JPS6251977A - 組織培養プレ−ト - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 工　発明の背景 〔技術分野〕 本発明は、細胞密度自動算定等に用いられる組織培養プ
レートに関する。

組織培養実験は人為的誤差をなくし、実験スピードをあ
げるため自動化の方向に進みつつある。また社会的にも
組織培養の需要はますます増加すると考えられ、供給と
のバランスの点からも最新技術を駆使し、できるだけ人
の手を借りずにコンスタントな結果が常に得られる装置
の開発が要望されている。

従来は細胞コロニーを算定する方法が行われ。

この方法ではコロニーを形成させる必要があり、多くの
場合細胞を染色しなければならない等の多くの問題があ
る。

細胞コロニーの染色による算定法ではなく、生細胞を直
接細胞密度測定を行うには画像解析自動算定法等の統計
的処理の精度をあげることと並行して、従来の組織培養
プレートでは、自動化の際、その機器に適応するような
形態と機能とが十分でないので、これらの組織培養プレ
ートの検討が必要である。

例えば、９６穴マイクロプレートの場合、液体自身の分
子間に働く力、つまり凝集力が液体分子とそれが接する
固体表面との間に（動く力、つまり付着力より小である
ため、周囲が高く中央がくぼんだ曲面のメニスカスが生
じ、それによる１ｉ！ｌｌ察光の屈折のため顕微鏡視野
の周辺がぼけてしまい十分な解析が不可能となる。

上記の問題、特に凹状のメニスカス減°少に対する対策
としては、これまで次のようなことがなされている。

細胞はプレートのウェル（有底小室）の器壁に付着して
増殖するが、付着にはウェルの器壁が親木性であること
が必要である。ガラス壁は親水性であるが、プラスチッ
クの場合は疎水性であるため、コーティング等の処理に
よりプラスチック表面を親水化する。これらの処理を施
してウェル底面、すなわち、細胞の付着する部分のみを
親水化することを試みたものがあるが、培養液には一般
に５〜２０％の血清を添加する為、一定時間培養を続け
ていると、血清中に含まれる蛋白が器壁にコーティング
されてしまい、ウェル全体が親水化される等の問題等に
よりやはりメニスカスの問題が生じてしまう。

また、本発明者らは、先に、ウェル一杯に培養液を入れ
た状態のものでは曲面状のメニスカスが形成されないこ
とから、第４図に示すような形状のウェルを考案してい
る。すなわち、ウェルは大径部４１および小径部４２を
有し、直径は５．５〜６■でウェル全体の高さが４．５
１鵬であり、底面から段部４３までの高さが２層重１段
部の直径が６．１〜７１３ｍｍのものである。

小径部４１全体に、すなわち、実ＭＡ４４で示すように
段部４３まで培養液を満たすことにより。

満たした直後においては、曲面状のメニスカスは生じな
いが、順次のウェルのＷ４微鏡観察等によりプレートを
移動させた場合などに振動した時１点線４５で示すよう
に壁面に近いところが高く、中央がへこんだメニスカス
が生じてしまうため、やはりメニスカスの問題が解決で
きないでいた。

ＩＩ　　発明の目的 本発明は、組織培養試験において細胞密度の自動算定等
に際し、培養液を入れるプレートの各ウェルにおいてウ
ェル壁と培養液との間に生じる凹状のメニスカスにより
ｗ４微鏡観察が支障を受けないよう構成した組織培養プ
レートを提供することを目的とする。

■　発明の詳細な説明 本発明は、少なくとも１個の有底小室を有する組織培養
プレートであって、前記小室は、底壁と、底壁にほぼ垂
直な周壁と、この周壁上端より外側上方に傾斜した面を
有する傾斜壁とで形成され、前記傾斜壁は充填される培
養液の液面の位置にあり、かつその水平面に対する鋭角
の傾斜角はプレートと培養液との接触角にほぼ等しいこ
とを特徴とする組織培養プレートを提供するものである
。

以下１本発明を更に詳細に説明する。

本発明の組織培養プレートのウェルは、従来のもので生
じたウェル壁と培養液との間のメニスカスに基づく問題
点を改良するために作成されたもので、これを第１図に
示す。

すなわち、底壁ｌＯと、底壁にほぼ垂直な周壁１１とこ
の周壁より外側上方に、水平面に対してほぼウェル材質
と培養液との接触角θで傾斜した傾斜壁１２とで形成さ
れている。尚、傾斜壁１２は曲面状であってもよい。

ウェル底は、位相差顕微鏡で例えば４０倍倍率でみて、
−視野でほとんどみえる面積とするのが良く、その直径
は４〜５ｍ＋ｓが好ましい。

こうすることにより、細胞分散のかたよりがあっても誤
差を非常に少なくすることができる。

底面積が大きくて一視野に入らないと、細胞分散のかた
よりがあった場合、−視野で全体を推測するには大きな
誤差が生ずるからである。

ウェルの容量は、２０〜１００ＪＬ文で、５０体文が最
適である。

ここで、凹状のメニスカスによる弊害を取り除くため、
つまり培養液の液面をほぼ水平面にするため周壁１１に
連結する傾斜壁１２に、ウェル材質と培養液との接触角
θとほぼ同じ角度の傾斜をつける。この接触角θはウェ
ル構成材質によっても、また培養液の選択によっても異
なる。なお、ウェル構成材料と培養液との接触角θは一
般に知られている方法により測定する。

底壁１０と、底壁１０にほぼ垂直な周壁１１とこの周壁
より外方に、はぼθで傾斜した傾斜壁１２とで培養液充
填空間が形成され、培養液は、第１図に点線１３．１４
で示す傾斜壁１２のレベル間に充填される。

これによって培養プレート静置時の凹状のメこスカスが
傾斜壁の傾斜角θによって相殺され、液面がほぼ平面に
なり、観察視野周辺の誤差がなくなり細胞密度測定精度
をあげることができる。

傾斜角が接触角よりも小さい場合は液面に凸状のメニス
カスが形成され、逆に接触角よりも大きい場合には凹状
のメニスカスが形成され、いずれも−視野で見える面積
が制限され、好ましくない。

尚、傾斜角が接触角にほぼ等しいとは、完全に一致しな
くとも実質的に観察視野に影響を与えない程度にメニス
カスの形成を防止し得る程度の角度の範囲を含むことを
意味する。

さらに、細胞密度測定を自動化した場合に、１つのウェ
ルから次のウェルへの移動が自動化され、この振動によ
ってもメニスカスが出ないので、測定精度をあげること
ができる。

このウェルを形成する材質は、細胞の培養に妨げとなら
ない性質の材料であればよい０代表例を挙げると、ガラ
ス、細胞培養に適した表面処理を施したポリエチレン、
ポリプロピレン、ポリスチレン、ポリカーボネート、塩
化ビニル樹脂、ＡＢＳ樹脂等がある。

このウェルは、一枚のプレート上に複数個ある。

プレートの外形は、どんな形でもよい０例えば、角形、
円形等が考えられるが、次に記す測定作動に都合のよい
ものを選択すればよい、すなわち、培養培地を自動的に
分注する機器、ウェルの中の細胞を自動的に洗浄する機
器等を使用するのに適する形状であり、かつウェルの配
置が適切なものが望ましい。

このプレートを用いて、細胞密度の測定は、次のように
して行なう、まず、第２図に示すような倒立位相差顕微
！１２１ののせもの台２２にこのプレート２３をのせる
。こののせもの台２２には、このプレート２３をおさえ
る装置あるいはぴったりと合う枠２４が用意されている
。プレート２３はあまりがたつかないようにされている
ことが望ましい。したがって、枠２４の内側には柔軟性
に富むバッキングがはめであるとさらにこのプレートは
ぴったりする。枠２４は制御手段２５により制御される
。顕微鏡２１を通した像は、一部モニター用のテレビ２
６に映されるようにされている場合もある。この像はコ
ンピューター２７にて画像解析され、視野内における細
胞の占める面積が計算され、それによって細胞密度が算
定される。

なお、培養および顕微鏡観察時に必要とされるプレート
カバーは密封系の場合は特開昭５８−９４３８２号およ
び回５８−９４３８３号に示されるものを用いればよい
。

本発明の組織培養プレートは１つのウェルが１観測視野
に充分入り、しかも培養液に凹状のメニスカスを生じな
いようにウェル壁面が所定の傾斜壁を有するから、細胞
密度測定精度を高くすることができるので、倒立位相差
顕微鏡、顕微鏡のせもの台の自動ピッチ移動モーターと
その制御部、画像自動解析装置等をシステム化すること
によって細胞密度自動算定を行うことができる。

本発明の組織培養プレートは、細胞密度自動算定に用い
られて効果的なものであるが、従来の手動による細胞密
度算定において用いれらても有効である。

〔実施例〕

次に、実施例を示して、本発明をさらに具体的に説明す
る。

組織培養プレート本体３１の大きさは、横１２７．８ｍ
ｍ　、たて８５．６＋ｓｍ、高さ５．８■とし、ウェル
３２は横１行に１２個、たて１列に８個の合計９６個設
けた（第３図参照）。

ウェル３２の大きさは外径８．８ｔ＋ｓ　、内径６．５
ｍｍとし、ウェルとウェルとのピッチ（間隔）は９．０
ａｕｓとした。　ウェル３２は、周壁１１の内径を２．
８＋ａ＋ｓ　、傾斜壁の上端の内径を８．４ｍｍ　、全
体の高さを２．０ｍｍ　、傾斜壁１２の高さを１．８■
とした。傾斜壁１２の傾斜角θは、培養液に５％仔牛血
清添加イーグルＭＥＭ（最小必須培地）を用いたので４
５°とした。

プレートカバーは、プレート本体を密封するものを用い
た（特開昭５８−９４３８２号および同５８−９４３８
３　号）、横１２８．０偽蕩、たて８ｆｌｉ、Ｏｍｍ、
高さ３．０ｍｍ　、材料の厚さは０．５ｍｍとした。

プレート材質にはポリスチレンを用いた。

なお、接触角０は、表面処理したポリスチレンと培養液
との間で決定した。

実験例 以上の組織培養プレートを用いた。

これを充分に洗浄ののち紫外線照射をして滅菌を行い、
前記培養液に浸せきして保存し、実験に供した。このう
えにｌ　ａｍあたり３Ｘ１０４個（Ｌ細胞、５％仔牛（
Ｎｅｗ　Ｂｏｒｎ　ＢＯＶＩＮＥ）血清添加イーグルＭ
ＥＭ）を、　０．０５　ｔｓ交毎分注したのち。

３７℃、５％炭酸ガス、９５％空気の条件の炭酸カスイ
ンキュベーター内にて４日間培養した後、ニコン製ＭＤ
ｙ！ｉ倒立位相差顕微鏡（４Ｘ５）にて各ウェル毎の細
胞の結像状態を観察するとともに、ウェルの写真撮影を
した。

比較例 べつに比較のために従来の円筒形ウェルで、本発明の旧
記ウェルと同じ視野に入るサイズのものを用いて、実験
例と同じ細胞を同じ条件で写真撮影を行った。

結果を本発明例および比較例をそれぞれ第５図および第
６図の写真に示す。

本発明の組織培養プレートを用いたものは培養液の表面
張力による光源の歪がなく、非常にきれいな写真撮影が
可能であった。

■　発明の具体的効果 本発明の培養プレートは、そのウェル底が充分顕微鏡の
一視野内におさまるため、細胞密度を測定する場合、ウ
ェル底に細胞分散のかたよりがあっても、−回で正確に
観測できる。

培養液の表面張力によるウェル材料との接触角と同じ角
度をもった傾斜部をウェルに設けているため、凹状のメ
ニスカスが相殺され平面となる。

このため観察視野の周辺が暗くなることがなくなり測定
精度が非常に高くなる。

さらに、１つのウェルから次のウェルと移動して観察す
る時、自動化しても振動による凹状メニスカスが生じな
いので、自動化を採用することができまた、観察結果の
解析に画像自動解析装置を用いれば、時間や操作の軽減
がはかられる。

本発明の組織培養プレートにより測定精度をあげること
ができるので生細胞密度自動算定を行うことができるよ
うになり細胞のコロニーをつくる必要も、細胞を染色す
る必要もなく、細胞を生きたままで、しかも最初に播種
する細胞の濃度をある程度高めてできるため、目的の培
養試験に定量性が出る。このため、このプレートを用い
た装置の利用範囲が広くなる。

例えば、細胞毒性試験、生理活性物質のスクリーニング
、制ガン剤等薬物の感受性試験、細胞の樹立化試験、変
異原性試験、発ガン物質性試験等に用いることができる
。

【図面の簡単な説明】

第１図は本発明の培養プレートのウェルの断面図、第２
図は本発明の培養プレートを用いて細胞密度を算定する
際の模式図。 第３図は本発明の組織培養プレートの部分断面斜視図。 第４図は従来の組織培養プレートの段部を有するウェル
の断面図である。 第５図および第６図は生物の形態を示す顕微鏡写真であ
り、それぞれ本発明および従来構成のプレートで培養結
果の４Ｘ５倍位相差顕微鏡写真である。 符号の説明 １０・・・ウェル底壁、１１・・・ウェル周壁。 １２・・・ウェル傾斜壁、１３．１４・・・培養液充填
レベル、２１・・・顕微鏡、２２・・・のせもの台、２
３・・・プレート、２４・・・枠、２５・・・制御手段
、２６・・・モニターテレビ、２７・・・コンピュータ
ー解析部、３１・・・プレート、３２・・・ウェル、４
１・・・大径部、４２・・・小径部、４３・・・段部、
４４・・・培養液初期充填レベル、４５・・・振動によ
りメニスカスを生じたレベル

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. （１）少なくとも１個の有底小室を有する組織培養プレ
   ートであって、前記小室は、底壁と、底壁にほぼ垂直な
   周壁と、この周壁上端より外側上方に傾斜した面を有す
   る傾斜壁とで形成され、前記傾斜壁は充填される培養液
   の液面の位置にあり、かつその水平面に対する鋭角の傾
   斜角はプレートと培養液との接触角にほぼ等しいことを
   特徴とする組織培養プレート。