JP2016182091A - 細胞培養器及び細胞培養方法 - Google Patents

Abstract

【課題】細胞を顕微鏡で観察したときに観察視野の広い範囲で焦点を合わせることが可能な細胞培養器、及びその使用による細胞培養方法を提供する。【解決手段】凹部１が上面２ａに形成された基板２と、上面２ａに設けられ、且つ、凹部１の開口縁よりも一回り大きい径を有する貫通孔３が形成された貫通孔板４とを備え、基板２の上方から見て、貫通孔３の径方向内側に配置された凹部１及び上面２ａにより構成された底部７ａ、並びに、貫通孔３の内壁３ｃにより構成された側壁部７ｃによって液密にウェル７が形成され、ウェル７の底部７ａにおいて、凹部１を除いた上面２ａにより第一段差部が構成され、第二段差部は、凹部１内において第一段差部よりも１段下面２ｂ側に設けられている細胞培養器１０。【選択図】図４

Description

本発明は、細胞を培養する容器及びこの容器を用いて細胞を培養する方法に関する。

近年、本発明者らは、再生医療技術の発展および新規医薬品の開発に資する技術として、複雑かつ微細な三次元構造を構築することが可能な強度と親水性を併せ持った、光分解性及び加水分解性ゲルを提案した（特許文献１，２）。これらのゲルを使用することにより、生体移植に適した三次元構造を有する組織体の形成及び生体環境に近い細胞アッセイ系の開発を進めている。さらに、三次元環境中で培養された細胞群から目的の細胞を分離する手段として、細胞群を内包した光分解性ゲルの特定領域にのみ光を照射する細胞分離装置を提案した（特許文献３）。

特開２０１４−２２６０８８号公報 国際公開第２０１４／１８８９１１号 特開２０１４−２２６０８９号公報

本発明者らが提案した光分解性ゲルは、二次元的に培養した細胞群から目的の細胞を分離する用途にも適している。細胞を分離する際には、まず目的の細胞を選抜することが必要であり、細胞を培養する培養器には、細胞を顕微鏡で観察したときに観察視野の広い範囲で焦点が合わせられることが求められている。

本発明は、上記事情に鑑みてなされたものであり、細胞を顕微鏡で観察したときに観察視野の広い範囲で焦点を合わせることが可能な細胞培養器、及びその使用による細胞培養方法を提供する。

［１］上面及び下面を有する基材と、前記上面に開口し、前記基材内に設けられた底部及び側壁部からなるウェルと、を備え、前記底部は、前記ウェルの径方向内側において基材厚みが小さくされた１段以上の段差部を有する、細胞培養器。
［２］前記段差部のうち、前記ウェルの径方向外側に位置する第一段差部と、前記ウェルの径方向内側で且つ前記第一段差部よりも前記下面側に位置する第二段差部と、が階段状に設けられている上記［１］に記載の細胞培養器。
［３］前記ウェルの底部が親水性である、上記［１］又は［２］に記載の細胞培養器。
［４］前記ウェルの底部がポリリジン膜によってコートされている、上記［１］〜［３］の何れか一項に記載の細胞培養器。
［５］前記基材は、凹部が上面に形成された基板と、前記上面に設置され、且つ、前記凹部の開口縁よりも一回り大きい径を有する貫通孔が板厚方向に形成された貫通孔板と、を備え、前記ウェルは、前記基板の上方から見て、前記貫通孔の径方向内側に配置された前記凹部及び前記上面により構成された底部、並びに、前記貫通孔の内壁により構成された側壁部、によって液密に形成され、前記ウェルの底部において、前記段差部のうち第一段差部は、前記凹部を除いた前記上面により構成され、前記段差部のうち第二段差部は、前記凹部内において前記第一段差部よりも１段下面側に設けられている、上記［１］〜［４］の何れか一項に記載の細胞培養器。
［６］前記ウェルの底部の最底面から１段目の段差部の高さまで充填された第一ハイドロゲルからなる第一ゲル層が備えられ、前記第一ゲル層の上面の周縁と前記１段目の段差部の周縁とが密着し、且つ、前記第一ゲル層の上面と前記１段目の段差部とが同じ高さ水準とされている、上記［１］〜［５］の何れか一項に記載の細胞培養器。
［７］前記第一ゲル層の上面に付着した細胞が備えられている、上記［６］に記載の細胞培養器。
［８］前記第一ゲル層の上に、第二ハイドロゲルからなる第二ゲル層が積層されている、上記［６］又は［７］に記載の細胞培養器。
［９］前記第一ゲル層の上又は前記第二ゲル層の上に培養液が保持されている、上記［６］〜［８］の何れか一項に記載の細胞培養器。
［１０］上記［１］〜［９］の何れか一項に記載の細胞培養器を使用して細胞を培養する、細胞培養方法。

本発明の細胞培養器及び細胞培養方法によれば、培養する細胞が付着するゲル層の上面を極めて平坦にすることができるので、ゲル層の上面に付着した細胞を顕微鏡で観察したときに観察視野の広い範囲において多数の細胞に焦点を合わせられる。これにより、観察視野中の細胞の識別効率が向上し、目的の細胞を容易に選抜することができる。

本発明の第一実施形態の細胞培養器１０を示す分解斜視図である。 細胞培養器１０を示す斜視図である。 細胞培養器１０が有するウェル７の断面模式図である。 細胞培養器１０のウェル７に第一ゲル層１１及び第二ゲル層１２が備えられた様子を示す断面模式図である。 細胞培養器１０を構成する基板２の平面図及び断面図である。 基板２の上面に設けられた凹部１における段差部の構成を示す平面図及び断面図である。 実施例１(A)及び比較例１(B)でサンドイッチ培養された細胞を顕微鏡観察した視野を撮像した画像である。 実施例２(a)及び比較例２(b)で２つのゲル層の間に挟まれた緑色蛍光ビーズを基板厚み方向にスライスするように顕微鏡観察した視野を撮像した画像である。

《細胞培養器》
以下、本発明の一実施形態である細胞培養器１０について、図面を参照して説明する。
図１および図２に示すように、細胞培養器１０は、凹部１が上面２ａに４行８列で形成された基板２と、上面２ａに設置され、且つ、凹部１の開口縁よりも一回り大きい径を有する貫通孔３（ウェル７）が板厚方向に４行８列で形成された貫通孔板４と、を有する基材５と、基板２の上面２ａに貫通孔板４を押さえつけて保持するホルダー６と、を備えている。

［ウェル］
図３に示すように、細胞培養器１０の基材５は、基板２と貫通孔板４とが一体化した状態において、基板２の下面２ｂによって構成される下面５ｂ及び貫通孔板４の上面４ａによって構成される上面５ａを有する。また、基材５は、上面５ａ（４ａ）に開口し、基材５内に設けられた底部７ａ及び側壁部７ｃからなるウェル７と、を備える。

ウェル７は、基板２の上方から見て（図３のＺ軸負方向へ見て）、貫通孔板４の貫通孔３の径方向（図３のＹ軸方向）の内側に配置された凹部１及び上面２ａにより構成された底部７ａ、並びに、貫通孔３の内壁３ｃにより構成された側壁部７ｃ、によって液密に形成されている。

底部７ａは、ウェル７の径方向の内側において基材厚みが小さくされた１段以上の段差部８を有する。段差部８において、ウェル７の径方向外側に位置する第一段差部８１と、ウェル７の径方向内側で且つ第一段差部８１よりも下面２ｂ側に位置する第二段差部８２と、が階段状に設けられている。

底部７ａにおいて、段差部８のうち第一段差部８１は、凹部１を除いた上面２ａにより構成されている。より詳しくは、第一段差部８１は、ウェル７の径方向内側において、上面２ａのうち凹部１を除いた領域である第一段差部上面８１ａと、凹部１の側壁１ｃの上端部である第一段差部側壁面８１ｃとによって構成されている。

底部７ａにおいて、段差部８のうち第二段差部８２は、凹部１内において第一段差部８１よりも１段下面側に設けられている。より詳しくは、第二段差部８２は、第一段差部８１よりも１段下面側において、凹部１の最底面（最下面）１ａを除いた領域である第二段差部上面８２ａと、第二段差部上面８２ａから最底面１ａまでを接続する第二段差部側壁面８２ｃとによって構成されている。

［ゲル層］
図４に示すように、ウェル７の底部に設けられた１段以上の段差部８のうち、最底面１ａから１段目の第二段差部８２の高さまで充填された第一ハイドロゲルからなる第一ゲル層１１が備えられている。第一ゲル層１１の側面と第二段差部側壁面８２ｃとが密着され、最底面１ａと第二段差部側壁面８２ｃとによって構成される第一ゲル層収容部に、第一ハイドロゲルが隙間無く充填されている。さらに、第一ゲル層の上面１１ａの周縁と第二段差部８２の周縁（内円）とが密着し、且つ、第一ゲル層の上面１１ａと第二段差部上面８２ａとが同じ高さ水準とされている。これにより、第一ゲル層の上面１１ａが極めて平坦化されるとともに、第一ゲル層１１の厚みが均一にされている。

第一ゲル層１１の上に、第二ハイドロゲルからなる第二ゲル層１２が積層されている。
図４に示すように、ウェル７の底部に設けられた１段以上の段差部８のうち、上方から数えて１段目の第一段差部８１の高さまで充填された第二ハイドロゲルからなる第二ゲル層１２が備えられている。第二ゲル層１２の側面と第一段差部側壁面８１ｃとが密着され、第一ゲル層の上面１１ａと第一段差部側壁面８１ｃとによって構成される第二ゲル層収容部に、第二ハイドロゲルが隙間無く充填されている。さらに、第二ゲル層の上面１２ａの周縁と第一段差部８１の周縁（外円）とが密着し、且つ、第二ゲル層の上面１２ａと第一段差部上面８１ａ（２ａ）とが同じ高さ水準とされている。これにより、第二ゲル層の上面１２ａが極めて平坦化されるとともに、第二ゲル層１２の厚みが均一にされている。

第一ゲル層１１の厚みに相当する第一段差部８１の高さは特に限定されず、例えば０．１ｍｍ〜５ｍｍが好ましく、０．２ｍｍ〜１ｍｍがより好ましく、０．３ｍｍ〜０．８ｍｍがさらに好ましい。０．１ｍｍ以上であることにより、第一ゲル層の厚みを均一化することが容易になる。５ｍｍ以下であることにより、目的の細胞を選択的に分離することが容易になる。

第二ゲル層１２の厚みに相当する第二段差部８２の高さは特に限定されず、例えば０．１ｍｍ〜５ｍｍが好ましく、０．２ｍｍ〜１ｍｍがより好ましく、０．３ｍｍ〜０．８ｍｍがさらに好ましい。０．１ｍｍ以上であることにより、第二ゲル層の厚みを均一化することが容易になる。５ｍｍ以下であることにより、目的の細胞を選択的に分離することが容易になる。

なお、第二ゲル層１２の上面１２ａが高度に平坦化されている必要が無い場合、第二ゲル層１２の厚みは第二段差部８２の高さと一致していなくても構わない。

［細胞のサンドイッチ培養］
細胞培養器１０において、第一ゲル層の上面１１ａに付着した細胞（不図示）が更に備えられ、細胞が第一ゲル層１１と第二ゲル層１２の境界面において培養される。ウェル７内の第二ゲル層１２の上には培養液（不図示）が満たされており、ゲル層を拡散及び浸透して、栄養成分及び酸素が細胞に供給される。

上記の様にサンドイッチ培養された細胞を光学顕微鏡で観察すると、第一ゲル層の上面１１ａが極めて平坦化されているので、観察視野内の多数の細胞が同じ高さ水準にある。この結果、観察視野内の多数の細胞にピントが合った状態で観察できるので、細胞の識別率が向上し、目的の細胞を容易に選択することができる。

［ゲル層の上面の平坦性の評価方法］
細胞培養器１０に備えられる第一ゲル層の上面１１ａの平坦性を評価する方法として、細胞に替えて蛍光ビーズを上面１１ａに付着させ、所定の焦点深度で階層的にゲル層１１，１２をスライスするように観察し、その観察視野の広い範囲において均一に蛍光ビーズが分散していることを調べる方法が挙げられる。ここで、所定の焦点深度としては、例えば１枚のスライス当たり１０μｍ〜３０μｍが挙げられ、略球形の蛍光ビーズの直径としては、例えば１μｍ〜３０μｍが挙げられる。撮像するスライス画像の枚数は、３枚以上であることが好ましく、５枚以上であることがより好ましく、１０枚以上であることが特に好ましい。１０倍の対物レンズをとおして観察した一辺３ｍｍ程度の視野全体において、蛍光ビーズが同じ高さ水準にあることが好ましい。
例えば、１０倍の対物レンズをとおして観察した一辺３ｍｍ程度の視野全体において、蛍光ビーズが同じ又は同等の高さ水準にあることが好ましい。ここで、同じ又は同等の高さ水準にあることは、例えば、焦点深度を20μm/sliceに設定し、焦点深度を段階的にずらして複数枚の蛍光写真を撮像したとき、任意の一枚においては殆ど蛍光が観察されず、次の一枚において突如として観察視野の全体に均一に分散した蛍光ビーズの存在を示す蛍光が観察されることによって確認できる。このように観察される蛍光画像は、上記任意の一枚と次の一枚の間に、均一に分散した蛍光ビーズの端部が位置することを示している。
なお、第二ゲル層の上面１２ａについても同様の方法でその平坦性を評価することが可能であり、第一ゲル層の上面１１ａと同等の平坦性を有することが好ましい。

［細胞の分離及び回収］
第一ハイドロゲル及び第二ハイドロゲルとして光分解性ゲルを使用してサンドイッチ培養を行うと、多数の細胞にピントを合わせた状態でレーザー光を高精度に照射し、狙った局所のゲルのみを分解して、目的の細胞のみを選択的に分離及び回収することができる。この際、第一ゲル層及び第二ゲル層の上面１１ａ、１２ａが平坦化されているので、高分解能で多数の細胞にピントを合わせることができる。さらに、第一ゲル層１１及び第二ゲル層１２の厚みが共に均一化されているので、ゲル層の厚み方向で光照射の焦点がずれて細胞の分離精度が低下することを防止している。

［ハイドロゲルの種類］
第一ハイドロゲル及び第二ハイドロゲルの種類は特に限定されず、従来の細胞培養に使用されるハイドロゲルが適用可能である。選択した目的の細胞のみを分離及び回収することが容易になる観点から、特許文献１〜３に記載された光分解性ゲルが好適である。この他、マトリゲル、コラーゲンなどの細胞外マトリクスを含む公知のハイドロゲルも好適である。また、非特許文献（Yanagawa, F. et al., Activated-Ester-Type Photocleavable Crosslinker for Preparation of Photodegradable Hydrogels Using a Two-Component Mixing Reaction. Adv. Healthc. Mat., 4 246-254 (2015).）に記載されたプレゲル溶液及びハイドロゲルも好適である。
第一ハイドロゲルと第二ハイドロゲルの種類は同じであってもよいし、異なってもよい。

［基板２について］
細胞培養器１０を構成する基板２の平面図及び断面図を図５に示す。上面２ａには段差部８が設けられた凹部１が８行４列で配置されている。凹部１を拡大した平面図及び断面図を図６に示す。凹部１が設けられた基板２の上面２ａの一部は、前述したように、第一段差部上面８１ａを構成している。第一段差部上面８１ａの周縁が基板２の下面方向に窪むことにより形成される第一段差部８１の周縁部が、外円８１ｄを構成している。第二段差部上面８２ａの周縁が基板２の下面方向に窪むことにより形成される第二段差部８２の周縁部が、内円８２ｄを構成している。外円８１ｄは凹部１の開口縁を示す。

外円８１ｄの直径は特に限定されず、例えば１ｍｍ〜５０ｍｍに設定することができる。上記範囲であると、第二ゲル層の上面１２ａを容易に平坦化することができる。
内円８２ｄの直径は特に限定されず、例えば０．５ｍｍ〜３０ｍｍに設定することができる。上記範囲であると、第一ゲル層の上面１１ａを容易に平坦化することができる。

基板２の材料は特に限定されず、サンドイッチ培養された細胞を光学的に観察することが容易になる観点から透明材料が好ましい。透明材料としては、例えば、合成樹脂、ガラス等が挙げられる。また、細胞培養を行う観点から、オートクレーブ滅菌が可能な材料であることが好ましい。

合成樹脂としては、シリコーン系樹脂（例えばポリジメチルシロキサン(ＰＤＭＳ)）、アクリル系樹脂（例えばポリメタクリル酸メチル(ＰＭＭＡ)）、スチレン系樹脂（例えばポリスチレン）、ポリビニルピリジン系樹脂（ポリ(４−ビニルピリジン)、４−ビニルピリジン−スチレン共重合体等）、ポリオレフィン系樹脂（例えばポリエチレン樹脂、ポリプロピレン樹脂、ポリメチルペンテン樹脂）、ポリエステル樹脂（ポリエチレンテレフタレート樹脂(ＰＥＴ)）、ポリカーボネート系樹脂、エポキシ系樹脂等が例示できる。
なかでも、シリコーン系樹脂（例えばポリジメチルシロキサン(ＰＤＭＳ)）、アクリル系樹脂（例えばポリメタクリル酸メチル(ＰＭＭＡ)）、スチレン系樹脂（例えばポリスチレン）は、高い透明性を有するため好ましい。

シリコーン系樹脂は酸素透過性が高いので、基板２の下面２ｂから上面２ａに向けて、細胞に必要な酸素を透過させることができる。この目的においては特にＰＤＭＳが基板２の材料として適している。酸素透過性をより高める観点から、基板２の下面２ｂから凹部１の最底面１ａまでの距離は、０．２〜５ｍｍであることが好ましく、０．５〜２ｍｍであることがより好ましい。

基板２に備えられた凹部１は公知の加工方法により形成可能であり、例えば、レプリカモールディング法、ＲＩＥ（Reactive Ion Etching）、レーザー加工、ＮＣ加工、光造形加工、射出成型加工、ナノインプリント加工などが挙げられる。

基板２の上面２ａ、凹部１、貫通孔３の内壁３ｃなどのウェル７の内面を構成する各表面に、例えば親水化処理、ポリリジンコート処理等の公知の表面処理を施してもよい。ウェル７の内面が親水性であると、ハイドロゲル前駆体を含む溶液が親水性表面に拡がり易くなり、ウェル７内に形成するゲル層の上面を平坦化することが容易になる。さらに、ゲル層とウェル７の内面との密着性を向上させることができる。これらの観点から、基板２の上面２ａ、凹部１の接触角は６０度以下であることが好ましく、４０度以下であることがより好ましい。
なお、上面２ａなどのウェル７の内面を構成する各表面が親水性であることは必須ではなく、各表面は疎水性であっても構わないが、上記の効果を得る観点から親水性であることが好ましい。

［貫通孔板４について］
貫通孔板４の材料及び加工方法は特に限定されず、基板２と同様の材料及び加工方法により作製することができる。基板２が構成する底部７ａと貫通孔板４の貫通孔３が構成する側壁部７ｃとからなるウェル７を液密に形成する観点から、貫通孔板４及び基板２は合成樹脂製であることが好ましい。

［ホルダー６について］
図１に示すように、ホルダー６は、基板２を支持する基体部６１と、基体部６１に支持された基板２の上面２ａに向けて貫通孔板４を押圧する一対の押圧バー６３（押圧部材）と、を有する。基体部６１は、略矩形の薄板状の底板部６４と、底板部６４の上面に高さ方向に突出して形成された厚肉部６５とを有する。

厚肉部６５は、底板部６４の２つの側縁部６４ａに形成された側縁凸部６５ａと、底板部６４の２つの端縁部６４ｂに形成された端縁凸部６５ｂと、を有する。
側縁凸部６５ａおよび端縁凸部６５ｂは、それぞれ底板部６４の側縁部６４ａおよび端縁部６４ｂに沿って形成されている。
２つの端縁凸部６５ｂの両端面には、それぞれ押圧バー６３の端部が挿入される挿入穴６５ｃが形成されている。

厚肉部６５によって囲まれた内部空間は、基板２および貫通孔板４の下部を収容する収容凹部６６となっている。基体部６１は、金属や樹脂で構成することができる。

図１および図２に示すように、押圧バー６３は、例えば金属などで構成され、その両端部を厚肉部６５の挿入穴６５ｃに挿入した状態で、この挿入部分を支点として、端縁凸部６５ｂに沿う中心軸の軸周り方向に回動可能となっている。
押圧バー６３の中央部には、例えばシリコーン樹脂で構成された円筒体６７が挿通され、回動可能に設定されている。

図２に示すように、一対の押圧バー６３は、円筒体６７を貫通孔板４の端面に設けられた突出部４１に係止させることができる。これによって、貫通孔板４を基板２に対して押圧し、ウェル７を確実に液密状態とすることができる。

底板部６４には４行８列に配列された３２個の貫通孔６８が各ウェル７の直下に設けられている。これにより、基材５の上方からだけでなくホルダー６の下方からも貫通孔６８を通してウェル７の内部を光学的に観察することができる。

《細胞培養方法》
細胞培養器１０を用いて細胞を培養する方法の一例について、図１〜図６を参照して説明する。まず、ホルダー６の収容凹部６６に基板２を収容し、基板の上面２ａに貫通孔板４を設置して、押圧バー６３で固定することにより、ウェル７を液密に形成する。続いて、ウェル７の最底面１ａに第一ハイドロゲルの前駆体を含む溶液（プレゲル溶液）を滴下し、親水性の最底面１ａに当該溶液を自然に展開させる。プレゲル溶液の体積を第一ゲル層収容部の容積と等しくすることにより、プレゲル溶液の液面にメニスカスが形成されず、プレゲル溶液の液面と第二段差部上面８２ａとの高さ水準が等しくなる。この結果、ゲル前駆体が化学反応によりゲル化されると、ゲル層の側面が第二段差部側壁面８２ｃに密着し、第二段差部上面８２ａと高さ水準が等しい第一ゲル層１１が形成される。同じ高さ水準において第一ゲル層の上面１１ａの周縁と第二段差部８２の周縁（内円８２ｄ）とが密着しているので、第一ゲル層の平坦な上面１１ａは上記の高さ水準で安定に保持される。

次に、第一ゲル層１１が形成されたウェルに液体培地（培養液）及び所望の細胞を注入し、細胞を第一ゲル層の上面１１ａに播種する。その後、上面１１ａに付着した細胞を残したまま液体培地を吸い出す。続いて、上面１１ａに第二ハイドロゲルの前駆体を含む溶液（プレゲル溶液）を滴下し、上面１１ａの細胞を押し流さないように静かに展開させる。プレゲル溶液の体積を第二ゲル層収容部の容積と等しくすることにより、プレゲル溶液の液面にメニスカスが形成されず、プレゲル溶液の液面と第一段差部上面８１ａとの高さ水準が等しくなる。この結果、ゲル前駆体が化学反応によりゲル化すると、ゲル層の側面が第一段差部側壁面８１ｃに密着し、第一段差部上面８１ａと高さ水準が等しい第二ゲル層１２が形成される。同じ高さ水準において第二ゲル層の上面１２ａの周縁と第一段差部８１の周縁（外円８１ｄ）（凹部１の開口縁）とが密着しているので、第二ゲル層の平坦な上面１２ａは上記の高さ水準で安定に保持される。

第二ゲル層１２が形成されたウェル７内に液体培地を注入することにより、第二ゲル層１２及び第一ゲル層１１に液体培地が浸透及び拡散する。
以上の工程により、第一ゲル層１１と第二ゲル層１２の境界面に細胞が保持されたサンドイッチ培養構造を形成できる。

以上の工程で形成された第一ゲル層の上面１１ａの平坦性は極めて高いので、光学顕微鏡で観察したときの観察視野の広い範囲で、焦点が合った細胞像が得られる。細胞の観察は基材５の上方又は下方から、貫通孔板４の貫通孔３及びホルダー６の貫通孔６８を通して光学的に観察することができる。

広い範囲でピントが合った観察視野の中から、選択した目的の細胞を囲む微小領域に光を照射して、第一ゲル層１１及び第二ゲル層１２を局所的に分解することにより、液体培地中に目的の細胞を取り出して回収することができる。光照射は光学顕微鏡で観察しながら行うことができる。光照射及び細胞回収方法の詳細は、例えば特許文献１〜３、および非特許文献（Tamura, M. et al., Optical Cell Separation from Three-Dimensional Environment in Photodegradable Hydrogels for Pure Culture Techniques. Sci. Rep., 4, 4793 (2014).）を参照して行うことができる。

本発明の一実施形態の細胞培養方法で培養する細胞は特に限定されず、例えばヒトを含む動物由来の細胞、植物由来の細胞等を目的に応じて適宜選択される。細胞の培養に使用する培養液は特に限定されず、従来の細胞培養に使用される培養液が適宜選択される。

［実施例１］
細胞培養器１０を使用し、市販のマトリゲルのプレゲル溶液７μＬをウェル７の底部７ａにおける内円８２ｄの内側に滴下し、均一に塗布した後、３７℃で１５〜３０分インキュベートして第一ゲル層１１（ボトム層）を形成した。続いて、予め３７℃に温め、付着性細胞（DU145細胞）を懸濁した液体培地６００μＬをウェル７内に注入し、３７℃で３時間静置し、付着性細胞を第一ゲル層の上面１１ａに付着させた。これにより細胞密度が2,000 cells/well、25 cells/mm²となった。次に、液体培地を完全に除去し、プレゲル溶液２０μＬをウェル７の底部７ａにおける外円８１ｄの内側に滴下に、３７℃で１５〜３０分インキュベートして第二ゲル層１２（ミドル層）を形成した。続いて３７℃に温めた液体培地６００μＬをウェル７内に注入し、細胞のサンドイッチ培養を所定時間行った後、光学顕微鏡で細胞画像を撮像した。

この結果、図７(A)に示すように、第一ゲル層の上面１１ａが平坦であるため、同じ高さ水準にある細胞の数が多くなるので、観察視野の広い範囲で細胞に焦点が適合した画像を取得できた。図中、白矢印はピントのあっている細胞を指している。画像の左下及び右下に見える黒い円弧は内円８２ｄの一部である。

［比較例１］
市販の９６穴プレートのウェルにマトリゲルのプレゲル溶液４０μＬを注入し、３７℃で１５〜３０分インキュベートして下層ゲルを形成した。続いて、付着性細胞DU145（2,000 cells/well、57 cells/mm²）を下層ゲルの上に播種し、３７℃で３時間静置し、下層ゲルの上面に付着させた。次に、上澄み液を完全に除去し、プレゲル溶液４０μＬを下層ゲルの上に静かに注入し、３７℃で１５〜３０分インキュベートして上層ゲルを形成した。サンドイッチした付着性細胞を実施例１と同様に光学顕微鏡で細胞画像を撮像した。
この結果、図７(B)に示すように、実施例１と同じ観察視野範囲内において、黒矢印で示すピントの合っていない細胞が多数現れた。白矢印で示すピントの合っている細胞は、観察視野の中央部に集中していた。この結果から、細胞が付着したゲル表面の中央部と周縁部の高さ水準が異なり、ゲル表面の平坦性が低いことが分かった。

［実施例２］
市販のマトリゲルのプレゲル溶液を使用し、細胞に替えて緑色蛍光ビーズ（直径3.1μｍ；50,000ビーズ／ウェル）を使用した以外は、実施例１と同様にサンドイッチ培養構造を有する細胞培養器１０を作製した。
マトリゲルでサンドイッチした緑色蛍光ビーズを共焦点レーザー顕微鏡(FV300, Olympus)で観察した。この際、焦点深度(z-stack)を20μm/sliceに設定し、焦点深度を段階的にずらして合計１１枚（Total depth 200μm）のスライス画像を撮像した。

この結果、図８(a)に示すように、深さ０μｍ〜６０μｍを撮像した画像では、観察視野全域にわたって緑色蛍光ビーズの存在がほとんどないが、深さ８０〜１６０μｍを撮像した５枚のうち何れの画像においても、観察視野の広い範囲で均一に緑色蛍光ビーズの蛍光が観察された。着目すべきは、深さ６０μｍでは少量の蛍光ビーズのみが観察される一方、深さ８０μｍでは観察視野全体に均一に分散した蛍光ビーズが突如として現れる（観察される）点である。
これらの結果は、第一ゲル層と第二ゲル層の境界に配置した各緑色ビーズが観察視野全域にわたって同じ高さ水準に位置していることを示している。従って第一ゲル層の上面１１ａが極めて平坦であることが確認された。

［比較例２］
市販の９６穴プレートのウェルにマトリゲルのプレゲル溶液４０μＬを注入し、３７℃で１５〜３０分インキュベートして下層ゲルを形成した。続いて、緑色蛍光ビーズの懸濁液（10,000ビーズ／ウェル）を下層ゲルの上に注入し、３７℃で３０分静置し、下層ゲルの上面に付着させた。次に、上澄み液を完全に除去し、プレゲル溶液４０μＬを下層ゲルの上に静かに注入し、３７℃で１５〜３０分インキュベートして上層ゲルを形成した。
マトリゲルでサンドイッチした緑色蛍光ビーズを実施例２と同様に共焦点レーザー顕微鏡(FV300, Olympus)で観察した。

この結果、図８(b)に示すように、深さ２０〜４０μｍの画像においては、観察視野の中央部のみに緑色蛍光ビーズの蛍光が観察され、深さ６０〜１００μｍの画像においては、観察視野の中央部を除いた周縁部のみに緑色蛍光ビーズの蛍光がドーナッツ状に観察された。この結果は、第一ゲル層と第二ゲル層の境界に配置した各緑色ビーズが、中央部と周縁部とで異なる高さ水準に位置していることを示している。このように下層ゲルの表面のうち中央部が下がっている理由として、下層ゲルの形成時にプレゲル溶液がウェルの側壁部に対してメニスカスを形成したことが挙げられる。

上述の実施形態における各構成及びそれらの組み合わせ等は一例であり、本発明の趣旨を逸脱しない範囲で、構成の付加、省略、置換、およびその他の変更が可能である。また、本発明は各実施形態によって限定されることはなく、請求項（クレーム）の範囲によってのみ限定される。

本発明は、細胞生物学、細胞工学、組織工学などの学術分野、及び再生医療、医薬品開発などのバイオ関連工業分野において広く利用することができる。

１…凹部、２…基板、２ａ…基板の上面、２ｂ…基板の下面、３…貫通孔、３ｃ…貫通孔の内壁、４…貫通孔板、４ａ…貫通孔板の上面、５…基材、５ａ…基材の上面、５ｂ…基材の下面、６…ホルダー、７…ウェル、７ａ…ウェルの底部、７ｃ…ウェルの側壁部、８…段差部、８１…第一段差部、８１ａ…第一段差部上面、８１ｂ…第一段差部側壁面、８２…第二段差部、８２ａ…第二段差部上面、８２ｂ…第二段差部側壁面、１０…細胞培養器、１１…第一ゲル層、１１ａ…第一ゲル層の上面、１２…第二ゲル層、１２ａ…第二ゲル層の上面

Claims (10)

1. 上面及び下面を有する基材と、
   前記上面に開口し、前記基材内に設けられた底部及び側壁部からなるウェルと、を備え、
   前記底部は、前記ウェルの径方向内側において基材厚みが小さくされた１段以上の段差部を有する、細胞培養器。
2. 前記段差部のうち、
   前記ウェルの径方向外側に位置する第一段差部と、
   前記ウェルの径方向内側で且つ前記第一段差部よりも前記下面側に位置する第二段差部と、が階段状に設けられている請求項１に記載の細胞培養器。
3. 前記ウェルの底部が親水性である、請求項１又は２に記載の細胞培養器。
4. 前記ウェルの底部がポリリジン膜によってコートされている、請求項１〜３の何れか一項に記載の細胞培養器。
5. 前記基材は、
   凹部が上面に形成された基板と、
   前記上面に設置され、且つ、前記凹部の開口縁よりも一回り大きい径を有する貫通孔が板厚方向に形成された貫通孔板と、を備え、
   前記ウェルは、
   前記基板の上方から見て、前記貫通孔の径方向内側に配置された前記凹部及び前記上面により構成された底部、並びに、前記貫通孔の内壁により構成された側壁部、によって液密に形成され、
   前記ウェルの底部において、前記段差部のうち第一段差部は、前記凹部を除いた前記上面により構成され、前記段差部のうち第二段差部は、前記凹部内において前記第一段差部よりも１段下面側に設けられている、請求項１〜４の何れか一項に記載の細胞培養器。
6. 前記ウェルの底部の最底面から１段目の段差部の高さまで充填された第一ハイドロゲルからなる第一ゲル層が備えられ、
   前記第一ゲル層の上面の周縁と前記１段目の段差部の周縁とが密着し、且つ、前記第一ゲル層の上面と前記１段目の段差部とが同じ高さ水準とされている、請求項１〜５の何れか一項に記載の細胞培養器。
7. 前記第一ゲル層の上面に付着した細胞が備えられている、請求項６に記載の細胞培養器。
8. 前記第一ゲル層の上に、第二ハイドロゲルからなる第二ゲル層が積層されている、請求項６又は７に記載の細胞培養器。
9. 前記第一ゲル層の上又は前記第二ゲル層の上に培養液が保持されている、請求項６〜８の何れか一項に記載の細胞培養器。
10. 請求項１〜９の何れか一項に記載の細胞培養器を使用して細胞を培養する、細胞培養方法。