는 카트리지 내의 항생제 웰 아래의 영역을 가열하도록 구성 될 수 있다. 항생제 히터 (550)는 시약 스테이지 (500)의 내주(520) 부분과 외주(510) 부분에 걸칠 수 있다. 다양한 실시 예에서, 상기 항생제 히터 (550)는 항원 웰의 온도를 약 41 로 유지하도록 구성 될 수 있다. 한천 히터 (560)는 카트리지 내의 한천 웰 아래의 영역을 가열하도록 구성 될 수 있다. 한천 히터 (560)는 시약 스테이지 (500)의 내주 (520)에 인접하여 위치 될 수 있다. 한천은 반고체이며, 사용하기 전에 한천을 용융시키는 것이 바람직할 수 있다. 한천 히터는 한천을 용융점 (약 100 ° C) 이상으로 가열 할 수 있습니다. 일단 한천이 녹으면, 한천 히터 (560)는 한천의 온도를 응고 온도 (약 50 ) 바로 위까지 낮추도록 구성 될 수 있다.
다양한 실시 예에서, 시약 스테이지 (500)는 카트리지의 존재 또는 부재를 검출하는 센서를 포함 할 수 있다. 예를 들어, GEF 접촉부 (540)은 카트리지상의 슬라이딩(sliding) 접촉의 존재를 검출하는데 사용될 수 있다. 또한 센서가 카트리지가 올바르게 삽입되었는지 감지 할 수 있다.
도 6을 참조하면, 다양한 실시 예에 따라 시약 스테이지 (500)의 바닥의 사시도가 도시된다. 시약 스테이지 (500)는 중심 축을 중심으로 회전 가능한 플랫폼 (610)을 포함 할 수 있다. 플랫폼 (610)의 회전은 피펫터가 샘플 및 카트리지 내의 상이한 시약에 접근하는 것을 허용 할 수 있다. 플랫폼 (610)은 스테퍼 모터 (620)에 의해 회전 될 수 있다. 플랫폼 (610)은 스테퍼 모터 (620)의 모터 샤프트 (624)상의 스퍼 기어 (622) 및 플랫폼 (610)에 결합 된 링 기어 (630)를 사용하여 회전 될 수 있다.
도 7을 참조하면, 다양한 실시 예에 따라 시약 스테이지 (500)의 단면도가 도시된다. 플랫폼 (610)은 베어링 (710) 상에 놓일 수 있다. 다양한 실시 예에서, 베어링 (710)은 스테이지 베어링 일 수 있다. 플랫폼 (610)은 링 기어 (630) 및 고정자 (720)에 대해 회전 할 수 있다. 다수의 전도성 링 (730)은 고정자 (720)의 상부 측에 결합 될 수 있다. 다양한 실시 예에서, 전도성 링 (730)은 니켈 도금 구리를 포함 할 수 있다. 로터 (740)는 플랫폼 (610)의 바닥면에 결합 될 수 있다. 로터 (740)는 일련의 스프링 장착 접촉부 (742)를 포함 할 수 있다. 플랫폼 장착부 (610)가 회전함에 따라 스프링 장착 접촉부 (742)는 전도성 링 (730)과 접촉을 유지할 수 있다. 전력은 스프링 적재 접촉부 (742) 및 도전성 링 (730)을 통해 플랫폼 (610)에 연결된 히터, 서미스터 및 GEF 접촉부 또는 임의의 다른 구성 요소에 인가 될 수 있다.
카세트 스테이지
기기 (100)는 카세트 스테이지 (800)를 포함 할 수 있다. 도 2에 도시 된 바와 같이, 카세트 스테이지 (800)는 베이스 조립체 (140)의 상부 측에 결합 될 수 있다. 카세트 스테이지 (800)는 사용자 삽입 카세트를 수용하도록 구성된다. 카세트 스테이지는 시약 스테이지의 내주에 의해 외접 될 수 있다. 카세트 스테이지 (800)는 중심 축을 중심으로 회전 가능하고 또한 조명 및 광학 시스템 대물 렌즈에 대해 카세트를 정확하게 위치시키기 위해 이동 될 수 있다. 다양한 실시 예에서, 카세트 스테이지 (800)는 y 축상에서 병진 운동 할 수 있다. 다양한 실시 예에서, 카세트 스테이지 (800), 시약 스테이지 및 도어 (130) 중 적어도 하나의 회전은 동축일 수 있다.
도 8A를 참조하면, 기기 (100)로부터 제거된 카세트 스테이지 (800)의 사시도가 다양한 실시 예에 따라 도시된다. 카세트 스테이지 (800)는 카세트 네스트(cassette nest)(810) 및 히터 플레이트(heater plate)(820)를 포함 할 수 있다. 카세트 네스트 (810)는 대체로 환형 일 수 있고 카세트 네스트 (810) 내에 카세트를 수용하도록 구성된 수용 웰 (812)을 형성한다. 히터 플레이트 (820) 사용자는 카세트를 수용 웰 (812)에 삽입 할 수있다. 사용자는 카세트를 카세트상의 카세트 네스트 (810)의 내벽 (816)에 위치 결정 핀 (814)과 인터페이스 시키도록 카세트를 회전시킬 수 있다. 형상 및 위치 설정 핀 (814)은 카세트를 카세트 네스트 (810) 내에 정렬 및 고정시킬 수 있다.
도 8B에는 다양한 실시 예에 따라 카세트 네스트 (810) 내의 카세트 (850)의 단면도가 도시되어있다. 카세트 (850)는 카세트 (850)의 바닥의 외부 환형에서 유리 링 (852)에 의해지지 될 수 있다. 에어 갭 (860)은 히터 플레이트 (820)와 카세트 (850) 사이에 존재할 수 있다.
도 9를 참조하면, 다양한 실시 예에 따라 가열 구성 요소를 도시하는 카세트 스테이지 (800)의 단면도가 도시된다. 히터 플레이트 (820)는 카세트와 동축일 수 있다. 히터 플레이트 (820)는 히터 플레이트 (820)의 하부 표면에 연결된(bonded) 인쇄 회로 형 가열 요소를 갖는 평판을 포함 할 수 있다. 정밀 서미스터가 히터 플레이트 (820)에 내장되어 온도 모니터링을 위한 피드백을 제공 할 수 있다. 적외선 온도 센서 (830)는 히터 플레이트 (820) 아래의 카세트 스테이지 (800)에 장착 될 수 있다. 적외선 온도 센서 (830)는 히터 플레이트 (820)의 관찰 구멍 (822)을 통해 조준 될 수 있다. 적외선 온도 센서 (830) 카세트의 온도를 정확하게 측정하기 위해 카세트의 온도를 측정한다. 카세트의 온도는 채널 내의 액체의 온도를 근사 시키는데 사용될 수 있다.
도 10을 참조하면, 카세트 스테이지 (800)의 회전 특징을 보여주는 단면도가 다양한 실시 예에 따라 도시되어있다. 카세트 스테이지 (800)는 카세트를 회전시켜 피펫 팅, EKC 및 이미징을 수행 할 수 있다. 카세트 네스트 (810)는 스테퍼 모터 (1020)에 의해 회전 될 수 있다. 스테퍼 모터 (1020)는 카세트 네스트 (810)상의 모터 샤프트 (1024) 및 링 기어 (1030)상의 스퍼 기어 (1022) 카세트 네스트 (810)를 회전시킨다. 스테퍼 모터 (1020)는 카세트 네스트 (810)를 회전시켜 특정 채널을 피펫터 또는 조명과 정렬시킬 수 있다.
도 11을 참조하면, 병진 형상을 도시하는 카세트 스테이지 (800)의 측면도가 다양한 실시 예에 따라 도시된다. 카세트 스테이지 (800)는 (도 10에 도시된) 하나 이상의 베어링 (1010) 상에 장착 될 수 있다. 다양한 실시 예에서, 베어링 (1010)은 Kaydon Corporation, Inc. (Muskegon, Michigan)에 의해 제조 된 "X- 접촉"볼 베어링을 포함 할 수 있다. 그러나, 다양한 실시 예에서, 베어링 (1010)은 크로스 롤러 베어링 또는 임의의 다른 적절한 베어링을 포함 할 수 있다. 선형 액추에이터(1120)는 리드 스크류(1122), 너트(1124) 및 스테퍼 모터(1126)를 포함 할 수 있다. 선형 액추에이터 (1120)는 카세트 스테이지 (800)를 양 또는 음의 y- 방향으로 구동시킬 수 있다. 선형 액추에이터 (1120)는 카세트 스테이지 (800)를 회전시켜 피펫 팅, EKC 및 이미징을 위해 카세트를 위치시키는 스테퍼 모터 (1020)와 연계하여 작동 할 수 있다.
피펫터 (Pipettor)
도 12를 참조하면, 다양한 실시 예에 따라 상부 외장 및 하부 외장이 제거된 기기 (100)의 사시도가 도시되어있다. 피펫터 (1200)는 베이스 조립체 (140)의 직사각형 부분 (446)에 결합 될 수 있다. 피펫터 (1200)는 카트리지 및 카세트에 접근하기 위해 시약 스테이지 (500) 및 카세트 스테이지 (800) 위에 외팔보형(cantilevered)일 수 있다.
도 13을 참조하면, 각종 실시 예에 따라 기기로부터 제거 된 피펫터 (1200)의 사시도가 도시되어있다. 피펫터 (1200)는 튜브와 일회용 피펫 팁 (미도시)에 연결된 용적 형 공기 펌프 (1220)를 사용하는 유체 이송 피펫 (1210)을 포함 할 수 있다. 피펫터 (1200)는 2 개의 모터 구동 축을 포함 할 수 있다. Z 축 모터 (1230)는 피펫터 맨드릴 (1240)을 양 또는 음의 z- 방향으로 구동하여 피펫터 맨드릴 (1240)을 상승 또는 하강시킬 수 있다. 쎄타축(theta-axis) 모터 (1250)는 피타 터 맨드릴 (1240)을 θ(쎄타) 방향으로 회전시킬 수 있다. z- 축 모터 (1230) 및 θ- 축 모터 (1250)는 시약 스테이지 모터 및 카세트 스테이지 모터와 함께 작동하여 ID 및 AST 프로세스 동안 기기의 피펫 팅 작업을 수행 할 수 있다.
피펫터 (1200)는 삽입 후 카트리지의 정확한 위치 및 배향을 결정하는데 사용될 수 있다. 경우에 따라 카트리지가 매번 정확히 같은 위치에 삽입되지 않을 수도 있다. 피펫터 (1200)는 팁 스트리퍼 칼라 (1260)를 포함 할 수 있다. 팁 스트리퍼 칼라 (1260)는 실질적으로 원통형 일 수 있다. 팁 스플리터 칼라 (1260)는 피펫터 맨드릴 (1240) 주위에서 동심원 일 수 있다. 팁 스플리터 칼라 (1260)는 카트리지 및 / 또는 시약 스테이지 내의 티칭 웰의 모서리와 접촉 할 수 있다. 기기는 티칭 웰의 모서리 위치에 따라 카트리지의 위치를 계산할 수 있다.
피펫터 맨드릴 (1240)은 피펫터 (1200)와 카트리지에 포함 된 피펫 팁 사이의 계면 일 수 있다. 피펫터 (1200)는 z- 접촉 센서 및 팁 존재 센서를 포함 할 수 있다. z- 접촉 센서는 피펫 암 (1270)의 대응 운동 없이 z- 축 구동 장치가 하강 (음의 z- 방향) 한 것을 나타낼 수 있다. 팁 존재 센서는 팁 스트리퍼 칼라 (1260)가 피펫터 맨드릴 (1240)에따라 상승 된 것을 나타낼 수 있다. 피펫 팁의 존재는 피펫 팁의 밀봉 부분이 피펫터 맨드릴 (1240)에의해 접촉되었음을 지시하는 높이 범위 내에서 예상된다. 일단 피펫 팁과 피펫터 맨드릴 (1240) 사이에 접촉이 이루어지면, z- 축 모터 (1230)는 피펫터 맨드릴 (1240)을 아래로 구동시킨다. 하향 운동은 손실 운동 스프링(1280)의 스프링 상수를 통해 예측 가능하고 반복 가능한 밀봉력(sealing force)으로 변환 될 수 있다. 팁 존재 센서는 피펫 팁이 피펫터 맨드릴 (1240)에 결합되어 있음을 나타낼 수 있다. 피펫 팁을 예상보다 빨리 또는 전혀 검출하지 않는 팁 존재 센서에 응답하여, 기기는 피펫터 맨드릴 (1240) 피펫 팁 사이의 밀봉이 만족스럽지 않다고 판단할 수 있고, 피펫터 (1200)는 피펫 팁을 제거하고 다른 피펫 팁을 선택할 수 있다.
피펫터 (1200)는 카트리지로부터 시약 또는 시편을 제거하기 위해 θ 및 z 방향으로 이동할 수 있다. 피펫터 (1200)는 피펫 팁을 사용하여 시약 웰 내의 막 밀봉을 관통시키고 시약을 얻을 수있다. 피펫터 (1200)는 카세트 내의 바람직한 입력 포트로 이동하여 피펫 팁과 입력 포트 사이에 밀봉 부를 형성 할 수 있다. 피펫터 (1200)는 시약을 입력 포트에 침착시키고(deposit) 시약을 샘플 채널에 가할 수 있다. 그 다음, 피펫터 (1200)는 피펫 팁을 제거하고 피펫 팁을 카트리지 내로 교체 할 수 있다.
피펫 팁 (1200)은 피펫터 (1200)의 θ 축에 결합 된 솔레노이드 (1290)를 포함 할 수 있다. 피펫 팁을 제거하기 위해, 솔레노이드 (1290)는 제거 핀 (1292)을 연장하여 팁 스플리터 칼라 (1260)의 제거 리시버에 삽입 할 수 있다. 제거 핀 (1292)과 제거 리시버 사이의 접촉은 팁 스트리퍼 칼라 (1260)의 상향 (양의 z- 방향) 운동을 방지 할 수 있다. z- 축 모터 (1230)는 피펫터 맨드릴 (1240)을 상방으로 들어 올릴 수 있고, 피펫 팁은 팁 스플리터 팁 스플리터 칼라 (1260)는 피펫 팁을 피펫터 맨드릴 (1240)로부터 멀어지게 할 수 있으며, 피펫 팁은 카트리지 내로 떨어질 수 있다. 피펫터 (1200)는 피펫 팁이 카트리지 내의 바람직한 위치로 완전히 떨어지지 않는 경우에 피펫 팁을 하향하도록 할 수 있다.
조명 및 광학(Illumination and Optics)
시스템은 조명 시스템 및 광학 시스템을 포함 할 수 있다. 다양한 실시 예에 따른 조명 시스템 (1400) 및 광학 시스템 (1450)이 도 14 내지 도 32에 도시된다. 조명 시스템 (1400)은 주로 도 14A 내지 도 18E를 참조하여 설명된다. 광학 시스템 (1450)은 주로 도 14A 및 도 19 내지 도 29를 참조하여 설명된다. 조명 시스템 (1400) ("조명"라고도 함)은 하우징 (1401), 조명 시스템 (1400)의 이동을 제공하도록 구성된 스테이지, 하나 이상의 광원, 거울 및 콘덴서를 포함 할 수 있다. 다양한 실시 예에서, 조명 (1400)은 또한 EKC 전극 조합체를 포함 할 수 있다. 광학 시스템(1450)은 대물 렌즈 (1451), 포커서 (1452), 폴드 미러(fold mirror)(1461), 초점 LED(1453), 광선 스플리터(beam splitter)(1462), 이중 밴드 필터(1454), 단일 밴드 필터 교환기(1466), 튜브 렌즈(1456)와 카메라(1457)를 포함할 수 있다. 이들 광학 시스템 구성 요소 각각은 이하에서보다 상세하게 설명된다.
다양한 실시 예에 따른 조명 (1400)은 이미지 획득을 위한 샘플 조명을 제공한다. 조명 (1400)은 백색광 (1402) 및 레이저 다이오드 광원 (1403, 1404)과 같은 복수의 광원을 제공하도록 구성 될 수 있다. 복수의 광원 각각은 카세트 (1420) 내의 샘플로부터 대물 렌즈 (1451)로 이르는 단일 광 경로를 따라 조명을 제공할 수 있다. 예를 들어, 조명 (1400)은 녹색 레이저 다이오드 (1403) (여기(excitation) 파장 = 520 nm) 및 ID (FISH) 프로세스 동안 사용되는 조명을 위한 적색 레이저 다이오드 (1404) (여기(excitation) 파장 = 637 nm) 및 ID 및 AST 프로세스 모두 동안 사용되는 암 필드 조명("암 필드 LED")을 위한 백색광 LED (1402)와 같은 카세트 (1420) 내의 샘플의 이미지 획득을 허용하는 3 개의 조명 소스를 제공하도록 구성 될 수 있다. (예를 들어, 적외선 레이저). 동일한 광 경로를 갖는 복수의 광원을 포함하는 조명 (1400)은 녹색 및 적색 형광 이미징을 이용하여 시야의 암시 야 이미지를 중첩시켜 어떤 이미지 형상이 파편 (즉, 하이브리드 화된 FISH 프로브로 표시되지 않음)인지 및 미생물 세포인지를 결정하는 것과 같이, 상이한 조명을 사용하여 얻어지는 동일한 특징(즉, 시야(a field of view) 내의 동일한 샘플 객체 위치에서 동일한 샘플 객체를 포함하는 시야)을 가지는 이미지를 오버레이 하는 것을 용이하게 할 수 있다.
다양한 실시 예에서, 조명 (1400)은 알루미늄 원통형 튜브 하우징 (1401), 적색 (1404) 및 녹색 (1403) 레이저 다이오드 및 암 필드 LED (1402)를 포함 할 수있다. 조명 하우징 (1401)은 조명 (1400)을 카세트 바로 위에 위치시키고 대물 렌즈 (1451)와 동축으로 정렬되도록 하기에 적합한 z- 축 및 θ- 축 운동을 제공하도록 구성된 조명 스테이지에 의해 베이스 조립체 (140)에 장착 될 수 있다. Z 축 이동은 레이저 (1403, 1404) 및 암 필드 (1402) 광원이 카세트 샘플 채널 플로우 셀에 포함 된 샘플에 대해 광원에 의해 방사 된 광의 적절한 포커싱을 가능하게 하도록 카세트 위의 상이한 수직 위치에 위치되도록 한다. 쎄타 - 축 이동과 함께 Z- 축 이동은 카세트 위의 영역으로부터 조명(1400)의 회전을 허용하여 피펫터가 카세트에 접근하도록 허용한다.
녹색 (1403) 및 적색 (1404) 레이저 다이오드는 상술 된 알루미늄 조명 하우징 (1401)의 외부에 장착 될 수 있다. 레이저들 (1403 및 1404)은 하향으로 지향 될 수 있고 하우징 (1401)을 따라 중간에 장착 된 45도 대각선 거울 (1405)에서 반사 될 수 있다. 레이저 광은 하우징 (1401) 측의 홀 (1406)을 통과하고, 광이 대물 렌즈 (1451)의 축과 일치하도록 다른 45도 대각 미러 (1407) (후술하는 광학 조리개 (1408) 아래에 위치 함)에서 하향으로 반사된다 (즉, 대물 렌즈 (1451)와 동축).
암시 야 LED (1402)로부터의 백색광은 LED를 빠져 나와 암시 야 LED (1402) 바로 아래의 일루미네이터 (1400)의 상부에 장착 된 상부 평행 화 렌즈 (1409)를 통과한다. 상부 평행 화 렌즈 (1409)는 광을 실린더로 형성한다. 직경이 20 mm 인 하우징 (1401)의 중앙의 광은 광학 조리개 (1408)로 차단된다. 하우징 (1401)의 하부에서, 하부 콘덴서 렌즈 (1410)는 암 필드 조명에 적합한 초점을 갖는 원추형으로 광을 재구성한다.
다양한 실시 예에서, 조명 서브 조립체는 EKC 전극 조립체로 구성 될 수 있다. 예를 들어, 도 15에 도시 된 바와 같이, EKC 전극 조립체 (1430)는 일루미네이터 (1400)의 측면상의 비도 전성 (중합체) 블록에 장착 된 2 개의 스프링 로딩 된(spring-loaded) 로듐 도금 된 핀을 포함 할 수 있다. 시스템은 조명기를 위치시켜 EKC 전극 조립체 핀이 카세트 내의 대응하는 EKC 전극 포트 및 EKC 전극 포트에 위치한 접촉 전극에 의해 수용되도록 하여 EKC 절차를 수행 할 수 있다. 제 1 핀 (1431)은 카세트의 유리 층의 상부 표면 상에 위치되고 작동 가능하게 연결된 전극과 접촉한다. 제 2 핀 (1432)은 카세트의 몰딩 된 플라스틱 상부 하우징의 하부 표면 상에 위치하는 작동 가능하게 연결된 전극과 접촉한다. EKC 전극 조립체 (1430)는 카세트 내의 샘플 채널에 전위를 전달하는데 사용될 수 있다. 예를 들어, 조명 서브 조립체 (1400) 상에 위치한 EKC 전극 조립체 (1430)를 사용하여 장치에 의해 저전압 (0.6 내지 1.6 볼트 DC)이 카세트 샘플 채널에 인가 될 수 있다. 전위는 본 명세서의 다른 부분에서보다 상세히 기술 된 바와 같이, 수분과 같은 정의 된 시간주기 동안인가 될 수 있다.
사용자에 의해 시스템에 배치 된 샘플 카세트 (1420)는 샘플 채널 (또는 플로우 셀)이 일루미네이터 (1400) 바로 아래 및 대물 렌즈 (1451)의 바로 위에 위치되도록 카세트 스테이지에 의해 위치 될 수있다 (즉, 대물 렌즈 (1400)와 대물 렌즈 (1451) 사이에 일렬로 배치된다.
다양한 실시 예에 따르면, 광학 시스템 (1450)은 대물 렌즈 (1451)를 포함 할 수 있다. 대물 렌즈 (1451)는 베이스 조립체 (140)에 장착 될 수 있고 대물 렌즈 (1451)가 카세트 스테이지 아래에 위치되도록 베이스 조립체 (140) 아래에 위치 될 수 있다. 대물 렌즈 (1451)는 이미지를 시준(collimate)하는 데 적합한 표준 "오프 쉘프 (off the shelf)"현미경 대물 렌즈를 포함 할 수 있다. 예를 들어, 다양한 실시 예에서, 0.45의 개구 수(a numerical aperture), 22 mm의 필드 수 및 20 배의 배율을 갖는 대물 렌즈가 사용될 수 있다. 다른 명세들의 대물 렌즈들은 본 명세서의 다양한 실시 예들에 따라 사용될 수 있다.
대물 렌즈 (1451)는 포커싱 메카니즘 (1452)에 장착 될 수 있다. 포커싱 메카니즘 (1452)은 z 축을 따라 대물 렌즈 (1451)를 이동 시키도록 (즉, 샘플을 유지하는 수평 배향 된 샘플 채널에 실질적으로 수직) 이미지를 포커싱하도록 구성 될 수 있다. 다양한 실시 예에서, 대물 렌즈 (1451)는 그 샤프트 상에 장착 된 정밀 캠을 갖는 스테퍼 모터에 의해 z- 축으로 이동 될 수 있다. 캠은 오프셋 장착 구멍이 있는 원형 디스크로 구성 될 수 있습니다. 마이크로 스텝 모드가 있는 스테퍼 모터를 사용하여 캠을 구동 할 수 있다. 예를 들어, 스테퍼 모터는 예를 들어 표준 모드에서 200 스텝 / 회전 운동을 제공 할 수 있으며 대물 렌즈 (1451)의 서브 미크론 해상도 움직임을 제공하기 위해 회전당 25,600 마이크로 스텝을 산출하는 마이크로 스텝 모드를 제공 할 수 있다.
광학 시스템 (1450)은 폴드 미러 (1461)를 더 포함 할 수 있다. 폴드 미러 (1461)는 광학 경로를 z 축 (즉, 조명기 (1400) 및 대물 렌즈 (1451)와 동축으로) )을 베이스 플레이트 아래의 y- 축 방향으로 그리고 아래에 설명 된 이미지 획득을 위해 사용되는 튜브 렌즈 (1456) 및 카메라 (1457)를 향하여 안내한다.
광학 시스템 (1450)은 초점 광 시스템을 포함 할 수 있다. 초점 광 시스템은 초점 LED (1453) 및 빔 스플리터 (1462)를 포함 할 수 있다. 다양한 실시 예에서, 초점 LED (1453)는 카세트의 상부 (유리) 표면에서 반사되어 별개의 광원을 제공하여 초점 LED (1453), 핀홀 (1463) 및 콜리 메이팅 렌즈는 주 광학 경로에 직각으로 위치 될 수 있다. 빔 스플리터 (1462)는 광학 경로 내에 배치 될 수 있고 초점 링 광원을 광학 경로 내로 폴딩하는데 사용될 수 있다. 상기 초점 광 시스템은 상기 제어기에 의해 제공된 방향에 응답하여 상기 시스템에 의해 수행되는 신속 초점 방법과 관련하여 사용될 수 있으며, 상기 신속 초점 방법은 상기 카세트로부터 반사 된 초점 광 조명에 기초하여 이미지 정보를 획득하고 처리하도록 구성된다. 그에 따라 대물 렌즈 (1451)의 위치를 조정할 수 있다.
광학 시스템 (1450)은 시야 조리개 (1464)를 포함 할 수 있다. 시야 조리개 (1464)는 미광이 카메라 (1457)에 도달하는 것을 차단하도록 구성된 원형 조리개 (1465)를 포함 할 수 있다.
광학 시스템 (1450)은 필터 또는 복수의 필터를 더 포함 할 수 있다. 필터 또는 복수의 필터는 광학 경로 내의 고정 된 위치에 배치 될 수 있다. 필터 또는 복수의 필터는 형광 여기(excitation)에 사용되는 광의 파장(예를 들어, 적색 레이저 다이오드 여기 파장 637 nm)과 같은 하나 이상의 파장의 광을 차단하고 FISH ID 절차에 사용되는 암 필드 광 및 방출 파장(예를 들어, 669nm의 적색 파장 및 553nm의 녹색 파장)을 통과 시키도록 구성 될 수 있다.
광학 시스템은 단일 대역 필터 (1455)를 더 포함 할 수 있다. 단일 대역 필터 (1455)는 단일 대역 필터 변환기 (1466) 상에 위치 될 수 있다. 단일 밴드 필터 체인저 (1466)는 FISH ID 절차 동안 방출 녹색 파장 (553 nm)을 허용하고 모든 다른 파장을 차단하도록 광 경로에서 단일 대역 필터 (1455)를 가역적으로 삽입하도록 구성 될 수 있다. 단일 대역 필터 체인저 (1466)는 스텝퍼 모터를 사용하여 단일 대역 필터 (1455)를 광학 경로 내외로 이동시킬 수 있다. 단일 대역 필터 (1455)는 방출 된 녹색광 (553 nm)을 이미징 할 때에 만 경로로 도입된다.
다양한 필터 구성들이 다양한 실시 예들에 따라 사용될 수 있다. 예를 들어, 광학 시스템은 복수의 가역적으로 삽입 가능한 필터를 포함하는 임의의 적절한 개수의 필터를 포함 할 수 있다. 필터는 사용 된 광원 및 형광체의 조합에 기초하여 선택 될 수 있으며, 광원, 형광체 및 고정 및 이동 가능한 필터의 다양한 조합이 가능하며 본 개시의 범위 내에 있다.
광학 시스템은 튜브 렌즈 (1456)를 더 포함 할 수 있다. 튜브 렌즈 (1456)는 카메라 센서 표면 상으로 광학 경로의 광을 재 이미징 하도록 구성된 다중 요소 렌즈 일 수 있다. 대물 렌즈 (1451)와 관련하여, 광학 시스템 (1450)은 시야 (즉, 20x 배율 대물 렌즈 및 0.305x 배율 튜브 렌즈)의 6.1 배 배율을 제공한다. 일부 실시 예에서, 광학 시스템은 직교 투영을 제공하는 텔레센트릭 렌즈(telecentric lens)를 포함하여, 다른 렌즈 유형이 적합 할 수도 있지만, 스케일링 없이 측정이 가능하도록 한다.
광학 시스템 (1450)은 이미지 센서 (별도로 도시되지는 않았지만 카메라 (1457) 내에 내장 됨)를 더 포함 할 수 있다. 이미지 센서는 샘플의 이미지를 획득하는데 사용될 수 있다. 다양한 실시 예에서, 이미지 센서는 상보 형 금속 산화물 반도체 (CMOS) 센서 또는 능동 픽셀 센서 카메라를 포함 할 수 있다. 예를 들어, CMOS 센서 카메라는 처리를 위해 이미지를 획득하는 데 사용되는 5 메가 픽셀 그레이 스케일 카메라 일 수 있다. 다양한 실시 예에서, 전하 결합 소자 이미지 센서와 같은 수동 픽셀 센서 카메라가 사용될 수 있다. 다양한 실시 예에 따라, 이미지 센서는 제어기에 동작 가능하게 연결되고, 저장 및 데이터 처리를 위해 획득 된 이미지를 제어기로 전송한다.
자동화된 고속 현미경 검사는 현미경 대물 렌즈와 샘플 사이의 정확한 거리를 신속하게 조정하여 두 위치 사이의 정확한 거리에 도달하도록 구성된 시스템을 필요로 한다. 이 정확한 거리를 설정하면 정확한 샘플 분석을 위해 관심 있는 샘플 피처가 적절한 초점 면에 이미징된다. 본 발명의 광학 시스템 (1450)은, 분석기가 분석되는 동안 주어진 샘플에서 미생물의 일련의 연속적인 이미지 (프레임)의 매우 신속한 포커싱을 가능하게 하도록 구성 될 수 있다. 이를 달성하기 위해, 상기 장치는 광학 시스템 (1450)을 약 500 ms 미만의 관심 대상 (예를 들어, 미생물)에 신속하게 집중시키는 방법을 수행한다. 광학 시스템 (1450)은 단지 2 개의 테스트 이미지가 이 프로세스에서 사용되는 것을 허용 할 수 있는 학습 알고리즘과 커플 링 된 단지 2 개의 트라이얼 이미지로 초점 평면을 설정할 수 있다. 이미지 데이터는 디지털 방식으로 저장되고 하나 이상의 샘플 피처에서 시간이 지남에 따라 비교 될 수 있습니다. 개시된 프로세스는 시야의 특정 위치에서 캡쳐 된 일련의 연속 프레임에서 신속한 포커싱을 위한 매우 빠른 방법을 제공 할뿐만 아니라, 고비용 또는 특수 제작 된 구성 요소를 수행 할 필요가 없다.
광학 시스템의 빠른 포커싱(Fast Focusing of Optical System)
당 업계에 공지 된 초점 방법들 (예를 들어, "사냥 및 추정"알고리즘들)과 달리, 광학 시스템 (1450)은 빠른 포커싱 알고리즘을 이용하여 도 76 및도 80 82A-82C에 도시된 바와 같이 샘플 내의 개별 미생물 또는 개별 콜로니에 대한 실제 초점 위치를 수학적으로 계산할 수 있다. 당해 분야의 숙련자는 본 개시된 고속 포커싱 방법이 본원에 개시된 것 이외에 다른 시스템 및 방법 (세포 또는 미생물을 검출하기 위해 사용되는 것과 같은)과 함께 사용될 수 있다는 것을 인식 할 것이다. 피사체의 이동 제어 및 후술하는 알고리즘의 처리는 도 101에 도시 된 제어 보드(321)에 내장될 수 있는 하드웨어 구성 요소를 사용하여 달성 될 수 있다. 피사체의 움직임은 도 78 및 도 79에 도시 된 바와 같이 관심 있는 샘플 특징 (예를 들어, 미생물)에 대한 이미지면의 양측상의 반사 된 포인트 소스 이미지의 디초점(defocus)를 야기한다. 빠른 포커싱 알고리즘은 두 개의 초점 데이터 포인트 p1 및 p2를 획득함으로써 가상의 실제 초점 위치 (pt)를 유도하는데, 이는 x- 좌표 포인트상의 픽셀의 점 소스 스폿 영역을 플로팅(plotting)함으로써 묘사 된 실제 초점 위치의 양측에 놓이며, 도 77, 도 80A 및 도 80B에 도시 된 바와 같이 기기의 목적물의 위치에 대해 좌표를 정한다. 실제 초점 포인트 pt는 p1과 p2 사이의 선형 비례 위치를 계산하여 생성 된 곡선의 로컬 최소값이다. 최적으로, 최상의 이미지는 핀홀 (1463)의 직경 (예를 들어, 약 25 미크론)과 거의 동일한 가장 작은 스폿(spot )을 가질 것이다. 이를 위해 기기는 다음 알고리즘 단계를 통해 목표 1451을 지시하는 소프트웨어를 포함 할 수 있다.
초점이 맞지 않는 위치로 대물 렌즈 이동 - 먼 위치;
점 출처의 이미지를 획득.
초점을 벗어난 위치로 대물 렌즈를 이동 - 가까운 위치;
포인트 출처 스폿(point source spot)의 이미지를 획득;
대물 렌즈의 정확한 초점 위치를 계산하기 위해 스폿 위치의 중심 및 스폿 크기를 사용;
대물 렌즈를 계산 된 위치로 이동하고 실제 이미지를 획득.
중심 스폿 위치는 그레이 스케일 초점 이미지에 대해 계산 될 수 있으며, 그 내용은 불규칙하고 변화하는 강도 일 수 있다. 초점 이미지 스팟의 중심을 알면 빠른 포커싱에 필요한 방향성 구성 요소가 있는 포커싱 알고리즘을 제공한다. 이미지의 픽셀은 행과 열로 인덱싱되며 한 구현에서 0-4095 (12 비트 그레이 스케일)의 명암 값을 가진다. 이미지의 모든 픽셀이 검사된다. 각 픽셀 강도 값은 해당 행과 곱해지고 '행 합계'에 추가된다. 각 픽셀 강도 값은 해당 열과 곱해지고 '열 합계'에 더해진다. 또한, 각 픽셀 강도 값은 '전체 이미지 합계'에 더해진다.
일단 모든 픽셀이 조사되고 합계가 누적되면, 이미지 중심의 강도 가중 중심 행 및 열은 다음과 같이 계산된다:
행 합 / 전체 이미지 합
열 합 / 전체 이미지 합
이 방법을 사용하면, 더 밝은 픽셀은 계산 된 위치에 더 많은 가중치를 부여하지만, 어두운 픽셀은 덜 기여한다. 따라서 결과는 이미지 내용의 중심 위치를 나타내는 훌륭한 척도가 된다.
일부 실시 예에서, 단계의 순서는 이 학습 알고리즘 (이에 따라 기기가 주어진 미생물의 시야에서 특정 위치를 학습하거나 동정함)에 대해 변경 될 수 있다. 예를 들어, 대물 렌즈의 근거리 부근 위치로의 이동 및 근점 원점의 이미징은 대물 렌즈가 초점이 맞지 않는 원거리 위치로 이동되거나 원거리 원점 위치의 이미징이 수행되기 전에 수행 될 수 있다. 반사율 및 다른 파라미터에서의 사이트 간 변화는 초점 곡선의 절대 값을 변경시킬 수 있지만 (예 : x 축을 따라 곡선을 올리거나 내림),이 유형의 변형은 계산 된 실제 초점 위치를 변경하지 않는다. 주어진 사이트에서 초점을 맞추기 위한 초기 단계는 두 가지 이상의 "집중된"초점 이미지를 얻고 실제 초점을 계산하기 전에 두 가지 이상의 초점 이미지를 찍을 수 있다. 첫 번째 영상 경로 중에 학습 알고리즘은 초점 시험 영상의 초기 시작점과 동일한 높이에 가까운 이웃 사이트를 사용한다. 연속적으로 통과하는 동안 학습 알고리즘은 사이트의 이전 통과 초점 시험 이미지 위치를 사용하여 초점 시험 이미지를 안내한다. 모든 경우에 초점 시험 이미지가 실제 초점 지점에서 "너무 가깝거나"너무 멀리 떨어져 있으면 안된다. 그럴 경우 새로운 초점 시험 이미지가 찍힌다. 수학적으로 실제 초점 위치는 다음과 같이 식별 할 수 있다.
[수학식 1]
Figure pct00001
또는
[수학식 2]
p2-p1 = x1+x2 or x1 = p2-p1-x2
[수학식 3]
p t=p2-x2
수학식 2의 x1을 수학식1의 x1으로 대체하면:
Figure pct00003
Figure pct00004
Figure pct00005
Figure pct00006
Figure pct00007
상기 x2를 수학식 3에 대입하면 최종 방정식은:
Figure pct00008
이들 방정식을 사용하여, 예를 들어,
p1 = 4.581, a1 = 1819, p2 = 5.823 and a2 = 1623
이면, 결과 pt = 5.237 이다.
도 80C의 사전 스캔 (8000)은 도 80A 및 도 80B에 도시 된 그래프를 얻기 위해 수행된다. 프로세스 블록 (8002)에서, 대략적 초점 발견이 개시된다. 초점 디스커버리는 2 개의 경로들, 즉 대략적 초점 디스커버리 경로 (8002) 및 다음에 미세 초점 디스커버리 경로 (8004)로 수행된다. 대략적 초점 디스커버리 경로는 광원 (예를 들어, LED)의 위치를 찾는데 사용된다. 초점 LED는 모든 기기의 다른 위치에 있는 카메라 이미지에 나타나며, 기기가 서비스되면 변경 될 수 있다. 따라서, 대략적 초점 발견 통과 동안, 광원에 의해 생성 된 반사의 위치가 결정될 필요가 있다. 이를 달성하기 위해 거친 경로 중에는 전체 화면 이미지 (예 : 2592x1944 픽셀)가 사용된다. 거친 경로는 100 내지 500 미크론 (예를 들어, 50 미크론 증분)의 상이한 초점 위치와 같은 상이한 초점 위치의 다중 반복에 대해 반복된다. 프로세스 블록 (8006)에서, 대략적 초점 발견이 시작된다. 프로세스 블록 (8008)에서, 대물 렌즈는 100 미크론의 위치로 이동된다 (다른 시작 위치가 사용될 수 있음을 인식하지만). 프로세스 블록 (8010)에서, 전체 화면 이미지가 캡쳐 된다. 프로세스 블록 (8012)에서, 가중 된 스폿 영역 및 스폿 오프셋은 여기에 설명 된 기술을 사용하여 결정된다. 가중 된 스폿 영역을 계산하는 것은 단지 단일 이미지에 대한 영역을 계산하는 것을 포함한다. 가중치 스폿 영역은 픽셀의 그레이 스케일 값 (광 강도) 및 픽셀의 상대 행 및 열 위치를 사용하여 계산된다. 스폿 오프셋은 이미지 중심으로부터의 오프셋으로 계산된다. 결정 블록 (8014)에서, 초점 위치가 미리 결정된 거리 (예를 들어, 이 실시 예에서 500 미크론이지만 다른 거리가 사용될 수 있음)에 도달했는지에 대한 검사가 이루어진다. 그렇지 않다면, 프로세스 블록 (8016)에서, 다음 초점 위치가 계산되고, 프로세스 블록 (8010 및 8012)이 반복되어 이미지가 다시 캡쳐된다. 결정 블록 (8014)이 긍정으로 응답되면, 프로세스 블록 (8018)에서, 캡쳐 된 이미지 스폿 영역이 분석된다. 캡쳐 된 이미지 스폿 영역을 분석하려면 모든 이미지의 계산 된 가중치 스폿 영역을 함께 사용하여 (곡선) 최상의 초점 위치를 찾는다. 스폿 영역은 곡선 맨 아래를 찾는 데 사용된다. 일단 바닥이 발견되면, 최상의 초점 위치의 양측에 고정 된 델타 위치는 나중에 초점을 맞출 때 사용하기 위해 스폿 오프셋 범위를 룩업(lookup)하는 데 사용된다.
도 77은 프로세스 블록들 (8010, 8012 및 8018)의 성능을 통해 얻어 질 수있는 M 자형 그래프의 일부를 도시한다. 이 도면은 "M"의 두 개의 레그 (미도시) 사이의 홈통 내의 M 자형 곡선을 도시한다. 좋은 초점 위치는 M 자 곡선의 중앙에 있는 계곡입니다. 대략적 초점 발견 단계 동안, 스폿이 왼쪽으로 이동하는지 또는 초점 위치가 증가 할 때 오른쪽으로 이동하는지에 대한 결정이 이루어진다. 이 알고리즘은 이동 방향을 학습하고 향후 계산에 이러한 방향을 사용한다.
판정 블록 (8020)에서, 적절한 LED 위치가 발견 되었는지와 M 자형 곡선의 골짜기인지가 결정된다. 그렇지 않다면, 프로세스 블록 (8022)에서, 대략적 초점 발견은 종료된다. 오류가 사용자 인터페이스에 보고 될 수 있다. 다른 한편, 결정 블록 (8020)이 긍정으로 응답되면, 프로세스 블록 (8030)에서, 양호한 초점 위치는 홈통의 영역에서 M- 형 곡선의 최하점을 사용하여 결정될 수 있다.
이 대략적 단계 (8002)는 미세 초점 검출 경로 (8004)를 수행 할 위치를 목표로 한다. 미세 초점 검출 경로는 가장 조잡한 초점 위치를 중심으로 훨씬 세밀한 초점 위치 단계를 사용하고 이미지의 어느 부분에 LED가 나타나는지 알기 때문에 작은 이미지(예를 들어, 401x401 픽셀)를 사용합니다.
미세 초점 발견 (8004)은 프로세스 블록 (8040)에서 시작한다. 프로세스 블록 (8042)에서, 초점자(focuser) (대물 렌즈)는 제 1 위치로 이동된다. 프로세스 블록 (8046)에서, 스폿은 광원으로부터의 이미지 상에 디스플레이 될 수 있고 카메라는 스폿을 캡쳐하는데 사용될 수 있다. 처리 블록 (8048)에서, 강도 가중치 및 스폿 오프셋은 전술 한 바와 유사한 방식으로 계산된다. 결정 블록 (8050)에서, 초점 위치가 소정의 수인 최종 초점 위치보다 큰지 여부가 체크된다. 그렇지 않다면, 프로세스 블록 (8052)에서, 초점 위치 (예를 들어, 10 미크론)에 소정의 거리를 가산함으로써 다음 초점 위치가 계산된다. 판정 블록 (8050)이 긍정으로 응답되면, 프로세스 블록 (8054)에서, 캡쳐 된 이미지 스폿 영역이 분석된다. 예를 들어, 스폿 영역은 스팟을 가로 질러 거리를 측정하는 것과 같이 계산 될 수 있다. 또한, 이미지 중심으로부터의 오프셋이 계산 될 수 있다. 처리 블록 (8056)에서, 최소 스폿 영역이 결정된다. 최소 스폿 영역은 최상의 초점 위치와 연관된다. 처리 블록 (8058)에서, 자동 초점 특징에 대해 좌측 및 우측 오프셋 범위가 결정된다. 범위는 캡쳐 된 스팟 이미지가 수용 가능한지 여부를 나타낸다. 일단 범위가 선택되면, 사전 스캔 단계는 처리 블록 (8060)에서 종료된다.
사전 스캔이 완료되면, 2 개의 이미지를 사용하여 자동 초점을 달성될 수 있다. 일반적으로, 화상은 소정의 양만큼 화상 면의 전방 및 후방에 초점 위치로 캡쳐된다. 스폿이 사전 스캔 중에 결정된 스폿 오프셋 범위 내에 있다고 가정하면, 각 스폿에 대해 강도 가중치가 계산되고 사전 스캔 데이터에 매핑되어 대물 렌즈의 최적 초점 위치를 결정할 수 있다. 기기에 뒤 따르는 전체 결정 경로는 도 82A에 도시 된 프로세스 흐름에서 가시화 될 수 있다. 프로세스는 프로세스 블록 (8202)에서 시작한다. 프로세스 블록 (8204)에서, 제 1 이미지는 제 1 곡선 측면에 대해 캡쳐되거나 획득된다. 초점 포인트 곡선 (제 1면)의 일측 상의 관심 대상 (예를 들어, 미생물)에 대한 초점 이미지를 획득하기 위한 시스템에 의한 시도가 이루어진다. 따라서, 제 1 스폿 오프셋을 추정하기 위해 대물 렌즈가 이동되는 소정의 초점 위치 (P1,도 77)가 사용된다. 이 위치 정보를 이용하여 초점 위치가 상면의 소정 거리가 되도록 대물 렌즈 (1451)를 이동시킨다. 예를 들어, 도 76에 도시 된 바와 같이, 유리 / 액체 계면 (즉, 유리 기판 상에 위치 된 미생물)을 포함하는 이미지면 (7620)은 대물 렌즈 (1451)를위한 최상의 초점 위치로서 도시되어있다. 그러나, 대물 렌즈 (1451)는 화살표 (7640)로 도시 된 바와 같이 좌측으로 이동하여 초점 포인트를 이미지면 (7620)의 전방의 미리 결정된 거리로 변경시킨다. 결과적으로, 초점 점은 의도적으로 상면의 소정 거리만큼 7610으로 도시 된 위치로 변경된다. 커브의 첫 번째 면에서 처음에 얻은 이미지가 필요한 범위를 벗어나면 기기가 약간의 매개 변수 조정을 수행하고 해당 위치의 이미지를 다시 얻는다. 따라서, 도 8의 결정 블록 (8206)에서, 도 82a에 도시 된 바와 같이, 이미지가 요구 된 범위 내에 있는지의 여부가 검사된다. 특히, 범위는 사전 스캔하는 동안 도 80C의 프로세스 블록 (8058)에서 결정된다. 이 범위는 사전 스캔 동안 획득 된도 80B에 도시 된 스폿 오프셋 대 초점 위치 정보에 관한 것이다. 스폿 오프셋은 중심으로 알려진 사각 중심(dead center)으로부터의 스폿 중심의 오프셋입니다. 예를 들어, 도 78에서, 이미지의 알려진 중심은 7810에 도시되어있다. 스폿의 중심은 7820에 도시되어 있으며, 스폿의 에지(edge)상의 하나의 포인트로부터 몇몇 위치의 반대 에지(edge)까지를 측정함으로써 계산된다. 오프셋은 이미지 (7810)의 중심과 스폿 (7820)의 중심 사이의 거리이다. 그 거리는 캡쳐 된 이미지가 요구 된 범위 내에 있는 스폿을 포함하는지 여부를 결정하기 위해 결정 블록 (8206)에서 사용된다. 결정 블록 (8206)이 네거티브로 응답되면, 결정 블록 (8208)에서, 이미지를 포착하기 위해 시도 된 시도의 횟수가 임계 값을 초과하는지의 여부가 검사된다. 만약 그렇다면, 프로세스 블록 (8210)에서 장애가 발생한다. 그렇지 않으면, 프로세스 블록 (8212)에서 바람직한 범위 내의 스폿 오프셋을 이동 시키는데 필요한 방향으로 대물 렌즈의 위치가 변경된다. 적절한 방향은 도 80B 의 사전 스캔 스폿 오프셋 의 데이터를 이용해 결정될 수 있다. 처리 블록 (8212)에서 대물 렌즈가 수정 된 후, 그 스폿의 이미지가 재 획득 될 수 있다. 따라서, 상기 프로세스는 상기 대물 렌즈를 반복적으로 이동시키고 상기 오프셋 거리가 상기 미리 결정된 한계들 내에 있을 때까지 상기 제 1 이미지를 다시 캡쳐하는 단계를 포함한다. 이 이미지가 요구되는 범위 내에 있으면, 프로세스 블록 (8220)에서 곡선의 반대측 (제 2)에서 동일한 절차가 수행된다. 따라서, 대물 렌즈는 점 P2 (도 77)로 이동된다. 따라서, 초점 포인트는 7630에 도시 된 바와 같이, 이미지 평면 뒤의 거리에서 새로운 초점 이탈 위치 (7630) (도 76)로 변경된다. 프로세스 블록 (8222)에서, 이미지는 새롭게 선택된 초점 이탈 위치에서 획득될 수 있다.
처리 블록들 (8224, 8226, 8228, 및 8230)은 제 1 이미지 획득에 대해 위에서 설명 된 것들과 유사하고, 간결성을 위해 다시 설명되지 않을 것이다. 실제 초점 위치는 프로세스 블록 (8250)에서 초점 포인트 곡선의 제 1 및 제 2면으로부터의 아웃 초점 이미지로부터 계산된다. 실제 초점 위치를 계산하기 위해 도 77의 사전 스캔 곡선을 사용할 수 있다. 강도 가중치는 각 이미지에 대해 결정되고 포인트 Q1 및 Q2 (도 77)에 도시 된 바와 같이 사전 스캔 정보에 매핑된다. 강도 가중치는 초점 LED에서 반사 된 빛의 12 비트 회색 음영(grayscale) 이미지를 취하고 대표 스폿 영역을 계산하여 결정할 수 있다. 이미지의 각 픽셀의 강도 값은 0-4095입니다. 스폿 영역의 계산은 실제 초점 이미지가 상당히 밝거나 어둡다는 것을 알고 결정되므로 실제 이미지 밝기에 영향을 받지 않는 알고리즘을 사용해야 한다. 이를 달성하기 위해, 먼저 이미지의 모든 픽셀에 대한 평균 픽셀 값이 계산된다. 그 다음, 픽셀 강도 임계 값은 그 평균의 80 %를 취함으로써 계산된다. 픽셀 강도 임계 값을 초과하거나 초과하는 모든 픽셀을 계산하여 스폿 영역을 생성한다. 결과 스폿 영역은 절대 이미지 세기에 둔감하다.
포물선의 바닥이 위치되고 포물선의 바닥과 관련된 대물 렌즈의 위치가 실제 초점 위치로서 사용되는 결정이 그 다음에 수행 될 수 있다. 프로세스 블록 (8252)에서 실제 초점 위치가 꽤 정확한 반면 시각적 초점(visual focus) 위치는 소정의 오프셋 (알려진 오프셋)을 실제 초점 위치에 가산함으로써 계산된다. 시각적 초점 위치는 단지 미생물 (예 : 박테리아 또는 곰팡이)의 이미지를 포착하는 데 초점을 맞추는 특정 적용을 고려한 보정 조정에 불과하다. 일단 오프셋이 적용되면, 대물 렌즈는 미생물을 이미징하기 위한 계산 된 위치로 이동된다. 프로세스 블록 (8260)에서, 미생물의 이미지가 포착된다.
따라서, 시각적 초점 위치가 계산되고, 이 정보를 이용하여 관심 있는 미생물의 실제 초점 위치로 이동 한 다음, 이미지를 획득한다. 학습 과정 중에 특정한 시도 (예 : 20 회 시도) 내에서 요구 된 범위 내에서 특정 이미지를 얻을 수 없는 경우, 기기는 그 위치가 초점을 잃을 수 있다고 판단하여 이미지 위치를 포기하고 새로운 프로세스를 시작하기 위해 다른 관심 대상으로 이동한다. 일부 실시 예에서, 2 개 또는 2 개보다 약간 많은 - 그러나 드물게 5 개 이상의 초점 이미지는 이미지의 실제 초점 포인트를 설정하는 데 필요할 수 있다. 기기는 실제 초점 포인트의 수학적 계산을 허용하는 초점 포인트의 양측에 존을 설정하여 옵셋 스폿 (옵셋 픽셀)을 사용한다. 첫 번째 사이트에서 처음 통과 한 후 기기는 초기 데이터에서 "학습"하고 실제 초점 지점을 계산하는 데 필요한 이미지의 수를 시야의 추가 위치에서 사이트 당 2 개로 줄일 수 있다. 이러한 학습 과정은 마이크로 유체 샘플 채널 (5702)에서 다수의 미생물의 이미지에 집중하고 반복적으로 캡쳐하는 데 필요한 시간의 양을 실질적으로 감소시킨다. 대물 렌즈의 실제 초첨 위치의 정확한 위치를 수학적으로 계산할 수 있는 기능은 - 실제로 기기의 대물 렌즈가 시행 착오를 거쳐 그 위치로 가야 하는 과정 없이 - 정확하고 신속하게 이미지를 얻는 데 바람직하다.
특정 미생물에 대한 실제 초점 위치가 정해지면, 상기 기기는 그 미생물에 대한 위치 데이터를 저장할 것이므로, 상기 기기가 카세트 (4500)의 미세 유체 샘플 채널 (5702) 내의 샘플 내의 다음 미생물로 이동하여 상기 프로세스를 반복하게 하고 따라서 이 다음 미생물을 이미징한다. 기기는 저장된 이미지 위치 데이터를 검색하고 주어진 시야에서 특정 미생물로 반복적으로 돌아와 시간 경과에 따른 여러 이미지를 캡쳐 함으로써 시험 조건 (예 : 항생제의 존재 또는 부재시 성장)에서 미생물이 나타내는 모든 반응이나 변화를 기념 할 수 있다. 생물학적 시료에서 미생물의 실제 초점 위치에 대한이 단계별 결정이 신속하게 이루어지는 것이 특정 항생제에 대한 박테리아의 감수성과 같은 치료에 대한 민감성뿐만 아니라 샘플 내의 미생물의 동정을 몇 시간(바람직하게는 8 시간 미만, 보다 바람직하게는 7 시간 미만, 심지어는 심지어 보다 바람직하게는 4 시간 미만, 예를 들어 3 내지 8 시간, 4 내지 8 시간, 4 내지 7 시간 또는 4 내지 6 시간) 내에 용이하게 하는 것에 중요하다.
일부 실시 예에서, 광원 (1453)은 샘플을 조명한다. 대물 렌즈 (1451)는 z- 평면을 통해 이동되어 최상의 이미지 위치를 찾는다. 일단 식별되면, 타겟된 반사점을 여러 번 다시 방문 할 수 있으며, 처음으로 변경 또는 수정을 위해 추가 이미지를 비교할 수 있는 기준선을 설정한다. 포커서(focuser) (1452)의 z- 높이는 주어진 글라스 지지대상의 부위에 따라 많이 변하지 않지만, 제조 중에 유리 지지체에 도입 된 불완전 성으로 인해 약간의 변화가 있을 것이다. 따라서, 제 1 이미지 경로로부터 획득 된 초기 데이터는 관심 있는 제 2 대상 (미생물)을 이미징하기 위해 유리 지지체 (4400)상의 제 2 부위를 어디에서 목표로 해야되는지에 대해 기기에 알리기 위해 사용될 수 있다.
미생물은 3 차원 독립체이고, 미생물의 윤곽은 분석 기간 동안 환경 적 도전 (온도 변화, 영양 상태, 항생제 등)에 대한 성장 또는 노출에 따라 변할 수 있기 때문에, 대물 렌즈 (1451)는 바닥 또는 시간 경과에 따른 측정의 일관성을 위해 미생물의 유리 접촉 영역을 대상으로 한다. 대조적으로, 기준선 측정 중에 미생물 상단에 초점을 맞추면 미생물 크기가 커지거나 배가 된 후 정확히 몇 분에서 몇 시간 후에 정확하게 동일한 지점을 찾기 힘들어진다. 이 시나리오에서 원래의 초점 위치의 깊이는 추가적인 세포 덩어리로 인해 원래의 목표 위치에서 측정 할 때 대물 렌즈의 재방문시 오류가 발생할 가능성이 있으므로 원래 목표 위치에서 측정 오류의 가능성을 소개한다. 본 명세서에 설명 된 빠른 초점 알고리즘은 이러한 결점을 극복한다.
특정 구체적 예에서, 미생물은 배지 (예를 들어, 한천 또는 아가로오스(agarose)를 포함하는 것)에 고정화되고, 분석 기간 동안 동일한 위치에 잔류하여, 미생물의 바닥 또는 유리 접촉 영역 환경 조건의 변화에 따라 변경되는 기능을 추적한다. 예를 들어, 미생물은 지지체의 표면 (예 : 플로우 셀 또는 유리 지지체) 상에 보유 될 수 있고, 이에 의해 보유 된 미생물을 생성시킬 수 있다.
특정 실시 예에서, 카메라 (1457)는 호스트 컴퓨터 일 수 있는 시스템 제어기와 통신한다. 시스템 제어기는 기기 (100)가 포커서 (1442)를 움직일 위치를 지시하는 소프트웨어를 포함한다. 시스템 제어기는 LED 광원 (1453)이 켜지도록하고 카메라 (1457)가 이미지를 캡쳐하도록 지시한다. 일부 예에서, 이미지 데이터는 기기 모듈에 저장되지 않는다. 이미지 데이터는 시스템 제어기에 저장되고 나중에 시스템 제어기에서 검색됩니다.
도 82B는 미생물에 대한 오토 포커싱을 위한 일 실시 예에 따른 흐름도이다. 처리 블록 (8266)에서, 초점 위치 대 강도 가중치를 포함하는 사전 스캔 정보가 제공된다. 사전 스캔 흐름은 상기 도 80C에 기술되어있다. 사전 스캔 동안, 복수의 강도 가중치 대 초점 위치 정보가 상이한 초점 위치의 범위에 대해 얻어진다. 결과는 도 80A에 도시 된 바와 같이 플롯 될 수 있다. 마찬가지로, 스폿 오프셋 대 초점 위치는 도 80B에 도시 된 바와 같이 몇몇 실시 예에서 복수의 초점 포인트에 걸쳐 획득 될 수 있다. 처리 블록 (8268)에서, 광은 이미지 평면에서 대물 렌즈를 통해 광원으로부터 투사 될 수 있다. 예를 들어, 광원은 유리 / 액체 인터페이스의 반사를 생성하는 광선을 투영하도록 설계된 제 1 광원 일 수 있다. 예시적인 광원은 (다이오드 (1403 또는 1404)와 같은) LED, 레이저 다이오드 등을 포함한다. 광원은 반사가 쉽게 볼 수 있도록 컬러 광원이 될 수 있습니다. 그러나 그레이 스케일 분석을 사용하면 그레이 스케일 값을 사용하여 반사를 측정하므로 컬러 조명이 필요하지 않습니다. 반사를 생성하는 데 사용되는 광원은 미생물을 이미징하는 데 사용 된 광원과 다른 광원입니다. 프로세스 블록 (8270)에서, 제 1 이미지는 제 1 위치에서 대물 렌즈 (예를 들어, 1451)로 반사된 광이 캡쳐된다. 첫 번째 위치는 의도적으로 초점이 맞지 않는 위치이며 실제 초점 앞에 초점이 있습니다. 이러한 초점 어긋남 위치의 예는 도 76의 초점 포인트 (7610)에 의해 도시된다. 프로세스 블록 (8272)에서, 제 2 이미지는 제 2 위치에서 대물 렌즈를 갖는 반사광이 캡쳐된다. 이 경우 두 번째 위치는 실제 초점 뒤의 의도적으로 초점이 맞지 않는 위치입니다. 이러한 초점 어긋남 위치의 예가 도 76의 초점 포인트 (7630)에 의해 도시된다. 프로세스 블록 (8274)에서, 제 1 및 제 2 이미지의 반사광에 대해 강도 가중치가 계산된다. 전술 한 바와 같이, 강도 가중치는 그레이 스케일 값 및 행 / 열 정보를 고려하여 이미지의 각 픽셀에 가중치를 제공한다. 프로세스 블록 (8276)에서, 사전 스캔 정보와 관련하여 계산 된 강도 가중치를 사용하여 초점 위치가 계산된다. 계산 된 강도 가중치는 사전 스캔 정보에 매핑 될 수 있으며 사전 스캔 정보의 최저 지점 (최저 강도 가중치)이 결정될 수 있다. 그 결정된 지점과 관련된 초점 위치는 바람직한 초점 위치이다 (일부 추가 보정이 필요할 수도 있음). 처리 블록 (8278)에서, 대물 렌즈는 계산 된 초점 위치로 이동된다. 이 시점에서, 초점 위치는 도 76의 7620에 도시 된 바와 같이 이미지 평면상의 실제 초점 위치 여야 한다. 공정 블록에서 8280은 대물렌즈를 적절하게 배치하여 미생물의 이미지를 캡쳐 할 수 있다.
도 82B는 미생물에 대한 오토 포커싱을 위한 일 실시 예에 따른 흐름도이다. 처리 블록 (8266)에서, 초점 위치 대 강도 가중치를 포함하는 사전 스캔 정보가 제공된다. 사전 스캔 흐름은 위의 도 80C에 기술되어있다. 사전 스캔 동안, 복수의 강도 가중치 대 초점 위치 정보가 상이한 초점 위치의 범위에 대해 얻어진다. 결과는 도 80A에 도시 된 바와 같이 플롯 될 수 있다. 마찬가지로, 스폿 오프셋 대 초점 위치는 도 80B에 도시 된 바와 같이 몇몇 실시 예에서 복수의 초점 포인트에 걸쳐 획득 될 수 있다. 처리 블록 (8268)에서, 광은 이미지 평면에서 대물 렌즈를 통해 광원으로부터 투사 될 수 있다. 예를 들어, 광원은 유리 / 액체 인터페이스의 반사를 생성하는 광선을 투영하도록 설계된 제 1 광원 일 수 있다. 예시적인 광원은 (다이오드 (1403 또는 1404)와 같은) LED, 레이저 다이오드 등을 포함한다. 광원은 반사를 쉽게 볼 수 있도록 컬러 광원이 될 수 있다. 그러나 그레이 스케일 분석을 사용하면 그레이 스케일 값을 사용하여 반사를 측정하므로 컬러 조명이 필요하지 않다. 반사를 생성하는 데 사용되는 광원은 미생물을 이미징하는 데 사용 된 광원과 다른 광원이다. 프로세스 블록 (8270)에서, 제 1 이미지는 제 1 위치에서 대물 렌즈 (예를 들어, 1451)로 반사 된 광을 포착한다. 첫 번째 위치는 의도적으로 초점이 맞지 않는 위치이며 실제 초점 앞에 초점이 있다. 이러한 초점 어긋남 위치의 예는 도 76의 초점 포인트 (7610)에 의해 도시된다. 프로세스 블록 (8272)에서, 제 2 이미지는 제 2 위치에서 대물 렌즈를 갖는 반사광을 포착한다. 이 경우 두 번째 위치는 실제 초점 뒤의 의도적으로 초점이 맞지 않는 위치입니다. 이러한 초점 어긋남 위치의 예가 도 76의 초점 포인트 (7630)에 의해 도시된다. 프로세스 블록 (8274)에서, 제 1 및 제 2 이미지의 반사광에 대해 강도 가중치가 계산된다. 전술 한 바와 같이, 강도 가중치는 그레이 스케일 값 및 행 / 열 정보를 고려하여 이미지의 각 픽셀에 가중치를 제공한다. 프로세스 블록 (8276)에서, 사전 스캔 정보와 관련하여 계산 된 강도 가중치를 사용하여 초점 위치가 계산된다. 계산 된 강도 가중치는 사전 스캔 정보에 매핑 될 수 있으며 사전 스캔 정보의 최저 지점 (최저 강도 가중치)이 결정될 수 있습니다. 그 결정된 지점과 관련된 초점 위치는 바람직한 초점 위치입니다 (일부 추가 보정이 필요할 수도 있음). 처리 블록 (8278)에서, 대물 렌즈는 계산 된 초점 위치로 이동된다. 이 시점에서, 초점 위치는 도 76의 7620에 도시 된 바와 같이 이미지 평면상의 실제 초점 위치 여야 한다. 공정 블록에서 8280은 목적물을 적절하게 배치하여 미생물의 이미지를 캡쳐 할 수 있다.
전술 한 프로세스를 사용하여, 자동 초점 특징은 2 개의 이미지만큼 적게 달성 될 수 있으며, 이는 다른 솔루션보다 더 빠르다.
도 82C는 다른 실시 예에 따른 흐름도이다. 프로세스 블록 (8282)에서, 초점 (focus point)이 이미지 평면의 전방에 있도록 대물 렌즈 (예를 들어, 1451)가 제 1 위치로 이동된다. 이미지 평면 (예를 들어, 7620)은 전형적으로 그 위에 미생물 기반 액체가 있는 유리 기판이다. 이미지 면의 "앞"은 초점 지점이 이미지 면과 대물 렌즈 사이에 있음을 의미한다. 따라서, 초점 위치가 의도적으로 초점을 벗어나게 하기 위해, 대물 렌즈는 이미지 면으로부터 멀어지는 방향으로 이동된다. 그렇게 함으로써, 포인트 (Q1) (도 77)는 사전 스캔 단계 동안 획득 된 기존의 그래프 상에 결정되고 매핑 될 수 있다. 처리 블록 (8284)에서, 초점이 맞지 않는 대물 렌즈를 사용하여 제 1 스폿 형 반사(a first spot-shaped reflection)가 생성된다. 다이오드 (1403 또는 1404)와 같은 제 1 광원이 사용될 수 있다. 대물 렌즈의 위치에 따라 다른 그레이 스케일 값과 오프셋이 생성됩니다. 처리 블록 (8286)에서, 제 1 이미지는 제 1 스폿 - 형 반사의 캡쳐이다. 예를 들어, 카메라 (1457)는 제어기의 지시 하에 제 1 이미지를 포착하는데 사용된다. 처리 블록 (8288)에서, 초점 포인트가 화상 평면 뒤의 미리 결정된 거리가 되도록 대물 렌즈가 제 2 위치 (P2,도 77 참조)로 이동된다. 이미지면 뒤에 있기 때문에 이미지 면이 초점 지점과 대물 렌즈 사이에 있는 것을 의미한다. 처리 블록 (8290)에서, 제 1 광원은 대물 렌즈를 통해 투사되어 제 2 스폿 형 반사를 생성한다. "첫 번째"광원은 첫 번째 유형의 광원을 의미합니다. 따라서, 레이저 다이오드 (1403 및 1404)는 반사를 발생 시키는데 사용되기 때문에 둘 다 제 1 광원으로 고려된다. 처리 블록 (8292)에서, 제 2 이미지는 제 2 스폿 - 형 반사의 캡쳐이다. 처리 블록 (8294)에서, 강도 가중 분석이 제 1 및 제 2 이미지에 대해 수행된다. 강도 가중 분석은 대물 렌즈의 초점 위치를 결정하는 데 사용된다. 예를 들어, 강도 가중치 Q1 및 Q2가 결정될 수 있고 (그림 77) 사전 스캔 그래프가 Q1 및 Q2에 맞게 조정된다. 초점 위치 P는 포물선상의 가장 낮은 점에 일치하는 것으로 계산 될 수 있다. 특정 실시 예에서 포물선의 선형 커브 측면이 초점 매핑을 위해 사용되었지만, 여기에 설명 된 프로세스는 상이한 기본 방정식을 사용하는 다른 커브에 적용될 수 있음을 알아야 한다.
외장 온도 제어(Enclosure Temperature Control)
도 81A 및 도 81B는 카세트 위의 상부 외장 (110) 내의 온도를 제어하는 것에 관한 것이다. 당해 기술 분야의 당업자는 개시된 온도 제어 방법이 본 명세서에 개시된 것 이외에 다른 폐쇄 시스템과 같은 다른 시스템 및 방법 (다른 폐쇄 시스템과 같은)과 함께 사용될 수 있다는 것을 인식 할 것이다. 도 3에서, 외장 (110)은 제거되어 제어 기판 (321)을 노출시킨다. 제어 보드 (321)는 온도 제어 알고리즘을 제어하기 위한 하나 이상의 온도 센서 및 제어기 (예를 들어, 프로세서, 마이크로 제어기, ASIC 등)를 포함 할 수 있다. 제어 보드 (321)는 도 101에 설명 된 하나 이상의 요소를 더 포함 할 수 있다. 생물학적 샘플이 온도 변화에 의해 악영향을 받지 않도록 외장 (110) 내에서 일정한 공기 온도를 유지하는 것이 바람직하다. 그러나 공간 제약으로 인해 추가 가열 및 / 또는 냉각 구성 요소가 설계에 통합되기 어려울 수 있다. 따라서, 제어기는 외장을 가열하기 위해 가열과 무관 한 기능을 갖는 기존의 구성 요소를 제어한다. 예를 들어, 활발히 사용되지 않는 스테퍼 모터는 아이들 전류를 증가시켜 외장을 가열하기 위한 추가 열을 발생시킬 수 있다.
폐열을 동적으로 제어하기 위한 간단한 흐름도가 도 81B에 도시된다. 프로세스 블록 (8110)에서, 외장 온도 제어 흐름도가 시작된다. 스테퍼 모터에 대해 설명되었지만, 흐름도는 가열과 무관 한 주요 목적을 갖는 다른 구성 요소로 확장 될 수 있다. 프로세스 블록 (8112)에서, 외장의 온도가 판독된다. 예를 들어, 서미스터 또는 열전대와 같은 온도 센서를 사용하여 외장 내의 온도에 대한 온도 정보를 제공 할 수 있다. 이러한 온도 센서는 제어 보드 (321) 상에 장착 될 수 있다. 프로세스 블록 (8114)에서, 온도 판독은 비례 - 적분 - 미분 (PID) 히터 또는 팬 출력을 계산하는데 사용될 수 있다. 보드 (321)상의 제어기는 PID 알고리즘을 사용하여 출력 수치(number)를 계산할 수 있다. 이 출력 수는 최대 잠재 출력의 백분율이 될 수 있다. PID 알고리즘은 당 업계에 공지되어 있고 임의의 바람직한 PID 알고리즘이 사용될 수 있다. PID 매개 변수가 제공 될 수 있다. 즉 P, I 및 D 항은 PID 알고리즘에서 승수(multiplier)로 작용하여 알고리즘을 응용 프로그램에 맞게 조정할 수 있다. PID 알고리즘은 가열 또는 냉각이 필요한지 여부 및 가열 또는 냉각의 양을 결정하는 데 사용될 수 있다. 예를 들어, PID 알고리즘이 음수의 제어 출력을 생성하는 경우 외장 온도의 가열이 필요하다. 다른 한편, PID 알고리즘이 양수를 출력하면 냉각이 필요하다. 또한 PID 알고리즘의 출력은 음의 최대 값과 양의 최대 값 사이의 범위를 가질 수 있으며 출력은 가열 또는 냉각을 추가 제어하기 위해 최대 값의 백분율이 될 수 있다. 예를 들어 계산 된 백분율을 사용하여 최대 팬 속도의 해당 백분율로 팬 속도를 조정할 수 있다. 간단한 예제에서 PID 출력이 최대 출력의 70 %이면 팬 속도가 최대 속도의 70 %로 설정 될 수 있다. 반대로, 가열이 필요한 경우, 이들 구성 요소와 관련된 다수의 구성 요소 또는 퍼센트 전력 증가는 최대 PID 출력의 백분율에 기초하여 계산 될 수 있다.
스테퍼 모터는 홀딩 토크 (스테핑 동작이 일어나지 않을 때)에 대한 최소 전류 요건을 가질 수 있다. 그러나 스테퍼 모터에 대한 추가 전류는 허용 가능하며 스테퍼 모터 제조업체가 지정한 최대 전류까지 추가 폐열을 생성할 수 있다. 스테퍼 모터의 최대 및 최소 값을 100 % 및 0 %로 사용하면 PID 알고리즘 출력을 기준으로 스케일을 생성 할 수 있다. 냉각이 필요한 경우, 스테퍼 모터는 최소한의 폐열이 생성되도록 최소로 유지 토크를 설정할 수 있다.
프로세스 블록 (8116)에서, 제 1 스텝 모터의 상태에 대한 체크가 이루어진다. 스테퍼 모터는 소정의 임계 기간 (예를 들어, 5 초) 동안 활성 (이동) 또는 비활성 (이동하지 않고 현재 위치를 유지) 될 수 있다. 활성 상태 일 때 스테퍼 모터는 활성 모드로 간주 될 수 있다. 제어기는 각 스테퍼 모터에 타이머를 유지하고 제어기가 제어하는 모터가 활성화되면 타이머를 리셋하기 만하면 된다. 이러한 방식으로 제어기는 모든 스테퍼 모터의 상태를 모니터링 할 수 있다. 능동적으로 사용되지 않는 스테퍼 모터는 운동과 무관 한 열 제어에 사용될 수 있다. 결정 블록 (8118)에서, 모터가 열 제어에 적합한 지의 여부에 대한 결정이 이루어진다. 그렇지 않다면, 프로세스 블록 (8120)에서 다음 모터가 검사된다. 모터가 적합하지 않은 경우의 예는 모터가 활성 상태이고 시스템 내의 구성 요소의 회전 운동을 수행하는 경우이다. 이러한 상태에서 스테퍼 모터는 토크에 모션 제어 매개 변수를 사용한다. 결정 블록 (8118)이 긍정으로 응답되면, 프로세스 블록 (8122)에서, PID 출력이 가열 또는 냉각을 나타내는 지의 여부에 따라 모터 아이들 토크가 위 또는 아래로 조정된다. 예를 들어, PID 알고리즘이 외장의 온도를 가열해야 한다고 지시하면 제어기는 스테퍼 모터에 명령을 전송하여 유휴 토크 전류를 바람직한 값으로 증가시킬 수 있다. 하나의 특정 구현 예에서, 애플리케이션 프로그래밍 인터페이스 (API) 요청은 유휴 토크 전류를 설정하는데 사용되는 파라미터로 제어기로부터 스테퍼 모터로 전송 될 수 있다. 스테퍼 모터의 최대 전류를 확인하고 PID 출력을 기준으로 최대 전류의 백분율을 사용할 수 있다. 외장이 냉각되어야 하는 경우, 유휴 토크 전류는 최소로 설정 될 수 있으며, 이는 현재 위치를 유지하는 데 필요한 최소값이다. 따라서, 전력은 구성 요소와 관련된 전류를 최소 허용 전류로 설정하는 것을 포함하는 구성 요소로 감소된다. 현재 스텝 모터가 아이들 토크 전류 세트를 갖는 후, 결정 블록 (8124)에서, 모든 모터가 아이들 토크 전류 세트를 갖는지의 여부가 체크된다. 그렇지 않다면, 프로세스는 다음 모터를 선택하기 위해 프로세스 블록 (8120)으로 되돌아 간다. 그 후, 결정 블록 (8118 및 8122)이 반복된다. 모든 모터가 그들의 유휴 토크 전류를 조정 한 후에, 프로세스 블록 (8126)에서 외장 팬 (320)은 그 속도가 조정될 수 있다. 예를 들어, 외장의 가열이 필요한 것으로 PID 출력이 나타내는 경우, 팬 (320)은 턴 오프 될 수 있다. 또는 외장의 냉각이 필요한 경우 팬을 활성화하고 각 유휴 스테퍼 모터의 유지 토크가 최소로 설정된다 (모터 위치를 유지하는 데 필요한 전류). 팬의 속도 (RPM)는 가변적이며 PID 출력을 기반으로 제어 할 수 있다. 프로세스 블록 (8128)에서, 외장 온도 루틴이 종료된다. 루틴은 일정한 간격으로 재실행하여 외장 내의 온도를 일관되게 제어 할 수 있다.
별도의 순서도는 스테퍼 모터가 정상 스테퍼 기능을 수행하도록 활성화 될 때 사용되는 프로세스를 도시한다. 처리 블록 (8140)에서, 루틴이 시작된다. 처리 블럭 (8142)에서, 모터 이동이 요구되는 제어기에 의한 결정이 이루어진다. 처리 블럭 (8146)에서, 제어기는 그 후 모터를 외장 열 제어에 부적격하다고 설정할 수 있다. 일반적으로 모터는 일정 시간 동안 작동하지 않을 때만 자격이 있다. 프로세스 블럭 (8148)에서, 정상적인 모터 토크가 모터로 복구된다. 프로세스 블록 (8150)에서, 흐름은 종료된다. 모터가 나중에 정지되면 미리 정해진 시간이 지난 후 열 제어를 다시 받을 수 있다.
따라서, 일반적으로 가열과 관련이 없는 기능 (예를 들어, 모터)을 갖는 구성 요소는 발열을 최대화하도록 전류가 변경 될 수 있다. 또는 전류를 낮추고 팬 속도를 낮추어 온도를 낮출 수 있다.
도 81A에 도시 된 그래프는, 전력 소비에 따른 외장 온도의 함수이다. 전체 온도를 높이기 위해 제어기는 다양한 구성 요소의 전력을 증가시켜 외장의 온도를 높인다. 증가하는 전력은 개별 구성 요소의 기능을 향상시키는 것과 관련이 없지만 열 발생을 단순히 증가시키는 것이다. 또는 제거기가 외장을 냉각하려고 하면 전력 소비가 줄어들 수 있다.
제어기(Controller)
다양한 실시 예에서, 시스템은 기기에 동작 가능하게 연결된 컴퓨터를 포함 할 수 있으며 기기 동작을 제어하고 및 / 또는 기기로부터 수신 된 데이터를 수신, 저장 및 처리하도록 구성 될 수 있다. 컴퓨터는 특수 목적 컴퓨터이거나 사용자 정의 소프트웨어를 실행하도록 구성된 범용 컴퓨터 일 수 있다. 다양한 실시 예에서, 컴퓨터는 디스플레이를 포함 할 수 있다. 터치 스크린 디스플레이와 같은 사용자 입력을 수신하도록 구성된 디스플레이가 사용될 수 있다. 예시적인 제어기가 도 101에 도시된다.
시약 카트리지(Reagent Cartridge)
다양한 실시 예에서, 시스템은 시약 카트리지를 포함 할 수 있다. 다양한 실시 예에 따른 시약 카트리지 (3300)가 도 26 내지 도 34에 도시되어있다. 시약 카트리지는 카트리지 내의 사전 정의 된 시약 배열에서 ID / AST 작동에 필요한 1,2,3,4,5 또는 그 이상의 (또는 심지어 모든) 시약 및 소모품을 고정 및 / 또는 보관하도록 구성 될 수 있다. 예를 들어, 시약은 멸균 탈 이온수, 항균제, GEF 완충액 및 EKC 완충액과 같은 완충액, 성장 배지, 핵산 프로브와 같은 FISH- 관련 시약, 투과 촉진제, 엄격한 세척 용액(stringency wash solutions), 세포 염색제 또는 염료 등을 포함 할 수 있다. 시약은 용액 또는 건조 또는 동결 건조 된 시약으로 포함될 수 있으며, 시약은 작동 중 기기에 의해 재구성될 수 있다. 이제 도 26 및 도 27을 참조하면, 시약은 시약 카트리지 주위에 분포 된 다수의 시약 웰 (3310)에서 밀봉 될 수 있다. 시약 웰은 피펫 팁 (3441)과 같은 피펫 팁이 장착 된 기기 피펫터에 의해 관통 할 수 있는 포일 씰(foil seal)로 밀봉 될 수 있다. 소모품은 에어로졸 장벽 필터 팁과 같은 기기 피펫터와 함께 사용하기 위한 적절한 피펫 팁 (3441)을 포함 할 수 있다. 다양한 실시 예에서, 카트리지는 또한 하나 이상의 GEF 장치, 시약 웰 그룹 또는 소모품 랙 (예 : 피펫 팁 랙)과 같은 다양한 샘플 준비 기능을 수행하기 위한 서브 조립체를 포함 할 수 있다. 카트리지 서브 조립체는 가열 요소 및 전기 접촉부 (예를 들어, GEF 접촉부)와 같은 시약 스테이지의 부분에 작동 가능하게 연결되거나 노출 될 수 있다.
시약 카트리지 (3300)는 폴리머 또는 다른 적절한 재료로 구성 될 수 있다. 시약 카트리지는 폴리머 하우징 (또는 다른 적절한 재료) (3320)을 포함 할 수 있다. 하우징은 일반적으로 직사각형 형상 (둥근 모서리 및 곡선 단부를 가짐)을 가질 수 있고 카세트 스테이지의 독립적 인 동작을 수용하도록 구성된 하우징 내에 원형 개구부 (3330)를 형성 할 수 있다 부착 된 카세트 및 피펫터, 조명 및 광학 시스템과 같은 장치의 다른 구성 요소에 의해 카세트에 접근 할 수 있다. 하우징 (3320)은 다양한 시약 또는 카트리지 서브 구성 요소를 포함하는 웰에 대한 피펫터에 의한 접근을 제공하는 하우징의 상부면에 복수의 포트 (3312)로 구성 될 수 있다. 하우징의 상부 표면은 또한 하나 이상의 티칭 웰(teaching well) (3314)을 포함 할 수 있다. 티칭 웰 (3314)은 피펫터가 IDT / AST 공정의 개시 및 / 또는 정기적 인 피펫터 배향 단계에서의 기기 작동 전반에 걸친 초기의 피펫터 배향 단계에서 카트리지에 공간적으로 방향을 맞추기 위해 사용할 수 있는 원형 개구와 같은 카트리지 하우징 내의 개구 일 수 있다. 다양한 실시 예에서, 티칭 카트리지 또는 시약 카트리지로부터 연장되는 다른 구조적 특징이 피펫터 방향을 위한 교시 특징으로 사용될 수 있다. 모든 카트리지 포트 또는 다른 개구의 위치는 티칭 웰 또는 다른 교시 특징의 위치에 대해 알려질 수 있다 (즉, 좌표계를 사용하는 것과 같이 언급 됨). 유사하게, 각각의 카트리지 포트 또는 개구에서의 카트리지의 내용물은 ID / AST 프로세스에 사용 된 시약 카트리지에 관한 사용자 입력 중 하나 또는 기기에 의해 감지 될 수 있는 바코드 또는 다른 식별자와 같이 기기가 카트리지로부터 획득한 정보 중 하나에 기초하여 시스템에 의해 포트 또는 개방 위치와 연관 될 수 있다.
시약 카트리지 하우징은 기기 시약 스테이지의 정렬 벽과의 마찰감(friction fit)을 제공하도록 구성 될 수 있다. 예를 들어, 시약 카트리지의 폭은 카트리지의 양 측면상의 정렬 벽과 접촉하도록 구성 될 수 있다. 시약 카트리지 하우징은 시약 스테이지의 정렬 벽에 결합 된 홀딩 특징과 인터페이스하는 클리트 (cleat) (3316)와 같은 하나 이상의 특징을 더 포함 할 수 있으며, 시약 스테이지에 시약 카트리지의 확실한 삽입 및 정확한 위치 설정을 제공한다. 시약 스테이지로의 시약 카트리지 삽입 및 / 또는 스냅 마찰감을 위한 양 정지(positive stop)를 제공함으로써 달성 될 수 있다.
시약 카트리지는 피펫 팁 랙 (3340)을 포함 할 수 있다. 피펫 팁 랙 (3340)은 시약 카트리지 하우징에 일체형 일 수 있거나 피펫 팁 랙은 마찰감에 의해 시약 카트리지 하우징 내로 조립되는 별개의 구성 요소 일 수 있다 또는 임의의 다른 적절한 부착 메카니즘에 의해 부착 될 수 있다.
시약 카트리지 하우징은 2 개 이상의 개별 하우징 구성 요소를 포함 할 수 있다. 예를 들어, 하우징은 하부 하우징 구성 요소 (3322) 및 상부 하우징 구성 요소 (3324)를 포함 할 수 있다. 하부 및 상부 하우징 구성 요소는 마찰 끼움(friction fit) 또는 임의의 다른 적절한 부착 하우징에 의해 서로 부착 될 수 있다.
다양한 실시 예에서, 하우징은 내부 공간을 형성 할 수 있다. 이제도 31을 참조하면, 내부 공간은 다양한 구성의 시약 웰을 포함하는 시약 래크 (3801), 시약 통 (예 : 터브 (3803)), GEF 장치를 수용하도록 구성된 GEF 웰 (3805) 등과 같은 복수의 시약 카트리지 구성 요소를 수용하도록 구성 될 수 있다. 하부 하우징 구성 요소 (3322)는 시약 스테이지 가열 요소와 시약 랙 (예 : 개구 (3807)) 사이와 같이 시약 스테이지와 시약 카트리지 구성 요소 사이의 접근 및 / 또는 접촉을 위한 개구를 포함 할 수 있다. 유사하게, 하부 하우징 구성 요소 (3322)는 또한 시약 스테이지와 하나 이상의 시약 카트리지 구성 요소 사이의 전기 인터페이스를 제공하기 위한 전기 접촉부와 같은 구성 요소를 포함 할 수 있다. 예를 들어, 시약 카트리지는 사용자에 의해 카트리지가 삽입 될 때 시약 스테이지 상에 위치 된 GEF 접촉부 (540) (도 5)와 결합하도록 구성된 시약 카트리지 하우징의 일부에 전기 접촉부 (3606) (도 29)를 포함 할 수 있다. 예를 들어, 적어도 하나의 전기 접촉부는 시약 카트리지의 외부로부터 접근 가능하다. 일부 예에서, 적어도 하나의 접촉부는 시약 카트리지의 한 단부에 위치되고 시약 카트리지가 시스템의 다른 전기 접촉부를 이동시키고 결합하게 함으로써 결합되도록 구성된 한 쌍의 이격 된 접촉부를 포함한다.
시약 카트리지에 포함 된 다양한 웰 및 욕조 중 적어도 일부는 피펫에 장착 된 피펫 팁에 의해 피어싱 될 수 있는 필름과 같은 필름으로 밀봉 될 수 있다. 필름은 시약 카트리지 하우징의 포트에 있거나 필름이 시약 용기 및 시약 용기 하우징에 있는 시약 통에 위치 할 수 있다.
다양한 구체 예에서, 시약 카트리지에 포함 된 특정 시약은 건조되거나 동결 건조 될 수 있다. 예를 들어, 항균제는 시약 웰의 내부 표면상의 필름으로 건조 될 수 있다. 건조되거나 동결 건조 된 시약은 시약 카트리지에 포함 된 물 또는 완충액을 첨가하여 기기로 재구성 할 수 있다.
시약 카트리지에 포함 된 시약은 미생물 ID 및 AST를 수행하는데 사용될 수 있는 임의의 다양한 시약을 포함 할 수 있다. 예를 들어, 시약은 물, 다양한 세제(detergent) 또는 완충액, 성장 배지, 투과 촉진제, 프로브, 염료 또는 염색제, 용매 등을 포함 할 수 있다.
시약 카트리지는 시약 카트리지 키트 (3400)의 일부를 포함 할 수 있다 (도 27-31 및 34). 시약 카트리지 키트는 단일 ID / AST 작업에 사용하기 위한 시약 카트리지 키트 구성 요소가 있는 밀봉 패키지로 포장 할 수 있다. 시약 카트리지 키트는 샘플 바이알 (3452) (예를 들어, 시약 카트리지 내에 삽입 가능한 샘플 바이알) 및 카세트 (3454)를 추가로 포함 할 수 있다. 카세트는 일회용 카세트 홀더 (3455) 내에 수용되거나 설정 될 수 있으며, 시약 카트리지 (3300)의 본체는 시약 카트리지가 기기에 삽입 될 때 카세트 및 카세트 스테이지의 작동을 수용하도록 구성된다. 예를 들어, 카세트 홀더는 카세트를 수용하도록 형상화 될 수 있으며, 예를 들어 카세트 홀더를 시약 카트리지의 개구 위 또는 안으로 결합시키기 위한 외형 치수(dimension)를 갖는다. 피펫 팁 (3441)을 포함하는 카세트 및 피펫 팁 봉인 (3440)은 밀봉 된 카트리지 키트 패키지 내의 제거 가능한 밀봉 부 (4257) (도 34)로 추가로 피복 될 수 있다.
작동시, 기기 사용자는 시약 카트리지 키트를 획득하고, 밀봉 된 패키지로부터 시약 카트리지를 제거하고, 샘플 바이알을 카트리지로부터 제거하여 임상 또는 연구 샘플을 샘플 바이알에 배치하고, 필름 밀봉 커버를 카세트 하우징 및 피펫 팁 랙에서 제거하고, 카트리지에서 카세트 및 / 또는 카세트 하우징을 제거하고 카트리지를 시약 스테이지에 놓고 기기에 놓는다. 다양한 실시 예에 따라, 상이한 시약이 시약 카트리지에 포함될 수 있고 상이한 시약 세트를 포함하는 카트리지가 상이한 연구 및 진단 목적을 위한 키트로서 제공 될 수 있다. 다른 카트리지 키트는 다른 임상 샘플 유형 또는 다른 감별 진단을 위해 제공 될 수 있다. 예를 들어, 혈액 배양, 기관지 세척 시험편, 객담, 상처 감염, 소변 샘플 등의 ID / AST에 대해 다른 카트리지 키트가 제공 될 수 있다. 시약 카트리지에 포함 된 시약은 샘플 유형 및 샘플 유형에 존재할 수 있는 예상 병원균에 따라 다른 키트에 포함 된 다른 FISH 프로브, 샘플 준비 시약 및 항균제를 사용하여 키트 유형에 따라 다를 수 있다. 예를 들어, 다양한 Gram-positive and Gram-negative bacteria 와 진균류 (예를 들어. 이스트)가 양성 혈액 배양 검사를 위한 ID/AST 카트리지(다음을 포함하나 이에 제한되지 않는다: Staphylococcus aureus, Staphylococcus lugdunensis, coagulase-negative Staphylococcus species (Staphylococcus epidermidis, Staphylococcus haemolyticus, Staphylococcus hominis, Staphylococcus capitis, not differentiated), Enterococcus faecalis, Enterococcus faecium (Enterococcus faecium and other Enterococcus spp., not differentiated, excluding Enterococcus faecalis), Streptococcus pneumoniae, Streptococcus pyogenes, Streptococcus agalactiae, Streptococcus spp., (Streptococcus mitis, Streptococcus pyogenes, Streptococcus gallolyticus, Streptococcus agalactiae, Streptococcus pneumoniae, not differentiated), Pseudomonas aeruginosa, Acinetobacter baumannii, Klebsiella spp. (Klebsiella pneumoniae, Klebsiella oxytoca, not differentiated), Escherichia coli, Enterobacter spp. (Enterobacter cloacae, Enterobacter aerogenes, not differentiated), Proteus spp. (Proteus mirabilis, Proteus vulgaris, not differentiated), Citrobacter spp. (Citrobacter freundii, Citrobacter koseri, not differentiated), Serratia marcescens, Candida albicans, and Candida glabrata.)를 이용해 동정될 수 있다.
본 명세서에 개시된 시스템 및 방법으로 검출 될 수 있는 기타 특정 박테리아는 제한 없이 포함된다: Acinetobacter baumannii, Actinobacillus spp., Actinomycetes, Actinomyces spp. (Actinomyces israelii 와 Actinomyces naeslundii 같은 류), Aeromonas spp. (Aeromonas hydrophila, Aeromonas veronii biovar sobria (Aeromonas sobria), 및 Aeromonas caviae 같은 류), Anaplasma phagocytophilum, Alcaligenes xylosoxidans, Actinobacillus actinomycetemcomitans, Bacillus spp. (Bacillus anthracis, Bacillus cereus, Bacillus subtilis, Bacillus thuringiensis, 및 Bacillus stearothermophilus 같은 류), Bacteroides spp. (Bacteroides fragilis 같은 류), Bartonella spp. (Bartonella bacilliformis 및 Bartonella henselae 같은 류), Bifidobacterium spp., Bordetella spp. (Bordetella pertussis, Bordetella parapertussis, 및 Bordetella bronchiseptica 같은 류), Borrelia spp. (Borrelia recurrentis, 및 Borrelia burgdorferi 같은 류), Brucella sp. (Brucella abortus, Brucella canis, Brucella melintensis 및 Brucella suis 같은 류), Burkholderia spp. (Burkholderia pseudomallei 및 Burkholderia cepacia 같은 류), Campylobacter spp. (Campylobacter jejuni, Campylobacter coli, Campylobacter lari 및 Campylobacter fetus 같은 류), Capnocytophaga spp., Cardiobacterium hominis, Chlamydia trachomatis, Chlamydophila pneumoniae, Chlamydophila psittaci, Citrobacter spp. Coxiella burnetii, Corynebacterium spp. (Corynebacterium diphtheriae, Corynebacterium jeikeum 및 Corynebacterium 같은 류), Clostridium spp. (Clostridium perfringens, Clostridium difficile, Clostridium botulinum 및 Clostridium tetani 같은 류), Eikenella corrodens, Enterobacter spp. (Enterobacter aerogenes, Enterobacter agglomerans, Enterobacter cloacae 및 Escherichia coli 같은 류, opportunistic Escherichia coli를 포함, enterotoxigenic E. coli, enteroinvasive E. coli, enteropathogenic E. coli, enterohemorrhagic E. coli, enteroaggregative E. coli 및 uropathogenic E. coli 같은 류) Enterococcus spp. (Enterococcus faecalis 및 Enterococcus faecium 같은 류) Ehrlichia spp. (Ehrlichia chafeensia 및 Ehrlichia canis 같은 류), Erysipelothrix rhusiopathiae, Eubacterium spp., Francisella tularensis, Fusobacterium nucleatum, Gardnerella vaginalis, Gemella morbillorum, Haemophilus spp. (Haemophilus influenzae, Haemophilus ducreyi, Haemophilus aegyptius, Haemophilus parainfluenzae, Haemophilus haemolyticus 및 Haemophilus parahaemolyticus 같은 류, Helicobacter spp. (Helicobacter pylori, Helicobacter cinaedi 및 Helicobacter fennelliae 같은 류), Kingella kingii, Klebsiella spp. (Klebsiella pneumoniae, Klebsiella granulomatis 및 Klebsiella oxytoca 같은 류), Lactobacillus spp., Listeria monocytogenes, Leptospira interrogans, Legionella pneumophila, Leptospira interrogans, Peptostreptococcus spp., Moraxella catarrhalis, Morganella spp., Mobiluncus spp., Micrococcus spp., Mycobacterium spp. (Mycobacterium leprae, Mycobacterium tuberculosis, Mycobacterium intracellulare, Mycobacterium avium, Mycobacterium bovis, 및 Mycobacterium marinum 같은 류), Mycoplasm spp. (Mycoplasma pneumoniae, Mycoplasma hominis, 및 Mycoplasma genitalium 같은 류), Nocardia spp. (Nocardia asteroides, Nocardia cyriacigeorgica 및 Nocardia brasiliensis 같은 류), Neisseria spp. (Neisseria gonorrhoeae 및 Neisseria meningitides 같은 류), Pasteurella multocida, Plesiomonas shigelloides. Prevotella spp., Porphyromonas spp., Prevotella melaninogenica, Proteus spp. (Proteus vulgaris 및 Proteus mirabilis 같은 류), Providencia spp. (Providencia alcalifaciens, Providencia rettgeri 및 Providencia stuartii 같은 류), Pseudomonas aeruginosa, Propionibacterium acnes, Rhodococcus equi, Rickettsia spp. (Rickettsia rickettsii, Rickettsia akari 및 Rickettsia prowazekii 같은 류, Orientia tsutsugamushi (일반적으로: Rickettsia tsutsugamushi) 및 Rickettsia typhi), Rhodococcus spp., Serratia marcescens, Stenotrophomonas maltophilia, Salmonella spp. (Salmonella enterica, Salmonella typhi, Salmonella paratyphi, Salmonella enteritidis, Salmonella cholerasuis 및 Salmonella typhimurium 같은 류), Serratia spp. (Serratia marcesans 및 Serratia liquifaciens 같은 류), Shigella spp. (Shigella dysenteriae, Shigella flexneri, Shigella boydii 및 Shigella sonnei 같은 류), Staphylococcus spp. (Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis, Staphylococcus hemolyticus, Staphylococcus saprophyticus 같은 류), Streptococcus spp. (Streptococcus pneumoniae (예를 들어 chloramphenicol-resistant serotype 4 Streptococcus pneumoniae, spectinomycin-resistant serotype 6B Streptococcus pneumoniae, streptomycin-resistant serotype 9V Streptococcus pneumoniae, erythromycin-resistant serotype 14 Streptococcus pneumoniae, optochin-resistant serotype 14 Streptococcus pneumoniae, rifampicin-resistant serotype 18C Streptococcus pneumoniae, tetracycline-resistant serotype 19F Streptococcus pneumoniae, penicillin-resistant serotype 19F Streptococcus pneumoniae, 및 trimethoprim-resistant serotype 23F Streptococcus pneumoniae, chloramphenicol-resistant serotype 4 Streptococcus pneumoniae, spectinomycin-resistant serotype 6B Streptococcus pneumoniae, streptomycin-resistant serotype 9V Streptococcus pneumoniae, optochin-resistant serotype 14 Streptococcus pneumoniae, rifampicin-resistant serotype 18C Streptococcus pneumoniae, penicillin-resistant serotype 19F Streptococcus pneumoniae, or trimethoprim-resistant serotype 23F Streptococcus pneumoniae), Streptococcus agalactiae, Streptococcus mutans, Streptococcus pyogenes, Group A streptococci, Streptococcus pyogenes, Group B streptococci, Streptococcus agalactiae, Group C streptococci, Streptococcus anginosus, Streptococcus equismilis, Group D streptococci, Streptococcus bovis, Group F streptococci, 및 Streptococcus anginosus Group G streptococci), Spirillum minus, Streptobacillus moniliformi, Treponema spp. (Treponema carateum, Treponema petenue, Treponema pallidum 및 Treponema endemicum 같은 류, Tropheryma whippelii, Ureaplasma urealyticum, Veillonella sp., Vibrio spp. (Vibrio cholerae, Vibrio parahemolyticus, Vibrio vulnificus, Vibrio parahaemolyticus, Vibrio vulnificus, Vibrio alginolyticus, Vibrio mimicus, Vibrio hollisae, Vibrio fluvialis, Vibrio metchnikovii, Vibrio damsela 및 Vibrio furnisii 같은 류), Yersinia spp. (Yersinia enterocolitica, Yersinia pestis, 및 Yersinia pseudotuberculosis 같은 류) 및 Xanthomonas maltophilia among others.
개시된 시스템 및 방법으로 검출 될 수있는 기타 특정 진균류는 칸디다 (Candida) spp. (Candida albicans, Candida glabrata, Candida tropicalis, Candida parapsilosis 및 Candida krusei와 같은), Aspergillus spp. (예 : Aspergillus fumigatous, Aspergillus flavus, Aspergillus clavatus), Cryptococcus spp. (Cryptococcus neoformans, Cryptococcus gattii, Cryptococcus laurentii 및 Cryptococcus albidus와 같은), Fusarium spp. (Fusarium oxysporum, Fusarium solani, Fusarium verticillioides 및 Fusarium proliferatum과 같은), Rhizopus oryzae, Penicillium marneffei, Coccidiodes immitis 및 Blastomyces dermatitidis 가 있고 이에 한정되지 않는다.
양성 혈액 배양 분석을위한 ID / AST 카트리지 키트는 균혈증 및 진균증의 진단을 보조하는 것으로 나타낼 수 있다. 또한 균혈증과 관련되거나 균혈증을 일으키는 특정 병원성 박테리아에 대한 감수성 검사에도 사용될 수 있다. 결과는 다른 임상 및 검사 결과와 함께 최적으로 사용해야 한다.
ID / AST 카트리지 키트 (혈액 배양 분석에 사용하기 위한 것과 같은)는 다음 항균제를 포함 할 수 있다 : amikacin, ampicillin, ampicillin-sulbactam, aztreonam, ceftazidime, ceftaroline, cefazolin, cefepime, ceftriaxone, ciprofloxacin, colistin, daptomycin, oxycycline, erythromycin, ertapenem, gentamicin, imipenem, linezolid, meropenem, minocycline, piperacillin-tazobactam, trimethoprim-sulfamethoxazole, tobramycin, vancomycin 이들 중 둘 이상의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것. 본 명세서에 개시된 시스템 및 방법에서 사용될 수 있는 추가의 항균제는 aminoglycosides (다음을 포함하나 이에 한정되지 않는다.kanamycin, neomycin, netilmicin, paromomycin, streptomycin, and spectinomycin), ansamycins (다음을 포함하나 이에 한정되지 않는다.rifaximin), carbapenems (다음을 포함하나 이에 한정되지 않는다.doripenem), cephalosporins (다음을 포함하나 이에 한정되지 않는다.cefadroxil, cefalotin, cephalexin, cefaclor, cefprozil, fecluroxime, cefixime, cefdinir, cefditoren, cefotaxime, cefpodoxime, ceftibuten, and ceftobiprole), glycopeptides (다음을 포함하나 이에 한정되지 않는다.teicoplanin, telavancin, dalbavancin, and oritavancin), lincosamides (다음을 포함하나 이에 한정되지 않는다.clindamycin and lincomycin), macrolides (다음을 포함하나 이에 한정되지 않는다.azithromycin, clarithromycin, dirithromycin, roxithromycin, telithromycin, and spiramycin), nitrofurans (다음을 포함하나 이에 한정되지 않는다.furazolidone and nitrofurantoin), oxazolidinones (다음을 포함하나 이에 한정되지 않는다.posizolid, radezolid, and torezolid), penicillins (다음을 포함하나 이에 한정되지 않는다.amoxicillin, flucloxacillin, penicillin, amoxicillin/clavulanate, and ticarcillin/clavulanate), polypeptides (다음을 포함하나 이에 한정되지 않는다.bacitracin and polymyxin B), quinolones (다음을 포함하나 이에 한정되지 않는다.enoxacin, gatifloxacin, gemifloxacin, levofloxacin, lomefloxacin, moxifloxacin, naldixic acid, norfloxacin, trovafloxacin, grepafloxacin, sparfloxacin, and temafloxacin), suflonamides (다음을 포함하나 이에 한정되지 않는다.mafenide, sulfacetamide, sulfadiazine, sulfadimethoxine, sulfamethizole, sulfamethoxazole, sulfasalazine, and sulfisoxazole), tetracyclines (다음을 포함하나 이에 한정되지 않는다.demeclocycline, doxycycline, oxytetracycline, and tetracycline), and others (다음을 포함하나 이에 한정되지 않는다.clofazimine, ethambutol, isoniazid, rifampicin, arsphenamine, chloramphenicol, fosfomycin, metronidazole, tigecycline, and trimethoprim) 또는 이들 중 둘 이상의 임의의 조합을 포함한다.
한 구체적인 예에서, 시약 카트리지의 하나 이상의 웰에서 적어도 하나의 프로브 (예컨대, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 또는 그 이상)와 적어도 하나의 항균제(1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15,16, 17, 18, 19, 20, 또는 그 이상)을 포함 할 수 있다. 특정 비 제한적인 실시 양태에서, 시약 카트리지는 포도상 구균 (Staphylococcus aureus) 프로브를 포함하는 적어도 하나의 웰, 응고 효소 - 음성 포도상 구균 프로브를 포함하는 웰 (예를 들어, S. 표피 디스와 하이브리드 화하는 프로브, S. 헤 모밀티 쿠스, S. 호미 니스 Streptococcus lugdunensis 프로브를 포함하는 웰, Enterococcus faecalis 프로브를 포함하는 웰, Enterococcus faecium 프로브를 포함하는 웰, Streptococcus agalactiae 프로브를 포함하는 웰, Streptococcus spp. 프로브 (예를 들어, S. mitis, S. gallolyticus, S. agalactiae, S. pneumoniae에 하이브리드화하는 프로브, 분화하지 않음), 대장균 프로브를 포함하는 웰, 클레 브시 엘라 종 (Klebsiella spp.) 프로브 (예를 들어, K. pneumoniae 및 K. oxytoca에 하이브리드하는 프로브, 분화되지 않은), Enterobacter spp. 프로브 (예를 들어, E. aerogenes 및 E. cloacae에 하이브리드화하는 프로브, 분화되지 않은 것), Citrobacter spp. 프로브 (예를 들어, C freundii 및 C. koseri에 하이브리드화하는 프로브, 차별화되지 않음), Proteus spp. Pseudomonas aeruginosa 프로브를 포함하는 웰, Acinetobacter baumannii 프로브를 포함하는 웰, 칸디다 균을 포함하는 웰 (예를 들어, P. mirabilis 및 P. vulgaris에 하이브리드화하는 프로브, 분화하지 않음), 세라티아 마르세센스 프로브를 포함하는 웰, albicans probe, 칸디다 glabrata probe를 포함한 웰, amicacin을 포함하는 웰, ampicillin을 포함하는 웰, ampicillin / sulbactam을 포함하는 웰, aztreonam을 포함하는 웰, cefazolin을 포함하는 웰, cefepime을 포함하는 웰, cefaroline을 포함하는 웰 (ciprofloxacin을 포함하는 웰, 콜리스틴을 포함하는 웰, daptomycin을 포함하는 웰, ertapenem을 포함하는 웰, erythromycin을 포함하는 웰, 겐타 마이신을 포함하는 웰, imipenem을 포함하는 웰, 리네졸리드를 포함한 웰, 웰 (meropenem), 미노사이클린을 포함하는 웰, 매크로 라이드 - 린코 사마이드 - 스트렙토그램닌 B를 포함하는 웰, cefoxitin을 포함하는 웰, piperacillin / tazoba를 포함하는 웰 ctam, 스트렙토 마이신을 포함하는 웰, 토 브라 마이신을 포함하는 웰, 트리 메토 프림 / 설파 메 톡 사졸을 포함하는 웰 및 반코마이신을 포함하는 웰. 일부 예에서, 프로브를 포함하는 각각의 웰은 또한 아 크리 딘 오렌지 또는 요오드화 프로피 듐과 같은 보편적 인 미생물 또는 세포 염색제를 포함한다.
카세트(Cassette)
다양한 실시 예에 따라, 시스템은 카세트를 포함 할 수 있다. 카세트는 미세 유체 샘플 채널에서 시료의 일부 및 다른 시약을 수용하도록 구성 될 수 있다. 카세트 및 샘플 채널은 기기 조명 및 광학 시스템으로 EKC, FISH ID, AST, 약력학 시험 및 기타 분석법 및 이미징 미생물 세포를 수행하는 것을 용이하게 한다. 다양한 실시 예에 따른 카세트가 도 35 내지 도65에 도시되어있으며, 이하에서 더 상세하게 설명된다.
다양한 실시 예와 도 35 내지 도 46에 도시 된 바와 같이, 카세트 (4500)는 유리 지지체 (4400), 라미네이트 층 (4601) 및 카세트 구성 요소로도 지칭되는 카세트 상부 (4300) (도 46 참조)를 포함하는 디스크 형 장치 일 수 있다. 라미네이트 층 (4601)은 라미네이트 층 중합체 재료의 양면 상에 접착층 또는 접착 처리를 갖는 중합체 재료를 포함 할 수 있다. 유리 지지체 (4400)는 접착 처리 된 라미네이트 층 (4601)에 의해 카세트 상부 (4300)에 접착 될 수 있다. 3 개의 구성 요소는 함께 조립되어 조립 된 카세트 (4500)를 형성 할 수 있다. 조립 된 카세트 (4500)(예, 48 개의 샘플 채널)(도 37B 및 도 57 참조) 는 카세트 내의 반경 방향 배열로 배열 된 복수의 미세 유체 샘플 채널 (5702)을 특징으로 할 수 있으며, 각 샘플 채널은 이하에서 더 상세하게 설명되는 유입구 (4503) 및 유출구 (4504) (도 41)를 갖는다. 일부 예에서, 미세 유체 채널은 라미네이트 층 또는 라미네이트 층 및 카세트 구성 요소에 형성된다. 다양한 실시 예에서, 샘플 채널은 카세트의 외주를 향한 입구 포트 (4503) 및 카세트의 중심을 향하는 출구 포트 (4504)로 배향된다. 다양한 다른 실시 예에서, 입구 포트는 카세트의 중심 근처에 있을 수 있고 출구 포트는 카세트의 둘레 부근에 있을 수 있다. 일부 실시 예에서, 카세트는 몰딩 된 중합체 디스크에 접착 된 유리 지지체 및 카세트를 가로 질러 반경 방향 배열로 배열 된 복수의 미세 유체 채널을 포함한다.
도 41에 도시 된 바와 같이, 카세트 (4500)는 또한 중앙 콘 또는 스핀들 (4505) 및 / 또는 카세트의 둘레 주위에 분포 된 탭 (4506)과 같은 사용자 취급을 위한 특징을 포함 할 수 있다. 유사하게, 카세트는, 카세트 스테이지 상에 배치 된 대응 특징과의 마찰 끼워 맞춤을 제공하는 카세트 둘레 주위의 복수의 로킹 스프링 아암(locking spring arms)(4507)과 같은 카세트 스테이지와 인터페이스하기 위한 특징을 포함 할 수 있어서, 카세트 스테이지는 안정적으로 및 카세트 스테이지에 진동 결합된다. 공통 폐기물 웰 (4515)은 원형 폐기물 옹벽 (4519)에 의해 구속되는 중앙 영역에 형성 될 수 있다.
카세트 상부 (4300)는 ZEONOR (예를 들어, ZEONORE 1060R) 및 ZEONEX와 같은 사출 성형 가능한 광학적으로 투명한 중합체로부터 성형 될 수 있는 카세트의 중합 부 / 영역을 포함 할 수 있다. 카세트 상부 (4300)의 하부 표면은, 샘플 채널 플로우 셀의 상부를 형성하는 카세트 상부 (4300)의 하부 표면 (4308)과 같이, 전체적으로 또는 샘플 채널의 영역에 ITO와 같은 광학적으로 투명한 전도성 층으로 코팅 될 수 있다 (즉, 카세트 상부 (4300)의 유동 셀 형성 릴리프 영역 (4309))뿐만 아니라 카세트 상부 (4300)의 하부의 유동 셀 형성 릴리프 영역의 측벽을 포함한다. ITO가 카세트 상부 (4300) 약 5 내지 약 200 ohms / sq, 또는 약 30 내지 약 170 ohms / sq, 또는 약 50 내지 약 120 ohms / sq, 또는 약 70 내지 약 100 ohms / sq의 시트 저항을 갖는다. 다양한 실시 예에서, 시트 저항은 약 100 옴 / sq 미만, 또는 약 80 옴 / sq 미만, 또는 약 60 옴 / sq 미만, 또는 약 40 옴 / sq 이하 약 20 옴 / sq 보다 작거나 약 10 옴 / sq 보다 작다.
도 37A 내지도 37C는 카세트 상부 (4300)의 상세를 도시한다. 도 37B는 카세트 상부 (4300) 내의 슬롯 주위의 마스크 (4311)를 도시한다. 도 41은 관련 유출 포트 (4504)와 관련하여 입구 포트 (4503) 중 하나를 도시하는 입면의 카세트 상부의 단면을 도시한다. 입구 포트 (4503)의 선택 표면은 ITO로 코팅 될 수 있다.
도 38 및 도 40에 도시 된 유리 지지체 (4400)는 외부 직경을 갖는 편평한 환형 유리 슬라이드 및 내부 직경에 의해 한정된 내부 개구 (4410)를 포함 할 수 있다. 유리는 Schott B 270 i Ultra-White Glass 또는 이와 유사한 유리 재료와 같이 높은 광선 투과율과 높은 화학적 안정성을 가질 수 있다. 내부 개구 (4410)는 카세트의 플라스틱 상부의 중앙 함몰 부를 수용하도록 구성 될 수 있다. ITO는 약 5 내지 약 200 ohms / sq. 또는 약 30 내지 약 170 ohms / sq. 또는 약 50 내지 약 120 ohms / sq의 또는 약 70 내지 약 100 옴 / sq 시트 저항을 제공하기 위해 유리 지지체의 표면에 적용될 수 있다. 다양한 실시 예에서, 시트 저항은 약 100 옴 / sq 미만, 또는 약 80 옴 / sq 미만, 또는 약 60 옴 / sq 미만, 또는 약 40 옴 / sq 이하 약 20 옴 / sq 보다 작거나 약 10 옴 / sq 보다 작다. 유리 지지체는 도 38의 영역 (4412)에 나타낸 바와 같이 내부 개구 근처에서 마스크 될 수 있다. 따라서, ITO 코팅은 유리 지지체의 내부 개구 (4410)의 에지까지 연장되지 않는다. 상기 영역은 도시 된 바와 같이 내부 직경 (ID) 및 외부 직경 (OD)의 경계를 가질 수 있다. ITO 처리 후, 유리 지지체는 폴리 -L- 라이신 ( "PLL")으로 추가 코팅 될 수 있다. 도 49에 도시 된 바와 같이, 유리 지지체 (4400)의 내부 및 외부 에지는 경계부 (4414)의 외부 및 내부 경계부 (4416)의 내부에 대해 에지 칩핑(chip)되거나 둥근 홈을 팔 수 있다.
카세트 (4500)는 EKC 슬롯 (4520) 및 EKC 구멍 (4522)을 포함 할 수 있으며, 이들은 도 41에 정렬되어 도시된다. 또한, 카세트 (4500)는 내부 기준 홀 (4530) 및 외부 기준 홀 (4532)을 포함 할 수 있다. 도시 된 실시 예에서, 3 개의 3 세트의 EKC 슬롯 및 구멍 사이에 산재 된 내부 기준 구멍 (4530) 및 외부 기준 구멍 (4532)의 균일하게 이격 된 세트를 포함한다.
도 도 47A에 가장 잘 도시 되고, 도 47B의 상세도에 도시 된 바와 같이, 각각의 EKC 슬롯 (4520) 및 각각의 EKC 구멍 (4522)의 영역은 실버 페인트 또는 다른 적절한 물질로 선택적으로 코팅되어 다양한 구성 요소의 정렬 된 슬롯 및 구멍 전체에 걸쳐 전도성을 보장 할 수 있다.
도 48A 및 도 48B의 상세도를 참조하면, 내부 기준 홀 (4530) 및 외부 기준 홀 (4532)을 도시한다. 도 48B에 도시 된 바와 같이, 유리 지지체 (4400)상의 기준 마크 (4534)는 라미네이트 층 (4601)의 원형 구멍 (4536) 내에서 중심에 위치된다. 유사하게, 유리 지지체 (4400)상의 기준 마크 (4538)는 라미네이트 층 (4601) 의 원형 구멍 (4540) 내에서 중심에 위치된다.
도 53a는 다른 실시 예에서 이젝터 패드(ejector pad) (E)가없는 카세트의 일부를 도시한다 (도 52A). 도 52B는 카세트의 일부를 도시하고, 도 53B는 다른 실시 예에서 포켓 (P)가 형성된 동일한 부분을 도시한다. 도 52C는 카세트의 일부에 구멍을 도시하고, 도 53C는 또 다른 실시 예에서 구멍 (H)에 부가 된 챔퍼 (C)를 도시한다.
도 65는 유리 지지체 (4400)가 ITO로 코팅 될 때 마스킹 된 후 내부 슬롯 (4520)이 은페인트로 도장되고, 기준 마킹이 각각의 구멍 (4540 및 4536) 내에 정렬되고, 바코드 (4550)가 제공되는 카세트(4500)의 대체 디자인의 평면도이다.
도 54 및 도 55는 다른 라미네이트 층의 사시도이다. 일부 실시 예에서, 대체 라미네이트 층 (4601 ')은 약 0.0035 인치의 두께를 가지며, 0.001 인치 PSA (투명), 0.0015 인치 PET (청색) 및 0.001 인치 PSA (투명)를 포함하는 구조를 갖는다. 일부 실시 예에서, 대체 라미네이트 층 (4601 ")은 약 0.0135 인치의 두께를 가지며, 0.00175 인치 PSA (투명 또는 청색), 0.010 인치 PET (투명) 및 0.00175 인치 PSA (투명 또는 청색)를 포함하는 구조를 갖는다.
더 얇은 라미네이트 층을 갖는 카세트 (4700)의 개략적 인 단면이 도 59에 도시된다. 도시 된 바와 같이, 유리 지지체와 카세트 상부 사이의 갭은 더 작아서, 유체는 가공 중에 갭에 포획되는 경향이 있다. 갭이 더 작기 때문에, EKC 전기장은 큰 갭을 갖는 구현보다 약 4 배 더 크다.
대조적으로, 도 60은 더 두꺼운 라미네이트 층을 갖는 카세트 (4702)의 개략적인 단면도이다. 도시 된 바와 같이, 유리 지지체와 카세트 상부 사이의 갭은 더 크다. 더 두꺼운 라미네이트 층은 더 깨끗하게 절단 될 수 있다. 또한, 더 두꺼운 PSA 층 성분은 보다 우수한 밀봉을 제공 할 수 있다.
도 61 및 도 63은 채널이 카세트 상부 및 라미네이트 층 모두에 형성되는 카세트 (4704)의 평면도 및 저면도이다. 또한, 도 62 및 도 64는 채널이 라미네이트 층에만 형성되는 카세트 (4706)의 평면도 및 저면도이다.
도 57에 가장 잘 도시 된 바와 같이, 각각의 개별 샘플 채널 (5702)은 플로우 셀 (flow cell) (5711)과 유체 연통하는 유입구 포트 (4503) 중 하나를 포함하며, 유출구 포트 (4504) 중 관련된 포트와 유체 소통한다. 유입구 포트 (4503)는 피펫터 조립체에 부착 된 피펫 팁을 수용하고, 피펫 팁으로부터 배출 된 유체가 팁 단부 위의 입구 포트를 채우는 것을 실질적으로 방지하기에 적합한 밀봉을 생성하는 방식으로 피펫 팁에 연결된다(즉, 팁으로부터 배출 된 유체는 피펫 팁과 입구 포트 사이의 계면에 의해 생성 된 밀봉으로 인해 입구 포트 채널 및 유동 셀로 우선적으로 향하게 된다). 입구 포트 (4503)는 입구 포트의 상부에서 내부 직경이 피펫 팁의 외부 직경보다 큰 원뿔 형상을 가질 수 있다. 입구 포트의 내부 직경은 입구 포트의 저부로 갈수록 감소 할 수 있으며, 피펫 팁에 의해 입구 웰 내로 하강 된 피펫 팁을 수용하고 수직 배향 된 유입구 채널과 실질적으로 동축 인 위치로 피펫 팁을 안내하는 것을 용이하게 하기 위해 피펫 팁보다 작은 입구 포트 채널 (5712)을 향해 가늘어진다. 입구 포트 구조는 입구 포트 및 / 또는 입구 포트 채널의 상부가 유동 셀의 레벨에 대해 상승 된 입구 포트 높이에 위치하도록 상기 유입구로부터 상기 플로우 셀 내로의 중력 구동 유체 유동을 더 생성하기 위해 상기 유동 셀에 대하여 양의 압력 헤드(즉, 유압 헤드)를 생성하도록 구성된 방식으로 구성 될 수 있다(즉, 유입포트의 샘플 채널 설계 및 구성, 샘플 채널 유동 셀, 및 유출 포트는 각 포트가 주위 압력에 있고 채널이 유입 포트 채널 및 유출 포트 채널 (즉, 유출구 노즐)의 상단에 도달하는 유체 레벨로 유체 처리 될 때, 피펫터에 의한 입구 포트에서의 양의 압력뿐만 아니라 샘플 채널을 통한 중력 및 표면 장력에 의한 입구 포트로부터 출구 포트로의 유동에 반응하여 피펫터를 통한 피펫 유동을 용이하게 하기에 적합하다(즉, 샘플 채널은 입구 포트 채널의 상부로부터 출구 포트 채널의 상부 (즉, 출구 포트 노즐)까지 연속적으로 유체 충전된다.).
플로우 셀 (5711)은 EKC 및 이미징을 위한 플로우 셀 경계에 의해 한정된 카세트의 영역을 가로 질러 샘플 대상물의 분배를 용이하게 하도록 구성된 수평 배향 챔버를 포함 할 수 있다. 다양한 실시 예에서, 플로우 셀은 약 300 ㎛ 내지 약 350 ㎛의 높이, 약 2.2 ㎜ (촬상 영역에서의) 폭, 및 약 22.5 ㎜의 길이를 가질 수 있다. 플로우 셀은 플로우 셀 이미징 영역 (5713) 및 플로우 셀 유출 영역 (5714)을 포함 할 수 있다. 플로우 셀 이미징 영역 (5713)은 길이가 약 16.5 mm 일 수 있다. 플로우 셀 유출 영역 (5714)은 길이가 약 6mm이고, 영상 진단 영역에서 약 2.2mm의 폭에서부터 (예를 들어, 반경 방향 내측으로) 유출 포트 부근에 위치한 유동 셀의 내측 단부에서 더 좁은 폭으로 감소 또는 점점 가늘어진다. 도 58은도 57의 대체적인 도면 / 사시도이다.
도 56은 불리할 수 있지만 많은 조건 하에서 여전히 기능 할 수 있는, 오정렬 된 채널을 갖는 구성을 도시하는 카세트의 일부분을 도시 한 도면이다. 플로우 셀 (5711)은 채널 오정렬이 없으며, 라미네이트 층 상에 유체 흐름이없고 출구 전이가보다 원활하기 때문에 이러한 시행을 피할 수 있는 대안적인 설계이다. 이미징 위치의 약간의 편차에 대한 허용 오차도 증가한다. 또한, 본 실시 예에서는 EKC 갭이 균일하고, 채널의 측면에 ITO가 필요하지 않다. 채널 체적의 추정 된 변화는 도 56에 구성된 실시 예에서 +1 마이크로리터(microliter) 정도이다.
다양한 실시 예에 따라, 플로우 셀 출구 영역의 구성은 출구 채널로부터 폐기물 또는 오염물의 확산을 감소 시키거나 실질적으로 제거 할 수 있다. 이론에 구속되기를 바라지는 않지만, 분자가 거리 L만큼 이동하는데 필요한 시간 t는 다음의 방정식으로 표현 될 수 있다:
t = L 2 /(10D),
여기서 D는 해당 분자의 크기와 모양뿐만 아니라 용매와의 상호 작용 및 용매의 점도에 따라 달라지는 확산 계수입니다. 1E-3 mm2/s의 D 값은 카세트에 사용되는 유체에 존재할 수 있는 전형적인 소형 분자를 나타내기 위해 사용될 수 있다. 위의 식에서 D의이 값을 사용하면 분자가 1 mm 확산하는 데 필요한 시간은 1000 초입니다. 따라서 같은 확산 계수를 가진 분자가 6mm 이동하는 데 필요한 시간은 3.6E4s 또는 10hr입니다. 다양한 구체 예에서, 시약은 폐기 시약을 유출 채널로 이동 시키도록 계산 된 방식으로 플로우 셀을 통해 교환 될 수 있으며, 플로우 셀 유출 영역에 의한 유출 포트 채널로부터의 플로우 셀의 이미징 영역의 분리는 용질 유출 채널에서 ID, AST 또는 다른 분석이 수행되는 시간대에서 플로우 셀의 이미징 영역 내로 확산되는 것을 방지한다.
샘플 채널의 유출 포트는 과량의 유체가 피펫터에 의해 입구 포트 내로 배출 된 유체에 의해 변위 될 때 샘플 채널을 빠져 나갈 수 있도록 구성 될 수 있다. 카세트는 복수의 샘플 채널 출구 포트 (4504) 각각으로부터 배출되는 초과 유체를 수용하는 공통의 폐기물 웰 (4515)로 구성 될 수 있다.
다양한 실시 예에서, 유출 포트 (4504)는 유출 포트 또는 폐기물 웰이 샘플 채널로 역류하는 것을 방지하도록 구성 될 수 있다. 또한, 카세트 및 / 또는 각각의 샘플 채널 유출 포트는 유체가 공통 폐기물 웰 (4515)로 유동하는 것을 촉진 시키도록 구성 될 수 있다. 출구 포트와 입구 포트 사이의 압력 헤드 차동 장치(Pressure head differentials)(즉, 입구 포트에서 출구 포트까지의 부압(negative pressure) 헤드 출구 포트)는 출구 포트에서 샘플 채널을 향한 역류 효과를 생성 할 수 있다. 마찬가지로 다양한 현상이 모세관 작용, 위킹 (wicking) 및 마 랑고 니 (Marangoni) 흐름과 같은 다양한 표면 장력 유발 효과를 포함하여 일반적인 폐기물 웰에서의 오염 또는 역류를 초래할 수 있는 이어질 수 있는 중력에 반하는 유체 흐름을 생성할 수 있다. 각 샘플 채널에 대해 별도의 폐기물 웰을 사용하면 역류로 인한 시료 채널 교차 오염에 대한 우려가 완화 될 수 있지만 각 채널에 대한 별도의 폐기물 웰은 카세트 크기를 늘리거나 유체 취급을 늘려야 한다. 또한, 개별 샘플 채널 폐기물 웰로부터의 역류는 여전히 방지되어야 한다.
출구 포트의 다양한 파라미터는 폐액(waste fluid)에 대해 바람직한 유출 포트 성능을 제공하도록 구성 될 수 있다. 이러한 매개 변수에는 길이, 직경, 유출 포트 채널의 표면 처리가 포함된다(이에 국한되지 않음). 출구 포트 채널 단부 (즉, 출구 포트 "노즐")의 방향; 출구 포트 노즐을 둘러싸는 표면의 구성 및 표면 처리; 일반 폐기물 위의 배출구 노즐의 높이; 인접한 출구 포트 채널 구조로부터 출구 포트 채널 구조 (즉, 출구 포트 채널을 수용하는 구조)의 거리; 등. 이러한 특징은 출구 포트 채널 내에서 모세관 작용을 생성하도록 구성 될 수 있으며, ID와 AST를 수행하기 위한 기기 작동 중에 샘플 채널에 사용되는 다양한 유체 및 유체 혼합물에 대한 출구 포트 노즐에서의 액적(droplet) 형성 및 액적 거동에 대한 다른 수력 효과를 생성하도록 구성 될 수 있다. 이들 파라미터는 출구 포트 채널로부터 샘플 채널을 향한 역류의 발생을 감소시키고 유체가 공통 폐기물 웰로부터 출구 포트로 유동하는 것을 방지하도록 구성 될 수 있다.
다양한 실시 예에서, 출구 포트는 유동 셀의 단부 위에 위치되고 수직 상향으로 배향 된 원통형 채널을 포함 할 수 있다. 출구 포트 채널은 공통의 폐기물 레벨보다 충분히 높은 출구 포트 채널의 높이를 연장시켜 모세관 작용 레벨을 생성시키는 표면 효과를 제공하기에 적합한 작은 직경을 가질 수 있으며, 입구 포트는 입구 포트 채널(주위 압력에서, 즉 피펫터로부터의 양압없이)의 상부에 채워진다. 유출 포트 구조는 유출 포트 구조 (4516)에 위치 될 수 있다. 유출 포트 구조 (4516)는 카세트의 상부 표면 (4517)으로부터 수직 상향 연장하도록 구성 될 수 있다. 출구 포트 구조는 출구 포트 구조를 출구 포트 구조 내에서 실질적으로 수직으로 배향 된 원통형 채널로 정의 할 수 있다. 유출 포트 구조는 중앙 공통 폐기물 웰 (4515)을 향해 반경 방향 내측으로 연장되는 아치형 핀 또는 리브(rib)(4518)를 포함 할 수 있다. 유출 포트 노즐의 평면은 유출 포트 채널 축에 직각으로 배향 될 수 있다. 출구 포트 노즐을 둘러싸는 출구 포트 구조의 상부의 영역 및 인접한 출구 포트 구조의 상부 사이의 거리는 출구 포트 노즐에서 형성되는 폐액 방울이 (도시되지 않은) 출구 노즐의 인접한 유출 구조의 상부 및 / 또는 노즐과 접촉하는 것을 방지하도록 구성 될 수 있다. 다양한 실시 예에서, 출구 포트 구조는 유체 표면 힘이 유체 몸체 힘을 극복하기에 불충분하여 임계 값을 초과하는 출구 포트 구조들 사이의 거리에 대한 높이의 비율을 갖는 기하 구조로 구성 될 수 있고, 따라서 위킹 및/또는 모세관 현상에 의한 유체 역류를 방지할 수 있다. 다르게 말하면, 각각의 출구 포트 구조의 높이 및 인접한 출구 포트 구조들 사이의 거리는 공동 폐기물 웰 내의 유체의 모세관 작용이 중력을 극복하고 출구 포트 구조물의 상부에 도달하는 것을 방지하기에 충분할 수 있다. 다양한 실시 예에서, 출구 포트 구조 핀의 아치형 구조는 폐액을 공통의 웰 웰로 아래쪽으로 흘릴 수 있다. 출구 포트 구조의 구성은 출구 포트 노즐로부터 멀어지는 방향으로 인접한 출구 포트 구조 사이의 모세관 작용을 제공하고, 카세트의 중앙 및 공통 폐기물 웰을 향하여 하방 및 / 또는 방사상 내측으로 폐 유체를 흡인 할 수 있다.
다양한 실시 예에서, 카세트 및 출구 포트의 구성은 개별 출구 포트 또는 폐기물 웰이 피펫터에 의해 비워지는 것을 요구하지 않는다. 일반 폐기물은 피펫터가 다른 작업에 필요하지 않은 경우 주기적으로 비울 수 있다.
다양한 실시 예에서, 출구 포트는 샘플 채널에서 증발을 감소 시키거나 방지하기 위해 미네랄 오일 오버레이 또는 유사한 처리를 요구하지 않는다. 출구 포트로부터의 유체 증발은 출구 포트의 압력 헤드를 감소시켜 입구 포트로부터 샘플 채널을 통해 유체 흐름을 생성하여 입구 포트 채널의 유체 레벨을 감소시킵니다. 다양한 실시 예에서, 입구 포트 채널 및 출구 포트 채널은 ID 또는 AST와 같은 분석 과정 동안 각각의 개방 표면으로부터의 유체의 증발이 임계 값보다 작도록 구성되어, 입구 포트 채널 및 출구 포트 채널은 과도한 체적을 저장하고 증발에 의한 체적 고갈은 유동 셀로부터 유체를 고갈시키지 않으며 및 / 또는 유동 세포에 함유 된 유체의 용액 성질에 영향을 미치지 않는다. 다양한 다른 실시 예에서, 입구 포트 및 / 또는 출구 포트는 미네랄 오일 또는 수성 유체를 오버레이하고 유체의 증발을 감소시키기에 적합한 임의의 다른 시약으로 피복 될 수 있다.
다양한 실시 예에서, 출구 포트는 입구 포트의 압력 헤드에 대해 감압 헤드를 제공하여 샘플 채널로의 역류를 감소 시키거나 실질적으로 방지하도록 구성 될 수 있다. 출구 포트는 낮은 출구 포트 채널 높이로 출구 포트 채널을 구성하는 것과 같이 작은 출구 포트 채널 볼륨을 유지함으로써 감소 된 압력 헤드를 제공하도록 구성 될 수 있다. 다양한 실시 예에서, 출구 포트 채널은 감소 된 채널 직경으로 구성되어, 출구 포트 채널 높이의 단위 당 감소 된 출구 포트 채널 체적이 제공되고, 증가 된 표면 장력 (즉, 모세관 작용)을 제공한다. 압력 헤드에 기여하는 중력을 중화시키는 출구 포트 채널의 유체 상에 존재한다. 이러한 방식으로, 출구 포트 채널은 헤드 웰을 증가시키면서 저압 헤드를 유지하도록 구성되어 폐기물 웰로부터 출구 포트로의 역류를 방지 할 수 있다. 다양한 실시 예에 따르면, 출구 포트의 압력이 낮은 헤드를 제공하도록 출구 포트를 구성함으로써, 출구 포트에 대해 양의 압력 헤드를 제공하면서 샘플 헤드 입구 포트가 낮은 헤드 높이로 구성되도록 하여, 입구 포트 구조는 출구 포트에 대해 입구 포트에서 양압 헤드를 제공하는 데 필요하다.
다양한 실시 예에서, 입구 포트 및 / 또는 입구 포트 채널보다 작은 출구 포트 채널 직경을 포함하는 샘플 채널의 사용은 동일한 전체 구성이지만 입구 포트 채널과 동일한 직경의 출구 포트 채널을 갖는 샘플 채널을 포함하는 카세트와 비교하여 단위 표면적 당 증가 된 샘플 채널 수를 허용한다.
다양한 실시 예에서, 수직 출구 포트 채널 구성은 추가적인 측면 작용 또는 픽업 없이 단일 성형 단계에서의 제조와 양립 할 수 있다.
동작 방법(Method of Operation)
개요
다양한 양태에 따른 기기 및 시스템은 자동화된 방식으로 미생물 동정, 정량 및 항균 감수성 테스트를 수행하는데 사용될 수 있다. 다양한 실시 예에 따른 시스템 및 동작 방법에 대한 시스템 아키텍처 및 프로세스 흐름이 도 69 내지 도 75에 도시되어있다. 개시된 ID / AST 방법의 개관은 다음 절에서 제공되는 방법의 다양한 측면에 대한 추가 세부 사항과 함께 제공된다.
일부 실시 예에서, 환자 샘플 (또는 그의 일부분)은 샘플 바이알에 적재되고 상기 기기에 적재된다. 환자는 고양이, 개, 소, 돼지, 말, 양, 닭 및 다른 새, 물고기 등과 같은 사람 및 수의사 대상을 포함 할 수 있다. 일부 예에서, 환자는 감염 (세균성 또는 곰팡이 감염과 같은)이 있거나 감염이 의심되는 사람이다. 한 예에서, 환자는 패혈증이다. 환자 샘플은 혈액 (예 : 전혈, 혈장 또는 혈청), 호흡기 샘플 (예 : 기관지 폐포 세척액, 구강 인두 면봉, 비 인두 면봉 또는 객담), 타액, 소변, 직장 면봉, 질 면봉, 조직 샘플 또는 기타 생물 샘플을 포함 할 수 있다. 개시된 방법 및 시스템으로 분석하기 전에 샘플을 농축, 희석 및 / 또는 분리 할 수 있다. 샘플의 일부는 카세트 내의 복수의 미세 유체 채널로 도입된다. 하나 이상의 검출 가능하게 표지 된 핵산 프로브 (예를 들어, 형광 물질과 같은 검출 가능한 표지 포함)가 각각의 미세 유체 채널에 도입된다. 특정 예에서, 검출 가능하게 표지 된 프로브는 종 특이적 (표적 - 특이적으로 지칭 됨) 프로브 및 / 또는 범용 프로브를 포함한다. 각각의 종 - 특이 적 탐침은 특이 적 표적 생물 (예를 들어, 대장균) 또는 표적 생물 군 (예를 들어, K. pneumoniae, K. oxytoca와 같은 Klebsiella 종, 분화되지 않음)의 핵산에 특이 적으로 혼성화한다. 일부 예에서, 종 특이 적 프로브는 각각 표적 유기체 또는 유기체 그룹의 rRNA와 특이 적으로 혼성화한다. 각각의 보편적인 탐침은 모든 박테리아 및 / 또는 곰팡이와 같은 생물 군의 집단으로부터의 핵산에 혼성화한다. 하나의 특정 예에서, 하나의 종 특이 적 프로브가 각각의 미세 유체 채널 (예를 들어, 각 채널의 상이한 종 특이 적 프로브)에 도입되고, 보편적 프로브가 모든 채널에 도입된다. 검출 가능하게 표지 된 프로브는 프로브가 샘플에 존재하는 미생물에 하이브리드 화하기에 충분한 조건하에 샘플과 함께 배양된다(incubated).
하나 이상의 미생물의 하나 이상의 (예를 들어 1-100, 예를 들어 2-25, 10-40, 30-80 또는 50-100) 시야의 이미지가 캡쳐된다. 동일한 시야의 다수의 이미지는, 예를 들어 하나 이상의 상이한 이미징 방식 하에서 포착 될 수 있다. 일부 예에서, 각각의 시야는 표지화된 프로브 (종 - 특이 적 프로브 및 범용 프로브와 같은) 및 선택적으로 암시야 조건 하에서 각각을 검출하는 조건하에 이미징된다. 이미지는 하나 이상의 검출 가능하게 표지 된 프로브의 신호 강도, 잡음, 누화 및 미생물 형태를 포함하는 영상화된 미생물의 특성을 확인하기 위해 형태 학적 또는 기타 분석 (예: 형태 동역학 분석)을 받는다. 형태학 분석으로부터의 정보는 분포의 확률 기대 모델에 입력되어 환자 샘플에 존재하는 하나 이상의 미생물을 동정한다. 일부 예에서, 미생물은 하나 이상의 복수의 미세 유체 채널로부터의 사후 확률의 조합에 기초하여 동정된다. 일부 예에서, 샘플 내의 검출 된 미생물의 신호 패턴은 경험적 임계 값을 사용하여 라벨링 된 표적 프로브의 사후 확률 밀도 함수 (posterior probability density function; PDF)와 비교되거나 매칭된다. 추가의 예에서, 사후 분포는 커널 밀도 추정기를 통과하여 마이크로 유체 채널에서 이벤트 (예를 들어, 특정 미생물의 존재 또는 부재)의 결과 가능성 또는 확률을 제공하도록 통합된다. 일부 예에서, 샘플은 하나의 미생물(예를 들어, 하나의 "표적"미생물)을 포함하고, 다른 예에서, 샘플은 본 명세서에서 "다균"샘플로 언급되는 둘 이상의 미생물(예를 들어, 2, 3, 4 또는 그 이상)을 포함한다.
일부 구체 예에서, 환자 샘플은 하나 이상의 검출 가능하게 표지 된 프로브와 샘플을 접촉시키기 전에 하나 이상의 전처리 단계를 거친다. 이러한 전처리 단계에는 GEF (예 : 시료의 용존 세포 및 파편 제거 또는 감소) 및 / 또는 EKC (예 : 미생물을 분석 용 표면에 국한시키기)가 포함된다.
추가의 구체 예에서, 미생물 동정 후, 환자 샘플 (또는 그 서브 샘플)을 AST 분석한다. 샘플 중의 미생물(들)의 동일성에 기초하여, 샘플의 일부는 하나 이상의 항균제의 존재 또는 부재 하에 성장되고, 확인 된 미생물의 성장은 시간에 걸쳐 모니터링된다(예를 들어, 적어도 30 분 적어도 1 시간, 적어도 2 시간, 적어도 3 시간, 적어도 4 시간, 적어도 5 시간, 또는 적어도 6 시간, 예컨대 약 1-6 시간) 일부 실시 예에서, 미생물의 성장은 반복 된 시간 간격 (예를 들어, 4.5 시간 동안 10 분마다)으로 미생물의 이미지를 포착하고, 미생물의 성장 (또는 성장의 양), 성장의 결핍 또는 분해를 질적으로 또는 양적으로 측정함으로써 모니터링된다. 하나 이상의 항균제 (예를 들어, 항균제에 노출되지 않은 대조군과 비교하여)의 존재하에 시간이 지남에 따라 미생물의 거동에 기초하여, 확인 된 미생물의 각 항생제에 대한 감수성 (또는 불확실성) 또는 저항성의 결정이 내려진다. 일부 예에서, 상기 방법은 또한 확인 된 미생물의 하나 이상의 항균제에 대한 MIC를 결정하는 것을 포함한다.
일부 구체 예에서, AST 분석 전에, AST에서 이용하기 위한 샘플의 적절한 희석을 계산하기 위해, 환자 샘플 내 미생물의 농도가 결정된다. 일부 실시 예에서, 농도는 본원에 기재된 동적 희석법을 사용하여 결정된다. 추가의 구체 예에서, 샘플 또는 그 일부는 AST에 앞서 하나 이상의 예비 - 처리 단계, 예를 들어 GEF 및 / 또는 EKC에 적용된다.
사용자 입력(User Input)
기기 사용자는 동작을 위한 기기를 준비하고 처리를 위해 시스템 구성 요소 및 샘플을 준비하기 위해 다양한 입력 기능을 수행 할 수 있다. 예를 들어, 사용자는 생물학적 또는 임상 샘플과 같은 샘플을 얻을 수 있다. 사용자는 시약 카트리지 키트를 포함하는 패키지를 얻을 수도 있다. 패키지에 포함 된 시약 카트리지 키트는 샘플 바이알과 카세트를 더 포함 할 수 있다. 사용자는 생물학적 또는 임상 샘플의 전부 또는 일부를 샘플 바이알에 옮기고 샘플 카트리지와 샘플 병을 기기에 적재 할 수 있다. 사용자는 카세트를 기기에 삽입 할 수도 있다. 사용자는 사용자 인터페이스를 통해 제어기에 주문 정보를 입력 할 수 있다. 다양한 실시 예에서, 상기 기기는 바코드를 스캐닝하거나 카트리지, 카세트 및 / 또는 샘플 바이알에 인코딩 된 정보를 인식하기 위한 하나 이상의 장치를 포함 할 수 있다. 기기는 다양한 정보를 기록하거나 또는 카트리지, 카세트 및 / 또는 샘플 바이알에 인코딩 된 정보를 기반으로 기기 기능을 수행하거나 또는 기기 스스로 기기를 인식할 수 있다. 모든 샘플 준비, 샘플로드 및 주문 입력 단계가 완료된 후 사용자는 기기에 있는 "실행"버튼을 눌러 ID / AST 프로세스를 시작할 수 있다. 다양한 실시 예에 따라, 기기 작동의 개시 이전에 사용자에 의해 완료되어야 하는 사용자 입력 단계는 약 15 분 이내에 사용자에 의해 완료 될 수 있다.
자동화된 샘플 준비(Automated Sample Preparation)
다양한 양태에서, 샘플 로딩 후, 자동화된 샘플 준비 단계가 수행된다. 샘플 준비는 미국 특허 공보 제 2014 / 0038171A1 호에 기재된 방식과 같은 겔 전기 여과 ("GEF")를 사용하여 수행 될 수 있으며, 이는 본원에 참고로 인용된다. 시료의 분액을 기기의 피펫으로 시료 바이알에서 꺼내어 GEF 장치로 옮길 수 있다. 샘플에 존재할 수 있는 미생물 세포로부터 샘플 파편을 분리하기 위해 GEF 단계가 수행된다. GEF 단계 후에, 젤 매트릭스의 표면으로부터 미생물 세포를 제거하기 위해 전기장을 간단히 반전시키고 샘플에 존재하는 미생물 세포를 포함하는 준비된 샘플을 GEF 장치로부터 제거 할 수 있다. 다양한 실시 예에 따라, 상기 기기 및 시스템은 FISH ID에 대한 샘플의 일부분을 준비하기 위해 수행되는 제 1 GEF 단계 및 AST의 샘플의 일부를 준비하기 위해 수행되는 제 2 GEF 단계로 2 개의 개별적인 GEF 단계를 수행하도록 구성 될 수 있다. 다양한 실시 예에 따라 기기에 의해 수행 될 수 있는 다양한 분석을 위해 샘플의 하나 이상의 부분을 준비하기 위해 임의의 수의 GEF 시료 준비 단계가 수행 될 수 있다. 샘플은 다수의 균주, 종 또는 유형의 미생물 (예 : 적어도 2 개, 적어도 3 개, 적어도 4 개 또는 적어도 5 개의 상이한 균주, 종 또는 유형의 미생물)이 존재하는 다균 환자 샘플 일 수 있다. 샘플은 직접 환자 샘플 일 수 있다.
세포 고정화(Cell Immobilization)
GEF에 의한 샘플 준비 후에, 회수 된 샘플은 카세트의 하나 이상의 샘플 채널로 피펫터에 의해 분액된다. 다양한 실시 예에서, EKC는 각 샘플 채널 플로우 셀의 캡쳐 표면상의 셀을 포착하도록 수행된다. 다른 구체 예에서, 세포는 세포와 접촉 한 후에 상 변화 될 수 있는 배지(예 : 한천)에서 삼차원 공간에 그들을 담아 고정함으로써 고정화된다. 고정화는 캡쳐 단계를 처음 수행하거나 수행하지 않고 수행 할 수 있다. 일부 구체 예에서, 고정화는 고정된 미생물 주위에 미세 환경을 생성하고, 그 특성은 확인 및 / 또는 감수성(susceptibility) 시험 기간 동안 인접한 미생물에 의해 영향을 받지 않는다. 일부 예에서, 상기 방법은 샘플 채널의 검출 표면 상에 미생물을 보유하고, 이에 의해 보유 된 미생물을 생성시키고, 이어서 (예를 들어, 한천을 포함하는 것과 같은) 겔 배지를 샘플 채널에 도입하는 단계를 포함하는데, 샘플 채널에 도입 된 이후에 보유 된 미생물; 미생물이 보유되어있는 동일한 위치의 샘플 채널에 보유 된 미생물을 고정화하여, 고정화된 미생물의 자손이 고정 된 미생물과의 위치에서 경시 적으로 남아있는 고정화된 미생물을 제조하는 단계; 미생물의 성장을 허용하기 위해 고정 된 미생물을 일정 시간 동안 배양하는 단계를 포함한다.
FISH 동정(FISH Identification)
미생물 동정은 FISH 분석에서 하나 이상의(예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17 , 18, 19, 20 또는 그 이상의) 종-특이적 탐침 및 / 또는 하나 이상의 범용 미생물 탐침(범용 박테리아 및 / 또는 범용 구체 예에서, 특정 미생물 종(예를 들어, "표적")의 리보솜 RNA에 하이브리드 화하도록 각각 설계된 17 종의 상이한 종 특이 적 프로브 및 "보편적 인"FISH 프로브가 시약 카트리지에 포함 된 시약 및 혼합물은 17 개의 샘플 채널에 도입되었다. 세포 투과성 및 세척 단계는 시약 카트리지에 포함 된 시약을 사용하여 기기에 의해 수행 될 수 있으며, 이어서 표적 미생물 종의 세포가 샘플에 존재하면 종 특이 적 프로브가 표적 미생물 종에 부착하는 혼성화 단계가 수행되고, 샘플 채널에 캡쳐된다. 범용 프로브는 존재하는 미생물 핵산 분자와 혼성화한다. 다양한 구체 예에서, 미생물 핵산에 대한 프로브 이동 및 하이브리드화는 기기에 의한 플로우 셀에서의 전기장의인가에 의해 가속 될 수 있다. 연결되지 않은(예: 하이브리드화 되지 않은(non-hybridized)) 프로브는 하이브리드 화 후 기기에 의해 채널 밖으로 헹구어 질 수 있다.
각각의 FISH 프로브는 적절한 여기 파장으로 조사 될 때 피크 방출 파장에서 빛을 방출하는 부착 된 형광 단을 갖는다. 예를 들어, 종 특이 적 프로브는 ATTO-532와 같은 제 1 레이저를 사용하여 조명에 의해 조사 될 때 553 nm와 같은 제 1 방출 파장에서 방출 검출을 제공하는 ATTO-532와 같은 제 1 형광 단으로 라벨링 될 수 있다. 녹색 레이저는 520 nm와 같은 제 1 여기 파장을 제공한다. 일부 실시 양태에서, 종 - 특이 적 프로브 각각은 동일한 형광 물질로 표지되고, 다른 구체 예에서는 종 - 특이 적 프로브 중 하나 이상은 종 특이 적 프로브 중 적어도 하나와 상이한 형광 물질로 표지된다.
"범용"FISH 프로브는 복수의 미생물 종에 혼성화되도록 구성되고, 일부 실시 예에서는 적색 레이저와 같은 제 2 레이저와 함께 사용된다. 보편적 인 탐침의 사용은 1 종 이상의 박테리아 또는 곰팡이 종을 포함하는 다균 시험편의 동정을 용이하게 하고 17 종의 특정 프로브 중 하나에 의해 표시되지 않은 박테리아의 존재를 관찰하는 데 도움이 될 수 있다. 다양한 실시 예에서, 범용 프로브에 사용되는 형광체는 제 2 여기 파장을 제공하는 적색 레이저를 사용하여 조명에 의해 조사 될 때 637 nm와 같은 637 nm와 같은 제 2 방출 파장에서 방출 검출을 제공하는 ATTO-647과 같은 제 2 형광체(예를 들어, 종 특이 적 프로브 중 하나 이상을 표지하는데 사용 된 것과 다른 형광 물질)를 포함 할 수 있다.
종-특이적 및 / 또는 범용 (universal) 프로브를 표지하기 위한 추가의 형광 단이 사용될 수 있다. 예시적인 형광 단은 Alexa Fluor® 형광 단, 쿠마린, FITC, 로다 민, 로다 민 그린, 로다 민 레드, 테트라 메틸 로다 민 (TRITC), Cy®3, Cy®7 및 Cy®5 형광체, Pacific Green ™ , Pacific Blue ™, Pacific Orange ™, Texas Red® 형광체, PlatinumBright ™ 형광체 (Leica), 6-FAM, TAMRA, JOE (6- 카르복시 -4 ', 5'- 디클로로 -2', 7 (TEX), 헥사 클로로 플루 오레 신 (HEX), ROX (carboxy-X-rhodamine), IRDyes® 형광체 (Li-Cor) 및 ATTO ™ 형광체가 포함된다. 당업자는 본원에 기재된 시스템 및 방법에서 이용되는 종-특이 적 및 / 또는 보편적 탐침을 표지하기 위한 적합한 형광 발색단 및 형광체의 조합을 선택할 수 있다.
다양한 실시 예에서, 시스템은 제어기에 의한 이미지 처리 동안 암시 야 영상 및 형광 영상화 모두를 사용하여 동시 - 표상화된 영상물만을 고려함으로써 분석으로부터 시료 파편을 배제 할 수 있다. AD-1 기기를 사용하여 획득 된 FISH ID 이미지 데이터의 예가 도 66에 도시되어있다.
다양한 실시 양태에서, 보편적인 대조 염색제(예를 들어, DNA 삽입 염료)를 제조 된 샘플과 조합하여 샘플 채널로 도입시킬 수 있다. 예시적인 보편적인 대조 염색제은 아 크리 딘 오렌지, 요오드화 프로피 듐 및 4'6- 디아미노 -2- 페닐 인돌 (DAPI)을 포함 하나 이에 한정되지 않는다. 모든 플로우 셀의 이미지 데이터는 샘플에 존재하는 유기체의 총 수를 결정하고 표적 미생물 및 다균 샘플의 존재에 대한 샘플의 평가를 허용하는 데 사용될 수 있다.
다양한 실시 예에 따라, 상기 기기는 샘플 로딩 후 약 1 시간 후에 FISH ID 결과를 보고 할 수 있다. ID 결과는 시약 카트리지에 포함 된 항균 시약 패널에서 AST를 수행하기 위한 적절한 항생제 또는 항진균제의 선택을 결정하기 위해 시스템에서 사용할 수 있다.
환자로부터의 직접적인 샘플 (혈액, 소변, 호흡 샘플과 같은)은 일반적으로 시험 절차를 방해하는 살아있는 세포, 죽은 세포 및 잔해를 포함하는 복잡한 환경이다. 환자 샘플에서 미생물을 확인하기 위한 일반적인 방법은 종종 모호한 정량 결과를 초래한다. 잠재적인 오류는 유기체 오분류, 잘못된 동정 및 살아있는 유기체의 부적절한 정량화를 포함한다. 문제는 과거에 비정량적인 실험자 판단에 의해 해결되었다. 이 기기 시스템은 다중 채널 및 프로브의 데이터를 자동 해석하여 동적 정확성을 높이고 미생물 정량화의 오류를 줄이는 동적 희석 절차를 사용한다. 일단 샘플의 미생물이 확인되면 샘플의 분할에 대해 항생제 감수성 검사를 실시하여 개체를 감염시키는 미생물 (또는 여러 미생물의 균주)의 특정 균주를 치료하는 최선의 치료 과정을 결정할 수 있다.
항균 감수성 검사 (AST)
다양한 구체 예에서, 상기 기기는 GEF (또는 그의 서브 샘플)에 의해 제조 된 샘플을 성장 배지와 결합시킬 수 있고 약 1 시간 FISH ID 분석 동안 샘플을 성장 전 단계로 처리 할 수 있다. 기기가 수행하는 사전 성장 단계는 AST 이전에 미생물 성장률을 정상화 할 수 있다. 기기는 보편적 인 핵산 결합 염색을 사용하여 세포 정량화 공정을 수행 (및 / 또는 반복)함으로써 예비 성장 된 시료에서 유기체 농도를 결정할 수 있다. 사전 성장 단계 후 샘플의 유기체 농도에 기초하여, 기기는 AST에 적합한 세포 농도를 제공하기 위해 샘플을 희석 할 수 있다. 자동화된 샘플 준비 및 EKC에 이어, 기기는 각 시험 항균제 (기기로 준비된 항생제)의 단일 농도를 포함하는 성장 매개체 (예 : MHA)를 추가하여 시료 채널을 분리 할 수 있다. 기기는 외장, 카세트 및 시약 카트리지의 시약을 온도 제어 할 수 있다. 다양한 실시 예에서, 상이한 온도가 시간에 따라 및 / 또는 기기의 특정 구성 요소에 대해 기기에 의해 제공 될 수 있다. 예를 들어, 기기는 MHA 및 항생제 시약을 포함하는 카세트의 서브 조립체에 대해 별도의 온도 제어 및 온도 프로파일 (예 : 분석 및 / 또는 기기 작동의 시간 경과에 따른 온도 변화)을 제공 할 수 있다. 샘플 채널로의 배양 배지의 분배에 따라, 기기는 AST 분석 기간, 예를 들어 약 5 ~ 30 분마다 (예를 들어 약 5 분마다, 10 분마다, 또는 약 5 ~ 10 분마다) 각 샘플 채널 플로우 셀에서 미생물 세포의 현미경 사진을 주기적으로 수집 할 수 있다. 약 1.5 시간, 2 시간, 3 시간, 4 시간, 4.5 시간, 5 시간, 6 시간, 7 시간 또는 그 이상과 같은 약 1 내지 8 시간 동안 (예를 들어, 15 분, 20 분, 25 분 또는 30 분) 8 시간, 미생물 성장의 저속 기록을 만든다. 시간 = 0 시간, 1.5 시간, 3 시간 및 4.5 시간에서 감수성 및 저항성 미생물에 대한 현미경 사진 이미지의 예가 도 67에 도시되어있다.
AST 프로세스 동안, 특정 종의 분할율(division rate) 및 성장하는 클론의 광 강도와 같은 다양한 미생물 클론 특성이 측정되고 분석에 사용된다. 예를 들어, 시간에 따른 개별 클론 성장 속도의 정량적 측정은 항균 효능을 결정하는 데 사용될 수 있습니다. 온보드 소프트웨어 알고리즘은 표적 유기체의 정량적 식별을 결정하고, 최소 저해 농도 값을 도출하고, "S", "I"또는 "R" (감수성, 중간 또는 내성) 또는 "S"또는 "NS""(감수성이 있거나 민감하지 않음)와 같은 범주 해석의 적절한 해석 및 보고를 위한 적절한 전문가 규칙을 적용한다. 다양한 실시 예에 따르면, AST는 약 5 시간 내에 수행 될 수 있다. S, I 및 R 성장 해석을 나타내는 미생물 성장 곡선의 예가 도 68에 도시되어있다.
일부 실시 양태에서, 시스템은 하나 이상의 항균제(예를 들어, 표 5의 항균제 중 하나 이상, 또는 본원에 제공된 다른 항균제에 민감한)에 대한 감수성, 중간 또는 내성 및 / 또는 하나 이상의 항균제를 위한 MIC를 보고한다. 다른 실시 양태에서, 메티 실린 내성 황색 포도상 구균 (MRSA), 메티 실린 내성 포도상 구균 (MRS), 반코마이신 내성 S. aureus (VRSA), 반코마이신 내성 포도상 구균 (VRE), 높은 수준의 아미노 글리코 사이드 내성 (HLAR) 및 macrolide-lincosamide-streptogramin B 내성 (MLSb)이 포함된다.
동적 희석법(Dynamic Dilution)
일반적으로, 감수성 시험은 표준 농도의 생존 가능한 접종 물을 설정된 농도의 항균제와 조합 할 것을 요구한다. 따라서, 미지의 박테리아 샘플에 대한 항균제 감수성 테스트를 수행하기 위해서는 샘플 접종 물의 시작 농도가 결정되어야 한다. 일반적으로 접종 농도는 완료까지 1-2 일이 걸리는 배양 또는 McFarland 탁도 분석을 사용하여 결정된다. 전통적인 배양 분석보다 빠르지 만 샘플에서 박테리아 세포 농도의 탁도 측정은 매우 정확하지 않다. 이 방법은 콜로니 형성 단위의 근사치만을 제공하기 때문이다. 이 근사값은 빛이 현탁액에 존재하는 세포의 바이오 매스의 지시자 역할을 하는 미생물 현탁액을 통과 할 때 얻어지는 산란량으로부터 계산된다.
혼탁도 분석은 박테리아 배양물을 통한 빛의 산란에 의존하기 때문에, 이 분석법은 존재하는 박테리아 세포의 수를 직접 카운트하지도 않고, 배양으로 달성되는 바와 같이 직접 콜로니 형성 단위를 측정하지도 않는다. 미국 약전 (Pharmacopeia)에 따르면 탁도 분석을 통해 얻은 세포의 추정 측정치는 시험이 진행되는 동안 대조군으로 확인되어야 한다. 그런 다음 확인 값을 사용하여 후속 감수성 테스트에 사용 된 접종 물의 크기를 보정한다. 이러한 기술은 중증 환자의 치료 과정을 식별하는 데 걸리는 시간을 연장시킨다. 그리고 빛의 산란은 박테리아의 질량을 추정하는 총체적인 접근법이기 때문에 전형적인 McFarland 기반 테스트는 비선형 적이다. 비선형성은 부피 측정 탁도가 죽은 세포와 살아있는 입자를 구별 할 수 없기 때문에 발생하는 오차에 부분적으로 기인한다. 그러나 과학자들은 일반적으로 그러한 테스트 데이터를 선형으로 취급한다. 또한 McFarland 기반 테스트는 단일 환자 샘플에서 여러 종 또는 미생물 균주를 구별하지 않는다. 균혈증과 패혈증의 정확한 진단과 치료에 있어 환자 혈액 샘플의 미생물 집단의 적절한 동정이 중요 할 수 있다.
공지 된 카운팅 절차의 이러한 단점 및 다른 단점은 개시된 기기 시스템에 의해 극복된다. 이 시스템은 1) 생존 가능한 미생물 세포의 상대적 존재량을 정량화하고 2) 그 정량화를 사용하여 항생제 테스트를 시작하는 데 필요한 희석 인자를 동적으로 계산하여 환자 시료의 세균 농도를 정확하고 정확하게 정량화하도록 설계되었다. 환자를 감염시키는 특정 미생물 (예를 들어, 박테리아)에 대한 치료를 맞추는 데 필요한 시간을 줄이는 개시된 시스템의 하나의 유익한 측면은 다른 항균제 감수성 테스트 시스템보다 더 큰 샘플 농도 입력 범위를 수용 할 수 있는 능력이다.
공정은 가장 농축 된 양의 시험편으로부터 시작하여, 하나 이상의 분액(aliquot)이 필요에 따라 희석된다. 이 공정은 목표 범위의 하단 끝에서 희석 된 시료를 농축하는 것보다 목표 범위로 시료를 더 희석하는 것이 더 쉽기 때문에 이 보수적 접근법을 따른다. 목적은 공개 된 기기 / 장치 내에서 가능한 가장 집중된 샘플을 얻는 것이다. 샘플의 미생물 농도를 검출하고 그것을 목표 농도로 희석하는 것은 다소 천천히 그리고 다소 부정확하지만 공지 된 방법에 의해 수행 될 수 있다. 그러나 매 실행 중에 주어진 유기체의 정확한 감수성 시험을 위한 적절한 범위를 얻기 위해 미생물(예: 박테리아) 접종물(inoculum)을 동적으로 희석하는 것이 개시된 시스템의 독특한 측면이다.
특정 선행 기술 기기는 샘플 희석을 목표로 하는 특정의 미리 결정된 농도 범위 (선험적으로 설정 됨)를 갖는다. 예를 들어, 하나의 알려진 시스템은 플레이트 상에 콜로니를 성장시키고, 그것을 골라 내고, 세균 분리 물의 배양 물을 확립하기 위해 튜브에 콜로니를 위치시키는 것을 필요로 한다. 시료를 희석제와 혼합하여 현탁액을 얻은 다음 분광 광도계에 넣고 농도 판독 값을 얻는다. 그러한 시스템의 경우 실험실 기술자는 존재하는 콜로니 형성 단위의 수를 추정하기 위해 0.46-0.54 (약 300 CFU (x106 / mL) 미만)와 같은 좁은 범위의 밀도 판독 값을 얻어야 한다 (예 : McFarland 규모). 죽은 세균 세포와 살아있는 세균 세포가 모두 존재할 경우, 샘플의 최종 희석은 항균 감도 시험을 위해 샘플에 존재하는 생존 세포의 수를 정확히 반영하지 않는다. 더욱이, 샘플의 초기 분취량(aliquot)과 추정 된 박테리아 세포 농도의 출력 사이의 시간 량에 따라, 박테리아 집단은 1 회 이상 2 배가 될 수 있으며, 따라서 농도 계산에 추가 오차를 유발할 수 있다.
대조적으로, 개시된 시스템을 사용하여 세포 성장 판독 치를 감수성 보고서 및 / 또는 MIC 수치로 번역하는 것은 예비 배양 단계 없이 가능하다. 개시된 시스템은 시야 당 10-130 개의 클론 범위 (예를 들어, 시야 당 약 10-100, 20-80, 30-60, 10-50, 40-80 또는 50-100 클론) 최적의 박테리아 성장을 달성한다. 특정 예에서, 시야 당 약 20-80 개 (예 : 약 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75 또는 80)의 성장 클론이 목표 범위이다. 너무 적은 클론이 존재한다면, 통계적으로 더 많은 수의 들판이 박테리아를 탐지하기 위해 관찰 되어야만 한다. 시야에 너무 많은 미생물 클론이 몰려와 성장 억제를 일으킨다.
단일 미생물 샘플의 경우, AST 평가로 예정된 박테리아 샘플의 이상적인 희석 포인트는 박테리아 접종물의 목표 범위 (예를 들어, 시야 당 클론의 목표 수)의 상한 및 하한의 중점 일 수 있다. 접종 시료가 세균 종 또는 균주의 혼합물을 포함하는 다균성 인 경우, 이상적인 희석점을 얻기 위해 두 경로를 따를 수 있습니다. 하나의 옵션은 두 종(예: 박테리아 종 A 및 B)의 박테리아 수가 접종원의 상한과 하한 사이에 집중되도록 샘플을 희석하는 것이다. 두 번째 옵션은 하나의 박테리아 종(예: 종 A)의 양이 접종원 상한선과 하한선의 중간 점으로 희석되어 박테리아 종 B를 접종원 하한선 아래 지점까지 희석하도록 샘플을 희석하는 것이다. 이러한 상황에서 박테리아 종 B에 대한 항균제 감수성 테스트는 시작되지 않으며 샘플에 존재하는 종 B의 양을 정량하기 위해 배양 또는 2 차 시험이 필요할 것이다.
따라서, 개시된 시스템은 MIC 평가에 필요한 박테리아의 농도를 얻기 위해 임상 실험실에서 통상적으로 사용되는 McFarland- 기재 탁도 방법보다 우수한 공정을 사용한다. 검출 시스템 및 염색 공정은 함께 개시된 시스템의 동적 희석 측면을 구성한다. 당업자는 개시된 동적 희석 방법이 본원에 개시된 것들 이외에 다른 시스템 및 방법(미생물을 검출 또는 측정하기 위한 다른 시스템과 같은)과 함께 사용될 수 있다는 것을 인식 할 것이다.
후술하는 바와 같이, 적어도 일부의 경우, 샘플에 대한 유효 희석 곡선은 비선형 일 수 있다. 따라서, 개시된 시스템은 샘플에 대한 비선형 유효 희석 곡선을 추정하기 위해 환자 샘플의 하나 이상의 서브 샘플 (예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5 또는 그 이상의 서브 샘플)을 사용한다. 추정 된 비선형 희석 곡선은 항균 감도 시험 이전에 시야 당 클론의 목표 수를 달성하기 위해 샘플을 희석하기 위한 표적 희석 인자를 결정하는데 사용된다.
도 102는 표적 희석을 사용하여 샘플을 동적 희석 및 희석을 사용하여 표적 희석 계수를 결정하는 예시적인 방법 (10200)의 흐름도이다. 도 2에 대해 아래에 설명 된 상이한 프로세스 블록들은 도 102 및 도 103에 도시 된 하드웨어 컴포넌트를 사용하여 달성 될 수 있다. 또한, 그러한 방법은 개시된 방법 및 시스템에 사용될 수 있거나, 또는 다른 항균 검출 및 AST 시스템 및 방법과 함께 사용될 수 있다.
따라서, 일부 실시 예에서, 10202에서, 세포 농도가 샘플의 다중 서브 샘플에 대해 결정되며, 여기서 각각의 서브 샘플은 상이한 희석 인자를 사용하여 희석된다. 일부 구체 예에서, 희석 인자는 GEF 후 샘플로부터 0.04, 0.2 및 0.625 (또는 25 배, 5 배 및 1.6 배) 중 하나 이상을 포함한다. 그러나, 추가 또는 상이한 희석 인자 (2 배, 3 배, 10 배 또는 20 배를 포함하지만 이에 한정되지는 않음)가 또한 본원에 개시된 방법에서 사용될 수 있다는 것을 인식 할 것이다. 여러 개의 서브 샘플은 샘플에서 추출하여 나머지 샘플과 별도로 저장할 수 있다. 예를 들어, 기기 피펫터를 사용하여 샘플 바이알에서 서브 시료를 추출하고 카세트의 개별 플로우 셀에 배치 할 수 있다. 일부 구체 예에서, 적어도 3 개의 서브 샘플 (예컨대, 3, 4 또는 5 서브 샘플과 같은)이 동적 희석 공정에서 사용된다. 서브 샘플이 카세트의 플로우 셀에 배치되면 저장 공간과 추정 정확도 사이에 균형이 존재할 수 있다. 더 많은 수의 서브 시료를 사용하면 시료의 유효 비선형 희석 곡선의보다 정확한 모델로 이어질 수 있다. 그러나 더 많은 수의 서브 시료가 카세트에서 더 많은 유동 세포를 차지한다. 경우에 따라 3 ~ 5 개의 서브 샘플 범위가 정확도와 카세트에서 사용 가능한 플로우 셀 사이의 균형을 잘 맞출 수 있다.
각각의 서브 샘플은 별개의 샘플 희석 인자를 사용하여 희석되고, 예를 들어 두 개의 서브 샘플은 동일한 희석 인자를 사용하여 희석되지 않는다. 일부 구체 예에서, 샘플 희석 인자는 가능한 샘플 농도의 범위를 대표하는 희석 된 서브 샘플을 생성하기 위해 미리 선별된다. 일부 구체 예에서, 샘플 세포 농도가 희석 된 서브 샘플에 의해 생성 된 범위 내에 들기 쉽도록 샘플 희석 인자가 선택된다.
서브 샘플이 샘플 희석 인자를 사용하여 희석 된 후에, 각각의 희석 된 서브 샘플의 세포 농도가 결정된다. 세포 농도를 결정하는 단계는 희석 된 서브 샘플에서 세포의 수를 계수하는 단계를 포함 할 수 있다. 특정 비 제한적인 실시 양태에서, 세포 수는 각 서브 샘플을 보편적 핵산 염색(예: 아 크리 딘 오렌지 또는 요오드화 프로피 듐)으로 접촉시키고 세포 수를 계수함으로써 결정된다. 일부 예에서, 세포는 이미지화되고 세포 계수는 이미지로부터 결정된다. 특정 예에서, 서브 샘플의 세포 농도를 결정하는 것은 동 전기 학적 농도를 사용하여 서브 샘플의 염색, 선택적으로 이미징 및 카운트하기 전에 표면(예를 들어, 카세트의 유리 표면)을 향한 서브 샘플의 세포 이동을 생성하는 것을 포함한다. 서브 샘플에 대한 세포 농도는 희석 된 서브 샘플 내의 세포의 수와 희석 된 서브 샘플에서의 유체의 양 사이의 비율 일 수 있다.
서브 샘플의 세포 농도가 결정된 후, 10204에서 서브 샘플 농도 및 관련 희석 인자를 사용하여 비선형 희석 곡선을 근사화한다. 비선형 희석 곡선을 근사화하는 것은 서브 샘플에 대한 희석 테스트 포인트를 생성하는 단계를 포함 할 수 있으며, 각각의 희석 테스트 포인트는 서브 샘플 셀 농도 중 하나 및 서브 샘플을 희석하는데 사용 된 대응 샘플 희석 인자를 포함한다. 희석 테스트 포인트는 2 차원 공간에서의 비선형 유효 희석 곡선상의 포인트를 나타낼 수 있는데, 여기서 희석 인자는 1 차원이고 그 결과 세포 농도는 다른 차원이다.
일부 실시 예에서, 비선형 희석 곡선은 희석 테스트 포인트 사이를 보간함으로써 추정된다. 예를 들어, 희석 곡선은 희석 테스트 포인트 사이에서 다중 선형 보간 및 / 또는 다중 스플라인(spline) 보간을 수행하여 추정 할 수 있다. 비선형 희석 곡선은 곡선의 모델을 생성하여 추정 할 수 있다. 일부 실시 예들에서, 비선형 희석 곡선의 모델은 희석 테스트 포인트들 사이의 다중 보간을 사용하여 생성 될 수 있다.
특정 예에서, 희석 곡선의 모델은 다수의 서브 샘플에 대응하는 다수의 희석 테스트 포인트 사이의 선형 보간을 사용하여 생성된다. 3 개의 서브 샘플을 이용하는 일례에서, 다음의 식을 사용하여 모델을 생성 할 수 있다:
[수학식 ]
Figure pct00009
DT는 샘플에 대한 표적 희석 인자이고, CT는 샘플에 대한 목표 세포 농도이고, C1은 제 1 서브 샘플에 대한 결정된 세포 농도이고, D1은 제 1 희석 테스트 포인트에서 C1과 관련된 제 1 샘플 희석 인자이고, C2 D2는 제 2 희석 테스트 포인트에서 C2와 관련된 제 2 샘플 희석 인자이고, C3는 제 3 서브 샘플에 대한 제 3 결정된 세포 농도이고, D3는 제 3 희석 시험 지점에서 C3와 관련된 제 3 샘플 희석 인자이다. 이 예에서, C1 <C2 <C3이다. 세 가지 희석 테스트 포인트 사이에서 선형 보간법을 사용하는 것을 때때로 "3- 포인트 희석법"이라고 부른다. 이 특정 예가 세 개의 서브 샘플을 사용하므로 세 가지 희석 테스트 포인트를 사용하지만 다른 수의 서브 샘플과 테스트 포인트도 사용할 수 있다.
적어도 하나의 실시 예에서, 비선형 희석 곡선의 모델을 생성하는 단계는 비례 상수를 사용하여 평균 세포 농도를 결정하는 단계를 포함한다. 평균 세포 농도는 각 서브 샘플 세포 농도에 비례 상수를 곱한 해당 샘플 희석 계수를 곱하여 곱을 합산하고 그 합을 서브 샘플의 수로 나눔으로써 결정할 수 있다. 특정 예에서 다음 공식을 사용하여 평균 세포 농도를 결정할 수 있다.
[수학식]
Figure pct00010
Cavg는 평균 세포 농도이고, N은 서브 샘플의 수이고, Ci는 서브 샘플 i에 대한 결정된 세포 농도이고, Di는 서브 샘플 i에 대한 상응하는 샘플 희석 인자이고, X는 1 미만의 값을 갖는 비례 상수이다. 비례 상수로 선택한 값은 비선형 희석 곡선을 정확하게 추정하는 데 중요한 요소가 될 수 있다. 일부 실시 예에서, 비례 상수는 1보다 작고 0.5보다 크거나 같은 값이다. 세포가 2 차원 표면에 포착되는 경우에는 0.75의 비례 상수가 효과적 일 수 있다. 비례 상수 값은 여러 가능한 값을 실험하고 예상 세포 농도를 관찰 된 세포 농도와 비교하여 경험적으로 결정할 수 있다.
10206에서, 비선형 희석 곡선의 근사가 표적 희석 인자를 결정하기 위해 샘플의 표적 세포 농도와 함께 사용된다. 표적 세포 농도는 항균제 감수성 검사 수행에 도움이 되는 샘플의 세포 농도 일 수 있다. 어떤 경우에는 가능한 세포 농도의 범위가 허용된다. 이러한 경우, 표적 세포 농도는 중간 값과 같은 수용 가능한 값의 범위 내에서 선택된 값일 수 있다.
비선형 희석 곡선의 근사가 다중 보간을 사용하여 생성 된 곡선의 모델을 포함하는 실시 예에서, 보간 중의 하나가 표적 희석 인자를 결정하는데 사용될 수 있다. 예를 들어, 표적 희석 인자를 결정하는 단계는, 표적 세포 농도보다 낮은 샘플 세포 농도로 다수의 희석 시험 점 중 첫 번째 표식을 식별하는 단계, 샘플 세포 농도보다 큰 샘플 세포 농도를 갖는 다중 희석 시험 점 중 두 번째 표식을 식별하는 단계, 상기 표적 희석 인자를 결정하기 위해 상기 제 1 및 제 2 확인 된 희석 테스트 포인트 사이의 보간을 이용하는 단계를 더 포함하는 방법을 포함할 수 있다. 다중 보간이 선형 보간 인 경우에, 제 1 및 제 2 식별 된 서브 샘플 간의 보간법을 사용하는 것은 테스트 포인트들 사이의 선형 보간을 사용하는 것을 포함한다. 특정 예에서 다음 공식을 사용하여 표적 희석 계수를 결정할 수 있다.
[수학식 ]
Figure pct00011
이 예시 식에서, DT는 표적 희석 인자이고, CT는 샘플 세포의 목표 세포 농도이고, C1은 첫 번째 확인 된 희석 시험 점의 세포 농도이고, D1은 C1에 대한 상응하는 희석 인자이고, C2는 두 번째로 확인 된 희석 테스트 포인트이며, D2는 C2에 해당하는 희석 계수이다.
표적 세포 농도가 샘플 세포 농도의 최저치보다 낮은 경우, 표적 희석 인자를 결정하는 것은 최저 서브 샘플 세포 농도의 곱과 그것의 상응하는 희석 인자 및 표적 세포 농도 사이의 비율을 사용하는 것을 포함 할 수 있다. 다음 예제 공식은 이러한 비율의 예이다.
[수학식 ]
Figure pct00012
이 예제 공식에서, DT는 표적 희석 인자이고, CT는 샘플의 표적 세포 농도이고, C1은 가장 낮은 샘플 세포 농도이고, D1은 C1에 대한 상응하는 희석 인자이다.
비선형 희석 곡선의 근사가 평균 세포 농도 및 비례 상수를 포함하는 희석 곡선의 모델을 포함하는 구체 예에서, 표적 희석 인자를 결정하는 것은 평균 세포 농도와 표적 세포 농도 사이의 비율을 결정하는 단계, 비례 상수의 역수의 비로 비율을 올리는 것이다. 특정 예에서, 표적 희석 인자를 결정하는 것은 다음 공식을 사용하는 것을 포함한다 :
[수학식 ]
Figure pct00013
DT는 표적 희석 인자, CT는 표적 세포 농도, Cavg는 평균 농도, X는 비례 상수이다.
단계 10208에서, 샘플의 일부는 표적 희석 인자를 사용하여 목표 농도로 희석된다. 경우에 따라 샘플의 일부는 서브 샘플을 추출한 후 남은 샘플의 일부이다. 경우에 따라 남은 시료의 일부만 항균제 감수성 검사를 위해 희석되고 다른 시료는 다른 목적으로 희석되지 않은 상태로 남겨진다.
일부 실시 예에서, 표적 희석 인자가 결정되는 동안 샘플의 세포 집단은 계속 증가 할 수 있다. 이러한 지속적인 세포 성장이 고려되지 않은 경우 표적 희석 인자를 사용하여 샘플을 희석하면 표적 세포 농도와 다른 표적 세포 농도로 희석 된 샘플이 생성 될 수 있다. 일부 구체 예에서, 표적 희석 인자를 결정하는 동안 표적 희석 인자를 조절하여 샘플의 세포 성장을 설명 할 수 있다. 또한, 서브 샘플 세포 농도에서 계수 된 세포의 일부는 비 생존 가능한 세포 일 수 있다. 이러한 비 생존 세포는 비선형 희석 곡선의 추정치의 근사치에 포함될 수 있다. 그러나, 이들 비 생존 세포는 세포 농도의 증가에 기여하지 않을 것이다.
성장 인자는 샘플에서 세포 성장을 설명하기 위해 결정된 표적 희석 인자를 조절하는데 사용될 수 있다. 성장 인자는 또한 예를 들어 확인 된 종과 관련된 비 생존 세포의 비율과 같은 비 생존 세포의 비율을 설명하기 위해 표적 희석 인자를 조정할 수 있다. 미생물 세포 생존 가능성은 일반적으로 미생물의 유형에 관계없이 시료의 건강을 최대화하는 분석법을 개발함으로써 설명된다. 그럼에도 불구하고 일부 표적은 다른 미생물보다 많은 미생물 수의 비율로 더 생존 가능한 성장 클론을 생산할 것이다. 예를 들어, 특정 표적 박테리아는 역동적 인 희석이 일어나는 기간 동안 두 배로 되는 성장률을 가질 수 있다. 그러나 박테리아의 90 %만이 생존 할 수 있다면 박테리아 개체군의 100 % 미만이 실제로 기능적이며 성장 목적으로 나누어집니다. 목적은 이러한 생존 가능한 세포를 플로우 셀 채널에서 성장하는 클론으로 간주하는 것이다. 성장 인자는 여러 번 실행되는 데이터와 대상 그룹 당 많은 격리(예: 성장 인자 당 10, 50, 100 또는 그 이상의 샘플)를 사용하여 결정할 수 있다. 성장 인자는 경험적으로 결정되기 때문에 궁극적으로 분석 자체의 타이밍, 시료 준비 및 희석 과정에서 박테리아의 건강, 개별 표적의 성장률 및 개별 표적의의 성장 효율(성장하지 않는 클론 / 성장하는 클론)의 요소가 된다.
도 103은 성장 인자를 사용하여 샘플에 대한 표적 희석 인자를 결정하는 예시적인 방법 (10300)의 흐름도이다. 10302에서, 샘플 내의 미생물과 관련된 성장 인자가 확인된다. 성장 인자는 미생물의 성장 속도와 생존 할 수 없는 세포의 비율을 모두 설명하는 단일 요인이 될 수 있다.
미생물의 상이한 종은 상이한 성장 인자와 관련 될 수 있다. 표 1은 다양한 미생물 종과 관련된 성장 인자의 예를 나열한다. 샘플에서 미생물과 관련된 성장 인자를 확인하는 것은 샘플에서 미생물의 종을 동정하고 동정 된 종과 관련된 소정의 성장 인자를 선택하는 것을 포함 할 수 있다. 성장 인자는 예를 들어 표적 희석 인자가 결정되는 동안 샘플의 세포 성장을 고려하여 결정된 표적 희석 인자를 조정하는 데 사용된다. 성장 인자는 시험되는 각 미생물 (또는 미생물의 조합)에 대해 실험적으로 결정된다. 몇몇 실시 예에서, 성장 인자는 샘플이 희석액으로 희석되는 다수의 실험으로부터 결정된, 성장하는 클론의 실제 수와 클론의 의도 된 수의 비의 중앙값을 선택함으로써 특정 미생물 또는 미생물의 조합에 대해 결정된다 목표 클론 수를 생산할 것으로 예상된다.
미생물 (FISH ID) 성장 인자
Proteus vulgaris, Proteus mirabilis (PRO) 0.75
Acinetobacter baumannii (ABA) 1
Enterobacter aerogenes, Enterobacter cloacae (ENT) 0.78
Enterococcus faecalis (EFS) 0.86
Enterococcus faecium (EFM) 0.75
Klebsiella oxytoca, Klebsiella pneumoniae (KLE) 0.93
Pseudomonas aeruginosa (PAE) 0.57
Staphylococcus lugdunensis (SLU) 1.21
Staphylococcus aureus (SAU) 1.15
Coagulase negative staphylococcus (CNS) 0.86
Citrobacter freundii, Citrobacter koseri (CIT) 1.11
Serratia marcescens (SMA) 1.3
Escherichia coli (ECO) 0.99
단계 10304에서, 샘플의 적어도 3 개의 서브 샘플이 상이한 샘플 희석 인자를 사용하여 희석된다. 희석 인자는 예시 방법 10200과 관련하여 전술 한 희석 인자와 유사 할 수 있다. 10306에서, 세포 농도는 3 개 이상의 희석 서브 샘플 각각에 대해 결정된다. 본원에 기재된 세포 농도를 결정하기 위한 예시적인 방법 중 임의의 것을 사용하여 희석 된 서브 샘플의 농도를 결정할 수 있다.
단계 10308에서, 적어도 3 개의 결정된 세포 농도 및 3 개 이상의 샘플 희석 인자를 사용하여 비선형 희석 곡선의 모델이 생성된다. 비선형 희석 곡선의 모델을 생성하는데 사용되는 기술은 다중 희석 테스트 포인트 사이의 보간, 비례 상수 등을 사용하여 평균 세포 농도를 결정하는 것과 같은 예시 방법 (10200)과 관련하여 상기 기술 된 기술 중 적어도 일부와 유사 할 수 있다. 일부 실시 예에서, 비선형 희석 곡선의 모델은 성장 인자를 설명하도록 조정될 수 있다. 성장 인자는 미생물의 신원에 기초하여 선택되며, 일부 예에서는 본원에 기술 된 FISH 분석에 의해 결정될 수 있다. 특정 예에서, 비선형 희석 곡선의 모델이 3 개의 희석 테스트 포인트 사이의 선형 보간을 포함하는 경우, 다음의 조정 된 공식을 사용하여 성장 인자를 설명 할 수 있다:
[수학식 ]
Figure pct00014
여기서, G는 성장 인자이고, DT는 표적 희석 인자이고, CT는 목표 세포 농도이고, C1은 제 1 서브 샘플에 대한 제 1 결정된 세포 농도이고, D1은 C1과 관련된 제 1 샘플 희석 인자이고, C2는 제 2 결정된 D2는 C2와 관련된 제 2 샘플 희석 인자이고, C3는 제 3 서브 샘플에 대한 제 3 결정된 세포 농도이고, D3는 C3와 관련된 제 3 샘플 희석 인자이다.
단계 10310에서, 샘플에 대한 비선형 희석 곡선의 모델, 성장 인자 및 표적 세포 농도를 사용하여 샘플 희석 인자가 샘플에 대해 결정된다.
곡선 모델의 근사가 희석 테스트 포인트 사이의 보간을 사용하여 생성되는 실시 예에서, 표적 희석 인자를 결정하는 단계는, 성장인자에 의해 조절될 때, 목표 세포 농도보다 작은 서브 샘플 셀 농도로 제 1 희석 테스트 포인트를 식별하는 단계; 성장인자에 의해 조절될 때, 목표 세포 농도보다 크거나 같은 서브 샘플 세포 농도로 제 2 희석 테스트 포인트를 확인하고, 제 1 및 제 2 확인 희석 테스트 포인트 간의 보간을 사용하여 타겟 희석 인자를 결정하고 성장 인자를 사용하여 타겟 희석 인자를 조정하는 단계를 포함할 수 있다. 특정 예에서 다음 공식을 사용하여 표적 희석 계수를 결정하고 성장 인자를 사용하여 이를 조정할 수 있다.
[수학식 ]
Figure pct00015
G는 성장 인자, DT는 표적 희석 인자, CT는 표적 세포 농도, C1은 첫 번째 확인 희석 시험 지점의 세포 농도, D1은 C1에 대한 상응하는 희석 인자, C2는 세포 D2는 두 번째 확인 된 희석 테스트 포인트의 농도이며, D2는 C2에 대한 해당 희석 계수이다.
표적 세포 농도가 성장 인자에 의해 조정 된 서브 샘플 세포 농도의 최저값보다 작은 경우에, 표적 희석을 결정하는 것은 가장 낮은 서브 샘플 세포 농도의 생성물을 결정하는 것을 포함 할 수 있으며, 희석 인자는 최저 농도 , 그리고 성장 인자. 결정된 생성물과 표적 세포 농도 사이의 비율은 표적 희석 인자로서 사용될 수 있다. 다음 예제 공식은 이러한 비율의 예이다.
[수학식 ]
Figure pct00016
이 예제 공식에서 G는 성장 인자이고, DT는 표적 희석 인자이고, CT는 샘플의 표적 세포 농도이고, C1은 가장 낮은 샘플 세포 농도이며, D1은 C1에 대한 상응하는 희석 인자이다.
희석 곡선의 모델이 비례 상수를 사용하여 결정된 평균 세포 농도를 포함하고, 표적 희석 인자를 결정하고, 성장 인자를 사용하여 이를 조절하는 실시 양태에서, 성장 인자를 사용하여 평균 농도를 조절하는 단계, 조정 된 평균 세포 농도와 표적 세포 농도 사이의 비를 비례 상수의 역수의 비로 상승시키는 단계를 포함한다. 특정 예에서, 표적 희석 인자를 결정하는 것은 다음 공식을 사용하는 것을 포함 한다:
[수학식 ]
Figure pct00017
여기서 G는 성장 인자이고, DT는 표적 희석 인자이고, CT는 샘플 세포의 목표 세포 농도이고, Cavg는 평균 농도이고, X는 비례 상수이다.
본원에 기술 된 예시적인 희석 방법 중 임의의 것에서, 샘플의 희석은 후속하는 항균 감도 시험 중에 유효화 될 수 있다. 예를 들어, 희석 된 샘플의 성장 세포 밀도는 항균 감도 테스트 동안 성장 제어 채널에서 정량화 될 수 있다. 희석 된 시료의 최종 증식 클론 밀도가 허용 범위를 벗어나면 항생제 감수성 테스트를 중단 할 수 있다.
본원에 기술 된 예시적인 희석 방법 중 임의의 것은 시스템 제어기를 포함하는 시스템에 의해 수행 될 수 있다. 시스템 제어기는 프로세서 및 컴퓨터 - 판독 가능 저장 매체를 포함한다. 컴퓨터 판독 가능 저장 매체는 프로세서에 의해 실행될 때, 시스템 제어기가 본 명세서에 기술 된 임의의 희석 방법을 수행하게 하는 명령을 저장할 수 있다. 특정 예에서, 시스템은 기기를 제어하도록 동작 가능한 부착 된 시스템 제어기를 갖는 개시된 기기 (예를 들어,도 1의 기기 (100))를 포함한다.
개시된 시스템의 또 다른 양태는 항생제 감수성 시험 동안 미생물의 형태 변화를 설명 할 수 있는 능력이다. 일부 박테리아는 영양 배지에서 성장하는 동안 항생제 노출의 처음 몇 시간 동안 형태를 변화시킨다. 예를 들어, 일부 Pseudomonas 및 Enteric 박테리아 종은 베타-락탐(beta-lactam) 항생제가 있는 상태에서 처음 몇 시간 동안 길게 늘어나고 섬유화된다. 더 큰 박테리아 세포로의 이러한 형태 변화는 항생제 존재 하에서의 자동화된 현미경 검사 시스템에 의해 인지될 수 있다. 이러한 상황에서 박테리아는 항생제에 대한 반응으로 박테리아가 결국 용해되고 죽을지라도 자동화된 시스템에 의해 내성 항생제로 잘못 분류 될 수 있다. 이는 박테리아 균주가 특정 항균제에 진정으로 저항 하는지를 몇 시간 이내에 결정하도록 설계된 자동화된 신속한 AST 시스템에 대한 과제를 야기한다. 이 문제를 해결하기 위한 표준 과정은 장시간 동안 박테리아를 배양하여 단순히 항생제 감수성 검사의 효율성을 희생시켜 시험 된 항생제의 최소 억제 농도를 결정하는 것이다.
세균 시스템은 표준 성장 배지와 비교하여 감소 된 수준의 영양 성분을 포함하는 혁신적인 배지 배합물을 사용함으로써 이 문제를 해결한다. 이것은 영양 염류 고갈이 일반적으로 박테리아 세포의 성장을 지연 시키므로 그들의 죽음을 촉진시키기 때문에 표준 사고에 대비된다. 예를 들어, Mueller-Hinton agar의 용질 농도를 현저하게 줄이면 진정한 항생제 내성 세균 세포와 감수성 세균 세포를 구별하기 위한 효율적인 테스팅 시스템이 만들어진다. 이 세균 세포는 죽기 전에 일시적인 필라멘트 상을 통과한다. 진정으로 저항하는 박테리아 세포는 그러한 영양 결핍 상태에서 약 4-5 시간까지 계속 성장하는 반면, 감수성이 있는 세균 세포는 짧은 기간의 신장을 거쳐 항생제 노출 1-2 시간 이내에 용해된다.
유사한 맥락에서, 세라 티아와 같은 특정 세균 종은 표준 AST 조건 하에서 지연되거나 느린 성장 패턴을 나타낸다. 마찬가지로, Streptococcus와 같은 까다로운 세균 종은 전형적으로 AST 시스템에서 자라기 위해 혈액 성분을 함유 한 특별한 영양 배지를 필요로 하며 혈액 농축 없이 천천히 성장한다. 적절한 성장 조건이 없다면 이 박테리아는 항생제 감수성 검사가 어렵고 특히 5 시간 이내에 결과를 낼 수 있도록 설계된 자동화 시스템에서 테스트하기가 어렵습니다. 따라서, 표준 배양 조건 하에서 까다로운 또는 지연된 성장 패턴을 나타내는 세균 종에 대한 항생제 감수성 시험을 향상시키기 위한 새로운 배지가 개발되었다. 신규 한 배지 조성은 환자 시료로부터 세균 분리 물에 대한 최소 억제 농도를 확립하는 AST 평가 동안 항생제 및 까다로운 스트렙토 코커스 존재 하에 세라 티아의 성장을 지원하기 위해 혈액을 첨가하지 않고 특정 비율로 펩톤 성분을 조합 하였다. 이 새로운 배양 배지는 우수한 결과를 나타내어 문제가되는 유기체 / 항생제 조합에 대한 신속한 감수성 시험을 통해 억제 농도 및 분류 (SIR) 결과를 최소화했다.
실시예
실시예 1
개시된 시스템은 항균 감수성 시험 (AST)을 개시하기 직전에 신속한 미생물 계수 검정을 수행한다. 이를 위해서는 여러 번의 희석을 통한 보정이 필요하다. FISH를 사용하는 McFarland 기반 테스트는 완료하는 데 너무 많은 시간이 걸린다 (적어도 1 시간 이상). 개시된 박테리아 계수 절차는 미생물을 포함하는 (또는 포함하는 것으로 의심되는) 샘플을 겔 전기 여과 (GEF)에 적용하여 파편을 실질적으로 제거함으로써 시작한다. 그런 다음, 어떤 경우에는, 샘플을 L-DOPA와 혼합하고 마이크로 유체 플로우 셀에 도입한다. 전위 및 폴리-l-라이신으로 코팅 된 플로우 셀 채널 표면이 존재하면, 샘플 박테리아가 챔버 내의 폴리-l-라이신 코팅 된 표면에 부착한다. 따라서, 포획 된 박테리아는 동 역학적 농축 (EKC)을 통해 유동 세포 표면 상에 농축된다. 결합되지 않은 박테리아는 플로우 셀에서 씻어 낸 다음 동적 희석 (위에서 설명한)을 수행한다. 다음으로, 박테리아 샘플을 하나 이상의 투과성 화제, 예컨대 알코올, 효소, 세제 등으로 처리한다. 예를 들어, 작은 분자 크기의 염색제 (예컨대, 요오드화 프로피 디움)이 사용될 때 존재하는 박테리아를 투과성 화시키기 위해 80 % 에탄올이 채널로 피펫팅된다. 보다 큰 크기의 투과성 분자가 이용되면 (예를 들어, 특정 그람 양성균과 함께), 박테리아는 에탄올 및 하나 이상의 효소와 같은 투과성 화제의 조합으로 처리 될 수 있다. 투과성 처리 과정은 염색제 분자가 위에서 논의 된 것처럼 시각화를 위해 세균 세포로 들어갈 수 있게 한다. 폴리-리신 표면에 포획 된 박테리아를 세척 할 때 박테리아 DNA에 삽입하는 핵산 염색 (예 : 1μg / mL propidium iodide, PI)이 사용된다. 이어서, 샘플을 적절한 여기 파장 (예를 들어, PI에 대해 535 nm)으로 조사하고 결합 염료를 형광색으로 한다 (예를 들어, PI의 경우, 최대 발광 617 nm에서 녹색). 개시된 시스템의 자동화된 검출 구성 요소는 염색 된 박테리아 세포로부터 방출 된 신호를 정량화한다. 이는 시야의 암시야 이미지를 오버레이하여 이루어 지므로 염색 된 세포의 녹색 형광 레이저 이미지에 존재하지 않는 세포 및 잔해를 시각화 할 수 있다. 신호 차단은 백그라운드에서 5 배 신호이며, 이로 인해 잔해로부터 방출되는 자동 형광을 제거한다.
채널 내의 박테리아의 농도는 샘플에서 박테리아의 총량을 확립하기 위해 역산된다. 계산 된 양이 예를 들어 60 개의 클론 인 경우 희석시 박테리아를 정확하게 관찰하는 데 필요한 표적 범위의 중간에 샘플이 있다. 계산 된 양이 너무 많으면 (예: 3,000 클론), 샘플을 40-80 클론 범위로 희석해야 한다. 목표는 모든 실행에 대해 각 채널에서 이 목표 범위의 중간에 도달하는 것이다.
도 83을 참조하면, Klebsiella pneumoniae의 출력 범위에 대한 보정 곡선의 비교는 단순한 단일 점 선형 곡선 근사 대 동적 희석을 위한 박테리아를 정량하기 위해 다중 점, 비선형 곡선을 사용하는 효과를 강조한다. 완전한 순차 희석에서, 상대 농도 1 (x- 축에 기재 됨)을 갖는 샘플은 이론적으로 1:10 희석에 이어 0.1의 상대 농도를 가져야하며, 이것은 직선으로 플로팅 될 것이다. 그러나 여러 희석점을 실제로 측정하고 그 농도를 플롯하면 Klebsiella pneumoniae (다른 대부분의 미생물과 마찬가지로)가 낮은 농도 범위에서 선형 진행을 따르지 않는 것이 분명해진다. 오히려 곡선은 왼쪽으로 편향되어 있으며, 단일점 선형 희석 곡선에서 예측되는 것보다 훨씬 많은 박테리아가 실제로 존재한다. 그럼에도 불구하고 이 비선형 곡선("Klebsiella pneumoniae"으로 표시)은 희석 및 농도 계산이 발생하는 기간 동안 환자 샘플의 박테리아가 복제된다는 사실을 고려하지 않았기 때문에 완전히 정확하지는 않다. 따라서, 개시된 시스템은 샘플 희석 단계 이전에 획득된 식별 정보를 경험적으로 적용하여 농도 상수에 성장 상수를 인자한다. Klebsiella pneumoniae의 차이점은 성장 상수가 없는 "Klebsiella pneumoniae"농도 곡선이 실제 농도 곡선("20% 성장인자(with 20 % growth factor)의 Klebsiella pneumoniae"로 표시됨)보다 낮다는 것이다.
도 84A-D는 시험 된 4 가지 유형의 박테리아(Acinetobacter baumannii-도 84A, 녹농균 -도 84B, 클렙시 엘라 뉴 모니 아 -도 84C 및 세라 티아 마르세 센스 -도 84D) 각각에 특이적인 성장 인자를 이용하는 3 점 희석 곡선과 비교 된 단순 선형 희석 곡선의 샘플 희석 효과를 비교하는 정상 확률 플롯의 형태로 이 원리를 추가로 입증한다. 각 플롯은 대략 1500 회의 실험을 요약한다. 3 점 곡선은 희석이 단지 x 축을 따라 곡선을 왼쪽으로 이동 시켰지만 곡선의 하단을 식별할 수 없게 변경하지 않음을 보여준다. 대조적으로, 단순 선형 곡선은 희석이 곡선을 왼쪽으로 이동시킬 뿐만 아니라 꼬리를 형성하는 낮은 범위를 아래로 유도하여 부정확 한 농도 추정을 유도 함을 보여준다.
요약하면, 미생물 (예 : 세균) 성장 속도를 설명하지 못하는 선형 희석 곡선 또는 곡선은 환자 샘플의 실제 농도를 과소보고 할 것이다. 이 오류는 사용자가 항균성 감도 테스트로 예정된 환자 샘플의 일부분을 희석하여 희석시켜 결과가 너무 집중되어 해당 평가 단계에서 사용되는 결과를 초래합니다. 시료가 충분히 희석되지 않기 때문에, 너무 많은 콜로니가 시험 챔버 (플로우 셀)에 존재할 것이며 항균제 존재 하에서 그 콜로니의 성장을 저해 할 것이다. 이는 주어진 항균제가 문제가되는 박테리아의 성장에 미치는 진정한 영향을 모호하게 만듭니다. 궁극적으로 적절한 치료제는 잘못된 AST 데이터의 결과로 환자 치료를 위해 선택되지 않을 수 있습니다. 대조적으로, 본원에 기술 된 동적 희석을 이용하면, 샘플에서 세포 수를보다 정확하게 추정 할 수 있고, 따라서 플로우 셀에서 표적 수의 콜로니를 얻기위한 샘플의보다 정확한 희석 (예를 들어, 필드 당 약 20-80 콜로니 보기). 따라서, 개시된 시스템은 당 업계에 공지 된 전통적인 방법에 비해 AST 프로세스의 정밀도 및 정확성을 향상시킨다.
실시예 2
일련의 성장 배지를 배양 배지에서 한천 농도를 0.94 %로 유지하면서 표준 뮐러 - 힌튼 영양소의 0.5 %, 0.25 % 및 0.125 % 강도(3g 쇠고기 주입, 17.5g 카제인 가수 분해물, 1.5g 전분, 최종 생성물은 25 ° C에서 중성으로 조정 됨)로 계산하였다. 박테리아 세포 성장에 대한이 영양 결핍 배지의 효과는 베타-락탐 항생제 패널의 존재하에 50 종 이상의 슈도모나스 균주를 사용하여 평가되었다. 상기 한 바와 같이 자동화된 현미경을 사용하여 세포를 영상화 하였다. 예시적인 결과가도 85A~F에 도시되어있다.
Pseudomonas 균주가 피페라실린 / 타조박탐 항생제 배합물의 존재하에 영양 결핍 배지에서 재배되는 도 85A-B는 뮬러 - 힌튼 영양소가 약 87 % 감소 된 배지에서 항균제 조합이 박테리아 성장에 미치는 효과를 도 85C 에 도시 된 표준 뮐러 - 힌튼 배지에서의 성장과 비교하여 나타낸다. 도 85A-C는 세균 암 위상 강도 대 시간의 로그를 도시하고, 이는 배양 물의 세포 질량 측정에 비례한다. 또한, 85D-F는 85A-C에서 박테리아 세포 분열 속도로 표현된 패널에서 제시된 데이터의 정량적 표현이다.
도 85C의 옅은 색의 선은 일반적으로 대부분의 시간 경과에 걸쳐 직선이며, 꼬리 부분에 약간의 변화가 있는 정상적인 박테리아 복제를 나타냅니다. 도 85A-B 의 밝은 색의 선은 고도의 가변성으로 만곡되어 있어 복제가 손상되었음을 나타낸다. 또한, 도 85D-F에서, 2 시간, 3 시간 및 3.5 시간에서의 박테리아 성장이 도식적으로 묘사된다. 고갈 된 영양 배지에서 성장한 박테리아 세포 (도 85D-E)는 2 시간 내지 3.5 시간의 노출 사이에 항생제 존재 하에서 큰 변동성을 나타내지 만 영양이 풍부한 배지에서 복제하는 세포는 거의 가변성을 나타내지 않았다 (도 85F). 따라서, 비록 해당 박테리아가 실제로 피 페라 실린 / 타조 박탐에 감수성이 있음에도 불구하고, 해당 기간 동안 표준 배지에서 재배 된 섬유 세포에서 분명한 항생제 효과가 나타나지 않았다. 이와는 대조적으로, 영양 결핍 배지에서 성장한 동일한 균주의 박테리아 세포는 극적으로 다른 복제 패턴을 나타내어 3.5 시간 이내에 피페라실린 / 타조박탐의 존재하에 실질적으로 손상된 성장을 보였다. 결과는이 영양 결핍 배지가 테스트 한 박테리아 세포의 균주에 따라 약 12 시간 이내(예: 1 ~ 4 시간)에 균체 내 항생제에 민감한 박테리아 세포를 항균제 감수성 세균 세포와 구별하는데 매우 효과적이라는 것을 보여준다. 이 영양소 결핍 배지를 사용하면 섬유계 박테리아의 항균제 감수성을 신속하고 정확하게 측정하고 공개 된 시스템을 통해 MIC 값을 평가할 수 있다.
실시예 3
느린 성장 및/또는 까다로운 박테리아에 대한 시험에서의 문제점을 해결하기 위해, 뮐러 - 힌튼 한천에서 펩톤 생성물의 칵테일로 새로운 배지를 제조 하였다. 이 새로운 배지는 아래의 표 2와 같이 혈액 성분이 필요 없이 특정 영양소 농도를 증가 시켰다.
표 2 펩톤 중간 배합 촉진
1% Phytone Tryptose CAMHB
Combine: 110 g Cation Adjusted Mueller-Hinton Broth dehydrated culture media
50 g Tryptose
50 g Phytone
5L 18 MΩ water
Heat: Heat, then boil 1 min, remove from heat
Autoclave: 121°C for 45 minutes
1% Phytone Tryptose MHA
Combine: 375 mL 1% Phytone Tryptose Cation Adjusted Mueller-Hinton Broth (CAMHB)
3.5401 g Ultrapure agar
Weigh: Record weight
Autoclave: 121°C for 45 minutes
Re-weigh: Add back volume of water needed to replace weight differential if vapor loss occurs during sterilization
새로운 항생제를 다양한 항생제의 존재 하에 세라티아 또는 스트렙토코커스 각각 50 종 이상으로 평가 하였다. Serratia isolates는 piperacillin / tazobactam, Aztreonam, Cefepime 및 Ceftazidime으로 시험 하였다. Streptococcus pneumoniae의 경우 항생제와 함께 Cefrtiaxone, Erythromycin, Levofloxacin, Penicillin의 성장 반응을 시험 하였다. 이 새로운 매개체가 있음에도 불구하고 공개 된 시스템은 Serratia의 감수성 증가 패턴을 신속하고 정확하게 사용자에게 알려주지 만 박테리아가 전형적으로 지연되거나 느리게 성장하지는 않는다. Fastidious Streptococcus 균주는 혈액 성분을 추가하지 않은 채로 새로운 배지에서 건강한 성장을 보였으며, 공개 된 시스템으로 빠르게 평가되었다. 따라서, 사용자 정의 된 Phytone 트립토오스 Mueller-Hinton Agar와 개시된 시스템 기술의 조합은 세라티아 및 스트렙토코커스 종에 대해 유효한 다양한 항생제의 최소 저해 농도를 신속하게 얻는 수단을 제공한다. 이 맞춤식 미디어 접근법은 다른 까다로운 미생물 (Neisseria gonorrhoeae, Bordatella pertussis, Haemohilus influenzae, Campylobacter spp. 또는 Helicobacter spp.를 포함하되 이에 국한되지 않음)의 정확한 감수성 테스트를 도와야 한다.
실시예 4
모델 개발
본 발명은 신속하고 대규모로 다중화된 자동 단일 세포 현미경 시스템을 사용하여 환자 샘플에서 미지 미생물, 특히 미생물 혼합물에 대한 형광 확인의 개선을 제공한다. 전통적인 현미경 검사는 현미경을 볼 때 미생물 샘플의 주관적인 인간 평가에 의존한다. 현미경 학자는 모양, 크기 등으로 볼 수 있는 시야의 물체를 평가하여 미생물을 확인한다. 초보 현미경 관찰자는 -수많은 미생물을 관찰한 후-특정 미생물의 특성을 인식 할 수 있도록 훈련 된 눈은 가진 경험 많은 과학자보다 정확도가 떨어지는 경향이 있다. 마찬가지로, 개시된 기기 시스템과 같은 자동 단일 세포 현미경 시스템의 정확성은 주어진 미생물의 특징을 인식하는 시스템의 기능을 켠다. 그러한 시스템에서 정확한 동정은 노련한 인간 현미경 검사자가 얻은 동일한 유형의 경험을 반영하기 위해 시스템을 적절히 훈련해야 한다. 적절하게 훈련 된 자동 현미경 검사 시스템을 사용하는 한 가지 이점은 짧은 시간 내에 여러 시료의 미생물을 정확하게 동정할 수 있는 효율성이다.
FISH를 통한 미지 미생물의 자동화된 동정을 위해, 하나의 단점은 불리한 신호 대 잡음비에 대한 가능성이다. 상당한 양의 세포 외 소음이 샘플에 존재할 수 있으며 이는 샘플의 자동 판독 중에 미생물의 정확한 탐지를 혼동시킬 수 있다. 본원에 개시된 다양한 실시 양태에서, 이 문제는 보편적 인 프로브를 대조군으로 사용하고 동일한 분석에서 하나 이상의 타겟 프로브를 사용하여 해결된다. 대조군과 표적 탐침은 서로 다른 파장의 여기 후에 단일 미생물에 위치 할 수 있는 다른 검출 가능한 표지로 표지 될 수 있다. 따라서, 예를 들어 2 색 기기에서, 범용 제어 프로브는 대상이 미생물 (예를 들어, 박테리아 또는 진균)임을 나타내며, 제 2 컬러 프로브는 미생물의 종을 동정할 것이다. 제 3의 컬러 프로브 (3 층 시스템)는 물체의 시스템 식별을 가능하게 하며, 예를 들어, 물체를 박테리아, 그 카테고리 및 종으로 동정한다. 표지 된 FISH 프로브는 표적 생물에서 rRNA 서열을 인식하고 결합하는 천연 및 합성 유래 프로브를 포함하여 다양한 방법으로 미생물을 인식하도록 설계 될 수 있다. 일부 미생물 확인 시험은 시판 중이지만 각 시험마다 내부 통제를 사용하지 않으므로 부정확 한 수준이 높아진다. 대조적으로, 본 명세서에 개시된 혁신적인 동정 프로세스 및 시스템의 실시 예는 각각의 개인 동정 테스트를 위한 내부 제어를 제공한다.
생물학적 기초 미생물 동정 검정의 대부분은 모든 경우는 아니지만, 어느 정도까지 변이가 존재한다. 예를 들어, 박테리아 종, 박테리아 균주 및 주어진 검출 시스템의 구성 요소 사이에서 변이가 발생할 수 있다. 탐지 시스템 내에서 각 프로브 채널은 신호 변동을 나타낼 수 있습니다. 시스템 변동에 기여하는 다양한 잡음, 시약의 변화, 온도 변화로 인한 변화 등이 있을 수 있다. 따라서, 예를 들어, 단일 세균 집단은 검출기기의 각 프로브 채널 내에서 변이 및 잡음을 나타낼 것이다. 그러한 프로브로부터 견고한 신호 검출을 보장하고, 얼마나 많은 물체가 시야에 존재 하는지를 정량화 한 다음 문제의 프로브가 실제로 표적 rRNA 서열에 결합하는 신뢰를 결정하는 것이 중요하다. 다양한 실시 예에서, 본 명세서에 개시된 동정 프로세스는 미생물 오인 확인에 기여할 수 있는 소스의 복잡한 혼합을 고려한다. 따라서, 개시된 시스템은 미생물 동정 프로세스 동안 신호 및 잡음의 다중 소스의 확률론적 기대 모델을 이용한다. 이 접근법 1)은 비특이적 인 프로브 상호 작용으로 인해 신호를 방출하는 아티팩트가 아니라 2) 알려진 미지와 미지의 미생물을 구별하는 것이다.
그렇게하기 위해, 개시된 프로세스 및 시스템은 주어진 프로브 채널로부터 발생할 수 있는 가변성 소스의 환경을 설명하는 방법을 결정한다. 이러한 변수를 인식하고 설명하면 이 변형을 여러 확률 적 기대 모델에 통합하기 위해 여기에서 공개한 혁신적 동정 프로세스를 훈련 중에 계속 정제 할 수 있다. 개시된 시스템은 특정 레벨의 미생물 동정 파라미터를 시스템에 알려주기 위해 예를 들어 신호, 잡음 (예: 배경) 및 누화 (종-특정종의 프로브를 비표적종에 결합) 데이터 포인트를 결합한다. 자신. 관측치가 최적의 적합성을 생성 할 수 있도록 기대치가 모델에 구성된다. 많은 쿼리에 대한 기대치를 충족시키는 것은 자동 시스템이 인간 학습과 동등한 것이다. 따라서, 확률론적 기대 모델은 동정 분석 동안 발생하는 복수의 이벤트에 대한 확률 점수를 할당하기 위한 통일 된 프레임 워크를 제공한다.
관련 이벤트를 질의 할 때, 개시된 시스템은 베이즈 식기술(Bayesian techniques)을 사용하여 훈련 동안 획득 된 사전 지식 및 (적용 가능한 경우) 이전 샘플 실행에 기초하여 수신 된 각각의 응답에 가중 화된 확률을 할당한다. 본질적으로, 시스템은 각각의 타겟 프로브에 대해 잡음 및 누화가 어떻게 생겼는지를 학습하고 이 지식을 크게 활용하여 각각의 타겟 프로브에 대한 시그널 신호 패턴을 식별한다. 시스템에 의한 의사 결정을 위한 관련 정보 비트의 조합은 신호, 누화 및 잡음을 구별한다. 뚜렷한 표적 신호가 없더라도, 예를 들어 분석 패널에서 표적 프로브에 의해 나타내지 않는 미생물의 존재를 나타내는 데이터를 생성 할 수 있다. 인간의 기술자는 대조적으로 긍정적 인 표적 탐침 신호를 확인하는 방향으로 편향되지만 부정적인 결과로 간주 될 수 있는 정보를 동화 할 수 없으므로 이를 인식하지 못할 가능성이 높다. 결과는 기존의 동정 프로세스로는 불가능했던 민감도와 특이성이 모두 높다.
본 발명의 방법 및 시스템은 관련 없는 데이터 소스 (잡음 등)를 파싱하는 것보다 신호를 생성하는데 더 많은 신뢰를 둔다. 따라서, 동정 프로세스는 잡음이 재현 가능하게 측정 될 수 있고 우수한 성능 결과를 산출하기 때문에 잡음 결합 신호뿐만 아니라 구조 잡음(예를 들어, 누화(crosstalk))을 전향적으로 모델링한다. 본 발명의 동정 프로세스는 의사 결정에 대한 집적 접근법을 사용한다. 이 의사 결정 방법론은 주어진 모집단의 관측 수가 증가함에 따라 대상의 중요한 특징(예: 평균, 분산 등)을 정량화하기 위한 유한 점에 접근한다는 개념에 동의한다. 시스템, 프로브, 시약 등의 스냅샷이 캡쳐되면 이러한 모든 구성 요소가 상호 작용하여 신호 생성을 기반으로 강력한 확률 적 기대 모델에 의해 인식되고 캡쳐되어야 하는 전체 변동성을 형성한다. 이것은 부분적으로 시스템의 조명 및 검출 절차를 미세 조정하고 신호의 기대치를 맞추어서 응집 기대치의 시스템 성능에 대한 루프를 폐쇄함으로써 성취된다. 따라서 시간이 지남에 따라 반복적으로 관찰함으로써 시스템은 프로브 성능 예측을 가능하게 한다. 다시 말해, 많은 수의 관측 후에 전체 시스템의 가변성이 유한하게 된다. 확률 모델에서 이러한 매개 변수가 알려지고 설명되면 동정 프로세스가 정확 해지고 100 %에 접근한다.
트레이닝 동안, 기기 시스템은 박테리아 및 곰팡이 프로브의 표준 패널과 같은 참조 패널에서 미생물의 정규 분포를 만든다. 정보를 제공하는 분포 패턴은 패널에 표시된 각 표적 유기체에 특유한 지문처럼 작용한다. 모델 기대치에 맞지 않는 환자 샘플 실행 중에 대상이 형광색으로 나타나면 시스템은 그 대상물이 이상치 인 것으로 판단한다. 그렇게 함으로써 시스템과 운영자는 어떤 실험이 효과가 있었고 어떤 실험이 효과가 없었는지 알 수 있다. 예를 들어, 동정 시스템의 목표가 95 %의 정확도라면, 현미경 전문가는 프로브 패턴을 관찰하여 동정 시스템이 작동하는지 여부를 판단 할 수 있어야 한다. 프로브가 희미하거나 특이하지 않은 경우, 현미경 전문가는 기대 모델에 따라 95 % 정확도 임계 값이 충족되는지 여부를 알 수 있다. 위에서 언급했듯이, 훈련 된 시스템은 참조 패널에 표시된 미생물에 맞지 않는 신호 패턴을 인식 할 수 있지만 단순한 잡음이 아니다. Acridine 오렌지 제어 채널에서 보편적인 프로브, 암시야 이미지 및 형광 표현에 의해 생성 된 신호의 조합을 사용하여 시스템은 샘플의 오프 패널 미생물의 존재를 감지 할 수 있다. 그 정보는 임상의에게 추가 샘플로부터 환자 샘플을 테스트하여 외부 생물체를 확인하도록 지시 할 수 있다.
본 발명의 확률론적 기대 모델을 개발하기 위해 베이지안 분석이 시스템 정확성 및 성능 레벨을 설정하는 데 사용되었다. 따라서 전체 시스템 성능은 정상 분산 및 시스템 구성 요소를 고려하여 95 % 정확도 수준에 도달했다. 특히, 베이지안 솔루션은 고정 된 경계(데이터)가 주어진 매개 변수 값에 관한 확률에 대한 설명이다. 베이지안 추론(Bayesian reasoning)은 정리에서 포착 된 바로 그 증거에 비추어 사실이 될 수 있는 가능성을 평가한다.
p(A|B)=p(B|A) p(A)/p(B)
이 방정식은 증거 B가 존재하는 경우에 이벤트 A를 관측 할 확률을 계산하는 주어진 B ( "p (A | B"))의 확률을 제공한다. Bayes 정리의 적용은, 예를 들면 미생물 동정 맥락, 실험실 테스트에서 미생물이 제대로 확인 될 가능성은 직관적인 인식에 의존하는 것과 달리 식별 계산에 올바른 데이터를 입력하는 것으로 변하도록 향한다. 베이지안 이론에 따르면 이 방법론은 기존의 이전 신념 이러한 기존의 신념은 추후 결정을 위한 기초로 사용되는 "사후"신념을 공식화하기 위한 새로운 정보로 업데이트된다.
이 접근법을 사용하여, 기준 데이터 세트에 대한 훈련은 신호 기반 확률 기대 모델에 의해 달성 된 아티팩트 검출(버블, 다균 샘플 등)을 가능하게 한다. 마찬가지로 이 모델은 단일 시료에서 여러 미생물을 정확하게 검출 할 수 있다. 모델에 포함 된 것은 참조 패널에 있는 각 유기체의 기대와 샘플에서 미지의 미생물 발현을 동정할 수 있는 기능입니다. 따라서, 확률론적 기대 모델은 환자 샘플에서 미지의 유기체의 표현에 대한 기대에 기초하고 있으며, 그들의 신호를 잡음과 구별 할 수 있다. 이 프로세스는 전반적인 시스템 성능(프로브 선택 등을 통해)이 최적화되도록 실험 설계에 대한 피드백으로 확률 모델링을 통합한다. 모델의 주요 측면은 노이즈가 아닌 신호를 기반으로 셀 수를 잘 예측하여 관계를 만드는 것이다. 이것은 특히 샘플에서 박테리아의 비율이 알려지지 않은 경우, 여러 박테리아를 혼합하지 않으려 할 때 특히 중요하다. 따라서, 본 발명의 양상에 따른 박테리아의 정확한 동정은 모델에 의한 발달, 아티팩트 판별 및 모델에 의한 수행에 좌우된다.
모델 평가(Model Evaluation)
특정 실시 양태에서, 개시된 FISH 동정 알고리즘은 주어진 미지 미생물 유형이 그 미생물의 특징인 예측 가능한, 알려진 특징 또는 파라미터에 기초하여 동정 될 수 있는 큰 기준 데이터 세트의 개발로 시작된다. 도 93A에 도시 된 바와 같이, 초기 데이터 세트는 공지 된 박테리아가 첨가 된 혈액 샘플에 적용된 17 개의 박테리아 프로브 유동 세포 및 아크리딘 오렌지(AO) 대조군 플로우 셀로 구성된 실험 분석에서 확립되었다. 이 표준 샘플을 표준 방식으로 처리하고 암실, 녹색 형광(표적 미생물) 및 적색 형광(박테리아 및 곰팡이 보편) 조명 조건을 사용하여 자동 FISH 분석을 수행했다. 사이트 당 3 개의 이미지가 포착되었고 플로우 셀당 10 ~ 24 개의 사이트가 포착되었다. 이미지는 플로우 셀당 객체 당 타겟 / 보편적 인 프로브 공간에서 시그널 오버 배경으로 정의 된 진정한 표현을 확인하기 위해 처리되었다. 기포와 같은 큰 찌꺼기가 식별되고 암시 야 이미지 기능을 사용하여 미적분에서 삭제되었다. 관심 객체는 3 가지 영상 모드 모두에서 검출되었지만, 동일 위치에 있는(예를 들어, 공간적으로 동시에 발생하는) 객체 만이 참된 관심 대상(즉, 태그 미생물)으로 유지되었다. 도 94는 x- 축상의 타겟 프로브 검출 및 y- 축상의 범용 미생물 프로브를 플로팅하는 신호 방출의 분포를 그래픽으로 도시한다.
샘플을 포함하는 유동 세포는 표적 미생물 세포 이외에 항상 다양한 환경 물질로 채워진다. 예를 들어, 샘플에는 생물학적 파편 (예 : 파열 된 세포, 부분 세포막 등) 및 인공물 (예 : 거품, 기기 카세트 불순물)을 포함하는 오염 물질이 포함될 수 있다. 샘플 파편 및 / 또는 인공물은 분석 과정에서 고려되지 않는 한 정량화를 왜곡시키는 백그라운드 노이즈를 생성 할 수 있다. 이 샘플 파편 및 / 또는 인공물은 형광 표식 프로브에 결합 된 표적 미생물 세포에서 방출 된 신호와 경쟁하기 때문에 "진짜"표적의 이미지를 잔해 및 아티팩트와 구별하기가 어렵다. 다른 경우 (관련 기기의 구조에 따라 다름), 표적 대상 세포는 시야에 비해 신호 대 잡음(signal-to-noise) 변동성이 증가하는 "밝기가 부족한"상태이다. 또한, 표적 프로브 간의 교차-하이브리드화(cross-hybridization)와 같은 유동 세포 혼선이 발생할 수 있다. 이러한 확인 문제를 혼란스럽게 하기 위해 미지의 생물체는 표적 생물체와 공유되는 서열의 중복으로 인해 FISH 프로브에 의해 형광 표식 될 수 있으며 이러한 미생물은 실험에 사용 된 참조 패널에 표시되지 않을 수 있다. 마지막으로, 미생물(들)이 매우 낮은 농도(예를 들어, 시야 당 10 개 미만의 클론)로만 샘플 내에 존재한다면, 관심있는 유기체의 확실한 검출을 달성하는 것이 어려울 수 있다.
내부적으로 스파이크 된 혈액 병을 사용하여 표지 된 박테리아 및 진균의 신호 매개 확률론적 기대 모델을 구축하는데 사용 된 참조 샘플을 생성하였다. 초기 모델 교육은 일반적으로 이러한 참조 샘플을 기반으로 한다. 일단 훈련 된 모델이 수립되면, 환자 샘플로부터 얻어진 표현 데이터는 훈련 실행으로부터 이전 관찰 ("선행(priors)")에 추가 될 수 있다. 다양한 혈액 배양 또는 저장 시스템에서 얻은 여러 박테리아 균주의 다양성을 모델링한다. 예를 들어, 전세계의 의료 시설은 환자 혈액 배양을 위해 다양한 혈액 병 배열을 사용하며, 각각은 본 발명의 동정 알고리즘 프로세스에서 사용되는 박테리아 특성에 영향을 미칠 수 있는 (또는 그렇지 않을 수도 있는) 약간 상이한 성질을 가질 수 있다. 이 "병유형 변동성"은 표현 데이터 분포에 영향을 줄 수 있으므로 주어진 모델에 적합하다. 초기 모델 개발 후 모델에 이 가변성의 원천을 추가하면 환자 샘플링 조건을 고려하여 분명 해지는 표현의 변화에 모델을 적용 할 수 있다. 다시 말해, 신호 매개 확률론적 발현 모델은 정확한 확률을 보장하기 위해 사전을 수정할 수 있는 베이지안 정보를 포함하도록 사후에 업데이트 될 수 있다. 본질적으로 알고리즘은 사람이 보는 것처럼 현미경을 통해 보이는 것을 전달하는 교육 시스템을 생성하기 위해 기기가 인간 학습 프로세스를 모방하는 것을 허용한다. 그 결과 오류율은 시간이 지남에 따라 감소하고 이전에 언급 한 것처럼 응집성 결정 이론의 특징 인 환자 샘플링 데이터에 의해 강화된 큰 참조 집단의 데이터로 인해 어느 시점에서 안정화된다.
따라서, 공정은 전형적으로 분석에 제공되는 기준 샘플에서 표적 미생물 및 / 또는 프로브의 "정상"또는 기저 발현을 정량화하는 것으로 시작한다. 분석 프로세스의 이 측면은 후속 샘플 관측 평가에 사용할 모델을 생성한다. "정상적인"또는베이스 라인 모델이 생성 된 후, 미생물 동정 / 동정 분석의 정확성을 저해 할 소음을 설명하기 위해 프로브의 누화 표현이 정량화된다. 그러한 누화 관련 잡음은 오프 - 타겟 "잡음"및 배경 / 프로세스 "잡음"을 포함 하나 이에 한정되지 않는 다수의 소스로부터 발생할 수 있다. 탐침의 누화 발현의 정량과 함께 표적 유기체의 "정상적인"발현의 정량화는 샘플의 다균 발현 해석에 대한 일반화를 허용한다. 개시된 시스템과 같은 신속하고 자동 단일 세포 동정 시스템에서, 환자 샘플로부터의 미생물의 동정은 분석 용 개시된 장치에 분취량이 적재되면 약 1 시간 내에 완료 될 수 있다. 도 93A의 예시적인 엔테로박터 분포 패널은 적절한 시스템 트레이닝 및 적절하게 특이적인 프로브의 사용으로, 공개 된 시스템이 환자 샘플에서 엔테로박터 박테리아를 동정하기 위한 표현 "지문"으로서 행동하는 확률 밀도 함수(PDF)를 만들 수 있음을 입증한다. 따라서, 공개 된 시스템이 그러한 분포를 만날 때마다, 그것은 환자 샘플에서 엔테로박터의 존재를 확인할 것이다. 이것은 혼합된 집단 (다균) 시료에서 미생물을 확인할 때 특히 중요하다.
일반적인 방법 단계:
1. 시험 샘플을 얻는다.
2. 바이알에 샘플의 분액을 도입.
3. 샘플에 하나 이상의 미생물이 존재하는지 확인하기에 충분한 시간 동안 품어 낸다.
4. 분취 액을 플로우 셀에 옮긴다.
5. 표지 된 범용 대조군 프로브와 하나 이상의 라벨이 부착 된 타겟 프로브 및 아크리딘 오렌지 대조군 착색을 도입.
6. 하나 이상의 미생물의 여러 시야의 이미지를 캡쳐.
7. 이미지화된 미생물의 특성을 확인하기 위해 형태 동역학 분석을 수행한다.
8. FISH 동정 알고리즘 과정을 사용하여 미생물을 확인하기 위해 확률 모델에 분석 데이터를 적용.
특히, 상기 방법은:
형태학 및 기타 분석을 통해 동정된 이미지화된 객체 당 특징은 베이지안 프레임워크(즉, 신호, 노이즈 및 누화 모델)를 통해 처리되어 각 미세 유체 채널에 대한 사후 분포를 얻는다.
- 사후 분포는 KDE(Kernel Density Estimator)를 통과하고 통합되어 마이크로 유체 채널 당 이벤트의 "우도 (likelihood)"를 얻는다. 그리고
- 하나 이상의 오프 패널 미생물의 유무를 결정하기 위해 패널 오프 감지 로직이 호출된다.
도 93B는 동정 알고리즘에 대한 예시적인 방법의 흐름도이다. 9310에 도시 된 바와 같이, 플로우 셀에서 동일한 점의 3 개의 상이한 이미지가 상이한 광원을 사용하여 포착된다. 이미지(9312)는 암 필드 이미지이며, 이미지(9314, 9316)는 상이한 파장의 광원을 사용하는 2 개의 상이한 형광 이미지이다. 따라서, 이미지 획득은 적어도 3 개의 조명 모드로 발생한다. 일 실시 예에서, 상이한 레이저 다이오드가 형광 신호를 생성하는데 사용될 수 있는 반면, 암 필드 이미지는 광대역 LED를 사용하여 생성 될 수 있다. 이미지는 이미지 프로세싱 스택 (9320)에 입력되며, 이미지 프로세싱 스택 (9320)은 이미지 내의 복수의 객체에 대한 특징을 추출한다. 예시적인 피처는 형상 특징, 강도, 방향, 형광 채널 매칭 등을 포함한다. 이미지 처리 스택(9320)은 플로우 셀 내의 모든 오브젝트에 대해 발견 된 피처의 각각을 설명하는 오브젝트/피처 매트릭스 테이블(9330)을 생성한다. 발견 된 특징에 기초하여, 일부 객체는 모듈 (9340)에서 알려진 잡음, 파편 등으로 필터링 될 수 있다.
나머지 오브젝트들/피처들은 일반적으로 9350으로 도시 된 다수의 모델들과 병렬로 비교된다. 다중 모델들 (9350)은 암 필드 및 형광 이미징 파장들의 각각에 대한 신호, 잡음 및 혼선 정보를 고려한다. 모델(9350)은 이하에 기술 된 바와 같이 생성되며, 공지 된 미생물의 과거 관측에 기초 할 수 있다. 이 모델은 알려진 미생물에 기인 한 특징에 대한 기대치와 관련이 있으며, 많은 세포 집단의 관찰을 통해 발생하는 가변성을 고려한 통계 모델을 나타낸다. 이러한 관찰은 모델을 훈련 시키는데 사용되어 셀 동정 동안 모델로부터 확률이 결정될 수 있다. 신호 정보는 이미지화된 대상에 부착된 프로브의 빛의 강도와 관련된다. 소음 정보는 예를 들어 파편과 같은 샘플 내의 비-핵산 성분에 검출 가능하게 표지된 프로브 또는 핵산 염료의 결합으로 인해 배경 신호로 정의 될 수 있다. 소음은 또한 시야 내의 배경 신호(예: 검출 가능하게 표지 된 프로브를 포함하지만 생물학적 샘플이 없는 시야의 형광)를 포함한다. 누화 신호는 다른 채널에 있는 다른 생물체의 존재가 어떻게 확인되는 유기체에 영향을 미치는지에 관한 것이다. 누화는 비특이적 프로브 바인딩과 연관 될 수 있으며 모델링되는 반복 가능한 신호이다. 보다 구체적으로, 누화는 검출 가능하게 표지된 종특이적 프로브의 비표적 미생물에 대한 하이브리드화 (비특이적 결합 또는 비특이적 하이브리드화라고도 함)를 포함한다. 누화는 종특이적 프로브가 표적 미생물과 비교적 밀접한 관련이 있는 미생물과 같이 비 표적 미생물에 대해 비특이적으로 또는 보다 낮은 엄격성 (예를 들어,보다 낮은 Tm)으로 하이브리드화할 때 발생할 수 있다. 특정 비제한적인 예로서, 대장균 종특이적 프로브는 또한 Citrobacter spp와 같은 관련된 미생물에보다 적게 하이브리드화 될 수 있다.
모델들 (9350)은 동정된 각각의 객체에 대한 신호 (Si), 잡음 (Ni) 및 누화 (Ci)에 대한 확률 분포를 계산하는 타겟 존재 모듈(9360)에 병렬로 결합된다. 또한, 모듈(9360)은 각각의 신호, 잡음 및 누화 모델을 만족시키기 위한 임계 값을 만족하는 객체의 양을 결정한다. 모듈(9360)이 신호 및 누화의 확률이 낮다고 판정하면, 관심 대상에 대한 동정이 성공하지 못하고 제어가 모듈(9370)로 전달되어 모듈(9370)이 오프 패널 존재를 결정한다. 외부 패널 존재 모듈은 핵산 염색 신호(예 : 아크릴 오렌지 컨트롤 9372)를 수신하고 패널에 없는 생물체가 존재하는지 여부를 결정할 수 있다. 모듈(9360)에서 타겟이 동정되면, 오프 - 패널 존재는 여전히 모듈(9380)에서 결정될 수 있고, 이는 또한 아카레인 오렌지 컨트롤(9372)을 수신한다. 모듈(9380)의 출력은 동정된 타겟 플러스 오프-패널 존재 정보 또는 더 이상의 오프 - 패널 정보가 제공되지 않으면 목표로 한다.
따라서, 이미지 획득은 단일 셀에 대한 다중 형광 모드 및 암 필드 모드를 포함하는 적어도 3 개의 조명 모드에 대해 발생한다. 비특이적인 핵산 염색(예: 아크리딘 오렌지) 이미지와 같은 추가 컨트롤을 사용할 수 있다. 암 필드 이미징 및/또는 범용 프로브의 이미징과 같은 다른 광학 제어 이미징을 사용하여 타겟 프로브를 이미징하는 것은 여기에 설명된 동정 프로세스에서 셀당 레벨에서 사용할 수 있다. 동일한 시야에서 여러 조명 모드로 셀 특정 컨트롤을 하고 신호, 잡음 및 누화에 대해 동일한 해상도와 모델링을 통해 셀을 최적으로 동정할 수 있을 뿐 아니라 셀이 존재뿐만 아니라 셀이 부존재 함을 확실하게 결론 내릴 수 있다. 예를 들어, 하나의 채널은 특정 미생물 (예 : 대장균)에 대해 양성으로 판정 될 수 있지만 높은 확실성으로 다른 미생물이 존재하지 않는다고 결정될 수 있다. 이러한 방식으로, 표적 정보 및 비표적 정보(예: 잡음 및 누화)가 모두 결합되어 미생물 확인에 도움이 되는 긍정적 인 정보를 제공한다. 신호, 누화 및 잡음의 개별 확률이 결합되어 적절한 식별 확률을 최대화한다. 베이지안 분석을 사용하는 확률론적 모델을 사용하는 다양한 실시 예의 양태는 각각의 프로브에 대한 표현 당 가능성 (likelihood)의 결정이다. 이 과정은 다음 공식에 따라 프로브 당 몇 가지 사후 품질 평가를 지시한다.
[수학식 ]
Lｉ8P(Mｉ|{FG, FR})
FISH 동정 알고리즘 프로세스는 기대를 구축하기 위한 상당히 견고한 방법을 사용한다. 박테리아 특유의 형태 학적 특징과 같은 다양한 특성을 이용하여 미생물을 동정 할 수 있다. 측정된 특성 변수가 반드시 직교일 필요는 없으므로 완전한 베이지안 배합이 필요하다. 추가 데이터 포인트가 미생물 차별을 개선하는 경우, 평가는 1 ~ 2 차원 더 증가 될 수 있다. 모집단 기반 메트릭에는 플로우 셀당 최소 클론 수가 더 높아야 한다는 요구 사항이 있다. 일 실시 예에서, 검출의 전체 최소 한계는 플로우 셀당 12 셀이다. 다른 구체 예에서, 50 < 카운트 <150 의 임계치를 설정한 실험이 방법에서 사용되었다.
채널 내 "다균 집단"(예를 들어, 둘 이상의 상이한 미생물을 포함하는 샘플)은 환자 샘플에서 미생물 개체를 확인하는 혼란 인자 일 수 있다. 공정 및 / 또는 유동체 인공물은 플로우 셀 내에서 서브 집단으로 이어질 수 있으며, 이는 오프 패널 생물체가 추가적인 표현 집단을 생성 할 수 있음을 의미한다. 사후 PDF 추정은 여러 서브 집단 (Gaussian Mixture Models 등이 사용됨)을 탐지 할 수 있게 한다. 정의에 따라 가우스 혼합 모델은 분석과 관련된 모든 데이터 요소가 미지의 매개 변수가 있는 유한 개수의 가우스 분포를 혼합하여 생성되는 것으로 가정하는 확률 통계 모델이다. 즉, 가우스 혼합 모델은 입력 데이터에 가장 잘 맞는 모델을 사용하여 밀도 추정에 대한 반 매개 변수 방식이다. 다양한 가우시안 혼합 모델에 대한 다양한 추정이 다른 추정 전략과 일치하도록 만들어 질 수 있다. Gaussian Mixture Model 객체는 Gaussian 모델의 혼합과 모델 파라미터 결정을 위해 EM (Expectation-Maximization) 또는 Maximum Likelihood Estimation 알고리즘을 구현할 수 있다. 또한 다 변수 모델에 대한 신뢰 타원을 그릴 수 있고 베이지안 정보 기준을 계산하여 데이터의 클러스터 수를 평가할 수 있다. Gaussian Mixture Model은 훈련 세트로부터 얻은 이미지에서 발견 된 기준에 기반하여 데이터 세트의 확률 밀도 함수를 찾기 위해 훈련 데이터 세트로부터 학습한다. 다양한 기술들이 기준 데이터 세트를 편집하기 위해 이용 될 수 있다. 예를 들어, 각각의 디스크립터의 평균 및 표준 편차는 큰 샘플링 모집단으로부터 얻어 질 수 있고, 디스크립터가 가우스 분포에 의해 근사화된다고 가정한다. 이 경우, 디스크립터가 평균의 3 표준 편차보다 낮은 샘플 시야의 객체는 거부된다. 따라서, 이 방법은 각 샘플에 가우시안 혼합 모델(Gaussian Mixture Models) "예측"방법을 사용하여 주로 속한 가우시안의 클래스를 할당 할 수 있다. 가우시안 혼합 모델에는 다른 클래스의 공분산을 제한하기 위해 다양한 옵션이 있다. 이 클래스 접근법은 가우스 혼합 모델 분포의 매개 변수를 보다 쉽게 평가하고, 샘플링을 시작하고, 최대 우도 추정을 가능하게 한다.
도 93C는 표적 미생물을 동정하는 방법의 흐름도이다. 처리 블록 9385에서, 상이한 이미지의 광을 사용하여 대상의 카메라를 사용하여 다수의 이미지가 캡쳐 링된다. 서로 다른 양상은 서로 다른 파장의 빛을 포함 할 수 있다. 프로세스 블록 9387에서, 동정된 객체들의 특징들이 결정될 수 있다. 전형적으로, 도 101의 하드웨어 컴포넌트는 제어 보드(321) 상에 내장 될 수 있는 이러한 결정을 수행하는데 사용된다. 특징은 형상, 방향, 세기 등을 포함 할 수 있다. 프로세스 블록(9389)에서, 잡음 및 / 또는 누화 (cross-talk)를 유발할 수 있다. 이 모델에는 신호 및 잡음 또는 신호 및 누화만 포함될 수 있다. 모델은 메모리(10120 또는 10125)와 같은 메모리에 저장 될 수 있다. 모델은 저장 장치(10140)에 더 저장 될 수 있다. 프로세스 블록(9391)에서, 신호 및 잡음 또는 누화 중 적어도 하나에 대해 확률 분포가 계산된다. 확률 분포는 중앙 처리 유닛(10110) 또는 그래픽 처리 유닛(10115)을 사용하여 계산 될 수 있다. 처리 블록(9393)에서, 계산 된 확률 분포를 사용하여 적어도 하나의 캡쳐 된 다중 화상 내에 미생물이 존재하는지 여부가 결정된다. 이러한 결정은 컴퓨팅 환경 (10100)을 사용하여 행해질 수 있다.
도 94는도 93A에 제시된 발현 데이터를 취하여 시험 된 미생물 각각에 대해 2 변수 PDF 패턴으로 제시한다. 따라서, 각 미생물의 발현은 반복 된 훈련 및 샘플링 실험 후에 개발 된 독특한 패턴을 특징으로 한다. PDF 패턴은 바이어스와 무관하게 공개 된 시스템에 의해 "학습"되었으며 이러한 미생물이 알려지지 않은 환자 샘플에 대해 테스트된 프로브에 어떻게 반응 할 것인지 신뢰할 수 있는 기대치를 제공한다. 개시된 시스템은 알려지지 않은 미생물의 신호 패턴을 패널 프로브의 PDF와 매칭시키는 경험적 임계 값을 적용한다. 도 94에서 명백한 바와 같이, PDF 패턴 중 일부는 y- 축을 따라 매우 비뚤어지고, 나머지는 x- 축을 따라 크게 정렬된다. 각 타원의 데드센터(Dead center)는 짙은 빨간색으로 표시되어 테스트 된 각 미생물에 대한 대부분의 신호 분포 위치를 나타낸다. 엔테로박터 샘플(도 94에서 검은 색 직사각형으로 도시 됨)은 균형 잡힌 로그-정규 분포를 나타낸다.
전술 한 바와 같이, 미생물 동정의 가변성은 샘플 판독 값을 아웃 라이어 상태로 시프트 할 수 있는 프로브, 도구, 시약 등을 포함하는(그러나 이에 한정되는 것은 아님) 다수의 소스로부터 발생할 수 있다. 훈련 데이터 세트를 개발하는 동안 테스트 실행을 수행 할 때 이러한 변동성의 원인이 고려되었다. 테스트 실행은 여러 기기에서 수행되어 정상적인 기기 변동성을 관찰 한다. 정상적인 값을 벗어난 수치는 거부되었다. 초기 기기 교육은 미생물 종 당 약 50 ~ 466 개의 균주로 시작되었다. 두 번째 세트의 훈련은 미생물 종 당 약 25 개의 분리 균을 이용했다. 자동 기기의 훈련은 관찰 된 데이터의 세트가 주어질 때 우도 함수를 최대화하는 값을 통합하는 최대 우도 추정(Maximum Likelihood Estimation, "MLE")을 생성하기 위해 수행되었다. 이 접근법은 통계 모델링에서 현재 값을 관찰 할 확률을 최대화하는 매개 변수가 가장 좋은 매개 변수라는 원칙을 적용한다. 따라서, MLE는 미생물 기준 패널로부터의 관측 자료를 사용하여 형광 태그 박테리아 및 곰팡이의 발현 양상을 평가하기 위한 것이다. 모델링의 기본 목표는 모델의 실행 가능성을 테스트하여 기본 프로세스의 형태를 추론하는 것이다. 모델은 관측 된 데이터의 적합도를 평가함으로써, 즉 모델이 관측 된 데이터에 얼마나 잘 맞는지 평가함으로써 테스트된다. 적합도는 매개 변수 추정에 의해 측정된다. 이는 관측 된 데이터에 가장 잘 맞는 모델의 매개 변수 값을 찾는 것이다.
도 95에 도시 된 바와 같이, 엔테로박터 샘플의 복수의 테스트 실행은 기기 훈련 동안의 분포 패턴을 생성하기 위해 수생된다. 도 93A에서와 같이, 그래프는 y- 축을 따른 범용 프로브 신호 분포에 대한 x- 축상의 타겟 신호 분포를 도시한다. 분홍색 반점은 신호를 모델링하기 위한 미적분에 사용되는 잡음을 나타낸다. MLE 계산은 엔테로박터의 분포 패턴에 대한 예상 된 우도 가능성을 결합하는 것을 포함한다. 기기를 훈련하기 위해 사용 된 총 466 개의 실험의 일부가 결합되어 각 프로브에 대해 MLE를 제작했다. 따라서 엔테로박터의 경우 ENT "모델"(MENT로 표시)이 작성되었다. 이것은 다변량 로그 정규 함수로서 수학적으로 특성화 될 수 있다:
[수학식 ]
f(Ｘ) = exp(N(μ,Σ))
실험 서브 세트로부터의 결합 된 파라미터는 도 95에서 MENT에 대한 데이터 분포의 흑백 이미지 윤곽선으로 플로팅되었다. 베이지안 공식을 이용한 모델 평가가 수행되었다. 샘플링 분포 p (X | θ)는 X가 {Fg, Fr}이고 θ가 매개 변수 모델 M(Training에서 얻은 것)인 관측치(실험 데이터)입니다. 사전 분포 p (θ)는 알 수 없다(가정은 π1 임). 따라서 Enterobacter 훈련 (또는 주어진 실험)의 사후 분포는 다음과 같다.
p(M|{Fg, Fr}) =
Figure pct00018
8 p({Fg,Fr})|M)
여기서 p ({Fg, Fr})는 관련 매개 변수 공간에서 가능한 모든 표현식을 나타내는 정규화 상수이다. 평가 옵션은 최대 사후 확률(Maximum-a-Posteriori, "MAP") 확률 추정 및/또는 한정된 사후 통합을 사용하는 것을 포함 한다: L =
Figure pct00019
PM, 여기서 PM은 확률 밀도 함수 p (M | {Fg , Fr}). 베이지안 경로를 사용함으로써, 본 발명의 프로세스는 환자 샘플 내의 미생물에 의한 프로브 결합이 기준 패널에서 알려진 미생물의 프로브 결합과 일치하는지에 대한 확률을 부여한다. 이 과정을 사용하여 병원체를 확인하는 것은 다중 흐름 채널에서 사후 확률의 조합을 기반으로 한다.
비록 확률 모델이 주어진 트레이닝 처방에 기초하여 "최종화"될 수 있지만, 프로세스는 미생물 동정 데이터를 계속 모니터링하여 사용 된 프로브의 사후 신념을 보강하여 기대치를 지속적으로 평가할 수 있고, 따라서 이러한 기대치를 바탕으로한 동정 모델을 사용할 수 있다. 이는 발생할 수 있는 새로 개발 된 변동성을 해결할 수 있는 새로운 프로브를 시스템에 추가하기 위한 사용자의 확신을 제공한다. 예를 들어, 동정 기대 모델은 혈청 병원균의 90 %를 포함하는 참조 박테리아와 곰팡이 패널을 사용하여 개발되어 훌륭한 지식 기반을 창출했다. 이 모델을 사용하는 현미경 관찰자는 독창적 인 시스템에서 병원성 혈액 미생물의 대부분이 무엇인지 알고 있으며, 이 시스템을 사용하여 이 병원균에 대한 검사가 민감하고 특수하다는 확신을 준다. 그러나 새로운 세균 균주가 발생하면 기대 모델을 개선 할 여지가 있다.
엔테로박터 모델링은 예시적인 경우로서 제시되었지만, 상기 원리는 참고 패널에서 미생물에 대한 임의의 프로브에 동등하게 적용된다. 도 96에는 양호한 매치 케이스가 도시되어 있는데, 모델 피팅은 0.94 (94 %)이다. 도 96의 좌측 상단 패널은 시스템에 의해 검출 된 형광성 미생물 세포를 나타내는 그래픽이다. 이전과 마찬가지로 x 축은 프로브 신호 분포를 나타내고 y 축은 범용 프로브 신호 분포를 나타낸다. 도 96의 우측 패널은 그래픽에 유채색 확률 스케일을 부가하는데, 여기서 0은 엔테로박터가 존재할 확률을 나타내지 않고(타원형 패턴에서 흰 점들로 나타낸 바와 같은 노이즈), 엔테로박터의 존재 확률을 나타내는 1.0을 나타낸다 (타원형 패턴에 검은 점으로 표시). 그래프 기점을 향한 작은 꼬리가 분명하다. 어두운 곳에서는 나타나지 않으므로 신호로 계산되지 않는다. 실험적 평가는 거의 100 % 확률에 근접한 커널 밀도에 대해 셀 신호를 평가했다. 커널 밀도 추정은 유한 데이터 샘플에 비추어 모집단에 대한 추론이 이루어지는 경우에 유용한 기본 데이터 평활화 도구이다. 커널 모델링은 사후 분포를 취하고 최대-사후 관계 추정치를 도출 할 수 있는 PDF를 제공한다. 커널 모델링은 전체 히스토그램을 스캔하고 관측 값은 1로 지정된다. 도 96의 우측 하단 히스토그램에 도시된 바와 같이, PDF는 갭을 메우기 위해 1로 통합되어야 한다. 혁신적인 프로세스는 예를 들어 미가공 입력 데이터와는 대조적으로 사후 분포에 대한 커널 밀도 추정을 사용하기 때문에 시스템 다양한 샘플 집단 밀도를 갖는 실험에 대한 확률을 비교할 수 있다.
대조적으로, 도 97은 덜 견고한 엔테로박터 (Enterobacter) 테스트에 대한 확률 모델을 나타내며, 이는 0.74(74 %)에 맞는 모델을 생성한다. 여기서 데이터 포인트는 예상 분포 패턴의 특정 영역에 상당히 한정되어 있지만 스파스(sparse)이므로 타원에 갭이 존재한다. 이러한 상황에서 확률을 더 적은 셀로 통합하는 것은 어려운 일이다. 부족분을 극복하는데 도움이 되는 커널 밀도 추정을 수행한다. 위에서 언급 한 것처럼 커널 모델링은 사후 PDF 배포와 PDF를 제공하는데, 이것은 주어진 모델에서 데이터 포인트가 희박 할 때 특히 유용하다. 로컬 가우시안 분포를 가정하여 갭을 평가하고 채움으로써 셀을 정규화한다. 이 갭 필링은 본질적으로 모델에 적합해야 하는 데이터를 위한 연속적인 공간의 생성을 허용한다. FISH 동정과 관련하여 부족한 데이터의 근본 원인은 디머 격리(dimmer isolates) 또는 전체 작동 지점의 이동과 같은 문제로 인한 것일 수 있다(높은 배경은 1 차원 등).
도 98에 도시 된 엔테로박터 신호 분포의 컴팩트 모델은 도 95에 도시 된 보다 견고한 모델보다 0.64(64 %) 낮은 점수를 갖는다. 그럼에도 불구하고, 소형 모델은, 예를 들어, 도 97의 "부족한"모델에 존재하는 것보다 더 많은 박테리아 데이터 포인트를 나타냈다. 상기 구별은 그림 97의 확률 모델이 "부족한"모델보다 더 많은 데이터 요소를 가지고 있지만 "양호한"모델에 있는 것처럼 신뢰 영역 내에서 광범위하게 분포되어 있지 않다는 사실에 있다.
마지막으로, 도 99는 0.13(13 %)의 MAP 추정치를 갖는 이러한 유형의 모델링의 "별로 좋지 않은 (non-so-good)"경우의 예를 도시한다. 데이터 점은 0,0 점으로 기울어 져 있으며 타원형 패터닝 공간(elliptical patterning space)의 대부분을 채울만한 점이 충분하지 않았다. 이는 표적 세포가 거의 없거나 전혀 없기 때문일 수 있다. 즉, "신호"의 대부분은 실제로 소음 또는 인공물이다.
실시예 5
다중화된 디지털 현미경의 기본 원리
다중화된 자동 디지털 현미경 검사법은 다 채널 검사 카세트 및 세포 고정을 사용하여 약 1 시간 동안 유기체 동정을 위한 현미경에 기초한 단일 세포 분석 및 임상 샘플로부터 직접 약 5 시간 내에 항균 감수성 검사를 가능하게 한다. 박테리아 및 곰팡이(효모) 세포 별 동정은 형광 가시적 분자결합화(in situ hybridization)을 사용하여 수행되었다. 감수성 보고서는 항균제가 있는 상태에서 거의 실시간으로(약 10 분마다) 개별 살아있는 고정화 미생물 세포를 디지털 현미경으로 관찰하여 생성되었다. 감수성 시험을 위한 항생제는 유기체 확인 결과에 따라 선택되었다. 특정 FISH 분석(비 표적 생물체)에 의해 동정되지 않은 생물체는 검출 되었으나 확인되지 않았으며, 이들 미생물에 대한 감수성 시험은 수행되지 않았다. 이 기술은 미생물 샘플의 분석을 가능하게 하며, 특정 샘플 유형에 대해 통합 된 자동 샘플 준비 과정이 개발되었다. 완전 자동 시스템에 대한 일반적인 프로세스 흐름이 도 86에 도시되어있다.
자동 시료 준비 - GEF (Gel Electro-Filtration)
자동 샘플 제조는 겔 전기 영동 원리에 기초한 겔 전기 여과 공정을 사용하여 수행되었다(도 87). 임상 샘플은 세균 및 효모 세포보다 작은 세공을 함유 한 아가로스겔로 자동 이송되었다. 겔을 박테리아 및 효모 세포가 음전하를 띠도록 하는 동 역학적 완충액에 침지시켰다. 전압이 가해 졌을 때 용해 된 혈액 세포와 잔해와 같은 샘플 불순물이 겔로 전달되었지만 더 큰 박테리아와 효모 세포는 웰에 갇혀있었다. 과정이 끝나면 전압을 잠시 반전시켜 웰 벽에서 박테리아 및 효모 세포를 해방시켰다. 이어서, 정제 된 접종 물을 세포 고정화 및 동정 시험 또는 항균제 감수성 검사를 위해 다 채널 시험 카세트의 개별 유동 세포로 피펫팅 하였다.
전기동력학 농도 (EKC)를 통해 세포 캡쳐
평행 유동 세포 채널을 형성하도록 성형 된 투명한 유리 바닥과 플라스틱 탑으로 구성된 다중 채널 시험 카세트가 사용되었다. 각 플로우 셀 채널의 상부 및 하부 표면은 전극 역할을 하는 전도성 인듐 주석 산화물(ITO)층으로 코팅되었다. 바닥 표면은 캡쳐 표면으로 작용하는 추가적인 양이온성 폴리-L-라이신 층을 갖는다. 접종물을 플로우 셀에 첨가하고 잠깐 동안 저전압으로 인가하여 부유 세균 및 효모 세포를 포획 된 하부 표면으로 이동시켜 확인 또는 항균제 감수성 테스트를 수행 하였다 (도 88).
Fluorescence in situ hybridization (FISH)에 의한 동정
일단 세포가 고정되면, 확인을 위해 FISH 분석을 수행 하였다. 투과성 및 세척 단계 후, 각각의 동정 표적의 rRNA에 결합하도록 설계된 ATTO-532 (녹색) 형광 표지된 DNA 탐침(들)의 칵테일(cocktails)을 상이한 플로우 셀들에 첨가 하였다. 각 칵테일에는 박테리아 또는 효모 세포에 결합 할 수 있는 범용 미생물 프로브인 ATTO-647(적색) 라벨이 포함되어 있다. 범용 미생물 프로브는 모든 박테리아 및 효모 세포의 rRNA와 결합하여 표적 프로브에 의해 인식되지 않더라도 그러한 세포의 존재를 확인한다. 상기 처리는 생물학적 샘플에서 미반형(off-panel) 미생물의 검출을 돕습니다. 각각의 미세 유동 세포는 532 nm, 647 nm 및 암시 야에서 카메라가 있는 낙엽 현미경(epifluorescence microscope)을 사용하여 영상화되었다.
이미지 수집 후, 커스텀 이미지 분석 소프트웨어는 각각의 마이크로 유체 플로우 셀에서 각각의 형광 및 암시 야 오브젝트에 대한 신호 대 백그라운드 비를 측정 하였다. 파편을 제외하기 위해, 범용 탐침 신호와 함께 국부 화된 암시야 대상들만이 분석에 포함되었다. 표적 프로브 신호와 범용 프로브 신호의 공-위치화 (co-localization)는 표적 유기체를 확인 하였다(도 89). 이 소프트웨어는 또한 플로우 셀에 있는 물체의 개수를 정량화하는데 사용될 수 있다. 샘플 중의 플로우 셀당 존재하는 유기체의 총 수를 정량화하기 위해 보편적 인 핵산 염색(예를 들어, 아크리딘 오렌지, 요오드화 프로피듐 또는 DAPI)을 대조군으로서 부가적인 플로우 셀에 첨가한다. 범용 박테리아, 효모 또는 핵산 프로브로 비추어 진 대상에 대한 각 표적 유기체의 상대적인 수의 비교는 비 표적 유기체의 검출 및 다균 샘플의 동정을 위해 허용된다.
항균 감수성 검사 (AST)
동정 검정의 결과는 항균제 감수성 시험을 위한 항생제 선택을 유도한다. 나머지 시료는 약 1 시간 FISH ID 분석 동안 성장 속도를 정상화하기 위한 사전 성장 단계를 거친다. 정제 된 접종 물에서의 유기체의 농도는 본원에서 이전에 기술된 바와 같이 범용 핵산 염색으로 정량화 공정을 반복함으로써 결정되었다. 이러한 결과에 근거하여 추가 유동 세포를 항균제 감수성 테스트를 위한 적절한 표적 범위로 동적 희석시킨 정제된 접종물로 채웠다. 세포 고정 후, Mueller-Hinton 한천의 항균 용액을 플로우 셀에 분배 하였다. 각기 다른 항균제를 별도의 플로우 셀에서 시험하였고 각 항균제의 단일 농도만을 사용했다. 항생제가 없는 Mueller-Hinton 한천으로 구성된 성장 조절 장치가 각 실행에 포함되었다. 어두운 필드 현미경과 카메라는 각 플로우 셀에서 딸 세포의 클론으로 성장하는 전구 세포의 약 10 분마다 저속 이미지를 생성했다. 한천은 딸 세포가 고정되어 각 성장 클론에 국한되어 있음을 확인했다. 저항성 클론은 감수성 클론이 시간이 지남에 따라 체포되거나 용해되는 동안 성장했다(그림 90).
개별 전구 세포에 고유 한 공간 XY 좌표가 할당 된 주문형 이미지 분석 소프트웨어(도 91)는 일련의 시간 경과 영상에 걸친 각각의 성장하는 클론이 동정되도록 한다. 각 클론의 강도는 각 이미지의 클론 질량의 메트릭으로 사용될 수 있다. 시간이 지남에 따라 측정함으로써 이 측정 항목을 사용하여 각 개별 클론에 대한 성장 곡선을 생성했다(그림 92). 세포 반응 패턴은 전체 개체군의 감수성을 결정하는 데 사용되었다. 각 유기체에 대해 개발 된 컴퓨터 알고리즘 - 항균제 조합은 주어진 항생제의 단일 농도에 대해 알려진 MIC가있는 격리체의 반응을 기반으로 한 수학 회귀 모델을 사용하여 미생물 성장 반응을 MIC 값으로 변환한다. 일단 얻은 MIC 값은 전문가 규칙과 함께 FDA, CLSI 또는 EUCAST 중단 점을 사용하여 범주 형 결과 (감수성 (S), 중간 (I) 또는 내성 (R))를 결정한다. MIC 외에도, 이 기술은 표현형 저항 메커니즘 탐지에 적용되었다.
특정 실시 양태에서, 항균 감수성의 측정은 확인 된 미생물을 항균제 감수성 분석에 적용시키는 단계를 더 포함 할 수 있으며, 미생물은 Mueller Hinton 영양소 결핍 배지에서 성장시켜 약 12 시간 이내 성장에 항균제 내성 세포를 섬유상의 항균제 감수성 세포와 구별한다. 일부 실시 양태에서, 까다로운 미생물은 항균제 감수성 및/또는 항균제의 최소 억제 농도를 결정하기 위해 1 % 피톤트립 토스 뮐러 힌튼 한천에서 재배된다.
다균 샘플 분석
FISH ID는 몇몇 상이한 플로우 셀에서 수행되었다. 표적 채널은 다중 표적 종의 동정 및 다균 샘플에서의 비표적종의 검출을 가능하게 했다. 항균제 감수성 검사는 동일한 샘플에서 최대 2 개의 표적 생물에 대해 수행되었다.
세포 형태 학적 이미지 분석은 다균 감염에서의 종 인식에 사용되었고, 분석 소프트웨어가 AST 테스트 동안 각 종에 MIC를 할당 할 수 있게 하였다. 세포 형태학(도 93A), 분할율, 성장 패턴 및 신호 강도를 비롯한 형태역학(Morphokinetic) 특징을 사용하여 생물 종을 구별 하였다.
정량적인 FISH 분석 결과는 다균 샘플에서의 다수 종의 상대적 존재량의 평가를 제공하여, 두 종 모두 동일한 시험 실시에서 AST 테스트를 위한 적절한 농도로 희석 될 수 있다. 그러나 한 종의 희석으로 인해 다른 종들이 범위를 벗어나면 범위 내 종에 대한 AST 결과만 보고된다. 또한, 형태역학적 특징이 여러 종을 서로 구별하기에 불충분하다면, MIC 값은 보고되지 않았고, 추가적인 감수성 테스트가 필요했다.
다중화된 디지털 현미경의 성능
양성 혈액 배양 샘플에 대한 다중화된 자동 디지털 현미경 검사의 성능을 평가 하였다. 임상적 분리물을 모의된 양성 혈액 배양물에 파종하고 밤새도록 배양하고 기기의 맞춤 엔지니어링 반복에 직접 적용시켰다. FISH ID 성능은 98%의 민감도(192/195 표적 유기체)와 99% 특이성(211/214 비표적 생물체)을 보였다(표 3). 항균제 감수성 테스트 결과는 520/542 대표 유기체-항균제 조합에 대한 '금 표준'미생물 희석액 MIC 결과와 96 %의 일치를 보였다(표 4). 추가적인 결과는 내성 메커니즘(98% 감수성)과 87/90 포도구균(97% 특이성)없이 (표 5) 49/50 포도상구균 샘플의 정확한 표현형 검출을 보여 주었다. ID / AST 기준 패널의 그람 양성균 및 그람 음성 박테리아의 포괄적인 목록이 표 6 및 표 7에 제시되어있다. 곰팡이(Candida albicans 및 Candida glabrata)는 ID / AST 기준 패널에서만 확인된다.
표 3. 알려진 동정 참조와 비교된 모의된 양성 혈액 배양에 파종된 임상 분리물의 동정을 위한 다중화된 자동 디지털 현미경 검사의 성능.
Target Group Sensitivity Specificity
Staphylococcus aureus 16/16 (100%) 16/16 (100%)
Staphylococcus lugdunensis 8/8 (100%) 12/12 (100%)
coagulase-negative staphylococci 14/16 (88%) 16/16 (100%)
Enterococcus faecalis 8/8 (100%) 8/8 (100%)
Enterococcus faecium a 8/8 (100%) 8/8 (100%)
Streptococcus genus 18/18 (100%) 12/12 (100%)
Streptococcus pneumoniae 6/6 (100%) 7/7 (100%)
Streptococcus agalactiae 8/8 (100%) 5/6 (83%)
Streptococcus pyogenes 8/8 (100%) 7/7 (100%)
Escherichia coli 12/12 (100%) 22/22 (100%)
Klebsiella oxytoca + K. pneumoniae 15/16 (94%) 18/19 (95%)
Enterobacter aerogenes + E. cloacae 14/14 (100%) 16/16 (100%)
Citrobacter freundii + C. koseri 12/12 (100%) 20/20 (100%)
Proteus mirabilis + P. vulgaris 15/15 (100%) 4/4 (100%)
Serratia marcescens 7/7 (100%) 17/18 (94%)
Acinetobacter baumannii 15/15 (100%) 8/8 (100%)
Pseudomonas aeruginosa 8/8 (100%) 15/15 (100%)
Total 192/195 (98%) 211/214 (99%)
a. Enterococcus faecium 및 기타 Enterococcus spp. (Enterococcus faecalis는 제외)
표 4. 시뮬레이션 된 양성 혈액 배양에 파종 된 임상 분리 균의 항균제 감수성 검사를 위한 CLSI 표준 냉동 배양액 희석액을 이용한 다중화된 자동 디지털 현미경 비교.
Organism Antibiotic Essential Agreement
Staphylococcus aureus Doxycycline 45/47 (96%)
Staphylococcus aureus Ceftaroline 43/44 (98%)
Streptococcus pneumoniae Penicillin 27/28 (96%)
Streptococcus pneumoniae Ceftriaxone 18/19 (95%)
Enterococcus spp. Ampicillin 43/45 (96%)
Enterococcus spp. Vancomycin 44/48 (92%)
Enterococcus spp. Linezolid 44/47 (94%)
Pseudomonas aeruginosa Ciprofloxacin 47/47 (100%)
Pseudomonas aeruginosa Amikacin 48/48 (100%)
Acinetobacter baumannii Ciprofloxacin 39/41 (95%)
Acinetobacter baumannii Amikacin 37/40 (93%)
Acinetobacter baumannii Imipenem 44/45 (98%)
Acinetobacter baumannii Minocycline 41/43 (95%)
Total 520/542 (96%)
표 5. 시뮬레이션 된 양성 혈액 배양에 파종 된 S. aureus 임상 분리주에서 표현형 내성 기작을 검출하기 위한 다중화된 자동 디지털 현미경 검사의 성능.
Resistance Mechanism Sensitivity Specificity
MRSA 24/24 (100%) 22/22 (100%)
VRSA 12/12 (100%) 41/43 (95%)
MLSb 13/14 (93%) 24/25 (96%)
Total 49/50 (98%) 87/90 (97%)
MRSA = 메티 실린 내성 S. aureus; VRSA = 반코마이신 내성 S. aureus; MLSb = macrolide-lincosamide-streptogramin 저항성.
표 6. 그람 양성 혈액 배양 샘플에 대한 ID/AST 시스템 테스트 패널 가속화.
Resistance Phenotype
Organism Ampicillin Penicillin Ceftaroline Ceftriaxone Doxycycline Levofloxacin Erythromycin Trimethoprim-Sulfamethoxazole Daptomycin Linezolid Vancomycin MRSA (Cefoxitin) MLSb (Erythromycin-Clindamycin) HLAR (High-Level Gentamicin) HLAR (High-Level Streptomycin)
S. aureus X X X X X X X X X
S. lugdunensis X X X X X X X X
CONS spp. b X X X X X X X X
E. faecalis X X X X X X X
E. faecium c X X X X X X X
S. pneumoniae X X X X X
S. pyogenes a
S. agalactiae a
Streptococcus spp. ad
MRSA=methicillin-resistant S. aureus ; MLSb=macrolide-lincosamide-streptogramin b resistance; HLAR=high-level aminoglycoside resistance
a ID only
b Coagulase-negative Staphylococcus species ( Staphylococcus epidermidis , Staphylococcus haemolyticus , Staphylococcus hominis , Staphylococcus capitis , not differentiated)
c Enterococcus faecium and other Enterococcus spp., not differentiated, excluding Enterococcus faecalis
d Streptococcus mitis , Streptococcus pyogenes , Streptococcus gallolyticus , Streptococcus agalactiae , Streptococcus pneumoniae , not differentiated
표 7. 그람 음성 혈액 배양 샘플에 대한 ID/AST 시스템 테스트 패널 가속화.
Organism Ampicillin-Sulbactam Piperacillin-Tazobactam Cefazolin Cefepime Ceftazidime Ceftriaxone Ertapenem Imipenem Meropenem Amikacin Gentamicin Tobramycin Ciprofloxacin Minocycline Aztreonam
E. coli X X X X X X X X X X X X X
Klebsiella spp. a X X X X X X X X X X X X X
Enterobacter spp. b X X X X X X X X X X X
Proteus spp. c X X X X X X X X X X X X
Citrobacter spp. d X X X X X X X X X X X
S. marcescens X X X X X X X X X
P. aeruginosa X X X X X X X X X X
A. baumannii X X X X X X X X
a Klebsiella oxytoca + K. pneumoniae
b Enterobacter aerogenes + E. cloacae
c Proteus mirabilis + P. vulgaris
d Citrobacter freundii + C. koseri
도 101은 기술 된 혁신이 구현 될 수 있는 적합한 컴퓨팅 환경(10100)의 일반화된 예를 도시한다. 혁신이 다양한 범용 또는 특수 목적 컴퓨팅 시스템에서 구현 될 수 있기 때문에 컴퓨팅 환경(10100)은 사용 또는 기능의 범위에 대한 임의의 제한을 제안하는 것으로 의도되지 않는다. 예를 들어, 컴퓨팅 환경(10100)은 다양한 컴퓨팅 장치(예를 들어, 데스크탑 컴퓨터, 랩탑 컴퓨터, 서버 컴퓨터, 태블릿 컴퓨터 등) 중 임의의 것일 수 있다. 대안으로, 컴퓨팅 환경 (10100)은 도 3의 제어 보드 (321)의 일부일 수 있다.
도 101을 참조하면, 컴퓨팅 환경 (10100)은 하나 이상의 처리 유닛(10110, 10115) 및 메모리(10120, 10125)를 포함한다. 도 101에서, 이 기본 구성(10130)은 점선으로 도시되어있다. 처리 유닛(10110, 10115)은 컴퓨터 실행 가능 명령을 실행한다. 처리 유닛은 범용 중앙 처리 장치(CPU), 주문형 집적 회로(ASIC)의 프로세서 또는 임의의 다른 유형의 프로세서 일 수 있다. 다중 처리 시스템에서, 다수의 처리 유닛은 처리 능력을 증가시키기 위해 컴퓨터 실행 가능 명령을 실행한다. 도 101은 중앙 처리 유닛(10110)뿐만 아니라 그래픽 처리 유닛 또는 공동 처리 유닛(10115)을 도시한다. 유형 메모리 (10120, 10125)는 휘발성 메모리 (예를 들어, 레지스터, 캐시, RAM), 비 휘발성 메모리 (예를 들어, ROM, EEPROM, 플래시 메모리 등), 또는 처리 유닛(들)에 의해 액세스 가능한 2 개의 조합을 포함 할 수 있다. 메모리 (10120, 10125)는 프로세싱 유닛(들)에 의한 실행에 적합한 컴퓨터 실행 가능 명령의 형태로 본 명세서에서 설명 된 하나 이상의 혁신을 구현하는 소프트웨어(10180)를 저장한다.
본원에 설명 된 임의의 예에서, 컴퓨팅 환경(10100)은 기기에 부착되고 기기를 제어하도록 동작 가능한 시스템 제어기 일 수 있다.
컴퓨팅 시스템은 추가적인 특징들을 가질 수 있다. 예를 들어, 컴퓨팅 환경(10100)은 저장 장치(10140), 하나 이상의 입력 장치(10150), 하나 이상의 출력 장치(10160) 및 하나 이상의 통신 연결부(10170)를 포함한다. 버스, 제어기 또는 네트워크와 같은 상호 연결 메카니즘 (미도시)은 컴퓨팅 환경 (10100)의 구성 요소들을 상호 접속시킨다. 전형적으로, 오퍼레이팅 시스템 소프트웨어 (도시되지 않음)는 컴퓨팅 환경 (10100)에서 실행되는 다른 소프트웨어에 대한 운영 환경을 제공하고, 컴퓨팅 환경 (10100)의 컴포넌트들의 활동을 조정한다.
유형 기억 장치(10140)는 제거 가능하거나 제거 불가능할 수 있으며, 자기 디스크, 자기 테이프 또는 카세트, CD-ROM, DVD, 또는 비일시적인 방식으로 정보를 저장하는데 사용될 수 있는 임의의 다른 매체를 포함하며, 컴퓨팅 환경(10100) 내에서 액세스 될 수 있다. 저장 장치(10140)는 본 명세서에서 설명 된 하나 이상의 혁신을 구현하는 소프트웨어(10180)에 대한 명령어를 저장한다.
입력 장치(들)(10150)은 키보드, 마우스, 펜 또는 트랙볼과 같은 터치 입력 장치, 음성 입력 장치, 스캐닝 장치, 또는 컴퓨팅 환경(10100)에 입력을 제공하는 다른 장치 일 수 있다. 출력 장치(들)(10160)는 디스플레이, 프린터, 스피커, CD 라이터(writer), 또는 컴퓨팅 환경 (10100)으로부터 출력을 제공하는 다른 장치 일 수 있다.
통신 접속(들)(10170)은 통신 매체를 통해 다른 컴퓨팅 엔티티(entity)로의 통신을 가능하게 한다. 통신 매체는 컴퓨터 실행 가능 명령, 오디오 또는 비디오 입력 또는 출력, 또는 변조 된 데이터 신호의 다른 데이터와 같은 정보를 전달한다. 변조된 데이터 신호는 그 특성 중 하나 이상이 신호 내에 정보를 인코딩하는 방식으로 설정되거나 변경되는 신호이다. 예로서, 통신 매체는 전기, 광학, RF 또는 다른 캐리어를 사용할 수 있지만, 이에 한정되는 것은 아니다.
개시된 방법 중 일부의 동작이 편리한 프리젠테이션을 위해 특정의 순차적 순서로 설명되었지만, 후술하는 특정 언어에 의해 특정 순서가 요구되지 않는 한, 이러한 방식의 설명은 재배치를 포함하는 것으로 이해되어야 한다. 예를 들어, 순차적으로 기술 된 동작은 경우에 따라 재배치되거나 동시에 수행 될 수 있다. 또한, 간략화를 위해, 첨부 된 도면은 개시된 방법이 다른 방법과 함께 사용될 수 있는 다양한 방법을 나타내지 않을 수도 있다.
개시된 방법들 중 임의의 방법은 하나 이상의 컴퓨터 판독 가능 저장 매체 (예를 들어, 하나 이상의 광 매체 디스크, (DRAM 또는 SRAM과 같은) 휘발성 메모리 구성 요소, 또는 비 휘발성 메모리 구성 요소 (예: 플래시 메모리 또는 하드 드라이브)에 저장되고, 컴퓨터 (예: 스마트 폰 또는 컴퓨팅 하드웨어가 포함 된 기타 모바일 장치를 포함한 상용 컴퓨터)에서 실행된다. 컴퓨터 판독 가능 저장 매체라는 용어는 신호 및 반송파와 같은 통신 연결을 포함하지 않는다. 개시된 실시 예들의 구현 중에 생성되고 사용되는 임의의 데이터뿐만 아니라 개시된 기술들을 구현하기 위한 컴퓨터 실행 가능 명령들 중 임의의 것을 하나 이상의 컴퓨터 판독 가능 저장 매체에 저장할 수 있다. 컴퓨터 실행 가능 명령어는 예를 들어, 전용 소프트웨어 애플리케이션 또는 웹 브라우저 또는 다른 소프트웨어 애플리케이션(예를 들어, 원격 컴퓨팅 애플리케이션)을 통해 액세스되거나 다운로드되는 소프트웨어 애플리케이션의 일부일 수 있다. 이러한 소프트웨어는 예를 들어, 하나의 로컬 컴퓨터(예를 들어, 임의의 적합한 상업적으로 이용 가능한 컴퓨터) 또는 네트워크 환경(예를 들어, 인터넷, 광역 네트워크, 근거리 통신망, 서버 네트워크(클라우드 컴퓨팅 네트워크와 같은), 또는 다른 그러한 네트워크)를 포함 할 수 있다.
명료성을 위해, 소프트웨어 기반 구현의 특정 선택된 양태 만이 설명된다. 당해 기술 분야에 잘 알려진 다른 세부 사항은 생략된다. 예를 들어, 개시된 기술은 임의의 특정 컴퓨터 언어 또는 프로그램에 한정되지 않는다는 것을 이해해야한다. 예를 들어, 개시된 기술은 C ++, Java, Perl, JavaScript, 조립체 언어 또는 임의의 다른 적절한 프로그래밍 언어로 작성된 소프트웨어에 의해 구현 될 수 있다. 마찬가지로, 개시된 기술은 임의의 특정 컴퓨터 또는 하드웨어 유형에 한정되지 않는다. 적합한 컴퓨터 및 하드웨어의 특정 세부 사항은 잘 알려져 있으므로 본 명세서에서는 상세하게 설명 할 필요가 없다.
여기에 설명 된 임의의 기능성은 소프트웨어 대신에 하나 이상의 하드웨어 로직 구성 요소에 의해 적어도 부분적으로 수행 될 수 있다는 것도 잘 이해해야한다. 예를 들어, 제한없이, FPGA (Field-Programmable Gate Array), ASIC (Application-Specific Integrated Circuits), ASSP (Program-Specific Standard Products), System-on-a 칩 시스템 (SOC), 컴플렉스 프로그래머블 로직 디바이스 (CPLD) 등의 설명적 타입의 하드웨어 로직 구성요소가 사용될 수 있다.
또한, 소프트웨어 기반 실시 예들(예를 들어, 컴퓨터로 하여금 개시된 방법들 중 임의의 것을 수행하게 하는 컴퓨터 실행 가능 명령들을 포함함)은 적절한 통신 수단을 통해 업로드, 다운로드 또는 원격 액세스 될 수 있다. 이러한 적합한 통신 수단은 예를 들어 인터넷, 월드 와이드 웹, 인트라넷, 소프트웨어 애플리케이션, 케이블 (광섬유 케이블 포함), 자기 통신, 전자기 통신 (RF, 마이크로파 및 적외선 통신 포함), 전자 통신, 또는 다른 그러한 통신 수단 일 수 있다.
개시된 방법, 장치 및 시스템은 어떤 방식으로든 제한하는 것으로 해석되어서는 안된다. 대신에, 본 개시는 다양한 개시된 실시 예의 모든 새롭고 명백하지 않은 특징 및 양상을 단독으로 그리고 다양한 조합 및 서로 서브 조합으로 지향한다. 개시된 방법, 장치 및 시스템은 임의의 특정 양상 또는 특징 또는 이들의 조합에 한정되지 않으며, 개시된 실시 예는 임의의 하나 이상의 특정 이점이 존재하거나 문제가 해결되도록 요구하지 않는다.
개시된 발명의 원리가 적용될 수 있는 다수의 가능한 실시 예를 고려하여, 예시 된 실시 예는 본 개시의 예일 뿐이며, 본 발명의 범위를 제한하는 것으로 받아 들여서는 안된다는 것을 알아야한다. 오히려, 본 발명의 범위는 다음의 청구 범위에 의해 한정된다. 따라서 우리는 이러한 주장의 범위 내에 있는 모든 것을 우리의 발명으로 주장한다.
본원에 제시된 개시는 독립적인 유용성을 갖는 적어도 하나의 다른 발명을 포함하는 것으로 생각된다. 적어도 하나의 발명이 예시적인 형태로 개시되었지만, 여기에 설명되고 도시 된 바와 같은 그의 특정 실시 예는 많은 변형이 가능하기 때문에 제한적인 의미로 고려되어서는 안된다. 다양한 실시 예, 재료, 조성물 및 방법의 동등한 변경, 수정 및 변형이 본 개시의 범위 내에서 이루어질 수 있으며, 실질적으로 유사한 결과를 달성 할 수 있다. 적어도 하나의 발명의 주제는 본 명세서에 개시된 다양한 요소, 특징, 기능 및 / 또는 특성의 모든 신규하고 자명 한 조합 및 서브 조합 및 이들의 등가물을 포함한다.
본원에 기술 된 방법은 샘플로부터의 미생물 세포의 신속한 배양 및 검출을 용이하게 하도록 구현 될 수 있다. 이점들, 다른 이점들, 및 문제들에 대한 해결책들이 특정 실시 예들과 관련하여 여기에 기술되었다. 그러나 이점, 이점, 문제에 대한 해결책 및 이점, 이점 또는 해결책이 발생하거나 더 분명해질 수 있는 모든 요소 또는 요소의 조합이 적어도 하나의 발명의 일부 또는 모든 청구항 중요하거나 필요하거나 필수적인 기능 또는 요소로 간주되지 않아야 한다. 본 개시의 범위 내의 많은 변화 및 수정이 본 발명의 사상을 벗어나지 않고 이루어질 수 있으며, 본 명세서에 기재된 하나 이상의 발명은 그러한 모든 변형을 포함한다. 특허 청구 범위의 모든 구성 요소의 대응하는 구조, 재료, 작용 및 균등 물은 구체적으로 열거 된 다른 청구 구성 요소와 함께 기능을 수행하기 위한 임의의 구조, 재료 또는 동작을 포함하도록 의도된다. 하나 이상의 발명의 범위는 여기에 설명 된 예가 아니라 첨부 된 청구항 및 법적으로 등가물에 의해 결정되어야 한다.
이점들, 다른 장점들, 및 문제들에 대한 해결책들이 특정 실시 예들과 관련하여 여기서 설명되었다. 또한, 여기에 포함 된 다양한 도면에 도시 된 연결 라인은 다양한 요소들 사이의 예시적인 기능적 관계 및/또는 물리적 결합을 나타내기 위한 것이다. 실제 시스템에는 많은 대체 또는 추가 기능적 관계 또는 물리적 연결이 있을 수 있다. 그러나, 이점, 이점, 문제점에 대한 해결책, 및 임의의 이점, 장점 또는 해결책을 발생 시키거나 더 현저하게 하는 임의의 요소는 본 발명의 중요성, 필수 또는 필수 특징 또는 요소로 해석되어서는 안된다. 따라서, 본 발명의 범위는 첨부 된 청구 범위 이외의 다른 것에 의해 제한되지 않으며, 단수의 요소에 대한 언급은 명시 적으로 언급되지 않는 한 "오직 하나"를 의미하는 것이 아니라 오히려 "하나 이상"을 의미하는 것으로 의도된다. " 더욱이, "A, B 또는 C 중 적어도 하나"와 유사한 구가 청구 범위에서 사용되는 경우, 어구는 A 단독이 실시 예에 존재할 수 있음을 의미하는 것으로 해석되어야 하고, 실시 예에서 B 단독이 존재할 수 있다. C만이 일 실시 예에 존재할 수 있거나, 요소 A, B 및 C의 임의의 조합이 단일 실시 예에 존재할 수 있다. A 및 B, A 및 C, B 및 C, 또는 A 및 B 및 C를 포함한다. 상이한 부분을 나타내기 위해 상이한 교차 해칭(hatching)이 도면 전체에 걸쳐 사용되지만 동일 또는 상이한 재료를 반드시 지칭 할 필요는 없다.
시스템, 방법 및 장치가 여기에 제공된다. 본 명세서의 상세한 설명에서, "일 실시 예", "실시 예", "예시 실시 예"등은 기술 된 실시 예가 특정 특징, 구조 또는 특성을 포함 할 수 있음을 나타내지 만, 모든 실시 예는 반드시 특정 특징, 구조 또는 특성을 포함하는 것은 아니다. 또한, 그러한 문구는 반드시 동일한 실시 예를 지칭하는 것은 아니다. 또한, 특정한 특징, 구조 또는 특성이 실시 예와 관련하여 설명 될 때, 다른 실시 예와 관련하여 그러한 특징, 구조 또는 특성에 영향을 미치도록 당업자의 지식 범위 내에 있다는 것이 제시된다. 명시적으로 설명되지 않았다. 설명을 읽은 후에, 대안 실시 예에서 본 개시를 구현하는 방법은 당업자에게 명백 할 것이다.
또한, 본 개시 물의 구성 요소, 구성 요소 또는 방법 단계는 구성 요소, 구성 요소 또는 방법 단계가 청구 범위에서 명시 적으로 언급되는지 여부에 관계없이 대중에게 제공되도록 의도되지 않는다. 본 명세서에서 청구 범위의 요소는 35 U.S.C. 본원에서 사용 된 바와 같이, "포함하다", "포함하다"또는 임의의 다른 변형은 비 배타적 인 포함을 포함하는 것으로 의도된다. 요소 목록을 포함하는 프로세스, 방법, 물품 또는 장치는 이들 요소만을 포함하지 않고 명시 적으로 열거되지 않았거나 그러한 프로세스, 방법, 물품 또는 장치에 내재 된 다른 요소를 포함 할 수 있음을 이해할 것이다.

Claims (134)

  1. 다수의 웰을 포함하는 시약 카트리지;
    시약 스테이지,
    상기 시약 스테이지는 내부 개구를 규정하는 환형을 포함하고, 상기 시약 스테이지는 제 1 평면에서 회전하도록 구성되며 상기 시약 스테이지는 상기 시약 카트리지를 수용하도록 구성되고;
    샘플을 수용하도록 구성된 복수의 미세 유체 샘플 채널을 포함하는 카세트,
    상기 복수의 미세 유체 샘플 채널은 피펫팁을 수용하도록 구성된 입구 포트를 포함하고;
    상기 시약 스테이지의 내부 개구 내에 위치되는 카세트 스테이지,
    상기 카세트 스테이지는 상기 카세트를 수용하도록 구성되며, 상기 카세트 스테이지는 상기 제 1 평면에서 회전하여 좌우로 이동하도록 구성되고;
    상기 시약 카트리지의 다수의 웰들과 상기 다수의 미세 유체 채널들 각각의 유입 포트들 사이에서 복수의 시약들을 이동 시키도록 구성된 피펫터 조립체;
    상기 복수의 미세 유체 샘플 채널에 포함 된 하나 이상의 미생물의 암시야 및 형광 현미경 사진을 얻도록 구성되는 광학 검출 시스템; 및
    시스템의 작동을 지시하고 상기 광학 검출 시스템에 의해 얻어진 현미경 사진으로부터 유도된 미생물 정보를 처리하도록 구성된 제어기;를 포함하는 자동 미생물 동정 및 항생제 감수성 시험을 위한 시스템.
  2. 제 1 항에 있어서,
    상기 복수의 미세 유체 샘플 채널은 상기 카세트의 중심에 대해 방사형으로 배열되고, 각각의 미세 유체 샘플 채널은 하나 이상의 출구 포트 및 입구 포트를 포함하는 자동 미생물 동정 및 항생제 감수성 시험을 위한 시스템.
  3. 다수의 웰을 포함하고 개구를 한정하는 시약 카트리지;
    상기 시약 카트리지의 개구부 끼워 지도록 구성된 카세트; 및
    상기 카세트 및 상기 시약 카트리지의 적어도 일부를 덮도록 형성된 밀봉 부;를 포함하는 자동 미생물 동정 및 항생제 감수성 테스트 시스템에 사용하기 위한 시약 카트리지 키트
  4. 제 3 항에 있어서,
    상기 카세트를 수용하도록 성형 된 카세트 홀더를 더 포함하고,
    상기 카세트 홀더는 상기 카세트 홀더를 상기 시약 카트리지의 개구 위 또는 내부에 결합하기 위한 외형 치수를 갖는 시약 카트리지 키트.
  5. 제 3 항 또는 제 4 항에 있어서,
    상기 시약 카트리지 내에 삽입 가능한 샘플 바이알을 더 포함하는 시약 카트리지 키트.
  6. 제 3 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 시약 카트리지의 웰의 일부에 수용되는 피펫팁 랙을 더 포함하는 시약 카트리지 키트.
  7. 제 3 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 시약 카트리지는,
    외부 표면에 형성되고 피펫팁을 수용 할 수 있는 크기의 적어도 하나의 교시 웰을 포함하는 시약 카트리지 키트.
  8. 제 3 항 내지 제 7 항 중 어느 한 항에 있어서,
    다수의 웰은 시약을 포함하고 피펫 팁으로 상기 시약에 대한 접근을 제공하는 각각의 포트를 갖는 시약 카트리지 키트.
  9. 제 3 항 내지 제 8 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 시약 카트리지 키트의 신원을 검출하기 위해 상기 시스템에 의해 감지 될 수 있는 식별자를 더 포함하는 시약 카트리지 키트.
  10. 제 3 항 내지 제 9 항 중 어느 한 항에 있어서,
    복수의 상기 웰은 GEF 장치를 수용하도록 형성된 GEF 웰을 포함하는 시약 카트리지 키트.
  11. 제 3 항 내지 제 10 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 시약 카트리지는 상기 시약 카트리지의 외부로부터 접근 가능한 적어도 하나의 전기 접촉부를 포함하는 시약 카트리지 키트.
  12. 제 11 항에 있어서,
    상기 적어도 하나의 접촉부는 상기 시약 카트리지의 한 단부에 위치되는 한 쌍의 이격된 접촉부를 포함하고, 상기 시약 카트리지가 상기 시스템의 다른 전기 접촉부를 이동시키고 결합시게 함으로써 결합되도록 구성되는 시약 카트리지 키트.
  13. 제 3 항 내지 제 12 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 웰 중 적어도 일부는 필름에 의해 밀봉되는 시약 카트리지 키트
  14. 유리 지지체;
    카세트 구성 요소;
    상기 유리 지지체와 상기 카세트 구성 요소 사이에 위치된 라미네이트 층; 및
    상기 카세트를 가로 질러 방사형으로 배열 된 복수의 미세 유체 채널;을 포함하는 자동 미생물 동정 및 항생제 감수성 테스트 시스템에 통합 가능한 카세트.
  15. 제 14 항에 있어서,
    상기 라미네이트 층은 상기 유리 지지체 및 상기 카세트 구성 요소에 접착 결합되는 카세트.
  16. 제 14 항 또는 제 15 항에 있어서,
    상기 각각의 미세 유체 채널은,
    피펫팁을 수용하도록 구성된 유입 포트; 및
    출구 포트;를 포함하는 카세트.
  17. 제 14 항 내지 제 16 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 미세 유체 채널은 상기 라미네이트 층에 형성되는 카세트.
  18. 제 14 항 내지 제 17 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 미세 유체 채널은 상기 라미네이트 층 및 상기 카세트 구성 요소에 형성되는 카세트.
  19. 제 14 항 내지 제 18 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 카세트 구성 요소의 적어도 일부는 광학적으로 투명한 중합체로 형성되는 카세트.
  20. 제 14 항 내지 제 19 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 카세트의 표면의 적어도 일부는 광학적으로 투명한 도전 층을 포함하는 카세트.
  21. 제 20 항에 있어서,
    상기 광학적으로 투명한 도전 층은 약 70 내지 약 100 ohms/square의 저항을 갖는 인듐 주석 산화물을 포함하는 카세트.
  22. 제 14 항 내지 제 21 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 유리 지지체는 폴리-L-라이신 및 인듐 주석 산화물로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 부재로 코팅되는 카세트.
  23. 대물 렌즈의 복수의 초점 위치에 대해 강도 가중 대 초점 위치가 얻어지는 사전 스캔 정보를 제공하는 단계;
    상기 대물 렌즈를 통해 광원으로부터의 광을 이미지면에 투사하는 단계;
    제 1 위치에서 상기 대물 렌즈로 반사 된 광의 제 1 이미지를 포착하는 단계;
    제 2 위치에서 상기 대물 렌즈로 반사 된 광의 제 2 이미지를 포착하는 단계;
    상기 제 1 및 제 2 이미지들에 대한 상기 반사광의 강도 가중을 계산하는 단계;
    상기 사전 스캔 정보와 관련하여 상기 계산 된 강도 가중치를 사용하여 초점 위치를 계산하는 단계;
    상기 대물 렌즈를 상기 계산 된 초점 위치로 이동시키는 단계; 및
    상기 계산 된 초점 위치에 상기 대물 렌즈로 미생물의 이미지를 포착하는 단계;를 포함하는 영상화 될 미생물에 초점을 맞추기 위한 방법.
  24. 제 23 항에 있어서,
    상기 광원은 상기 이미지 평면에서 유리 및 액체 인터페이스의 반사를 생성하는데 사용되는 제 1 광원이고, 상기 이미지의 포착은 제 2 광원에 의한 것인 영상화 될 미생물에 초점을 맞추기 위한 방법.
  25. 제 24 항에 있어서,
    상기 제 1 광원은 상기 유리 및 액체 계면으로부터 착색된 반사를 생성하도록 설계된 착색된 광원이고, 상기 제 2 광원은 상기 미생물의 화상을 포착하도록 설계된 백색 광원 인 영상화 될 미생물에 초점을 맞추기 위한 방법.
  26. 제 23 항 내지 제 25 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 제 1 위치는 초점이 맞지 않는 위치이고 상기 이미지 평면의 제 1면으로부터 제 1 고정 거리이며, 상기 제 2 위치는 초점이 맞지 않는 것 인 방법. 상기 제 1면의 반대편에서 상기 이미지면의 제 2면으로부터 제 2 고정 거리인 영상화 될 미생물에 초점을 맞추기 위한 방법.
  27. 제 23 항 내지 제 26 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 제 1 이미지에서 상기 반사광의 중심을 계산하고 상기 중심을 알려진 중심과 비교하여 상기 알려진 중심으로부터의 오프셋 거리를 결정하는 단계와, 상기 오프셋 거리가 미리 결정된 한계 내에 있다면 상기 제 1 이미지만을 사용하는 단계를 더 포함하는 영상화 될 미생물에 초점을 맞추기 위한 방법.
  28. 제 27 항 에있어서,
    상기 대물 렌즈를 반복적으로 이동시키는 단계 및 상기 오프셋 거리가 상기 미리 결정된 한계치들 내에 있을 때까지 상기 제 1 이미지를 다시 포착하는 단계를 더 포함하는 영상화 될 미생물에 초점을 맞추기 위한 방법.
  29. 제 23 항 내지 제 28 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 광의 투영은 그레이 스케일 분석을 통해 검출 가능한 이미지 스폿 상에 광 스폿을 생성하는 영상화 될 미생물에 초점을 맞추기 위한 방법.
  30. 제 23 항 내지 제 29 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 광의 투영은 그레이 스케일 분석을 통해 검출 가능한 이미지 스폿 상에 광 스폿을 생성하는 영상화 될 미생물에 초점을 맞추기 위한 방법.
  31. 제 23 항 내지 제 30 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 강도 가중의 계산 단계는 상기 제 1 이미지의 각 픽셀에 대한 그레이 스케일 값을 획득하고 상기 그레이 스케일 값에 중심점에 대한 위치를 그 전체 픽셀 합계 강도 인 전체 이미지 합 강도로 나눈 값을 곱하는 단계를 포함하는 영상화 될 미생물에 초점을 맞추기 위한 방법.
  32. 제 23 항 내지 제 31 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 사전 스캔 정보는 상기 대물 렌즈의 상기 복수의 초점 위치에 대한 스폿 오프셋 대 초점 위치를 더 포함하는 영상화 될 미생물에 초점을 맞추기 위한 방법.
  33. 미생물에 대해 자동 초점을 맞추기 위한 시스템에 있어서,
    광선을 투영하고 이미지면에 반사 스폿을 발생시키는 제 1 광원;
    상기 이미지면 상에 상기 미생물의 이미지를 포착하기 위해 광을 투사하는 제 2 광원;
    상기 제 1 및 제 2 광원과 상기 이미지면 사이에 위치하여 상기 이미지면에 초점을 맞추기 위한 가동 대물 렌즈;
    상기 반사 스폿을 포착하고 초점을 맞추기 위해 상기 대물 렌즈를 사용하여 상기 미생물의 이미지를 포착하는 카메라; 및
    상기 카메라로부터 상기 반사 스폿의 2 이상의 이미지를 수신하고, 상기 반사 스폿의 강도 가중치에 기초하여 상기 대물 렌즈의 위치를 수정하는 제어기;를 포함하는 영상화 될 미생물에 대해 자동 초점을 맞추기 위한 시스템.
  34. 제 33 항에 있어서,
    상기 강도 가중치는 중심에 대한 각 픽셀의 위치에 따라 가중되는 각 픽셀과 관련된 그레이 스케일 값에 관련되는 시스템.
  35. 제 33 항 내지 제 34 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 제어기는,
    상기 대물 렌즈의 복수의 초점 위치에 대한 강도 가중치가 획득되는 사전 스캔을 수행하는 시스템.
  36. 제 33 항 내지 제 35 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 제어기는,
    상기 대물 렌즈의 복수의 초점 위치에 대해 오프셋 대 초점 위치가 획득되는 사전 스캔을 수행하는 시스템.
  37. 제 33 항 내지 제 36 항 중 어느 한 항에있어서,
    상기 제어기는,
    상기 대물 렌즈의 위치를 결정하기 위해 상기 강도 가중치의 사전 스캔과 함께 상기 반사 스폿의 강도 가중치를 사용하여 초점 위치를 계산하도록 구성되는 하는 시스템.
  38. 실행시 컴퓨터 시스템이 자동 초점 동작을 수행하게 하는 명령들을 포함하는 컴퓨터 판독 가능 저장 매체에 있어서,
    초점이 이미지면의 전방에서 미리 결정된 거리가 되도록 제어 보드를 사용하여 대물 렌즈를 제 1 위치로 이동;
    상기 대물 렌즈를 통해 제 1 광원을 투사하고, 상기 광원은 상기 이미지면으로부터 제 1 스폿 형 반사를 생성하도록 설계;
    제 1 스폿 형 반사의 제 1 이미지를 포착;
    상기 초점이 상기 이미지 평면 뒤의 미리 결정된 거리가 되도록 상기 대물 렌즈를 제 2 위치로 이동;
    제 2 스폿 형 반사를 생성하기 위해 상기 대물 렌즈를 통해 상기 제 1 광원을 투사;
    상기 제 2 스폿 형 반사의 제 2 이미지를 포착; 및
    상기 제 1 및 제 2 이미지에 대해 강도 가중 분석을 수행하고 상기 강도 가중 분석을 사용하여 상기 대물 렌즈의 초점 위치를 결정;
    을 포함하는 실행시 컴퓨터 시스템이 자동 초점 동작을 수행하게 하는 명령들을 포함하는 컴퓨터 판독 가능 저장 매체.
  39. 제 38 항에 있어서,
    상기 제 1 스폿 형 반사의 중심을 계산;
    실제 중심으로부터의 중심의 오프셋이 제 1 소정 범위 내에 있는지 여부를 결정;
    상기 제 2 스폿 형 반사의 중심을 계산; 및
    상기 제 2 스폿 팅 반사의 중심의 오프셋이 제 2 소정 범위 내에 있는지 여부를 결정;
    을 더 포함하는 실행시 컴퓨터 시스템이 자동 초점 동작을 수행하게 하는 명령들을 포함하는 컴퓨터 판독 가능 저장 매체.
  40. 제 38 항 내지 제 39 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 강도 가중 분석은 각 픽셀에 대한 그레이 스케일 값을 사용하고 상기 스폿 형 반사의 중심 위치를 결정하기 위한 행 및 열 정보를 사용하는 것을 포함하는 컴퓨터 판독 가능 저장 매체.
  41. 제 38 항 내지 제 40 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 제 1 및 제 2 스폿 각각의 중심을 계산하는 연산을 더 포함하는 컴퓨터 판독 가능 저장 매체.
  42. 제 38 항 내지 제 41 항 중 어느 한 항에 있어서,
    초점 위치에 대한 복수의 강도 가중을 포함하는 사전 스캔 정보를 결정하기 위해 사전 스캔을 수행하는 동작을 더 포함하는 컴퓨터 판독 가능 저장 매체.
  43. 제 38 항 내지 제 42 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 강도 가중 분석의 결과를 상기 사전 스캔 정보에 매핑;
    명령을 더 포함하는 컴퓨터 판독 가능 저장 매체.
  44. 제 38 항 내지 제 43 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 자동 초점을 수행하기 위해 최대 2 개의 이미지가 캡쳐되는 컴퓨터 판독 가능 저장 매체.
  45. 제 38 항 내지 제 44 항 중 어느 한 항에 있어서,
    미생물을 이미징하기 위해 상기 제 1 및 제 2 광원과 상이한 광원을 이용;
    명령을 더 포함하는 컴퓨터 판독 가능 저장 매체.
  46. 실행시에 컴퓨터 시스템으로 하여금 희석 조작을 수행하게 하는 명령을 포함하는 컴퓨터 판독 가능 저장 매체로서,
    샘플의 다수의 서브 샘플에 대한 세포 농도를 제어 보드상에서 결정; 여기서, 상기 각 서브 샘플은 상이한 희석 인자를 사용하여 희석되고,
    다중 서브 샘플 농도 및 관련된 희석 인자를 사용하여 비선형 희석 곡선을 근사;
    상기 샘플에 대한 목표 세포 농도 및 상기 샘플에 대한 표적 희석 인자를 결정하기 위해 상기 비선형 희석 곡선의 근사를 사용; 및
    상기 표적 희석 인자를 사용하여 샘플의 일부를 표적 농도로 희석;
    명령을 포함하는 실행시에 컴퓨터 시스템으로 하여금 희석 조작을 수행하게 하는 명령을 포함하는 컴퓨터 판독 가능 저장 매체.
  47. 제 46 항에 있어서,
    상기 동작들은,
    상기 표적 희석 인자가 결정되는 동안 상기 샘플의 세포 성장을 설명하기 위해 상기 결정된 표적 희석 인자를 조정;
    명령을 더 포함하는 컴퓨터 판독 가능 저장 매체.
  48. 제 47 항에 있어서,
    상기 조정은,
    상기 샘플에서 미생물의 종을 동정;
    상기 동정된 종과 관련된 성장 인자를 선택; 및
    상기 선택된 성장 인자를 사용하여 상기 결정된 표적 희석 인자를 조절;
    명령을 포함하는 컴퓨터 판독 가능 저장 매체.
  49. 제 48 항에 있어서,
    상기 선택된 성장 인자를 사용하여 상기 결정된 표적 희석 인자를 조절은,
    상기 동정된 종과 관련된 생존 할 수 없는 세포의 비율을 설명하기 위해 상기 결정된 희석 인자를 조정;
    명령을 포함하는 컴퓨터 판독 가능 저장 매체.
  50. 제 46 항 내지 제 49 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 비선형 희석 곡선을 근사는,
    프로세서를 사용하여 평균 세포 농도를 결정하고, 각각의 서브 샘플 세포 농도는 비례 상수의 지수로 승산 된 상응하는 샘플 희석 인자에 의해 곱해지며, 비례 상수는 1보다 작고 0보다 큰 값이고, 상기 다수의 서브 샘플들의 카운트에 의한 상기 제품들의 합; 및
    상기 표적 희석 계수를 결정은,
    상기 결정된 평균 세포 농도와 상기 표적 세포 농도 사이의 비율을 결정; 및
    비례 상수의 역수의 비로 비율을 올림;
    명령을 포함하는 컴퓨터 판독 가능 저장 매체.
  51. 제 50 항에 있어서,
    상기 비례 상수는 1보다 작고 0.5 이상인 컴퓨터 판독 가능 저장 매체
  52. 제 46 항 내지 제 51 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 비선형 희석 곡선을 근사는,
    상기 서브 샘플에 대한 다수의 희석 테스트 포인트를 생성;을 포함하고,
    상기 각각의 희석 테스트 포인트는 상기 복수의 서브 샘플 셀 농도 중 하나 및 대응하는 희석 인자를 포함하고; 및
    희석 테스트 포인트간의 보간을 수행;
    명령을 포함하는 컴퓨터 판독 가능 저장 매체.
  53. 제 52 항에 있어서,
    상기 희석 테스트 포인트간의 보간은,
    상기 희석 테스트 포인트들 사이에서 다수의 선형 보간을 수행;
    명령을 포함하는 컴퓨터 판독 가능 저장 매체.
  54. 제 53 항에 있어서,
    상기 표적 희석 계수를 결정은,
    상기 표적 세포 농도보다 낮은 서브 샘플 세포 농도로 상기 다수의 희석 테스트 포인트의 제 1을 확인;
    상기 표적 세포 농도보다 크거나 같은 서브 샘플 세포 농도로 상기 다중 희석 테스트 포인트의 제 2를 확인; 및
    상기 표적 희석 인자를 결정하기 위해 상기 제 1 및 제 2 확인된 희석 테스트 포인트들 사이의 선형 보간법을 이용;
    명령을 더 포함하는 컴퓨터 판독 가능 저장 매체.
  55. 제 54 항에 있어서,
    상기 제 1 및 제 2 확인된 서브 샘플 테스트 포인트 간의 선형 보간 이용은, 수학식 1을 사용하여 표적 희석 계수를 결정; 명령을 포함하는 컴퓨터 판독 가능 저장 매체.
    [수학식 1]
    Figure pct00020


    (여기서, DT는 표적 희석 인자, CT는 표적 세포 농도, C1은 첫 번째 확인 희석 테스트 포인트의 세포 농도, D1은 C1에 대한 상응하는 희석 인자, C2는 두 번째 확인 된 희석의 세포 농도, D2는 C2에 대한 상응하는 희석 인자이고, G는 샘플과 관련된 세포 성장 인자이다.)
  56. 제 52 항에 있어서,
    상기 표적 희석 계수를 결정은,
    상기 샘플에 대한 상기 표적 세포 농도가 상기 서브샘플 세포 농도의 최저값보다 작은 것으로 결정; 및
    a) 가장 낮은 상기 서브 샘플 세포 농도 및 가장 낮은 상기 서브 샘플 세포 농도에 대응하는 희석 인자의 곱, 및 b) 상기 샘플에 대한 상기 표적 세포 농도 사이의 비율을 사용하여 표적 희석 인자를 결정;
    명령을 포함하는 컴퓨터 판독 가능 저장 매체.
  57. 제 52 항에 있어서,
    상기 희석 테스트 포인트간을 보간하는 단계는 상기 희석 테스트 포인트들 사이에 다수의 스플라인(spline) 보간을 수행;
    명령을 포함하는, 컴퓨터 판독 가능 저장 매체.
  58. 프로세서; 및
    상기 프로세서에 의해 실행될 때, 상기 시스템 제어기로 하여금 동작을 수행하게 하는 명령들을 저장하는 컴퓨터 판독 가능 저장 매체;
    를 포함하는 시스템 제어기를 포함하는 시스템으로,
    상기 동작은,
    샘플로부터 3 개 이상의 서브 샘플을 추출;
    별개의 희석 인자를 사용하여 각 서브 샘플을 희석;
    각각의 희석 된 서브 샘플의 세포 농도를 측정;
    상기 세포 농도 및 상기 별개의 희석 인자를 사용하여 상기 샘플에 대한 비선형 유효 희석 곡선을 추정;
    상기 비선형 유효 희석 곡선을 이용하여 표적 세포 농도로 상기 샘플을 희석하기 위한 표적 희석 인자를 결정; 및
    상기 결정된 표적 희석 인자를 사용하여 샘플의 나머지를 희석;
    을 포함하는 시스템.
  59. 제 58 항에 있어서,
    상기 3 개 이상의 서브 시료를 추출하는 단계는 상기 시료 피펫터를 사용하여 상기 샘플로부터 각각의 서브 샘플을 제거하는 기기 피펫터(instrument pipettor)를 더 포함하는 시스템.
  60. 제 58 항 내지 제 59 항 중 어느 한 항에 있어서,
    광학 조립체;를 더 포함하고, 및
    각각의 희석 된 서브 시료의 세포 농도를 결정은,
    각각의 희석 된 서브 시료에 대해,
    전기동력학적 농도를 사용하여 양극(positive electrode)의 표면을 향해 상기 서브 샘플에서 세포의 이동을 생성;
    상기 서브 샘플 내의 세포를 핵산 염색으로 염색; 및
    광학 조립체를 사용하여 서브 샘플을 이미징하여 서브 샘플 내의 셀들의 수를 카운트;
    명령을 포함하는 시스템.
  61. 제 58 항 내지 제 60 항 중 어느 한 항에 있어서,
    FISH(fluorescence in situ hybridization) 프로브;를 포함하고, 및
    상기 동작들은,
    상기 FISH 프로브를 사용하여 상기 샘플에서 미생물의 종의 동일성을 결정; 및
    상기 표적 희석 인자를 결정하는 단계는 상기 확인 된 미생물과 관련된 미리 결정된 성장률을 설명하기 위해 상기 비선형 희석 곡선의 추정치를 조정; 을 포함하는 시스템.
  62. 프로세서를 사용하여 표적 희석 인자를 결정하는 단계; 및
    결정된 표적 희석 인자를 사용하여 샘플을 희석하는 단계;를 포함하고,
    상기 표적 희석 인자 결정 단계는,
    샘플에서 미생물과 관련된 성장 인자를 동정하는 단계;
    상이한 샘플 희석 인자를 사용하여 샘플의 하나 이상의 서브 샘플을 희석시키는 단계,
    상기 하나 이상의 희석 된 서브 샘플 각각에 대해, 상기 희석된 서브 샘플의 세포 농도를 결정하고,
    상기 하나 이상의 결정된 세포 농도 및 상기 관련 샘플 희석 인자를 사용하여 비선형 희석 곡선의 모델을 생성하는 단계 및
    상기 비선형 희석 곡선, 상기 성장 인자 및 상기 표적 세포 농도의 모델을 이용하여 상기 표적 희석 인자를 결정하는 단계;
    를 포함하는 샘플을 표적 세포 농도로 동적 희석하는 방법.
  63. 제 62 항에 있어서,
    상기 표적 희석 인자를 결정하는 단계는 상이한 희석 인자를 사용하여 상기 샘플의 3 개 이상의 서브 샘플을 희석시키는 단계; 및
    상기 3개 이상의 서브 샘플로부터 상기 3 개 이상의 결정된 세포 농도를 사용하여 비선형 희석 곡선의 모델을 생성하는 단계를 포함하는 샘플을 표적 세포 농도로 동적 희석하는 방법.
  64. 제 63 항에 있어서,
    상기 비선형 희석 곡선의 모델을 생성하는 단계는 다음 수학식 2를 사용하는 단계를 포함하는 샘플을 표적 세포 농도로 동적 희석하는 방법.
    [수학식 2]
    Figure pct00021

    (여기서, C1은 제 1 서브 샘플에 대한 제 1 결정된 세포 농도이고, D1은 C1과 관련된 제 1 샘플 희석 인자이고, C2는 제 2 서브 샘플에 대한 제 2 결정된 세포 농도이고, DT는 표적 희석 인자이고, CT는 표적 세포 농도이고, D2는 C2와 관련된 제 2 샘플 희석 인자이고, C3는 제 3 서브 샘플에 대한 제 3 결정된 세포 농도이고, D3는 C3와 관련된 제 3 샘플 희석 인자이고, G는 성장 인자이다.)
  65. 제 62 항 내지 제 64 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 비선형 희석 곡선의 모델을 생성하는 단계는,
    다음 수학식 3에 따라, 서브 샘플 농도를 사용하여 평균 농도를 결정하는 단계;를 포함하는 샘플을 표적 세포 농도로 동적 희석하는 방법.
    [수학식 3]
    Figure pct00022


    (Cavg는 평균 농도이고, N은 서브 샘플의 수이고, Ci는 서브 샘플 i에 대한 결정된 세포 농도이고, Di는 서브 샘플 i에 대한 상응하는 샘플 희석 인자이고, X는 0보다 크고 1 미만의 값을 갖는 비례 상수이다.)
  66. 제 65 항에 있어서,
    상기 표적 희석 배수를 결정하기 위해 상기 비선형 희석 곡선의 모델 및 상기 표적 세포 농도를 사용하는 단계는 수학식 4를 사용하는 것을 포함하는 샘플을 표적 세포 농도로 동적 희석하는 방법.
    [수학식 4]
    Figure pct00023


    (여기서, DT는 표적 희석 배수, CT는 표적 세포 농도, G는 성장 인자이다.)
  67. 온도 센서로부터 외장 내의 공기 온도를 판독하는 단계;
    상기 외장의 공기 온도가 증가되어야 한다고 결정하는 단계;
    현재 유휴 상태에 있는 시스템 내의 구성 요소를 프로세서를 사용하여 결정하는 단계; 및
    상기 결정된 구성 요소는 유휴 상태를 유지하는 동안, 상기 결정된 구성 요소에 전력을 증가시켜 열을 발생 시키는 단계;를 포함하는 시스템에서 온도를 제어하는 방법.
  68. 제 67 항에 있어서,
    상기 결정된 컴포넌트는 상기 스테퍼 모터가 상기 시스템 내에서 이동을 일으키는 능동 모드 및 상기 스테퍼 모터가 활동하지 않고 현재 위치를 유지하는 유휴 모드를 갖는 둘 이상의 스테퍼 모터인 시스템에서 온도를 제어하는 방법.
  69. 제 67 항 내지 제 68 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 외장의 공기 온도가 증가되어야 하는지를 결정하는 단계는 비례-적분-미분 알고리즘을 이용하는 단계를 포함하는 시스템에서 온도를 제어하는 방법.
  70. 제 67 항 내지 제 69 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 구성 요소들이 현재 유휴 상태로 간주되도록 미리 결정된 시간 동안 비활성 인 것을 모니터링 하는 단계를 더 포함하는 시스템에서 온도를 제어하는 방법.
  71. 제 67 항 내지 제 70 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 공기 온도가 감소되어야 한다고 결정하는 단계와, 상기 결정에 기초하여 최대 속도의 백분율로 팬을 작동시키는 단계를 더 포함하는 시스템에서 온도를 제어하는 방법.
  72. 제 67 항 내지 제 71 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 공기 온도의 판독 단계는, 서미스터(thermistor) 또는 열전대(thermocouple) 하나 이상을 포함하는 온도 센서로부터의 입력 온도 판독 값을 수신하는 단계를 포함하는 시스템에서 온도를 제어하는 방법.
  73. 제 67 항 내지 제 72 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 결정된 컴포넌트에 대한 전력의 증가는 유휴 상태 중에 전류를 증가시키기 위해 상기 결정된 컴포넌트에 대한 API (Application Programming Interface) 요청을 생성하는 단계를 포함하는 시스템에서 온도를 제어하는 방법.
  74. 제 67 항 내지 제 73 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 공기 온도가 감소되어야 한다고 결정하는 단계 및 현재 유휴 상태인 상기 구성 요소에 대한 전력을 감소시켜 상기 구성 요소가보다 더적은 열을 발생시키는 단계를 더 포함하는 시스템에서 온도를 제어하는 방법.
  75. 외장 내에서 현재 온도를 얻기 위해 온도 센서를 판독;
    상기 외장 내에 필요한 공기 냉각 수준을 결정;
    유휴 상태에 있는 시스템 내의 구성 요소의 경우 열 발생을 최소화하기 위해 상기 구성 요소의 전력을 낮춤; 및
    상기 결정된 냉각 수준에 따라 프로세서를 사용하여 팬 속도를 제어;를 포함하는 실행시에 컴퓨터 시스템이 외장 내의 온도를 제어하게 하는 명령들을 포함하는 컴퓨터 판독 가능 저장 매체.
  76. 제 75 항에 있어서,
    상기 외장 내에서 요구되는 가열 레벨을 결정하고, 열을 발생시키기 위해 유휴 상태인 상기 구성 요소에 대한 전력을 증가;를 더 포함하는 실행시에 컴퓨터 시스템이 외장 내의 온도를 제어하게 하는 명령들을 포함하는 컴퓨터 판독 가능 저장 매체.
  77. 제 75 항 내지 제 76 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 온도 센서의 판독은 프로세서를 이용해 서미스터 또는 열전대를 포함하는 온도 센서로부터 온도 정보를 판독;을 포함하는 실행시에 컴퓨터 시스템이 외장 내의 온도를 제어하게 하는 명령들을 포함하는 컴퓨터 판독 가능 저장 매체.
  78. 제 75 항 내지 제 77 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 컴포넌트로의 전력을 감소시키는 단계는 상기 컴포넌트와 관련된 전류를 최소 허용 전류로 설정;을 포함하는 실행시에 컴퓨터 시스템이 외장 내의 온도를 제어하게 하는 명령들을 포함하는 컴퓨터 판독 가능 저장 매체.
  79. 제 75 항 내지 제 78 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 구성 요소는 조정 가능한 유지 토크 전류를 갖는 스테퍼 모터들인 실행시에 컴퓨터 시스템이 외장 내의 온도를 제어하게 하는 명령들을 포함하는 컴퓨터 판독 가능 저장 매체.
  80. 제 75 항 내지 제 79 항 중 어느 한 항에 있어서,
    유휴 상태의 컴포넌트들은 미리 정해진 기간 동안 그들의 의도된 기능을 능동적으로 수행하지 않는 실행시에 컴퓨터 시스템이 외장 내의 온도를 제어하게 하는 동작 명령들을 포함하는 컴퓨터 판독 가능 저장 매체.
  81. 제 80 항에 있어서,
    적어도 하나의 컴포넌트는 상기 미리 결정된 시간 동안 이동하지 않은 스테퍼 모터인 실행시에 컴퓨터 시스템이 외장 내의 온도를 제어하게 하는 동작 명령들을 포함하는 컴퓨터 판독 가능 저장 매체.
  82. 환자 샘플에서 미생물을 동정하는 방법으로서,
    제 1 항 또는 제 2 항의 상기 시스템의 상기 카세트의 상기 복수의 미세 유체 채널에 환자 샘플을 도입하는 단계;
    미생물의 서열을 인식하고 결합하는 하나 이상의 표지된 범용 대조군 프로브 및 하나 이상의 표지된 표적 프로브를 도입하는 단계;
    상기 프로브들을 상기 환자 샘플 내의 미생물들에 결합을 가능하게 하기에 충분한 시간 동안 상기 표지된 프로브를 상기 샘플과 함께 배양하는 단계;
    표지 된 프로브에 결합된 하나 이상의 미생물의 다수의 시야의 이미지를 포착하는 단계;
    하나 이상의 이미지화된 미생물의 특성을 확인하기 위한 형태역학적 분석을 수행하는 단계;
    상기 환자의 샘플에서 하나 이상의 미생물을 동정하기 위해 상기 형태역학 분석으로부터의 데이터를 분포의 확률 기대 모델에 입력하는 단계,
    여기서, 병원체의 동정은 복수의 미세 유체 채널로부터의 사후 확률의 조합에 기초 하고; 및
    경험적 문턱 값을 이용하여 알려지지 않은 미생물의 신호 패턴을 표지된 표적 프로브의 사후 확률 밀도 함수와 매칭시키는 단계를 포함하는 미생물 동정 방법.
  83. 제 82 항에 있어서,
    하나 이상의 미생물의 다수의 시야의 이미지를 캡쳐하는 단계는 상기 다수의 시야의 암 필드 이미지를 캡쳐하는 단계를 더 포함하는 미생물 동정 방법.
  84. 제 82 항 또는 제 83 항에 있어서,
    상기 환자 샘플은 다균성인 미생물 동정 방법.
  85. 제 82 항 내지 제 84 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 배양 단계는 범용 대조군 염색으로 상기 샘플을 배양하는 것을 추가로 포함하는 미생물 동정 방법.
  86. 제 85 항에 있어서,
    상기 범용 대조군 염료는 범용 핵산 염료인 미생물 동정 방법.
  87. 제 86 항 에있어서,
    범용 핵산 염료가 아크리딘 오렌지(acridine orange) 또는 요오드화 프로피듐(propidium iodide)을 포함하는 미생물 동정 방법.
  88. 제 82 항 내지 제 87 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 분포의 확률 기대 모델은 공지된 미생물의 참고 패널상에서 상기 자동 현미경 검사 시스템을 훈련시킴으로써 생성되는 미생물 동정 방법.
  89. 제 82 항 내지 제 88 항 중 어느 한 항에 있어서,
    암시야 이미징은 자동 현미경 검사 시스템이 미생물로부터 아티팩트(artifact)를 식별 할 수 있게 하는 미생물 동정 방법.
  90. 제 82 항 내지 제 89 항 중 어느 한 항에 있어서,
    하나 이상의 오프-패널 미생물의 존재 또는 부재를 결정하기 위해 오프-패널 검출 로직(logic)이 발동되는 미생물 동정 방법.
  91. 제 82 항 내지 제 90 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 형태역학적 분석은 각 미세 유체 채널에 대한 사후 분포를 획득하기 위해 베이지안 프레임워크(Bayesian framework)를 통해 대상 특징을 처리하는 단계를 더 포함하는 미생물 동정 방법.
  92. 제 91 항에 있어서,
    상기 사후 분포는 커널 밀도 추정기(KDE)를 통과하고, 플로우 채널 당 이벤트의 결과 우도를 얻기 위해 적분되는 미생물 동정 방법.
  93. 제 82 항 내지 제 92 항 중 어느 한 항에 있어서,
    동정된 미생물을 항균제 감수성 분석에 적용시키는 단계를 더 포함하고, 상기 미생물은 항균제 내성 세포와 항균제 감수성 세포를 구별하기 위해 하나 이상의 항균제의 존재 또는 부재하에 뮐러-힌튼 영양소 결핍 배지(Mueller-Hinton nutrient-depleted media)에서 재배하는 단계를 포함하는 미생물 동정 방법.
  94. 제 93 항에 있어서,
    항균제 감수성 및 항균제의 최소 저해 농도를 결정하기 위해 까다로운 미생물을 1 % 피톤 트립토스(phytone tryptose) 뮬러 힌튼 한천에서 재배하는 미생물 동정 방법.
  95. 제 94 항에 있어서,
    1 % 피톤 트립토스 뮐러-힌튼 한천은 1 % 한천을 함유한 1% 피톤 1% 트립토스 양이온 조정된 뮐러-힌튼 배지인 미생물 동정 방법.
  96. 제 82 항에 있어서,
    상기 환자 샘플은 혈액 샘플, 소변 샘플 또는 호흡 샘플인 미생물 동정 방법.
  97. 제 82 항 내지 제 95 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 미생물은,
    황색 포도상 구균(Staphylococcus aureus), 포도상 구균 루그두넨시스 (Staphylococcus lugdunensis), 포도상 구균, 응고 효소 음성 포도상 구균 종(coagulase-negative Staphylococcus species), 엔테로코커스 패칼리스(Enterococcus faecalis), 엔테로코커스 패시움(Enterococcus faecium), 폐렴구균(Streptococcus pneumoniae), B군연쇄상구균(Streptococcus agalactiae), 스트렙코커스 속(Streptococcus spp.), 녹농균(Pseudomonas aeruginosa), 애시네토박터 바우마니(Acinetobacter baumannii), 클렙시엘라 종(Klebsiella spp.), 대장균 (Escherichia coli), 엔테로박터 종(Enterobacter spp.), 프로테우스 속(Proteus spp.), 시트로박터 속(Citrobacter spp.), 세라티아 마르세센스(Serratia marcescens), 칸디다 알비칸스(Candida albicans) 및 칸디다 글라브라타(Candida glabrata)를 포함하는 미생물 동정 방법.
  98. 제 93 항 내지 제 97 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 하나 이상의 항균제는 아미카신 (amikacin), 암피실린 (ampicillin), 암피실린-술박탐 (ampicillin-sulbactam), 아즈트레오남 (aztreonam), 세파졸린 (cefazolin), 세피피임 (cefepime), 세프타롤린 (ceftaroline), 세프타지딤 (ceftazidime), 세프트리악손 (ceftriaxone), 시프로플록사신 (ciprofloxacin), 콜리스틴 (colistin), 댑토마이신 (daptomycin), 독시사이클린 (doxycycline), 에리쓰로마이신 (erythromycin), 에르타페넴 (ertapenem), 겐타마이신 (gentamicin), 이미페넴 (imipenem), 리네졸리드 (linezolid), 메로페넴 (meropenem), 미노사이클린 (minocycline), 피페라실린-타조박탐 (piperacillin-tazobactam), 토브라마이신 (tobramycin), 트리메토프림-설파메톡사졸 (trimethoprim-sulfamethoxazole) 및 반코마이신 (vancomycin)을 포함하는 미생물 동정 방법.
  99. 표적 미생물을 동정하는 방법으로서,
    카메라에서, 상이한 방식의 광을 사용하여 대상의 다수의 이미지를 포착하는 단계;
    식별된 상기 물체들의 특징을 결정하는 단계;
    알려진 미생물에 대한 신호, 잡음 및 누화에 기초한 복수의 모델을 제공하는 단계;
    상기 복수의 모델 및 상기 식별된 물체의 상기 결정된 특징을 이용하여 신호 및 잡음 또는 누화 중 적어도 하나에 대한 확률 분포를 계산하는 단계; 과
    상기 계산된 확률 분포를 이용하여 상기 촬영된 다수의 영상 중 적어도 하나에 상기 미생물이 존재 하는지 여부를 판단하는 단계;를 포함하는 미생물 동정 방법.
  100. 제 99 항에 있어서,
    상기 다수의 이미지를 캡쳐하는 단계는 적어도 2 개의 형광 광원 및 암시야 이미징에 적합한 적어도 하나의 광원을 이용하는 단계를 포함하는 미생물 동정 방법.
  101. 제 99 항 내지 제 100 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 특징을 결정하는 단계는 상기 식별된 대상의 형상, 강도 및 방향을 결정하는 단계를 포함하는 미생물 동정 방법.
  102. 제 99 항 내지 제 101 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 누화는 비특이적 프로브 결합과 관련되는 미생물 동정 방법.
  103. 제 99 항 내지 제 102 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 식별된 객체 및 각 객체와 관련된 상기 특징 각각을 식별하는 행렬 테이블을 생성하는 단계를 더 포함하는 미생물 동정 방법.
  104. 제 99 항 내지 제 103 항 중 어느 한 항에 있어서,
    미생물의 오프-패널 존재를 검출하는 단계를 더 포함하는 미생물 동정 방법.
  105. 제 99 항 내지 제 103 항 중 어느 한 항에 있어서,
    오프-패널 미생물의 부존재를 검출하는 단계를 더 포함하는 미생물 동정 방법.
  106. 제 99 항 내지 제 105 항 중 어느 한 항에 있어서,
    오프-패널 미생물의 부존재를 검출하는 단계를 더 포함하는 미생물 동정 방법.
  107. 제 99 항 내지 제 106 항 중 어느 한 항에 있어서,
    미생물이 존재하지 않을 때, 오프-패널 미생물의 검출이 존재하는 미생물 동정 방법.
  108. 제 99 항 내지 제 107 항 중 어느 한 항에 있어서,
    미생물이 존재하지 않을 때, 오프-패널 미생물의 검출이 존재하지 않는 미생물 동정 방법.
  109. 실행시에 컴퓨터 시스템으로 하여금 미생물을 동정하게 하는 명령들을 포함하는 컴퓨터 판독 가능 저장 매체에 있어서,
    카메라에서, 암필드 이미지 및 관심 대상의 적어도 하나의 형광 이미지를 포착;
    프로세서를 사용하여 상기 대상과 관련된 다수의 특징들을 식별;
    미생물에 대한 신호, 잡음 및 누화 데이터를 포함하는 모델과 상기 다수의 특징을 비교; 및
    상기 관심 대상이 상기 미생물인지 여부를 결정;
    명령을 포함하는 컴퓨터 판독 가능 저장 매체.
  110. 제 109 항에 있어서,
    상기 적어도 하나의 형광 이미지는 제 1 파장의 제 1 형광 광원을 사용하는 제 1 이미지이고, 제 2 형광 광원을 사용하여 제 2 파장에서 상기 관심 대상의 이미지를 캡쳐하는 명령을 더 포함하는 컴퓨터 판독 가능 저장 매체.
  111. 제 109 항 내지 제 110 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 대상의 상기 다수의 특징은 형상, 강도 및 방향을 포함하는 컴퓨터 판독 가능 저장 매체.
  112. 제 109 항 내지 제 111 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 누화 데이터는 비특이적 프로브 결합과 관련되는 컴퓨터 판독 가능 저장 매체.
  113. 제 109 항 내지 제 112 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 결정 단계는 상기 미생물이 존재하지 않는다고 결정하지만, 다른 미생물의 오프-패널 존재를 결정;
    명령을 포함하는 컴퓨터 판독 가능 저장 매체.
  114. 제 109 항 내지 제 112 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 결정 단계는 상기 미생물이 존재한다고 결정하고, 다른 미생물의 오프-패널 존재를 결정;
    명령을 포함하는 컴퓨터 판독 가능 저장 매체.
  115. 제 109 항 내지 제 114 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 모델은 특징을 상이한 미생물과 비교하는 복수의 모델을 병렬로 포함하는 컴퓨터 판독 가능 저장 매체.
  116. 시약을 포함하는 다수의 웰; 및
    개구;를 포함하고,
    상기 시약을 포함하는 다수의 웰은 프로브를 포함하는 적어도 하나의 웰 및 항균제를 포함하는 적어도 하나의 웰을 포함는 시약 카트리지.
  117. 제 116 항에 있어서,
    프로브를 포함하는 상기 적어도 하나의 웰은,
    황색 포도상구균 (Staphylococcus aureus) 프로브를 포함하는 웰, 응고 효소 - 음성 포도상구균 (staphylococci) 프로브를 포함하는 웰, 포도상구균 루그두넨시스(Staphylococcus lugdunensis) 프로브를 포함하는 웰, 엔테로코커스 패칼리스(Enterococcus faecalis) 프로브, B군연쇄상구균(Streptococcus agalactiae) 프로브를 포함하는 웰, 스트렙코커스 속(Streptococcus spp.) 프로브를 포함하는 웰, 대장균 (Escherichia coli) 프로브를 포함하는 웰, 클렙시엘라 종(Klebsiella spp.) 프로브를 포함하는 웰, 엔테로박터 종(Enterobacter spp.) 프로브를 포함하는 웰, 시트로박터 속(Citrobacter spp.) 프로브를 포함하는 웰, 프로테우스 속(Proteus spp.) 프로브를 포함하는 웰, 세라티아 마르세센스(Serratia marcescens) 프로브를 포함하는 웰, 녹농균(Pseudomonas aeruginosa) 프로브를 포함하는 웰, 애시네토박터 바우마니(Acinetobacter baumannii) 프로브를 포함하는 웰, 칸디다 알비칸스(Candida albicans) 프로브를 포함하는 웰 및 칸디다 글라브라타(Candida glabrata) 프로브를 포함하는 웰을 포함하는 시약 카트리지.
  118. 제 117 항에 있어서,
    프로브를 포함하는 상기 적어도 하나의 웰은 범용 미생물 프로브를 더 포함하는 시약 카트리지.
  119. 제 116 항 내지 제 118 항 중 어느 한 항에 있어서,
    항균제를 포함하는 상기 적어도 하나의 웰은,
    아미카신 (amikacin)을 포함하는 웰, 암피실린 (ampicillin)을 포함하는 웰, 암피실린-술박탐 (ampicillin-sulbactam)을 포함하는 웰, 아즈트레오남 (aztreonam)을 포함하는 웰, 세파졸린 (cefazolin)을 포함하는 웰, 세피피임 (cefepime)을 포함하는 웰, 세파롤린 (ceftaroline)을 포함하는 웰, 세파지딤 (cefazidime)을 포함하는 웰, 시프로플록사신 (ciprofloxacin)을 포함하는 웰, 콜리스틴 (colistin)을 포함하는 웰, 댑토마이신 (daptomycin)을 포함하는 웰, 독시사이클 (doxycycline)을 포함하는 웰, 에르타페넴 (ertapenem)을 포함하는 웰, 에리쓰로마이신 (erythromycin)을 포함하는 웰, 겐타마이신 (gentamicin)을 포함하는 웰, 이미페넴 (imipenem)을 포함하는 웰, 리네졸리드 (linezolid)을 포함하는 웰, 메로페넴 (meropenem)을 포함하는 웰, 미노사이클린 (minocycline)을 포함하는 웰, 매크로라이드-린코사마이드-스트렙토그라민 B (macrolide-lincosamide-streptogramin B)를 포함하는 웰, 세폭시틴 (cefoxitin)을 포함하는 웰, 피페라실린-타조박탐 (piperacillin-tazobactam)을 포함하는 웰, 스트렙토마이신 (streptomycin)을 포함하는 웰, 토브라마이신 (tobramycin)을 포함하는 웰, 트리메토프림-설파메톡사졸 (trimethoprim-sulfamethoxazole)을 포함하는 웰 및 반코마이신 (vancomycin)을 포함하는 웰을 포함하는 시약 카트리지.
  120. 제 116 항 내지 제 119 항 중 어느 한 항에 있어서,
    세척 용액을 포함하는 하나 이상의 적어도 하나의 웰, 투과성(permeabilization) 용액을 포함하는 적어도 하나의 웰, 버퍼를 포함하는 적어도 하나의 웰, 범용 셀 염색제를 포함하는 적어도 하나의 웰 및 물을 포함하는 적어도 하나의 웰을 포함하는 시약 카트리지.
  121. 제 120 항에 있어서,
    상기 범용 염색제는 아크리딘 오렌지 또는 요오드화 프로피듐을 포함하는 시약 카트리지.
  122. 제 116 항 내지 제 122 항 중 어느 한 항에 있어서,
    양이온 보정된 뮐러-힌튼 (Mueller-Hinton) 배지를 포함하는 하나 이상의 적어도 하나의 웰 및 뮐러-힌튼 한천을 포함하는 하나 이상의 웰을 더 포함하는 시약 카트리지.
  123. 제 122 항에 있어서,
    양이온 보정 된 뮐러-힌튼 (Mueller-Hinton) 배지는 1% 피톤 트립토스(phytone tryptose) 양이온 보정 된 뮐러 - 힌튼 (Mueller-Hinton) 배지 또는 뮐러-힌튼 (Mueller-Hinton) 한천이 1% 피톤 트립토스(phytone tryptose) 양이온 보정 뮐러-힌튼 한천을 포함하는 시약 카트리지.
  124. 제 3 항에 있어서,
    제 116 항 내지 제 123 항 중 어느 한 항의 상기 시약 카트리지를 포함하는 시약 카트리지 키트.
  125. 제 1 항에 있어서,
    상기 카세트는 성형된 중합체 디스크에 접착된 유리 지지체를 포함하는 적층 구조를 포함하는 시스템.
  126. 제 1 항에 있어서,
    상기 복수의 미세 유체 샘플 채널은 상기 카세트를 가로질러 방사형으로 배열되는 시스템.
  127. 제 1 항, 제 125 항 및 제 126 항 중 어느 한 항에 있어서,
    각각의 미세 유체 샘플 채널은 출구 포트를 포함하는 시스템.
  128. 제 1 항에 있어서,
    상기 입구 포트는 상기 카세트의 외주부를 향하여 배향되고 상기 카세트의 외주부 부근에 위치되는 시스템.
  129. 제 1 항에 있어서,
    상기 입구 포트는 상기 카세트의 상기 중앙 근처에 위치되고 상기 출구 포트는 상기 카세트의 상기 외주 근처에 위치하는 시스템.
  130. 자동 미생물 동정 및 항생제 감수성 테스트 시스템에 통합 된 카세트로서,
    성형된 중합체 디스크에 접착 된 유리 지지체; 및
    상기 카세트를 가로 질러반경 방사형으로 배치 된 복수의 미세 유체 채널을 포함하는 카세트.
  131. 제 130 항에 있어서,
    각각의 미세 유체 채널은
    피펫 팁을 수용하도록 구성된 유입 포트; 및
    출구 포트를 포함하는 카세트.
  132. 제 130 항에 있어서,
    상기 성형된 중합체 디스크는,
    광학적으로 투명한 중합체; 및
    선택적으로 광학적으로 투명한 전도층으로 적어도 부분적으로 코팅 된 하부 표면을 갖는 카세트.
  133. 제 132 항에 있어서,
    상기 광학적으로 투명한 전도층은 약 70 내지 약 100 ohms/square의 저항을 갖는 인듐 주석 산화물을 포함하는 카세트.
  134. 제 130 항 또는 제 133 항에 있어서,
    상기 유리 지지체는 폴리-L-리신 및 인듐 주석 산화물로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 부재로 코팅되는 카세트.

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