KR102145842B1 - 정확한 관찰이 용이한 신속한 세포배양검사 장치 - Google Patents

정확한 관찰이 용이한 신속한 세포배양검사 장치 Download PDF

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Abstract

복수의 웰 유닛들을 구비한 세포배양검사 장치로서, 상기 웰 유닛은 제1 유체 및 제2 유체를 주입하기 위한 입구부; 및 상기 제1 유체를 수용하기 위한 제1 서브웰을 포함하는 바닥부를 포함하되, 상기 웰 유닛의 내벽의 둘레를 따라 상기 웰 유닛의 중심방향으로 돌출된 제1 단차부가 존재함으로써, 상기 웰 유닛이 상기 입구부 쪽의 상단부보다 좁은 내부 너비를 갖는 하단부를 갖는 것인 세포배양검사 장치가 제공된다.

Description

정확한 관찰이 용이한 신속한 세포배양검사 장치{Rapid Cell Culture Device With Accurate Observation}
본 명세서에 개시된 기술은 세포배양검사 장치에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 유체 분주 시 칩의 웰 내에서 고르게 분포하여 정확한 관찰이 용이한 세포배양검사 장치에 관한 것이다.
인체 감염균에 의한 감염 시 적절한 시기에 항생제를 처방 받는 것은 생존율에 큰 영향을 끼친다. 올바른 항생제 처방을 위해서는 우선 감염 원인균주의 생장이 특정 항생제의 특정 농도에서 억제되는지에 대한 확인이 필요한데, 이러한 확인을 항생제 감수성 검사라고 부른다.
항생제 감수성 검사는 일반적으로 감염 원인균을 배양액과 항생제를 다양한 농도로 섞은 마이크로 웰에서 18시간 가량 배양한 후 자랐는지 여부를 광투과성으로 판단하게 되는데, 여기에 소요되는 배양 시간을 최소화하고 업무를 자동화하기 위한 제품이 많이 개발되고 있다.
배양 시간을 최소화하기 위해서는 우선 배양 환경의 소형화가 기본적인 조건이며, 이러한 소형화와 자동화를 위해 미세 유체를 분주하고 원하는 형상과 시퀀스로 조정할 수 있는 마이크로 단위의 구조물을 가지는 일회용 플라스틱 플레이트를 도입하는 사례가 급증하는 추세이다.
한편 본 출원인은 이러한 미세유체 플레이트를 도입하여 현미경 이미징 방식으로 균의 성장 여부를 판단하는 항생제 감수성 검사 시스템을 개발하였는데, 본 시스템을 이용하면 수 시간 내에 항생제 감수성 검사를 마칠 수 있는 장점이 있으나, 유체의 이동 및 정착 과정에서 전체 웰에 균일하게 퍼지지 않고 미세유체 플레이트의 한쪽 벽면에 달라붙는 현상이나 버블 발생 등에 의해 항생제 감수성 검사 결과가 왜곡되는 문제가 발생할 수 있어 이를 개선한 새로운 안이 필요하다.
(0001) 대한민국 공개특허 제10-2017-0132856호 (0002) 대한민국 공개특허 제10-2017-0003177호
전술한 문제를 해결하기 위하여, 본 발명은 유체 분주 시 칩의 웰 내에서 고르게 분포하여 정확한 관찰이 용이한 세포배양검사 장치를 제공하고자 한다.
본 명세서에 개시된 기술의 일 측면에 의하면, 복수의 웰 유닛들을 구비한 세포배양검사 장치로서, 상기 웰 유닛은 제1 유체 및 제2 유체를 주입하기 위한 입구부; 및 상기 제1 유체를 수용하기 위한 제1 서브웰을 포함하는 바닥부를 포함하되, 상기 웰 유닛의 내벽의 둘레를 따라 상기 웰 유닛의 중심방향으로 돌출된 제1 단차부가 존재함으로써, 상기 웰 유닛이 상기 입구부 쪽의 상단부보다 좁은 내부 너비를 갖는 하단부를 갖는 것인 세포배양검사 장치를 제공한다.
일 구현 예에 있어서, 상기 제1 단차부는 상기 제2 유체의 주입시 상기 바닥부로부터 수직방향 전진을 막을 수 있도록 상기 제2 유체의 전진방향에 대해 90도 이상의 각도를 갖는 것일 수 있다.
일 구현 예에 있어서, 상기 제1 단차부는 상기 내벽의 둘레를 따라 연결된 모서리의 형상을 가질 수 있다.
일 구현 예에 있어서, 상기 제1 단차부의 높이는 상기 바닥부의 내부 모서리로부터 상기 바닥부 중심까지의 거리보다 작을 수 있다.
일 구현 예에 있어서, 상기 제1 단차부의 높이는 0.2mm 이상, 4mm 이하일 수 있다.
일 구현 예에 있어서, 상기 바닥부와 유닛 내벽이 형성하는 바닥부의 내부모서리는 상기 내벽의 둘레를 따라 연결된 모서리의 형상을 가질 수 있다.
일 구현 예에 있어서, 상기 바닥부와 유닛 내벽이 형성하는 바닥부의 내부모서리는 바닥부를 기준으로 70~120°의 각도를 가질 수 있다.
일 구현 예에 있어서, 상기 바닥부에는 상기 제2 유체를 수용할 수 있으며 항생제를 특정 위치에 적재하기 위한 제2 서브웰을 포함할 수 있다.
일 구현 예에 있어서, 상기 제1 서브웰 및 제2 서브웰은 상기 웰 유닛의 바닥부 직경보다 작게 제작되어 제2 단차부를 형성할 수 있다.
일 구현 예에 있어서, 상기 제2 단차부는 상기 유체의 주입시 상기 바닥부로부터 수직방향 전진을 막을 수 있도록 상기 유체의 전진방향에 대해 90도 이상의 각도를 가질 수 있다.
일 구현 예에 있어서, 상기 제1 서브웰의 내부 모서리는 곡선형을 가질 수 있다.
일 구현 예에 있어서, 상기 제1 서브웰의 내부 모서리는 곡률반경이 0.1~1mm이며, 높이가 0.1~1mm일 수 있다.
일 구현 예에 있어서, 상기 제2 서브웰의 내부 모서리는 곡선형을 가질 수 있다.
일 구현 예에 있어서, 상기 제1 유체는 고형화제를 함유한 액상 매질과 생물학적 물질의 혼합용액이고, 상기 제2 유체는 물, 세포배양용 배지, Dimethylformamide(DMF) 또는 Dimethyl sulfoxide (DMSO)를 포함하는 용매일 수 있다.
본 명세서에 개시된 기술의 다른 측면에 의하면, 복수의 웰 유닛들이 정렬되어 형성된 어레이 구조를 가지는 복수의 웰 유닛들을 구비한 세포배양검사 장치를 이용한 세포의 분석 방법으로서, 상기 웰 유닛은 고형화제를 함유한 액상 매질과 생물학적 물질의 혼합용액인 제1 유체 및 물, 세포배양용 배지, Dimethylformamide(DMF) 또는 Dimethyl sulfoxide (DMSO)를 포함하는 용매인 제2 유체를 주입하기 위한 입구부; 및 상기 제1 유체를 수용하기 위한 제1 서브웰과 상기 제2 유체를 수용할 수 있으며 항생제를 적재하기 위한 제2 서브웰을 포함하는 바닥부; 상기 웰 유닛의 내벽의 둘레를 따라 상기 웰 유닛의 중심방향으로 돌출된 제1 단차부가 존재함으로써, 상기 웰 유닛이 상기 입구부 쪽의 상단부보다 좁은 내부 너비를 갖는 하단부;를 포함하며, (a) 상기 제1 유체를 상기 제1 서브웰에 주입하고, 상기 혼합용액을 고화하여 고체 박막을 형성하는 단계; (b) 상기 제2 유체를 제2 서브웰에 투입하여 항생제를 분산 또는 용해하며, 제2 유체를 제2 서브웰 상부의 웰 유닛까지 투입하여 상기 제1 서브웰 내부의 제1 유체의 고체 박막과 접촉시키는 것으로 상기 항생제를 상기 고체 박막으로 확산시키는 단계; 및 (c) 상기 제1 유체의 고체 박막과 상기 제2 유체가 서로 만나 형성된 계면에서 일어나는 생물학적 물질의 변화를 단일세포 단위로 관찰하는 단계;를 포함하는 세포의 분석 방법을 제공한다.
일 구현 예에 있어서, (d) 상기 항생제에 대한 생물학적 물질의 변화를 단일 세포 단위로 관찰하여 최소 억제 농도(Minimum Inhibitory Concentration, MIC) 또는 최소 바이오필름 박멸 농도(Minimum Biofilm Eradication Concentration, MBEC)를 측정하는 단계를 더 포함할 수 있다.
본 발명에 의한 정확한 관찰이 용이한 신속한 세포배양검사 장치는 유체의 주입시 정확한 양을 주입할 수 있으며, 내부에 기포와 같은 이상이 생기는 것을 최대한 방지할 수 있어 기존의 항생제 검사장치에 비하여 정확한 검사를 수행할 수 있으며, 고체박막 내에 고정된 세포를 이용하여 항생제의 거동을 관찰하고 있어 기존의 장치에 비하여 신속한 항생제 감수성 검사가 가능하다.
또한 본 발명에 의한 정확한 관찰이 용이한 신속한 세포배양검사 장치는 일반적으로 단일 세포(single bacteria)의 성장변화는 수십 분(보통 30분) 이내에 관찰이 가능하고, 단일 세포 군집(single colony of bacteria)의 변화에는 보통 4~6시간 이내에 관찰이 가능하기 때문에 생물학적 물질에 대한 생리활성물질의 영향을 기존 방식에 비해 정확하고 빠르게 확인할 수 있다.
또한 본 발명에 의한 정확한 관찰이 용이한 신속한 세포배양검사 장치는 생리활성물질에 대한 생물학적 물질의 변화를 단일 세포 군집 단위로 관찰하여 최소 억제 농도(Minimum Inhibitory Concentration, MIC) 또는 최소 바이오필름 박멸 농도(Minimum Biofilm Eradication Concentration, MBEC)를 측정할 수 있음에 따라, 항생제 감수성 시험 뿐 아니라 바이오필름 어세이(biofilm assay)에도 매우 유용하게 활용할 수 있다.
도 1은 세포배양검사 장치의 일 구현 예를 나타낸다.
도 2는 본 명세서에 개시된 기술의 일 구현 예에 따른 세포배양검사 장치의 웰 유닛의 단면을 나타낸 것이다.
도 3은 제1 유체 및 제2 유체를 웰 유닛에 도입하여 항생제 감수성 검사를 하는 과정을 나타낸다.
도 4는 (a) 표면장력에 의하여 내벽의 일부에 고르게 퍼지지 못한 유체를 도시한 것이며, (b)는 그 단면을 각기 나타낸 것이다.
도 5는 구조물의 두 표면이 만나는 모서리에서의 접촉각을 각기 나타낸 것이다.
도 6은 구조물의 한 표면에서의 이동거리와 두 표면이 만나는 모서리에서의 이동거리를 각기 나타낸 것이다.
도 7은 단차부에서의 유체이동양상을 간략히 도시한 것이다.
도 8은 유체가 웰 유닛에 주입될 때의 거동을 간략히 나타낸 것이다.
도 9는 유체가 웰 유닛에 주입될 때 단차부의 유무에 따른 유체의 거동을 간략히 나타낸 것이다.
도 10은 유체가 제1 서브웰 및 제2 서브웰에 주입될 때 모서리가 뾰족한 코너에서의 버블 발생을 나타낸 것이다.
도 11은 유체가 제1 서브웰 및 제2 서브웰에 주입될 때 모서리가 둥근 코너에서의 유체 이동을 나타낸 것이다.
이하 본 명세서에 개시된 기술에 대해 도면을 참조하여 보다 상세히 설명하고자 한다.
이하, 첨부한 도면들을 참조하여, 본 명세서에 개시된 기술의 구현 예들을 보다 상세하게 설명하고자 한다. 그러나 본 명세서에 개시된 기술은 여기서 설명되는 구현 예들에 한정되지 않고 다른 형태로 구체화될 수도 있다. 단지, 여기서 소개되는 구현 예들은 개시된 내용이 철저하고 완전해질 수 있도록 그리고 당업자에게 본 기술의 기술적 사상이 충분히 전달될 수 있도록 하기 위해 제공되는 것이다. 도면에서 각 장치의 구성요소를 명확하게 표현하기 위하여 상기 구성요소의 폭이나 두께 등의 크기를 다소 확대하여 나타내었다. 전체적으로 도면 설명 시 관찰자 시점에서 설명하였고, 일 요소가 다른 요소 위에 위치하는 것으로 언급되는 경우, 이는 상기 일 요소가 다른 요소 위에 바로 위치하거나 또는 그들 요소들 사이에 추가적인 요소가 개재될 수 있다는 의미를 모두 포함한다. 또한, 해당 분야에서 통상의 지식을 가진 자라면 본 발명의 기술적 사상을 벗어나지 않는 범위 내에서 본 발명의 사상을 다양한 다른 형태로 구현할 수 있을 것이다. 그리고, 복수의 도면들 상에서 동일 부호는 실질적으로 서로 동일한 요소를 지칭한다.
한편, 본 명세서에서 서술되는 용어의 의미는 다음과 같이 이해되어야 할 것이다. "제1 " 또는 "제2 " 등의 용어는 하나의 구성요소를 다른 구성요소로부터 구별하기 위한 것으로 이들 용어들에 의해 권리범위가 한정되어서는 아니 된다. 예를 들어, 제1 구성요소는 제2 구성요소로 명명될 수 있고, 유사하게 제2 구성요소도 제1 구성요소로 명명될 수 있다.
또, 단수의 표현은 문맥상 명백하게 다르게 뜻하지 않는 한 복수의 표현을 포함하는 것으로 이해되어야 하고, "포함하다" 또는 "가지다"등의 용어는 기술되는 특징, 숫자, 단계, 동작, 구성요소, 부분품 또는 이들을 조합한 것이 존재함을 지정하려는 것이지, 하나 또는 그 이상의 다른 특징들이나 숫자, 단계, 동작, 구성요소, 부분품 또는 이들을 조합한 것들의 존재 또는 부가 가능성을 미리 배제하지 않는 것으로 이해되어야 한다. 또, 방법 또는 제조 방법을 수행함에 있어서, 상기 방법을 이루는 각 과정들은 문맥상 명백하게 특정 순서를 기재하지 않은 이상 명기된 순서와 다르게 일어날 수 있다. 즉, 각 과정들은 명기된 순서와 동일하게 일어날 수도 있고 실질적으로 동시에 수행될 수도 있으며 반대의 순서대로 수행될 수도 있다.
본 명세서에 개시된 기술의 일 측면에 의하면, 복수의 웰 유닛들을 구비한 세포배양검사 장치가 제공된다. 도 1은 세포배양검사 장치의 일 구현 예를 나타낸다. 도 1의 (a)는 세포배양검사 장치의 전체적인 구성을 나타낸 도면이고, (b)는 세포배양검사 장치의 일부를 확대한 것이고 (c)는 웰 유닛의 단면을 나타낸 것이다. 도 1을 참조하면, 세포배양검사 장치(100)은 복수의 정렬된 웰 유닛(110)들을 구비한다. 이 때 상기 웰 유닛(110)이 다수 정렬되어 전체적으로 상용 멀티-웰 플레이트와 유사한 규격을 가질 수 있다. 바람직하게는 웰 유닛(110)의 중심이 상용 멀티-웰의 중심과 일치할 수 있다. 도 2를 참조하면, 웰 유닛(110)은 제1 유체 및 제2 유체를 투입하기 위한 입구부(120)와 제1 서브웰(132)을 갖는 바닥부(130)를 포함한다. 또한 웰 유닛(110)의 내벽의 둘레를 따라 상기 웰 유닛의 중심방향으로 돌출된 제1 단차부(140)가 존재한다. 아울러 필요에 따라 상기 바닥부에는 제2 서브웰(134)이 추가로 포함될 수 있다.
화학적, 생화학적, 및/또는 생물학적 분석에 있어서 멀티-웰 플레이트는 다수의 샘플을 처리하고 분석하기 위한 표준 도구이다. 멀티-웰 플레이트는 다양한 형태, 크기 및 모양을 취할 수 있는데, 일반적으로 표준 크기 및 모양으로 만들어지고, 웰들의 표준 배열을 가진다. 상기 멀티-웰 플레이트와의 호환성을 위하여 상기 복수의 웰유닛은 96-웰 플레이트(12x8의 웰 배열), 384-웰 플레이트(24x16의 웰 배열), 및 1536-웰 플레이트(48x32의 웰 배열)의 표준 웰배열을 가질 수 있으며, 기타 다양한 방식의 상용 멀티-웰 플레이트와 동일 또는 유사한 배열을 가질 수 있다. 세포배양검사 장치(100)이 상용 멀티-웰 플레이트와 동일 또는 유사한 규격을 가짐으로써 종래의 다양한 생물학적 분석 기술과 용이하게 호환될 수 있다. 따라서 본 발명에서 복수의 웰 유닛은 1x1, 1x2, 1x4, 2x4, 4x6, 12x8, 24x16 또는 48x32의 웰 배열을 갖는 것일 수 있다.
입구부(120)는 통상 웰 유닛(110)의 상부에 위치하며 전면이 개방된 형태 또는 부분적으로 개방된 형태일 수 있다. 입구부(120)는 단일 또는 복수의 개구부를 구비할 수 있다. 피펫팅이나 인젝션 등에 의해 상기 제1 유체 및 상기 제2 유체가 입구부(120)을 통해 웰 유닛(110) 내부에 도입될 수 있다.
바닥부(130)는 깊이 방향으로 움푹 들어간 제1 서브웰(132)을 구비하며, 제1 서브웰(132)은 입구부(120)를 통해 도입된 상기 제1 유체를 수용할 수 있다. 또한 상기 제2 유체를 상기 입구부(120)에 직접 주입하는 것도 가능하지만 바람직하게는 상기 바닥부에 제2 서브웰(134)을 설치하여 입구부(120)를 통해 도입된 상기 제2 유체의 적어도 일부를 수용할 수 있다.
이때 상기 제1 서브웰(132)를 통하여 박테리아의 성장 변화를 관찰하게 되므로 상기 제1 서브웰(132)의 단면적을 최대한 크게 하는 것이 바람직하다. 이를 위하여 상기 제1서브웰(132)은 횡단면이 원형 또는 타원형으로 제작될 수 있으며, 제2 서브웰(134)이 설치되는 경우 제2 서브웰(134)의 횡단면은 타원형 또는 초승달형으로 제작될 수 있다. 상기 제1 서브웰(132) 및 제2 서브웰(134)이 각각 원형의 횡단면을 가지도록 제작되는 경우 상기 제1 서브웰과 제2서브웰의 직경의 합은 상기 바닥부(130)의 직경을 초과할 수 없다. 특히 제2 서브웰(134)에 일정량의 항생제 또는 제2 유체가 주입되어야 하므로 실질적으로는 상기 제1 서브웰(132)의 직경은 상기 바닥부(130) 직경의 2/3까지로 제한된다. 하지만 상기 제1서브웰(132)을 타원형의 횡단면을 가지도록 제작하는 경우 제2 서브웰(134)의 크기 변화 없이 더욱 넓은 시야를 확보할 수 있으며, 제2 서브웰(134)을 타원형 또는 초승달형의 횡단면을 가지도록 제작하는 경우 제2 서브웰(134)의 수용량을 유지하면서도 상기 제1 서브웰(132)의 직경을 더욱 크게 제작할 수 있다.
또한 상기 제1 서브웰(132)과 제2 서브웰(134)은 분리격벽(142)를 통하여 물리적으로 구분될 수 있다. 상기 분리격벽(142)은 제1 서브웰(132) 및 제2 서브웰(134)을 수평방향으로 분리시켜주는 역할을 수행하지만 수직방향으로는 물리적인 분리가 되지 않아 제2 유체가 공급되는 경우 상기 분리격벽의 상부를 통하여 제2 유체가 제1 서브웰로 공급될 수 있도록 할 수 있다. 특히 본 발명에서는 상기 제2 유체에 의하여 분산 또는 용해된 항생제가 상기 제1 유체의 고체 박막과 접촉하여야 하므로 상기 분리격벽의 높이는 상기 제1 서브웰(132) 및 제2 서브웰(134)의 측면 벽과 유사한 높이를 가지는 것이 바람직하다. 아울러 본 발명의 바닥부와 상기 제1 서브웰 및 제2 서브웰의 경계면에 후술할 제2 단차부가 형성되는 경우 상기 분리격벽의 상부도 제2 단차부로서 작동할 수 있다.
상기 제1 유체 및 상기 제2 유체는 통상적으로 물을 70~99 중량% 바람직하게는 85~99 중량%, 가장 바람직하게는 93~99 중량% 의 분산매 또는 용매로서 포함할 수 있다. 예를 들어, 상기 제1 유체는 고형화제(gelling agent)를 함유한 액상 매질과 생물학적 물질(biological agent)의 혼합용액일 수 있다. 상기 범위 내에서 물은 분산매로서 최적의 성능을 발휘할 수 있다.
상기 액상 매질(제1 유체 및 제2 유체)은 물을 포함할 수 있으며 고형화제의 존재에 의해 고체화될 수 있다. 고형화제의 예로 한천(agar), 아가로즈(agarose), 젤라틴(gelatin), 알기네이트(alginate), 콜라겐(collagen), 피브린(fibrin) 등을 들 수 있다. 바람직하게는 한천 또는 아가로즈가 사용될 수 있다. 일 예로 액상 매질 내에는 한천이 0.3 내지 4 중량% 가 사용될 수 있다. 통상적으로 액상 매질은 영양성분을 필요로 하지 않지만, 몇몇 예에 있어 영양성분을 포함할 수도 있고, 특정 세포의 분열을 촉진시키는 배지를 포함한 용액일 수 있다. 상기 한천이 0.3 중량% 미만으로 포함되는 경우 고형화가 이루어지지 않을 수 있으며, 4 중량% 를 초과하는 경우 과도한 고형화로 인하여 생물학적 물질의 확산이 용이하지 않을 수 있다.
상기 생물학적 물질은 바이러스, 박테리아, 균류, 조류, 원생동물, 기생 병원균, 사람 또는 포유류의 세포 및 바이오필름 등을 포함한다. 또한 상기 생물학적 물질은 박테리아, 바이러스, 균류 등과 같이 감염성을 나타내는 생물학적 물질과 혈구 세포의 혼합 상태일 수 있다. 예를 들어, 박테리아에 감염된 사람으로부터 채취한 혈액일 수 있는데, 이런 경우 혈구 세포와 박테리아 세포를 구별할 수 있도록 박테리아 세포의 분열만 촉진시키는 배지를 사용하여 혈구 세포와의 크기 변화 차이로 구별할 수 있다. 상기 생물학적 물질은 액상 또는 고상의 배지 내에서 성장할 수 있고 외부 생리활성물질의 종류 및 농도에 따라 성장에 영향을 받을 수 있다. 상기 혼합 용액 내에서의 상기 생물학적 물질의 밀도는 102 내지 1010 cells/ml, 바람직하게는 104 내지 109 cells/ml, 더 바람직하게는 105 내지 108 cells/ml 일 수 있다. 상기 범위 미만에서는 생물학적 물질의 위치를 파악하기 어려울 수 있고 상기 범위 초과에서는 개별적인 생물학적 물질의 상태를 파악하기 어려울 수 있다.
바닥부(130) 또는 제1 서브웰(132)이 고체 형태의 항생제를 포함하고 있는 경우, 상기 항생제는 건조된 상태일 수 있다. 건조된 항생제를 용해하는 용매로는 물, 세포배양용 배지, Dimethylformamide(DMF), Dimethyl sulfoxide (DMSO) 가 사용될 수 있다. 상기 항생제를 용해하는 용매는 고체 형태의 항생제를 완전히 용해시키고, 용해된 후 용액의 균일한 농도를 갖도록 하기 위해 피펫팅 하면서 도입될 수 있다. 아울러 상기 항생제는 효능을 떨어트리지 않는 건조법이라면 제한 없이 사용하여 건조할 수 있지만 바람직하게는 가열건조, 동결건조 또는 감압건조를 이용하여 건조될 수 있고 가장 바람직하게는 가열건조를 통하여 건조될 수 있다. 또한 상기 항생제는 상기와 같은 건조법을 이용하여 건조된 다음, 상기 바닥부 또는 제1 서브웰에 주입될 수 있으며, 바닥부 또는 제1 서브웰에 항생제 용액을 주입한 다음, 상기 건조법을 이용하여 건조시키는 것도 가능하다.
다만 상기 제2 서브웰(134)이 있는 형태의 세포배양검사 장치를 사용하는 경우 상기 항생제는 제2 서브웰에 건조되어 있는 것이 바람직하다. 이때 제2 유체는 제2 서브웰에 주입되어 제2 서브웰 내에 존재하는 항생제를 용해시키며 웰 바닥부(130)와 웰 하단부(112)를 채우는 것이 바람직하다.
상기 제2 유체는 항생제를 함유한 용액일 수 있고, 항생제를 용해시키는 용매일 수 있다. 그 결과 제2 서브웰(134)에는 항생제가 함유된 제2 유체가 일부 적재될 수 있다. 제2 서브웰(134)의 부피는 목표로 하는 시스템의 스케일에 따라 달라질 수 있으나 구현 가능한 범위인 1㎕ 내지 50㎕ 일 수 있다. 제2 서브웰의 부피가 1㎕ 미만인 경우 웰의 크기가 감소하여 원활한 피펫팅 및 건조가 어려울 수 있으며, 50㎕ 를 초과하는 경우 필요한 샘플 및 시약의 양이 늘어남에 따라 효율이 감소될 수 있다.
도 2는 본 명세서에 개시된 기술의 일 구현예에 따른 세포배양검사 장치의 웰 유닛의 단면을 나타낸 것이다. 도 2를 참조하면, 도 2의 (a)는 세포배양검사 장치의 웰 유닛(110)을 위에서 내려다 본 모습이고, 도 2의 (b)는 (a)의 A-A' 단면의 모습을 나타낸 것이다. 제1 서브웰(132)은 상기 제1 유체를 수용하기 위한 것으로, 충분한 크기의 공간을 가지는 웰 형태일 수 있다. 제1 서브웰(132)의 부피는 특별히 제한되지 않지만 제1 유체를 주입한 후 장시간 동안 반응을 관찰하기 위해 충분한 크기를 가질 수 있으며, 예를 들어 1 ㎕ 내지 50 ㎕일 수 있다. 제1 서브웰의 부피가 1㎕ 미만인 경우 웰의 크기가 감소하여 원활한 관찰이 어려울 수 있으며, 50㎕를 초과하는 경우 필요한 샘플 및 시약의 양이 늘어남에 따라 효율이 감소될 수 있다.
도 3은 제1 유체 및 제2 유체를 웰 유닛에 도입하여 항생제 감수성 검사를 하는 과정을 나타낸다.
고형화제(gelling agent)를 함유한 액상 매질과 생물학적 물질(biological agent)의 혼합용액인 제1 유체가 제1 서브웰(132)에 도입된 후 고화됨으로써 생물학적 물질, 예를 들어 박테리아가 겔 매트릭스 내에 고정될 수 있다. 이후 제2 유체가 입구부(120)를 통해 도입되어 항생제를 녹이고, 제2 유체의 부피가 점점 늘어남에 따라 웰 유닛(110)의 하단부를 채우면서 제1 서브웰(132)에 채워진 겔 매트릭스와 계면을 형성하게 된다. 그리하여 항생제가 계면을 통하여 겔 매트릭스 내로 확산되고 겔 매트릭스 내에 고정된 박테리아의 성장 변화를 관찰함으로써 항생제에 대한 감수성을 현미경으로 관찰할 수 있다.
현미경 관찰을 위해 제1 서브웰(132)이 위치한 곳의 바닥면을 통해 상기 제1 유체 내의 대상을 관찰할 수 있도록 웰 유닛의 바닥면의 적어도 일부가 광학적으로 투명한 재질로 이루어질 수 있다. 예를 들어 상기 세포배양검사 장치의 몸체가 투명 재질로 이루어질 수 있다. 바람직하게는 상기 투명 재질은 폴리스티렌, 폴리에틸렌, 폴리프로필렌, 폴리메타크릴레이트, 폴리카보네이트와 같은 고분자 수지일 수 있다. 세포배양검사 장치는 고분자 수지를 사출하는 방식으로 제조될 수 있다.
본 명세서에 개시된 기술의 가장 큰 특징은 웰 유닛(110)의 내벽의 둘레를 따라 웰 유닛(110)의 중심방향으로 돌출된 제1 단차부(140)가 존재하며, 또한 웰 유닛의 바닥을 둘러싼 내부 모서리가 존재한다는 것이다. 웰 유닛(110)의 단면 형상으로부터 알 수 있듯이 제1 단차부(140)의 존재로 인해, 웰 유닛(110)이 입구부(120) 쪽의 상단부(114)보다 좁은 내부 너비를 갖는 하단부(112)를 갖게 된다. 이때 제1 단차부(140)는 상기 내벽의 둘레를 따라 연결된 모서리의 형상을 갖는다. 제1 단차부(140)가 상기 형상을 가짐에 따라 웰 유닛(110) 내 유체의 거동이 제어됨으로써 전체 웰 유닛(110) 내부에 유체가 고르게 퍼질 수 있다. 제1 단차부(140)의 기능은 구체적으로 아래와 같이 서술될 수 있다.
고정된 구조물에 유체가 유입될 때, 유체의 유입 시 관성력 외에 유체의 거동에 가장 큰 영향을 미치는 요소는 유체와 구조물 표면에 작용하는 표면장력과 유체에 작용하는 중력이다. 그러나 부피가 작아질수록 유체의 질량에 비해 표면 면적에 의해 영향을 받는 표면장력이 점점 주도적인 힘으로 작용하게 되고, 중력은 상대적으로 미미한 효과를 가지게 된다. 따라서 본 세포배양검사 장치에서 주로 다루는 수~수백 ㎕ 스케일의 부피 범위에서는 물에 대해 중력이 거의 영향을 끼치지 못하거나 약한 영향을 끼치는 수준으로 이러한 범위에서는 유체의 거동에 주로 표면장력이 중요한 영향을 끼칠 수 있다.
도 4의 (a)는 표면장력에 의하여 내벽의 일부에 고르게 퍼지지 못한 유체를 도시한 것이며, (b)는 그 단면을 나타낸 것이다.
먼저 제2 유체가 목적하는 바와 상반되는 형태로 구조물의 일부분에 갇혀 고르게 퍼지지 못하는 경우, 유체는 가로에 비해 세로의 비율이 더 높거나 비슷한 형태를 가지며, 중력의 영향으로 상단보다는 하단으로 쏠린 형태를 지닌다. 또한 유체와 구조물 간의 경계면은 낮은 접촉각으로 인해 뾰족한 형태를 가지는 형태로 볼 수 있으나(도 4의 (a)), 유체의 볼륨에 비해 적은 면적에 분포하여 그 단면은 볼록한 형태감을 가진다(도 4의 (b)).
이러한 환경에서 유입된 유체가 위 기술한 바와 같이 목적한 구조물 내를 완전히 채우기 위해서는 우선 유체에 대한 구조물 표면의 접촉각이 90도 이내를 유지하는 것이 좋으며, 유체의 표면장력은 일부 유체를 제외하고 가장 강한 물의 표면장력보다 낮거나 같은 경우를 유지하는 경우를 가지는 것이 바람직하다. 더 자세하게는 10도 이상, 90도 이하의 접촉각을 가지는 것이 바람직하다. 또한 밀도는 0.1g/mL 이상, 10g/mL 이하이고 점도는 0.1mPa/s 이상, 10mPa/s 이하이며 부피는 10㎕ 이상, 200㎕ 이하인 것이 바람직하다. 상기 밀도 및 점도 범위에서 유체는 상기 구조물에 완전히 퍼지도록 작용할 수 있으며, 상기 범위를 초과하는 유체의 경우 상기 구조물에 고르게 퍼지지 못할 수 있다. 여기서는 유체의 표면장력과 밀도, 점도가 물과 유사(72dyne/cm, 1g/mL, 1mPa/s)하며, 접촉각이 50도, 볼륨은 대략 100㎕ 인 경우를 가정하여 기술한다.
접촉각이 50도 가량 되는 경우 기본적으로 유체는 웰 유닛 구조물 표면에 살짝 퍼지다 말고 둥근 형태로 뭉치게 되나, 구조물의 두 표면이 만나는 상기 바닥부의 내부모서리에서는 보다 멀리까지 이동할 수 있다. 도 5에 나타난 바와 같이, 구조물의 두 표면이 만나는 모서리에서는 유체와 구조물의 표면간의 접촉각이 낮아지는 효과가 발생하여, 이에 따라 더욱 먼 거리까지 유체가 퍼져나갈 수 있다.
이를 더욱 상세히 살펴보면 유체와 한 표면 사이의 접촉각 θ가 Concus-Finn 범위 내에 있는 경우(예를 들어 두 표면이 90도의 각을 이룰 때 유체와 한 표면 사이의 접촉각 θ가 45도 이내), 이론적으로 유체는 모서리를 따라 무제한의 거리를 이동하게 된다. 하지만 유체와 한 표면 사이의 접촉각 θ가 Concus-Finn범위보다 크고 90도 보다 작은 경우 모서리에서 유체가 두 표면과 동시에 이루는 접촉각 θ`은 하기의 식 1에 따라 계산될 수 있다.
[식 1]
Figure 112020024183712-pat00001
위 식 1에서 접촉각 θ`은 항상 접촉각 θ보다 작은 값을 가지며 이는 하기의 식 2에서 확인할 수 있다.
[식 2]
Figure 112020024183712-pat00002
또한 구조물의 한 표면에서의 유체이동거리(a)와 두 표면이 만나는 모서리에서의 유체의 이동거리(a`)는 하기의 식 3으로 표현될 수 있다(도 6 참조).
[식 3]
Figure 112020024183712-pat00003
따라서 상기 바닥부와 유닛 내벽이 형성하는 바닥부의 내부모서리는 바닥부를 기준으로 70~120°의 각도를 가지는 것이 바람직하다. 상기 내부모서리의 각도가 70°미만인 경우 입구의 크기가 작아져 유체의 주입이 어려울 뿐만 아니라 웰 유닛의 크기가 작아져 원활한 검사가 어려울 수 있으며, 내부모서리의 각도가 120°를 초과하는 경우 모서리를 따라 이동하는 유체의 이동거리가 짧아져 유체의 주입이 원활하지 않을 수 있다.
이와는 반대로 유체의 전진 방향에 수직한 단차를 만나면 90도의 추가 접촉각을 가지도록 부피가 증가하기 전까지 전진을 중단하고 멈춘다(도 7 참조). 위의 조건을 바탕으로 유체의 고른 분포를 달성하기 위해 본 구조물에서는 목표 공간 바닥면의 이어진 모서리 구조물과 목표 공간 상단부의 단차를 이용하였다(도 7).
이를 더욱 상세히 살펴보면 웰 유닛(110)에 주입된 유체는 표면장력으로 인하여 벽면을 타고 올라가는데, 그 높이는 유체의 중력과 균형을 이루어 결정된다(도 8). 유체가 벽면과 바닥면에 형성하는 구간의 길이(도 8의 a, b)는 유체의 부피에 따라 증가함과 더불어 중력의 영향을 받게 된다. 따라서 유체가 벽면과 바닥면에 형성하는 구간의 길이는 a≥b의 관계를 형성한다.
이때 제1 단차부의 역할은 유체의 수직 방향 전진을 방해하여 유체가 차지하는 표면 면적을 줄이고 중력의 영향을 증대시켜 유체의 수평 방향으로 힘을 가하고 보다 전진시키는 것이며, 도 9에 나타난 바와 같이, 단차가 없는 경우에 비하여 유체가 추가되는 형상이 수평방향으로 쏠릴 수 있다. 또한 단차가 존재하는 경우 용액의 전진방향은 단차의 반대방향으로 제한되므로, 제1 단차부의 높이(b`)이 바닥면의 반지름의 길이(a`)보다 작은 경우에 위 디자인을 적용하는 것이 바람직하다. 즉 0<b`<a`의 관계가 성립된다.
또한 중력에 의하여 유체가 평평한 표면을 일부 가질 수 있는 최소 높이는 하기의 식 4와 같으므로,
[식 4]
Figure 112020024183712-pat00004
상기 h높이 이상의 웰 유닛에서는 단차 없이도 유체가 충분히 퍼질 수 있으며 이에 따라 제1 단차부의 높이(b`)는 상기 식 4의 h보다 낮은 것이 바람직하다(즉 b`<h). 이때 상기 h는 각 유체에 따라 다른 값을 가질 수 있지만 물의 경우 약 4mm이므로 물과 유사하거나 낮은 h값을 가지는 제1유체를 사용하는 본 발명에서는 상기 제1 단차부의 높이(b`)는 4mm 이하인 것이 바람직하다.
제 2 유체의 부피에 따라 제1 단차부의 높이는 달라질 수 있지만, 제2 유체의 부피가 100㎕ 이며 96웰 플레이트를 구성하기 위해 한 웰의 바닥면의 직경이 대략 8mm 라고 가정할 때, 제1 단차부의 높이는 최소 0.5mm 임을 알 수 있다. 제 2 유체의 부피가 10㎕ 이며 384웰 플레이트를 구성하기 위해 한 웰의 바닥면의 직경이 4mm 라고 가정한다면 제1 단차부의 높이는 0.2mm 임을 알 수 있다. 따라서 제1 단차부의 높이(b`)는 0.2mm 이상인 것이 바람직하다.
즉 상기 단차부의 높이는 0.2~4mm인 것이 바람직하다. 단차부가 0.2mm미만의 높이를 가지는 경우 제2유체가 단차부의 윗부분까지 채우게 되므로 단차부를 사용하는 이점이 없으며, 4mm를 초과하는 높이는 가지는 경우 단차 없이도 유체가 충분히 퍼질 수 있어 이 역시 단차부를 사용하는 이점이 없을 수 있다.
상기 기술에 따라 상기 단차부와 바닥부 내부모서리를 가지는 본 발명의 경우 단차부에 의하여 일정 높이 이상으로의 유체이동이 차단됨과 동시에 바닥부 내부모서리를 통하여 상기 유체의 이동을 빠르게 하는 것으로 웰의 내부에 유체가 고르고 신속하게 분주될 수 있다.
아울러 상기 제1 서브웰 및 제2 서브웰은 상기 웰유닛의 바닥부 직경보다 작게 제작되어 제2 단차부를 형성하는 것일 수 있다.
상기와 같은 웰 유닛 내부에서의 유체의 이동은 상기 제1 서브웰 및 제2 서브웰에서도 동일하게 적용될 수 있다. 특히 웰 유닛보다 작은 제1 서브웰의 경우 제1유체를 주입해야 하므로 상기와 같은 단차부를 이용하여 정확하게 주입되도록 하는 것이 더욱 바람직하다. 다만 상기 제1 단차부의 경우 상기 웰 유닛의 일부에 추가적으로 형성되어 있는 것이지만 상기 제1 서브웰 및 제2 서브웰은 상기 웰 유닛의 바닥부보다 직경이 작게 제작되어 바닥부와 상기 제1 서브웰 및 제2 서브웰의 경계면에 자연스럽게 제2 단차부가 형성되도록 하는 것이 바람직하다. 이때 상기 제2 단차부는 상기 제1 서브웰 및 제2 서브웰의 상단부 둘레를 따라 연결된 모서리의 형상을 갖는 것일 수 있다. 이때 상기 제1 서브웰을 통한 관찰을 용이하도록 제1 서브웰의 직경을 늘려 제1 서브웰의 일측 벽면이 상기 웰 유닛의 하단부 벽면과 일치하는 경우 도 9에 나타난 바와 같이 제1 유체가 벽면을 타고 웰 유닛의 하단부로 침범할 수 있으며 이에 따라 검사결과의 분석에 오류를 나타낼 수 있다. 따라서, 제1 서브웰 및 제2 서브웰은 상기 웰 유닛의 바닥부 직경보다 작게 제작되어 제2 단차부를 형성하는 것이 바람직하다.
뾰족한 모서리는 유체의 전진 거리를 크게 증대시키는 요소지만 동시에 공기 버블이 갇히기 쉬운 환경이 되기도 한다. 특히 제1 유체의 하단부에 발생하는 버블은 이후의 분석에 큰 영향을 끼친다는 점을 고려하여, 본 발명에서는 이러한 공기 버블 발생을 억제하기 위해 제1 유체가 위치하게 되는 제1 서브웰의 형상에도 주목하였다.
제1 유체는 위에서 기술한 제2 유체의 물성과 유사한 범위를 가지며, 동일한 물성을 가정하여 작동 원리를 기술하였다. 제 1 유체는 검사의 대상이 되는 미생물을 고정시키는 하이드로젤로 구성되며, 영양 및 항생제를 운반하는 역할을 하는 제 2 유체의 최소 비율을 고려하여 제1 유체는 1㎕ 이상, 50㎕ 이하의 부피를 가지는 것을 가정하였다. 제1 유체가 1㎕미만으로 주입되는 경우 용액의 면적이 충분하지 않고 웰의 크기가 감소하여 원활한 관찰이 어려울 수 있으며, 50㎕를 초과하여 주입하는 경우 제1 서브웰 밖으로 넘치거나 필요한 샘플의 양이 많아져 검사효율이 저하될 수 있다.
우선 바닥면에 버블이 생성되고 부착되는 원리는 다음과 같다. 유체 유입의 마지막 단계에는 모서리를 따라 유입된 양 방향의 유체와 바닥면을 따라 벽을 향해 유입된 유체가 서로 만나게 되는데, 유체의 전진 접촉각이 90도에 가깝거나 그 이상의 각도로 형성될 경우 유체의 상단부가 먼저 벽과 만나 하단부의 공기가 빠져나가지 못하고 버블을 형성하는 경우가 생긴다(도 10 참조). 이어서 버블과 유체의 계면을 사이에 두고 압력 차이가 발생하고 버블에는 이에 상응하는 압력이 사방에서 작용하는데, 버블의 일부분이 구조물의 표면에 닿아 있는 경우 버블에 작용하는 압력에 구조물 표면을 향한 방향성이 생겨 버블이 떠오르지 못하고 붙어있게 된다. 하지만 구조물과 유체의 표면장력, 밀도, 점도 등의 특성으로 인해 전진 접촉각이 90도에 미치지 못하는 경우 모서리를 따라 먼저 전진한 유체의 하단부가 맞닿은 후 이어 상단부의 유체가 서로 접촉하게 되므로 이와 같은 버블이 발생하지 않는다.
모서리에 둥근 코너가 들어간 형상에서는 전진 중인 유체와 바닥면 간의 전진 접촉각이 유지된 상태에서 바닥면의 경사가 점점 커지며, 유체가 이루는 경사가 점점 작아지게 된다(도 11). 최종적으로 바닥면이 기존과 90도의 경사를 이루면 유체 역시 [기존 접촉각 - 90] 도를 이루며, 이는 90도 보다 작은 값이므로 버블이 발생하지 않는 조건이 된다.
따라서 전진 접촉각이 90도 이상인 경우를 가정하여, 버블이 발생하지 않기 위한 코너의 반지름 값은 모서리가 직각일 경우 발생하는 버블의 크기보다 커야 하며, 바람직하게는 곡률반경이 0.1~1mm이며, 높이가 0.1~1mm일 수 있다. 즉 상기 코너부분은 도 10 및 도 11에 나타난 바와 같이, 높이 0.1~1mm까지 둥근모서리가 이어져 있으며, 이 둥근모서리의 곡률반경은 0.1~1mm일 수 있으며, 더욱 바람직하게는 실제 발생하는 버블에 비해 커야 한다는 점을 고려할 때 0.3mm일 수 있다. 아울러 상기 범위 미만으로 모서리가 둥글게 제작되는 경우 모서리의 곡률이 버블의 최소곡률보다 작아지게 되어 버블이 발생할 수 있으며, 상기 범위를 초과하여 모서리가 제작되는 경우 바닥 면적이 줄어들게 되어 관찰 가능한 시야가 줄어들 수 있다.
또한 제2 서브웰의 형상에 있어서도, 상기 제2 유체가 주입될 때 버블이 발생하는 경우 내부의 항생제가 일부 용해되지 않고 버블의 내부에 남아있을 수 있어 분석에 영향을 줄 수 있다. 따라서 제2 서브웰의 하단부 모서리도 제1 서브웰과 유사하게 둥근 모서리를 가지도록 제작하는 것이 바람직하다.
상술한 바와 같이, 본 명세서에 개시된 기술의 일 구현예에 따른 세포배양검사 장치를 사용하면 유체를 분주할 때 전체 웰에 고르게 퍼질 수 있으며, 버블이 생기지 않아 광학 현미경을 이용한 항생제 감수성 검사시 대상 생물학적 물질의 성장변화를 정확하게 이미징할 수 있다.
본 발명에 따른 정확한 관찰이 용이한 신속한 세포배양검사 장치는 체결 구조를 통해 개폐 가능한 방식으로 제공하거나 혹은 실리콘, 폴리에틸렌 테레프탈레이트(PET), 폴리에틸렌(PE), 폴리프로필렌(PP), 폴리스티렌(PS), 폴리카보네이트(PC), 테프론 또는 폴리비닐클로라이드(PVC)를 포함하는 재질의 커버 필름으로 처리하여 제공할 수 있다. 상기 커버 필름의 하부 제1 서브웰(120)에 대응하는 위치에 십자 혹은 X자 형태의 타발이 형성되어, 미소량의 제1 유체 투입을 용이하게 하는 제1 유체 투입구로서 작용할 수 있다. 상기 필름의 하부 제2 서브웰(130)에 대응하는 위치에도 십자 혹은 X자 형태의 타발이 형성되어 제2 유체의 투입을 용이하게 하는 제2 유체 투입구로서 작용할 수 있다. 사용상 편의를 고려하여, 제1 유체 투입구의 형태와 제2 유체 투입구의 형태를 달리 하는 것이 바람직하다.
세포배양검사 장치(100) 의 하측면은 관찰 대상의 위치 정보를 제공하는 포커싱 표지를 포함할 수 있다. 포커싱 표지는 세포배양검사 장치의 관찰 영역을 자동적으로 추적(tracking)할 수 있도록 세포배양검사 장치(100) 하측면에 표지될 수 있다. 포커싱 표지는 사출 몰딩(injection molding)의 방법을 통해서 마이크로채널(microchannel)의 형태로 하측면에 제작된다. 고체 박막 내 생물학적 물질은 고정되어 있으므로 포커싱 표지를 이용하여 촬영하면, 촬영 시간마다 같은 영역을 촬영할 수 있다. 포커싱 표지는 관찰 영역의 자동 추적에 있어서 x축, y축, z축 3가지 축 방향으로의 위치를 보정하는 역할을 한다.
이하 본 발명을 세포 분석방법을 통하여 상세히 설명한다.
본 발명의 다른 측면에 따르면, 복수의 웰 유닛들이 정렬되어 형성된 어레이 구조를 가지는 복수의 웰 유닛들을 구비한 세포배양검사 장치를 이용한 세포의 분석 방법으로서, 상기 웰 유닛은 고형화제를 함유한 액상 매질과 생물학적 물질의 혼합용액인 제1 유체 및 물, 세포배양용 배지, Dimethylformamide(DMF) 또는 Dimethyl sulfoxide (DMSO)를 포함하는 용매인 제2 유체를 주입하기 위한 입구부; 및 상기 제1 유체를 수용하기 위한 제1 서브웰과 상기 제2 유체를 수용할 수 있으며 항생제를 적재하기 위한 제2 서브웰을 포함하는 바닥부; 상기 웰 유닛의 내벽의 둘레를 따라 상기 웰 유닛의 중심방향으로 돌출된 제1 단차부가 존재함으로써, 상기 웰 유닛이 상기 입구부 쪽의 상단부보다 좁은 내부 너비를 갖는 하단부;를 포함하며, (a) 상기 제1 유체를 상기 제1 서브웰에 주입하고, 상기 혼합용액을 고화하여 고체 박막을 형성하는 단계; (b) 상기 제2 유체를 제2 서브웰에 투입하여 항생제를 분산 또는 용해하며, 제2 유체를 제2 서브웰 상부의 웰 유닛까지 투입하여 상기 제1 서브웰 내부의 제1 유체의 고체 박막과 접촉시키는 것으로 상기 항생제를 상기 고체 박막으로 확산시키는 단계; 및 (c) 상기 제1 유체의 고체 박막과 상기 제2 유체가 서로 만나 형성된 계면에서 일어나는 생물학적 물질의 변화를 단일세포 단위로 관찰하는 단계;를 포함하는 세포의 분석 방법을 포함한다.
먼저 고형화제(gelling agent)를 함유한 액상 매질과 생물학적 물질(biological agent)의 혼합 용액(제1 유체)을 만든다.
상기 액상 매질은 약 95% 이상의 물을 포함할 수 있으며 고형화제의 존재에 의해 고체화될 수 있다. 고형화제의 예로 한천(agar), 아가로즈(agarose), 젤라틴(gelatin), 알기네이트(alginate), 콜라겐(collagen), 피브린(fibrin) 등을 들 수 있다. 바람직하게는 한천 또는 아가로즈가 사용될 수 있다. 일 예로 액상 매질 내에는 한천이 0.3 내지 4 중량%가 사용될 수 있다. 통상적으로 액상 매질은 영양성분을 필요로 하지 않지만, 몇몇 예에 있어 영양성분을 포함할 수도 있다.
상기 생물학적 물질은 바이러스, 박테리아, 균류, 조류, 원생동물, 기생 병원균, 사람 또는 포유류의 세포 및 바이오필름 등을 포함한다. 상기 생물학적 물질은 액상 또는 고상의 배지 내에서 성장할 수 있고 외부 생리활성물질의 종류 및 농도에 따라 성장에 영향을 받을 수 있다. 상기 혼합용액 내에서의 상기 생물학적 물질의 밀도는 102내지 1010cells/ml, 바람직하게는 104내지 109cells/ml, 더 바람직하게는 105내지 108cells/ml 일 수 있다. 상기 범위 미만에서는 생물학적 물질의 위치를 파악하기 어려울 수 있고 상기 범위 초과에서는 개별적인 생물학적 물질의 상태를 파악하기 어려울 수 있다.
이후 상기 제1 서브웰에 제1 유체를 공급한다. 공급된 제1 유체는 위에서 살펴본 바와 같이 내부 모서리의 곡면형상 및 제2 단차부에 의하여 상기 제1 서브웰에 평평하게 주입될 수 있다. 이때 제1 유체는 1㎕ 이상, 50㎕ 이하가 공급될 수 있으며, 주입이 완료된 이후 상기 제1 유체를 고화시켜 상기 생물학적 물질이 고정된 고체박막을 형성할 수 있다. 높은 온도에서 액상 매질의 온도가 내려감에 따라 매질이 고화됨으로써 상기 생물학적 물질의 움직임이 저하된다. 상기 고정에 의하여 운동성이 있는 상기 생물학적 물질을 계속해서 용이하게 관찰할 수 있다
상기 고체 박막의 두께와 너비는 상기 제1 서브웰의 너비와 주입되는 제1 유체의 양에 따라 정해진다. 본 명세서에서 "박막"이라 함은 상기 생물학적 물질을 고정하여 단일 세포 단위로 관찰할 수 있을 정도면 두께가 특별히 제한되지 않으나, 대체로 1㎛ 내지 5mm, 또는 1㎛ 내지 3mm, 또는 1㎛ 내지 2mm, 또는 1㎛ 내지 1.5mm, 또는 1㎛ 내지 1mm, 또는 1㎛ 내지 800㎛, 또는 1㎛ 내지 500㎛, 1㎛ 내지 100㎛, 또는 10㎛ 내지 3mm, 또는 100㎛ 내지 500㎛ 또는 10㎛ 내지 1mm, 또는 100㎛ 내지 1mm, 또는 200㎛ 내지 1mm, 또는 500㎛ 내지 1mm 중 어느 하나의 범위를 갖는 얇은 층을 의미한다. 여기서 고체 박막의 두께는 관찰하고자 하는 고체 박막 면에 대한 수직방향의 크기에 해당할 수 있다. 고체 박막은 상술한 범위의 두께를 가지므로 내부에 고정된 생물학적 물질을 개별 세포(single cell) 단위로 관찰할 수 있다.
다음으로 상기 웰 유닛(110)에 물, 세포배양용 배지, Dimethylformamide(DMF) 또는 Dimethyl sulfoxide (DMSO)를 포함하는 용매인 제2 유체를 공급한다. 상기 제 2 유체는 웰 유닛(110) 내에 적재되어 있는 항생제를 분산 또는 용해하여 공급하는 역할을 한다. 이때 상기 제2 유체는 바닥부(130)와 하단부(112)를 완전히 채운 이후 계속적으로 공급되어 상기 웰 유닛을 채우게 되며, 이때 상기 제1 단차부에 의하여 치우침 없이 균일하게 상기 웰 유닛을 채울 수 있다.
아울러 상기와 같이 웰 유닛을 채운 제2 유체는 상기 제1 서브웰까지 공급되어 상기 제1 유체의 고체 박막과 접촉하게 된다. 이에 따라 상기 제2 유체에 분산 또는 용해된 항생제는 상기 고체 박막의 내부로 확산될 수 있다.
다음으로, 상기 항생제에 대한 상기 생물학적 물질의 반응을 관찰한다. 상기 생물학적 물질이 상기 고체 박막에 고정됨으로써 2차원적으로 분포하게 되어 결과적으로 단일 세포 단위로 관찰이 가능하다. 일반적으로 개별세포의 성장변화는 수십 분(보통 30분) 이내에 관찰이 가능하기 때문에 생물학적 물질에 대한 항생제의 영향을 기존 방식에 비해 정확하고 빠르게 확인할 수 있다. 예를 들어 박테리아 세포에 대해서 생리활성 검사를 수행할 경우 3~4시간 이내에 검사를 끝낼 수 있다. 본 명세서에서 이러한 빠른 생리활성 검사 방법을 단일 세포 모폴로지 분석(single-cell morphological analysis, SCMA)라고 칭하기로 한다. 상술한 어레이 구조를 가지는 복수의 웰 유닛들을 구비한 세포배양검사 장치를 이용하면 다양한 항생제 조건 하에서 단일 세포 모폴로지의 변화를 시간 경과 이미징(time-lapse imaging)으로 관찰할 수 있다.
관찰을 위해 광학 측정 장치가 사용될 수 있다. 상기 광학 측정 장치는 CCD 또는 CMOS 카메라와 같은 이미지화 시스템을 포함할 수 있다. 상기 광학 측정 장치는 또한 초점을 맞추고 빛을 이미지화하는 데 필요한 렌즈, 조명 및 빛 가이드 등을 포함할 수 있다. 또한 상기 광학 측정 장치는 카메라에 의해 관찰된 이미지 데이터를 가공 및 분석하기 위한 이미지 처리 시스템을 포함할 수 있다. 상기 광학 측정 장치는 검사 과정에 나타난 생물학적 물질의 성장변화를 빠른 속도로 기록하고 분석하여 검사 결과를 얻는다. 상기 제1 유체의 고체 박막과 상기 제2 유체가 접하는 계면 주위가 이미징 영역이 되는데 상기 이미징 영역은 약 100㎛*100㎛ 내지 4000㎛*4000㎛의 크기를 가질 수 있다. 적어도 상기 제1 서브웰의 횡단면은 상기 이미징 영역보다 큰 너비를 가지는 것이 바람직하다.
결국, 생물학적 물질의 고정과 항생제의 확산방식을 이용하는 상술한 검사 방법을 이용하면 약물 검사에 필요한 약물 및 세포의 양이 종래 기술에 비해 대폭 저감될 수 있고, 단일 세포의 성장변화를 빠른 속도로 추적할 수 있어 빠르면 2 시간 이내에 보통 3~4 시간에 빠른 약물 검사 결과를 얻을 수 있는 장점이 있다. 이는 현재까지 알려진 최고의 검사 속도이다
일 구현 예에 있어서, (d) 상기 항생제에 대한 생물학적 물질의 변화를 단일 세포 단위로 관찰하여 최소 억제 농도(Minimum Inhibitory Concentration, MIC) 또는 최소 바이오필름 박멸 농도(Minimum Biofilm Eradication Concentration, MBEC)를 측정하는 단계를 더 포함할 수 있다.
바이오필름은 미생물이 감염되거나 부착된 부분에서 나타나며, 폴리머 기질로 감싸인 미생물에 의해 형성된 점액질의 미생물 복합체를 이루는 막이다. 바이오필름의 형성은 사람의 건강에도 중대한 영향을 끼칠 수 있다. 바이오필름에 의한 감염증으로 폐 감염증, 중이염, 치주염 등이 있다 그런데 바이오필름 내의 세균은 부유 상태보다 항생물질에 대한 내성이 1000배 이상이 되어 문제가 된다. 종래 바이오필름을 연구하기 위한 방법으로 플로우 셀 시스템(flow cell system)이나 웰 기반의 시스템(well based system) 등을 이용한 방법들이 있었으나 이들 어세이 시스템들은 바이오필름 형성을 위해 수 일 간의 장시간이 요구되며, 관찰을 위해서는 염색을 해야 하고, 컨포칼 현미경(confocal microscope)을 이용해야 하는 등의 어려운 면들이 있었다. 또한 최소 억제농도(Minimum Inhibitory Concentration, MIC)나 최소 바이오필름 박멸 농도(Minimum Biofilm Eradication Concentration, MBEC)를 측정할 경우 추가적인 실험이 필요하다. 또한 이러한 시스템들은 크기가 매우 클 뿐 아니라, 바이오필름 형성 단계들(biofilm formation stages)을 분명하게 보여주지 못하고 박테리아 감염에 있어 체내(in vivo) 바이오필름 형성을 대표하지 못한다.
바이오필름의 형성과정과 항생제에 대한 반응성을 연구하기 위한 효율적인 시스템이 요구되며 본 발명의 일 구현 예에 따른 어레이 구조를 가지는 복수의 웰 유닛들을 구비한 세포배양검사 장치는 훌륭한 대안이 될 수 있다.
이하, 본 발명의 바람직한 실시 예를 첨부한 도면을 참조하여 당해 분야의 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있도록 설명하기로 한다. 또한, 본 발명을 설명함에 있어 관련된 공지의 기능 또는 공지의 구성에 대한 구체적인 설명이 본 발명의 요지를 불필요하게 흐릴 수 있다고 판단되는 경우에는 그 상세한 설명을 생략하기로 한다. 그리고 도면에 제시된 어떤 특징들은 설명의 용이함을 위해 확대 또는 축소 또는 단순화된 것이고, 도면 및 그 구성요소들이 반드시 적절한 비율로 도시되어 있지는 않다. 그러나 당업자라면 이러한 상세 사항들을 쉽게 이해할 것이다.
실시예
열가소성 플라스틱 수지(폴리스티렌)를 도 1 및 도 2에 도시된 구조로 사출 성형하여 12 x 8개의 정렬된 웰 유닛의 어레이를 갖는 세포배양검사 장치를 준비하였다.
준비된 웰 유닛에 제1 유체로서 아가로오즈와 균액의 혼합물 10㎕를 제1 서브웰에 분주하였다. 제2 단차부에 의하여 상기 제1 서브웰 전체에 아가로오즈 용액이 고르게 분주된 것을 확인할 수 있었으며, 제1 서브웰에서 웰 유닛으로의 누출은 없는 것으로 확인되었다. 상기와 같은 방법으로 제1 서브웰의 분주를 마친 다음, 제1유체를 고형화 하고 제2유체(배양액)를 제1 유체와 동일한 방법으로 제2 서브웰에 주입하였으며, 이때 제2 유체는 상기 제1 단차부까지 동일한 양(100㎕)을 주입하였다.
비교예 1
상기 실시 예에서 제1 단차부가 형성되지 않은 세포배양검사 장치를 사용한 것을 제외하고 동일하게 실시하였다.
비교예 2
상기 실시 예에서 제1 서브웰의 측면벽의 일부를 상기 웰 유닛의 하단부와 일치시켜 제작한 것을 제외하고 동일하게 실시하였다.
비교예 3
상기 실시 예에서 상기 제1 서브웰의 모서리를 직각으로 제작한 것을 제외하고 동일하게 실시하였다.
시험예
상기 실시 예 및 비교 예 1~3의 세포배양검사 장치를 각각 10개 제작한 다음(각각 960 웰), 제1유체 및 제2유체의 주입 불량여부를 확인하였다. 주입불량은 모서리 버블발생, 유체의 불균형, 유체 누출을 기준으로 판단하였으며, 그 결과는 하기의 표 1과 같다.
모서리 버블발생 유체2 불균형 유체1 누출
실시예 제1 유체 0 - 4
제2 유체 - 0 -
비교예 1 제1 유체 0 - 6
제2 유체 - 52 -
비교예 2 제1 유체 0 - 960
제2 유체 - 0 -
비교예 3 제1 유체 462 - 0
제2 유체 - 0 -
표 1에 나타난 바와 같이 제1 단차부가 존재하지 않는 비교예 1의 경우 본 발명의 실시 예에 비하여 제2 유체의 불균형 현상이 많이 나타나는 것을 확인할 수 있었다. 또한 제1 서브웰의 측면벽의 일부를 상기 웰 유닛의 하단부와 일치시켜 제2 단차부의 일부를 제거한 비교 예 2의 경우 제1 유체의 불균형 및 누출의 발생이 늘어나는 것을 확인할 수 있었다. 마지막으로 제1 서브웰 및 제2 서브웰의 바닥을 뾰족하게 제작한 비교 예 3의 경우 버블의 발생이 많이 관찰되는 것으로 나타났다. 즉 본 발명의 실시 예와 동일하게 제1 단차부 제2 단차부 및 둥근 코너를 가지는 서브웰을 구비하는 경우 유체를 더욱 정확하게 주입할 수 있음은 물론 배양 검사의 신뢰도를 향상시킬 수 있는 것을 확인할 수 있었다.
이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술한 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시 양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
110 : 웰 유닛 112 : 하단부
114 : 상단부 120 : 입구부
130 : 바닥부 132 : 제1 서브웰
134 : 제2 서브웰 140 : 제1 단차부
141 : 제2 단차부 142 : 분리격벽

Claims (14)

  1. 복수의 웰 유닛들을 구비한 세포배양검사 장치로서,
    상기 웰 유닛은 고형화제를 함유한 액상 매질과 생물학적 물질의 혼합용액인 제1 유체 및 물, 세포배양용 배지, Dimethylformamide(DMF) 또는 Dimethyl sulfoxide (DMSO)를 포함하는 용매인 제2 유체를 주입하기 위한 입구부; 및
    상기 제1 유체를 수용하기 위한 제1 서브웰 및 상기 제2 유체를 수용할 수 있으며, 항생제를 특정 위치에 적재하기 위한 제2 서브웰을 포함하는 바닥부를 포함하되,
    상기 웰 유닛의 내벽의 둘레를 따라 상기 웰 유닛의 중심방향으로 돌출된 제1 단차부가 존재함으로써, 상기 웰 유닛이 상기 입구부 쪽의 상단부보다 좁은 내부 너비를 갖는 하단부를 가지며,
    상기 제1 서브웰의 직경 및 상기 제2 서브웰의 직경은 상기 웰 유닛의 상기 바닥부 직경보다 작게 제작되어 제2 단차부를 형성하며,
    상기 제1 단차부는 상기 제2 유체의 주입 시 상기 바닥부로부터 수직방향 전진을 막을 수 있도록 상기 제2 유체의 전진방향에 대해 90도 이상의 각도를 가지며,
    상기 제2 단차부는 상기 제1 유체의 주입 시 상기 바닥부로부터 수직방향 전진을 막을 수 있도록 상기 제1 유체의 전진방향에 대해 90도 이상의 각도를 가지며,
    상기 제1 서브웰 및 상기 제2 서브웰의 내부모서리는 곡률반경이 0.1~1mm이며, 높이가 0.1~1mm인 곡선형을 갖는 것인 세포배양검사 장치.
  2. 삭제
  3. 제1 항에 있어서,
    상기 제1 단차부는 상기 내벽의 둘레를 따라 연결된 모서리의 형상을 갖는 것인 세포배양검사 장치.
  4. 제1 항에 있어서,
    상기 제1 단차부의 높이는 상기 바닥부의 내부 모서리로부터 상기 바닥부 중심까지의 거리보다 작은 것인 세포배양검사 장치.
  5. 제4 항에 있어서,
    상기 제1 단차부의 높이는 0.2mm 이상, 4mm 이하인 것인 세포배양검사 장치.
  6. 제1 항에 있어서,
    상기 바닥부와 유닛 내벽이 형성하는 바닥부의 내부모서리는 상기 내벽의 둘레를 따라 연결된 모서리의 형상을 갖는 것인 세포배양검사 장치.
  7. 제6 항에 있어서,
    상기 바닥부와 유닛 내벽이 형성하는 바닥부의 내부모서리는 바닥부를 기준으로 70~120°의 각도를 가지는 세포배양검사 장치.
  8. 삭제
  9. 삭제
  10. 삭제
  11. 삭제
  12. 삭제
  13. 복수의 웰 유닛들이 정렬되어 형성된 어레이 구조를 가지는 복수의 웰 유닛들을 구비한 세포배양검사 장치를 이용한 세포의 분석 방법으로서,
    상기 웰 유닛은 고형화제를 함유한 액상 매질과 생물학적 물질의 혼합용액인 제1 유체 및 물, 세포배양용 배지, Dimethylformamide(DMF) 또는 Dimethyl sulfoxide (DMSO)를 포함하는 용매인 제2 유체를 주입하기 위한 입구부; 및 상기 제1 유체를 수용하기 위한 제1 서브웰과 상기 제2 유체를 수용할 수 있으며 항생제를 특정 위치에 적재하기 위한 제2 서브웰을 포함하는 바닥부; 상기 배양액인 제2 유체의 주입 시 상기 바닥부로부터 수직방향 전진을 막을 수 있도록 상기 제2 유체의 전진방향에 대해 90도 이상의 각도를 갖는 제1단차부; 상기 제1서브웰의 직경 및 상기 제2 서브웰의 직경은 상기 웰 유닛의 상기 바닥부 직경보다 작게 제작되며, 상기 제1 유체의 주입 시 상기 바닥부로부터 수직방향 전진을 막을 수 있도록 상기 제1 유체의 전진방향에 대해 90도 이상의 각도로 형성되는 제2 단차부; 상기 웰 유닛의 내벽의 둘레를 따라 상기 웰 유닛의 중심방향으로 돌출된 제1 단차부가 존재함으로써, 상기 웰 유닛이 상기 입구부 쪽의 상단부보다 좁은 내부 너비를 갖는 하단부;를 포함하며,
    상기 제1 서브웰 및 상기 제2 서브웰의 내부모서리는 곡률반경이 0.1~1mm이며, 높이가 0.1~1mm인 곡선형을 형성하며,
    (a) 상기 제1 유체를 상기 제1 서브웰에 주입하고, 상기 혼합용액을 고화하여 고체 박막을 형성하는 단계;
    (b) 상기 제2 유체를 상기 제2 서브웰에 투입하여 항생제를 분산 또는 용해하며, 상기 제2 유체를 상기 제2 서브웰 상부의 상기 웰 유닛에 설치된 상기 제1 단차부까지 투입하여 상기 제1 서브웰 내부의 상기 제1 유체의 상기 고체 박막과 접촉시키는 것으로 상기 항생제를 상기 고체 박막으로 확산시키는 단계; 및
    (c) 상기 제1 유체의 상기 고체 박막과 상기 제2 유체가 서로 만나 형성된 계면에서 일어나는 생물학적 물질의 변화를 단일세포 단위로 관찰하는 단계;를 포함하는 세포의 분석 방법.
  14. 제13 항에 있어서,
    (d) 상기 항생제에 대한 생물학적 물질의 변화를 단일 세포 단위로 관찰하여 최소 억제 농도(Minimum Inhibitory Concentration, MIC) 또는 최소 바이오필름 박멸 농도(Minimum Biofilm Eradication Concentration, MBEC)를 측정하는 단계를 더 포함하는 세포의 분석 방법.
KR1020200028427A 2020-03-06 2020-03-06 정확한 관찰이 용이한 신속한 세포배양검사 장치 KR102145842B1 (ko)

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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2021177530A1 (ko) * 2020-03-06 2021-09-10 주식회사 퀀타매트릭스 정확한 관찰이 용이한 신속한 세포배양검사 장치

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2016182091A (ja) * 2015-03-26 2016-10-20 国立研究開発法人産業技術総合研究所 細胞培養器及び細胞培養方法
KR20170003177A (ko) 2015-06-30 2017-01-09 (주) 마이크로핏 다각형 마이크로 플레이트, 이의 제조방법 및 이를 이용한 세포 집합체의 배양방법
KR101711105B1 (ko) * 2016-04-21 2017-03-06 주식회사 퀀타매트릭스 신속한 항생제 감수성 검사를 위한 멀티-웰 기반의 세포배양검사 장치
KR20170132856A (ko) 2015-03-30 2017-12-04 액셀러레이트 다이어그노스틱스, 아이엔씨. 신속한 미생물 동정 및 항균제 감수성 시험을 위한 기기 및 시스템

Family Cites Families (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US3957583A (en) * 1974-12-02 1976-05-18 Mcdonnell Douglas Corporation Apparatus and process for determining the susceptibility of microorganisms to antibiotics
KR20130058954A (ko) * 2011-11-28 2013-06-05 삼성전기주식회사 배양 용기 및 이의 시료 주입 방법
JP6444314B2 (ja) * 2013-01-11 2018-12-26 リジェネロン・ファーマシューティカルズ・インコーポレイテッドＲｅｇｅｎｅｒｏｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ， Ｉｎｃ． 試料ハンドリングのためのシステムおよびデバイス
WO2015078884A1 (en) * 2013-11-26 2015-06-04 Alleati Ag Method and microfluidic assembly for antibiotic susceptibility testing
US20170191020A1 (en) * 2015-12-30 2017-07-06 Palo Alto Research Center Incorporated Thermochromic sensing devices, systems, and methods
JP2018143168A (ja) * 2017-03-06 2018-09-20 クアーズテック株式会社 細胞培養担体
KR102145842B1 (ko) * 2020-03-06 2020-08-19 주식회사 퀀타매트릭스 정확한 관찰이 용이한 신속한 세포배양검사 장치

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2016182091A (ja) * 2015-03-26 2016-10-20 国立研究開発法人産業技術総合研究所 細胞培養器及び細胞培養方法
KR20170132856A (ko) 2015-03-30 2017-12-04 액셀러레이트 다이어그노스틱스, 아이엔씨. 신속한 미생물 동정 및 항균제 감수성 시험을 위한 기기 및 시스템
KR20170003177A (ko) 2015-06-30 2017-01-09 (주) 마이크로핏 다각형 마이크로 플레이트, 이의 제조방법 및 이를 이용한 세포 집합체의 배양방법
KR101711105B1 (ko) * 2016-04-21 2017-03-06 주식회사 퀀타매트릭스 신속한 항생제 감수성 검사를 위한 멀티-웰 기반의 세포배양검사 장치

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2021177530A1 (ko) * 2020-03-06 2021-09-10 주식회사 퀀타매트릭스 정확한 관찰이 용이한 신속한 세포배양검사 장치

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