JPH02501529A - 細胞培養装置用の生体適合性ポリオルガノシロキサン組成物 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ３３、段１ｉｆｆａ）が、ポリオルガノシロキサン表面を０．５〜１ｃａｌ／Ｊ のＩＮ塩酸と接触させる段階を含むことを特徴とする請求の範囲第３０項に記載 の細胞培養基質。

３４、段階ｂ）が、ポリオルガノシロキサン表面を０．５〜１山１／ｃｄの１Ｍ 水酸化アンモニウム水溶液と接触させる段階を含むことを特徴とする請求の範囲 第３０項に記載の細胞培養基質。

３５、前記ポリオルガノシロキサン組成物を細胞培養を支持する固体手段上に組 入れる段階を含むことを特徴とする請求の範囲第３０項に記載の細胞培養基質。

３６、　ＭＡ胞培養を支持する固体手段を含み、該固体手段がポリオルガノシロ キサンを含む表面を少なくとも一つ有し、該ポリオルガノシロキサン組成物が１ 級アミン含有シラン、カルボキシル基含有シラン、１級アミン含有シロキサンお よびカルボキシル基含有シロキサンからなる群から選ばれる化合物を含有する近 接層とともに硬化することにより処理された表面を持つことを特徴とする細胞培 養基質。

３７、前記ポリオルガノシロキサン組成物か３−アミノプロピルトリエトキシシ ラン、２−アミノエチルトリメトキシシラン、トリメチルシリル蟻酸、３−（ト リクロロシリル）酪酸、およびｉ、　１．１−　トリクロロート（トリメチルシ リル）シラナミンから選ばれる化合物を懸濁した水溶液あるいは緩衝キャリアー 水溶液の近接層とコーキュアーされ、このコーキュアーは近接組成物をＦｑ１室 温で、実質的に光なしで、約２４時間維持することにより行うことを特徴とする 請求の範囲第３６項に記載の細胞培養基質。

３８、前記ともに硬化する処理を６０℃、大気圧下で約４５分間行うことを特徴 とする請求の範囲第３６項に記載の細胞培養基質。

３９．前記固体手段がマルチウェルポリスチレンプレートであることを特徴とす る請求の範囲第２１項、第３０項あるいは第３６項に記載の細胞培養基質。

４０、前記ウェルの各々がその底部に前記ポリオルガノシロキサン組成物を含む ことを特徴とする請求の範囲第３９項に記載の細胞培養基質。

４１、前記ポリオルガノシロキサン組成物が前記ウェルの各々の底部と積層物を 形成することを特徴とする請求の範囲第４０項に記載の細胞培養基質。

４２、前記ウェルの各々の実質的に全ウェル底部が前記ポリオルガノシロキサン 組成物の単一層を含むことを特徴とする請求の範囲第４０項に記載の細胞培養基 質。

４３、前記ポリオルガノシロキサン組成物が前記ウェルの各々の底部に有るアン カーリングに接着していることを特徴とする請求の範囲第４２項に記載の細胞培 養基質。

４４、一つ以上のウェルを有する細胞培養プレートを含み、前記ウェルの各々が 少なくとも部分的にエラストマー状膜で形成された実質的に平らな底部を有し、 前記エラストマー状膜が細胞培養と細胞付着を許す、処理された上面を持ってい ることを特徴とする細胞培養基質。

４５、一つ以上のウェルを有する少なくとも一つの細胞培養プレートを含み、前 記ウェルが各々生体適合性ポリオルガノシロキサン組成物で作られるエラストマ ー状膜で少なくとも部分的に形成される実質的に平らな底部を有し、前記エラス トマー状膜に真空の引張り力を制御的に加える真空手段を含むことを特徴とする 細胞培養に応力を加える装置。

４６、前記真空手段が、制御手段により真空源に接続される真空プレナムを含み 、前記培養プレートが前記真空プレナムにより担持され、かつ該真空プレナムと 接触し、前記真空プレナムが前記真空を前記エラストマー状膜の底面に連絡する 手段を含むことを特徴とする請求の範囲第４５項に記載の装置。

４７、前記真空プレナムが少なくとも一つの真空溝をその上表面に有する平らな 板であり、前記プレナムの上表面に隣接し、前記培養プレートの下部に位置する 実質的に平らなガスゲットを含み、前記ガスゲットが貫通した１つ以上のアパチ ャーを有し、該アパチャーが下部に有る真空溝と上部に有る培養プレートのエラ ストマー状膜と一致して配列されかつ両者の間に伸びており、シールされたエア チェンバーが形成され、該エアチェンバーはエラストマー状膜から、アパチャー と真空溝等を経由して前記真空源に至ることを特徴とする請求の範囲第４６項に 記載の装置。

４８、前記プレナムと前記真空源の間に配置された流通手段を含み、真空の前記 真空プレナムへの適用を制御する制御手段を含むことを特徴とする請求の範囲第 ４７項に記載の装置。

４９、前記流通手段がソレノイドバルブであり、前記制御手段が前記ソレノイド バルブに電気的に接続されるコンピューターであることを特徴とする請求の範囲 第４８項に記載の装置。

明細書 ・　細胞培養装置用の生体適合性ポリオルガノシロキサン組成物挾−血二欠−団 本発明は、試験管内及び生体内で、改良された生体適合性を示す表面改質ポリオ ルガノシロキサン組成物およびこのような組成物を取入れた細胞培養装置に関す る。

！−１−技一歪 合成高分子は技術及び日常生活で広く使用されているが、臨床医学及び実験医学 では高分子は慎重に扱われ、その使用は限定されていた。

この制限使用は需要と関係が無く、人工器官及び血液透析あるいは酸素添加用膜 製造用、血漿あるいは血液の置換物製造用及び薬剤、ホルモンあるいは他の生理 的に活性な物質の除数用の基質としての体内埋込み用あるいは可溶性高分子の製 造用に適当な合成高分子の需要が増大している。

不幸にして、種々のシリコーン樹脂のように比較的低い細胞毒性を示す合成高分 子でも、一般には少なくともある程度の生体不適合性を示す、たとえば、哺乳動 物あるいは人の組織に埋込んだシリコーン樹脂インブラントは、通常、上皮性カ プセル化、あるいは上皮肥厚および／または周囲の関連＃ｆｌ織の角化によるカ プセル化などを生じる。試験管内での類似の現象は、合成高分子基質に引張りあ るいは他の歪を生じさせる力を加えると細胞が多くのこれら基質に付着するのを 妨げる。

特に、試験管内細胞培養に関して、試験管内で細胞が付着できるエラストマー基 質に対する需要が大きいのは、生体内応用で生体適合性高分子に対する需要の場 合と同様である。この需要は細胞培養の試験管円曲げの分野の開発から生じた。

この曲げ技術は従来法の細胞培養法と比較していくつかの利点を示す。

試験管内での細胞繁殖に用いる従来法の培養プレートあるいは培！Ｉ瓶は、一般 にポリスチレンあるいはガラスで作られている。細胞を培養する通常法としては 、細胞をフラスコ、単一培養皿、あるいはマルチウェルプレートに接種し、栄養 媒質を加え、制御条件下で細胞を培養する方法が挙げられる。試験管内で細胞を 培養する別の方法には、連続して回転するガラスあるいはプラスチックの瓶中で 細胞を培養し、絶えず回転する媒質の下の培養容器壁に細胞を付着させる（代り に、細胞を内表面積の大きな溝付きローラー瓶中で培養することもできる）方法 、あるいはに！Ａ胞をガラス上、複雑な多糖類ビーズ、組織セグメント上で培養 する方法、あるいは細胞を適当なＩＩＩＪ胞媒質中に懸濁させて培養する方法な どがある。しかし、これらの方法にあっては、培養媒質が細胞自身に変形応力、 たとえば駿によって加えられる体内での応力、あるいは心臓や肺がその構成細胞 に加える周期的な応力などと類似するような変化応力を及ぼすようなことはない 。

肺の環境中で物理的変形中に、細胞が経験することをシュミレーションするため に、細胞をエラストマーからなる基質に付着させ、基質には周期的に１分間で１ ５回２０％の伸びを加え、休息状態をシュミレーションしながら培養することが できる。肺細胞に周期的に１分間で４０回２０％の伸びを加え、運動中の状態を シュミレーションすることもできる。このような研究は、細胞がビールス性感染 を受け易いのは、周期的に変形応力を加えられたときか、あるいは静止したとき かあるいはマクロファージに周期的変形が加えられる場合、バクテリアをもっと 容易に食菌するがどうかといった疑問、あるいは関連した問題向けに適合させる ことができる。これらの問題に対して得られた解答は、次にビールス性あるいは バクテリア性感染を受けている患者の治療計画の開発に際し考慮に入れることが できる。

培養中の細胞の試験管円曲げの一システムが、エイ・ジェイ　ベインズらにより 、“試験管内細胞に静的あるいは可変周期的張力あるいは圧縮力を加える新しい 真空操作応力供与装置”という表題でジャーナル　オブ　セル　サイエンス（Ｊ 、Ｃｅ１ｌ　Ｓｃｉ、、１９８５）に報告されている。然し、この公表された用 法中では、プラスチック（ポリスチレン）のベトリ皿の物理的制限は、細胞基質 （ペトリ皿底部）における周期的変形の制限量以上に押えられた。（関連した試 験管内システムは、ディー　ツムジエンらにより“媒介されたプロスタグランジ ンＥ２中での物理応力により誘起された骨の再構成”という表題でビオヒミ力エ 　ビオフィジ力　アクタ（Ｂｉｏｃｈｉｎｉｃａ　ｅｔＢｉｏｐｈｙｓｉｃａ　 Ａｃｔａ、、６２７（１９８０）９１−１００）に、ディー・ワイーエムルング らにより、エクスベリメンタル　セル　リサーチ（１０９（１９７７）２８５− ２９８　）に発表された“機械的刺激に対する細胞応答の研究に用いられる新規 試験管内システム”、ディー・ワイ・エム　ルングらにより、サイエンス（１９ １（１９７６）４７５−４７７　＞に発表された“周期的引張りは試験管内での 動脈平滑筋Ｍ３胞による基質成分の合成を刺激する”、ハセガワらにより、カル シフ　ティッシュ−インターナショナル（Ｃａｌｃｉｆ　Ｔｉ５ｓｕｅ　Ｉｎｔ 、、３７（１９８５）４３１−４３６）に発表された”機織的引張りはデオキシ リボ核酸を合成する培養骨細胞の数を増やし、蛋白合成のパターンを変える”、 ディー・エム　ブルーネットらにより、ジャーナル　オブ　セル　サイエンス（ Ｊ、Ｃｅ１ｌ　Ｓｃｉ、、６９（１９８４）３５−４５　）に発表された“ｍｈ 的引張りはデオキシリボ核酸を合成する培養中の上皮性４ＩｉＩ胞の数を増やす ”などに夫々報告されている）。

上記のすべてを考慮すると、生体内でのカプセル化を促進せず、試験管内での細 胞の付着を妨げない低細胞毒性合成高分子組成物に対する需要は依然として存在 する。理想的には、このような組成物は一般に低細胞毒性と高い引張強度および たわみ強度を示すことで知られているシリコーン樹脂組成物の色々な利点をも提 供するであろう。

立盟例皿示 本発明は、この需要に応じるための生体適合性表面を有するポリオルカッシロキ サン組成物に関する。生体適合性表面は細胞接触を意図した表面の改質によって 得られる。より詳細には、本発明はポリオルガノシロキサン組成物に関し、その 表面に炭素粒子が埋込んであるか、その表面を１級アミンおよび付加的な選択に よりペプチドで処理しであるか、あるいはその表面を１級アミン含有あるいはカ ルボキシル基含有のシランあるいはシロキサンとともに硬化しである。改質した ポリオルカッシロキサンは細胞培養基質、あるいは胸部インブラント、人工血管 、人工関節、人工鍵、人工心臓弁等の多くの人工器官の応用に有用である０本発 明では、生体適合性ポリオルガノシロキサン組成物を取入れた特別な細胞培養プ レートと使用する真空装置も開示されている。

区面凶固単な説朋 第１図は、本発明の生体適合性ポリオルガノシロキサン組成物を有する６ウエル 培養プレートとそのカバーの分解斜視図、第２図は第１図に示した培養プレート の平面図、第３図は第２図の■−■の線に沿って切断して得られた断面図、第４ 図は第１図に示した培養プレートとの関連で使用するのに適した真空装置の分解 斜視図、第５図は第４図の真空装置の斜視図、第６図は第５図のＶｌ−Ｖｌの線 に沿って切断して得られた断面図、第７図は第３図の真空装置を制御する装置の 概略図である。

明を実施するための最良の形態 本発明のポリオルガノシロキサン組成物の表面改質は３方法の中の１つ以上の方 法により達成される６組成物表面に炭素粒子を埋込まれていても良く、また同表 面を１級アミンとオプションよるペプチドで処理されていても、あるいは同表面 を１級アミン含有あるいはカルボキシル基含有のシランあるいはシロキサンとと らに硬化されていても良い、現在、アミノ基あるいはカルボキシル基および場合 によっては、ペプチドはポリオルガノシロキサン組成物の表面に集まり、生体適 合性表面を形成すると信じられている。改質反応は硬化してないかあるいは硬化 したポリオルガノシロキサン表面上で行なう、しかしながら、何れの場合でも、 改質はポリオルガノシロキサンの表面上で行なう。

硬化したあるいは硬化してないたとえば膜のようなポリオルガノシロキサン表面 の改質の第１の方法は、表面に複数の炭素粒子を埋込む方法か含まれる。たとえ ば、キュアーしてない表面をブンゼンバーナーの焔上に吊し、微細な炭素粒子を 表面に析出させ、表面を硬化する。得られた表面は改善された生体適合性を示す 。

硬化したポリオルカッシロキサン膜をアミン化する第２の方法は、２つの基礎段 階を含む、最初に、膜表面を大気中において、０．５〜１ｍｌのＩＮ　ＨＣｊで ３０分間渦巻き運動をさせながら処理する。

次に酸をデカントする。その後大気中において、表面を０．５〜１ｍｌのＩＭ　 ＮＨ４ＯＨと３０分間接触させる。別の方法としては、酸をデカントした後、ペ ルジャー中で表面をアンモニア蒸気に１５分間さらす、得られた改質表面を水洗 し、乾かす０代りに化学量論的に当量のＨＦ、ＨＢｒ　（あるいは他のハライド 含有１ｆｆｌ＞　、ＮＨ２ＣｌあるいはＮＨＨＣＯ３のような他の酸や１級アミ ンを使用しても良い、このように処理した表面ではポリオルカッシロキサンはア ミノ基か開基となり、高分子表面に配向しているので生体適合性を示すと信じら れている。

ポリオルガノシロキサン表面を処理する第３の方法は、上記のアミノ化処理と次 いでオプションで行なうペプチド化が含まれる。酸性化し、アミノ化する段階の 後で水洗し、表面を０．５〜１　ｍｌ／ｃｊの１ナノモルー１ミリモルのグルタ ルアルデヒドと接触させて処理する。当量の反応性のある他のアルデヒド、たと えばアセトアルデヒドあるいはブチルアルデヒドなどを代りに使っても良い、グ ルタルアルデヒド処理表面を、次に一般にアミンとカルボキシル基の官能性を持 つペプチドの水溶液と接触させる０通常は、選択したペプチドは直鎖上に２〜４ ０のアミノ酸を持ち、相対する端末でアミンとカルボキシル基の官能性を持つよ うにする。しかし、分子量数千のより大きなペプチドや蛋白を用いることもでき る。最後に水洗する。アルデヒドは結合アミンと反応してシッフ塩基を生じ、残 った遊離のアルデヒドはペプチドのアミノ基と反応する。生じたアミノ化／べ１ チド化ポリオルガノシロキサンは従って生体適合性の１級アミンを含有するカル ボキシル基を末端とした表面を形成する。この表面の生体適合性は、特定の細胞 培養との組織適合性によってペプチドを選ぶ時、殊に高められる。特定の応用に 対しては、公知の手段によりペプチドの生体適合性が決定できる。

アミン化の第４の方法としては、ポリオルガノシロキサンを１級アミン含有ある いはカルボキシル基含有シランあるいはシロキサンとコーキュアーする方法を挙 げられる（コーキュアーするとは、少なくとも１つの隣接したシランあるいはシ ロキサン含有組成物がその場所で硬化されることを意味する。）、典型的化合物 としては、３−アミノプロピルトリエトキシシラン、２−アミノエチルトリメト キシシラン、トリメチルシリルｔａ酸、３−（トリクロロシリル）酪酸および１ ．ｉ、ｉ−トリクロロ−Ｎ−（トリメチルシリル）シランアミンなどが挙げられ る。１級アミン含有またはカルボキシル基含有のシラン、あるいはシロキサンの 適当な希釈剤としては、メトキシトリメチルシラン、トリメトキシシラン、クロ ロジメチルシランおよびクロロトリイソシアナートシランなどを挙げることがで きる。シランあるいはシロキサン（シラン希釈剤を含む場合と含まない場合があ る）を実質的に中性あるいは塩基性の水溶液あるいは１１衡水溶液で用い、硬化 したポリオルガノシロキサン表面全体を覆う、たとえばこの分野では良く知られ ている２０ｍＭ　ＨＥＰＥＳ！衝液のように、細胞培養媒質を作成するのに通常 用いる緩衝液はどれでも、シランやシロキサンの溶媒あるいは担体として使用す るのに適している。生じた層は室温で１５分以上、２４時間以下の間コーキュア ーする。

望ましい場合には、硬化は高い温度で行う０代りに、１級アミン含有あるいはカ ルボキシル基含有のシランあるいはシロキサンを硬化していないポリオルガノシ ロキサン上に塗布し、二層をコーキュアーしても良いが、その方法は基板となる ポリオルガノシロキサン層のみを硬化する場合と同様である。硬化した表面はさ らに、上に述べたように所望に応じてペプチド化するか、あるいは炭素粒子埋込 み処理を行うことができる。

上記の何れかの方法で調製した後、組成物は水あるいは緩衝液で洗浄し、紫外線 等で殺菌し、使用前の貯蔵のため包装する。他の殺菌法としては、公知のマイク ロウェーブエネルギー、ガンマ線放射および他の公知の殺菌手段などを挙げるこ とができる。

特定の改質法については、下記の実施例で詳細に述べる。

上記の方法で改質した生体適合性ポリオルガノシロキサンは多くの潜在的応用が 有るが、このようなエラストマーの殊に重要な使用法の一つには細胞培養基質の 試験管内での曲げがある。細胞培養基質としてでさえも、本発明の改質ポリオル ガノシロキサンの使用法は無数に有る０色々な細胞培養容器と組合せて、組成物 単独でも使用できるし、付着細胞培養増殖が望まれる他の応用にも使用できる。

本発明の生体適合性ポリオルガノシロキサン組成物を利用した細胞培養プレート １０の１具体例を第１〜３図に示す、培養プレート１０は実質的に平らで、矩形 状の構造をしていて、平らな上面１２と、この上面１２の外側端部から下側に伸 び、かつ隣り合った端で接合している側壁１３．１４および端面壁１５．１６と を有する。

上方が開放された複数のウェル１８は上面１２から下方に伸びている。第１〜３ 図に示す培養プレート１０は、２Ｘ３配列となった６個のウェル１８を有するが 、必要に応じて、ウェル１８は幾つであっても良く、１つでも良い。

各ウェル１８は円筒形の側壁２０を有し、側壁２０に取付けた実質的に平らなウ ェル底部２２で終る。ウェル底部２２は側壁２０と一体になったアンカーリング ２４を含む、ウェル底部２２の残りは、エラストマー状膜２６により形成され、 エラストマー状膜２６はアンカーリング２４を覆い、かつアンカーリング２４に よって画成される開口部を満たす、アンカーリング２４は、好ましくはフラスト コニカル（截頭円錐）状に形成され、かつこのアンカーリング２４を貫通した複 数の孔２８を有する。孔２８はエラストマー物質で満たされていて、この物質は エラストマーＩＩ！２６と連続する。この構造はウェル底部２２に於て、ＪＩｉ ２６をその場所で確保するのに役立つ、膜２６は、上記のように、表面改質ポリ オルガノシロキサン組成物で作られる。

ウェル１８は側壁１３．１４および終端壁１５．１６の下端より僅かに下方に出 ている。培養プレート１０は保護底部リム３０を有し、これは側壁１３．１４お よび終端壁１５．１６の下端から下方に伸び、ウェル底部２２の底面より下にあ る。底部リム３０はウェル底部２２を持ち上げ、ウェル底部２２にかき傷がつい たり、底部２２が損傷を受けたりするのを防ぐ。

培養プレートの上面１２、すなわち複数のウェル１８は、カバー３２あるいは類 似の物で閉じられる。隣り有った終端壁と側壁の間の隅は、培養プレートの確実 な方向付けができるように構成しても良い、第１〜２図に示すように、側壁１３ と終端壁１５の間の偶３４および側壁１４および終端壁１５の間の偶３５は面取 りしである。カバー３２にも矢張り対応して面取りした偶３６．３７が有る。

底部リム３０の外表面に渭加工し、培養プレート１０をより安全に取扱えるよう にできる。

第１〜３図に示す培養プレート１０は、１．５瞭厚ポリスチレンで作った市販の ファルコン６ウエル培養プレートを用いて作成できる。ファルコン培養プレート は実質的に平らなポリスチレンの固体層で作ったウェル底部を有する。ファルコ ン培養プレートのウェル底部は部分的に削除して、各ウェル１８にポリスチレン の底部アンカーリング２４を残すことができる。各アンカーリング２４にドリル で複数のフラストコニカル孔２８をあけ、孔の狭い方の端がアンカーリング２４ の上面にくるようにする。公知の手段で適当な離型層をアンカーリング２４の直 下に取付け、硬化していないポリオルガノシロキサン組成物を各ウェル１８内に 置＜、３［Ｉ当なポリオルガノシロキサン組成物の一例としては、ダウ−コーニ ング）ｌＤＸ４−４２１０（商品名５ＩＬＡＳＴＩＣで販売）が挙げられる０代 表的な組成物例は、ダウ−コーニングＨＤＸ４−４２１０　３５部、適合するロ ット番号の触媒１５部およびメディカルグレードのシリコーン油１５部である。

このようなあるいは類似の混合物から得られる硬化していないポリオルガノシロ キサンの予定量を各ウェル１８に注ぎ、ウェル底部に膜を形成し、同時にこの硬 化していない組成物はアンカーリング２４中のフラストコニ力ルホール２８の各 々に流れ込む、ポリオルカッシロキサンは次いで脱気し、硬化し、離型層を除い て、第１〜３図の培養プレート１０を作成する。

硬化していないポリオルガノシロキサンの脱気（あるいは気泡除去）は特に光学 的に透明なウェル底部２２の作成の際に重要である。

（たとえば、光学的に透明であると、細胞培養を保持するエラストマーの顕微鏡 検査か容易になる。）気泡は公知の手段で除くか、あるいは特別な遠心分離技術 によって明確に除去できる。遠心分離で脱気するために、個々の培養プレート１ ０はカバー３２を付けた状態あるいはカバー３２なしで、培養グレート１０を収 容できるようになっている遠心分離容器中に置く、プレートには次に重力の８０ ０〜１２００倍の遠心力を３〜６分間かける。プレート１０を遠心分離器から取 り出し、手あるいは機械で回転あるいはゆすり、ポリオルガノシロキサンウェル 底部２２ができるだけ平らな膜になるようにする。プレートをオーブン中、約６ ０℃で４５分間硬化させ、オーブンから取出し、冷却する際に離型層を取除く、 培養プレート１０のウェル底部２２の上面を上記の何れかの方法で、また、下記 の実施例で詳細に述べるように改質できる。

一般に、本発明の培養プレート１０はウェル底部２２を有し、これは＋ＳＥ！胞 が付着できる基質を与える外に、多くの手段で延伸し、あるいは応力を加えるこ とかできる。ウェル底部２２のようなエラストマー細胞基質を延伸するのに殊に 便利な一つの方法は、選択的にウェル底部２２の直下の閉領域を制御真空源に接 続する方法がある。

このような真空延伸は、各ウェル底部２２の下に取付けである個々の真空孔を用 いて行なう、各ウェル底部２２を選択的に真空にするより簡単で効果的な装置を 第４〜６図の真空装置により示す。

第４〜６図に示す真空装置は、プレクシグラス（商品名）あるいは類似品の固体 で、平らで、矩形の板で作った真空プレナム４０を有する。プレナム４０の上面 には、複数の真空溝が切削加工してあり、この溝の深さはプレナム４０の厚さよ り少ない、主真空溝４２はプレナム４０の板厚の半分以上の深さがあり、実質的 にプレナム４０の全長に拡がっている。複数の副真空清４４は、主真空？４４２ の各側から直角に伸び、主真空溝４２と流体か流通するように連絡している。プ レナム４０の一端にドリルで孔をあけ、この孔には主真空講４２と流体で連絡す るニップル４６が取付けられている。

ニップル４６は真空ホース４８とつながり、真空ホース４８はプレナム４０を真 空源（図示しない）と接続する。

各真空？Ｌ４２，４４はその全長のどの点に於てもプレナム４０の上面に開口し ている。開口し表面にある真空装４２，４４を孤立させるため、平らなガムラバ ーガスフット５０をプレナム４０の上面に隣接して置く、ガスゲット５０は矩形 で、ブレナム４０と略同寸法である。ガスゲット５０は複数の開口部あるいはア パチャー（ａｐｅｒｔｕｒｅ）　５２を有し、この開口部は下部の副真空消４４ と流体が流通するように連絡する。主真空講４２はガスゲット５０により完全に 覆われる。アパチャー５２は、培養プレート１０をガスゲット５０の上面に置い た時、各々が一つのウェル１８の底部２２の直下に配列して、位置するように置 く、従って、アパチャー５２は、真空溝４２．４４からのみ作用し得る個々のシ ールされた空気チェンバーを作り出す、第４〜６図に示す実例では、ガスゲット ５０は６つの群（各群は２部３配列）のアパチャー５２を有する。３群のアパチ ャーの各群は分離した副真空渭４４の上に位置している。

従って、第４〜６図に示す真空装置は、上記したような、第１〜３図に示す培養 グレート１０を６つ収容する。第４〜６図に示す真空装置は、６つの個々の６ウ エル培養プレートを使用するように設計しであるが、色々な数のウェルを有する 個々のプレートが幾つ有っても、使用する特定のプレート（単数あるいは複数） が必要とする位置に真空溝４２．４４およびアパチャー５０を設けるのみで使用 できる。

真空ホース４８を通じて生じた真空は、同様にして、真空溝４２゜４４を経由し て、培養プレート１０のウェル底部２２の下にあるアパチャー５２により形成さ れる各チェンバー中に生じる。真空が生じると、各ウェル１８中のエラストマー 膜２６は下部に引張られ、伸びて屈曲した立体配置に到達し始める。第６図は、 充分な真空度が得られた時に、エラストマー膜２６の下方への伸びを示す、真空 度を減じると、膜２６は第３図に示す元の水平配置に戻る。１部ｇ！２６の真空 中での延伸は、一定状態で留めておくか、周期的に行うか、不規則に行なうか、 あるいは望ましいパターンで行う、しかし、６つの培養グレート１０の各々は同 一の真空状態に置かれる。

第４〜５図に示す真空装置は広範な各種のシステムにより、制御した仕方で真空 に引かれる。このようなシステムの１つを第７図に図式的に示す、プレナム４０ （図示していない）、カスゲット５゜および培養プレート１０を含む各真空装置 はホース４８を経由して、ソレノイドバルブ５４に接続する。ソレノイドバルブ ５４は、夫々ホース５６を経由して、複数の出口を持つ真空源５８に接続する。

ソレノイドバルブ５４は、それぞれ配線６０を経由して、コンピューター６２あ るいは他の制御装置に接続される。各ソレノイドバルブ５４は、各培養プレート １０のウェル底部２２中のエラストマー状膜２６を真空に引くのを制御する。コ ンピューター６２はソレノイドバルブ５４の操作を制御し、真空に引く時期と強 度を制御するのみでなく、真空プレナム４０中の１４２．４４を平衡化し、望ま しいだけ雰囲気の空気を戻す、単一あるいは複数のソレノイドバルブ５４を使っ て真空に引いたり、大気圧に戻したりする。さらに、各圧力−電気信号変換器を 各真空プレナムと結合し、あるいは各エラストマー状膜２６の下に置き、その出 力信号をコンピューター６２に供給することもできる。圧力−電気信号変換器に よって生じた情報は実際に真空に引くのを制御するのに使用できる。

ウェル底部２２に付着している細胞はウェル底部２２自身に加えられる応力に釣 り合った応力を受ける。このシステムは、従って、上で論じたように細胞培養基 質の試験管円曲げに使うことができる。

６つの培養プレート１０と関連した真空装置はもちろん、標準の培養器中で培養 できるし、あるいは公知のマルチウェル培養プレートのように培養条件にさらす ことができる。

細胞の曲げを必要としないが、細胞基質への細胞の接着が望まれている特定の応 用については、本発明の表面改質したポリオルガノシロキサン組成物を、最初に ウェル底部を切削することなしに、６ウエル培養プレート中に付着させても良い 、この付着させた表面改質ポリオルガノシロキサン層はどんな厚さでも良いが、 通常は１止厚程度の膜であることが必要なすべてである。

本発明の性質を変更することなく、本発明の開示に応じて種々の変更を加えるこ とができる。底部アンカーリングを使って作成した６ウエルの培養プレートは底 部アンカーリング孔２８を持つ必要がない、たとえば、硬化してないポリオルガ ノシロキサンを置く前に、底部アンカーリングを粗面化し、シロキサン樹脂の実 際の底部アンカーリング表面への接着性を高めても良い０表面改質したポリオル ガノシロキサンは、同様に、幾つの細胞培養容器にも細胞培養基質として組入れ ることができ、何れにしてもマルチウェルプレートには限定されない０本発明の ポリオルガノシロキサン組成物は、培養容器側壁と同様に、細胞が付着できる個 々の分離した粒子あるいはビーズとして用いるか、あるいは当該技術の専門家に は直ちに明らかな多くの他の方法の一つに使用できる。真空装置を使えば、上記 のようにして作成されたポリオルガノシロキサン膜中に真空伸びが誘起できる６ 作成した層あるいは膜の厚みを公知の手段で制御し、予言可能な伸び特性を持つ 基質を形成することができる。

本発明の表面改質したポリオルガノシロキサン組成物は、上皮性のカプセル化あ るいは周囲の結合性Ｍｉ廠の厚み増大、および／あるいはケラチン化を促進しな いので、事実上細胞付着が望ましいインブラントあるいは人工器官は本発明のポ リオルガノシロキサン組成物から製造できる０表面改質ポリオルガノシロキサン の可能な使用法（限定されるものではないが）として、合成血管、胸部、インブ ラントを含む構造的人工器官および人工ひざや人工指関節のような人工関節が含 まれる。たとえば、人工指関節はポリオルガノシロキサンから作られ、ポリオル ガノシロキサンは指関節構造の端末で選択的にアミノ化され、その結果、細胞が 指関節の端部に付着できる。

付着した細胞は骨中に定着するが、滑りが起る必要のある指関節中央部には付着 しない、このようにして選択的に改質したポリオルガノシロキサンは、細胞の付 着と非付着が選択的に制御できるので、インブラントとして使用するのに殊に適 している。

［実施例］ 以下の実施例により本発明について詳細に述べる。

Ｘ豊医１ ５Ｘ３／１６−５Ｘ５／１６インチファルコン６ウェルボリスチレン培養プレー トを木製治具保持体中に固定した。各ウェルの底部の中心点にマークを入れた。

１−１／１６インチの金属ドリルバイトを中心マークの直上に置き、ドリルバイ トを使ってプラスチックに略完全に穴をあける。穴が規定寸法を超えないように 、完全なドリル穴開けは避けた。ウェルの中心部は指の圧力で押し出して、ウェ ルの底部に４關巾のアンカーリムを残した。

プレートを治具中に逆さにして確保した。研磨バイトで、ウェルの残りのポリス チレン底部に１２の等間隔のフラストコニカル状の孔をあけた。再び治具中で板 を逆さにし、石のバイトを使い、ウェルの底部に残るポリスチレンリングと側壁 を粗面化した。その後でプラスチック粒子を真空吸引により除いた。

培養プレート全体を９５％エタノールで洗浄して取扱いにより入りこんだ汚染物 を除去した後、プレートを清浄表面上で逆さにして、ウェル底部を３インチＩＪ の粘着テープでシールした。粘着テープは注意深く当てがい、各培養プレートウ ェルに滑らかで平らな底面を生じるようにした。プレートを直立させた。

８５ｇのダウーコーニングＨＤＸ４−４２１０クリーングレードのエラストマー と、１５ｇの触媒および１５ｓｒのメディカルグレードのシリコーンオイルとを 混合して、ポリオルガノシロキサン組成物を調製した。混合成分は、プラスチッ クの使い捨て式ビーカーに量り出し、ドリル装置の塗料混合バイトを使って混合 した。得られた混合物を２つの６０ｍ１プラスチツク注射器に満たし、残りは後 の使用に備えて一２０℃で貯蔵した。

作業は手早く行ない、各プレートは拝上に置き、注射器を使って各ウェルに２． ０ｔの混合物を入れた。４プレートに入れ終った後、このプレートを遠心分離器 にかけ、重力の１０００倍の力を４．５分間（室温で）加えて、樹脂中から目視 で検出できる気泡をすべて除いた０手早く作業するため、樹脂は注入と遠心分離 の間、見かけ上粘度を増すことはなかった。また、各培養プレートの底部にある 膜は容易に充分に安定し、遠心分離器から取出すと平らな面を形成した。

硬化するため、プレートを６０℃にしであるオーブン中の平らな金属製棚上に４ ５分間置いた。（高温での硬化が何かの理由で遅れたら、遠心分離にかけたプレ ートは加熱前に、−２０℃で貯蔵することができる。）プレートをオーブン中か ら取出し、平らな面上で３０分間室温となるまで放置した。

純度９８％の３−アミノプロピルトリエトキシシラン５ｍｌを、５ｍｌのＬＭ　 ＨＥＰＥＳバッファー（ｐＨ７，２）と混合し、次いで脱イオン水を加えて２５ ０ｍ１の体積にした。得られた３−アミノプロピルトリエトキシシラン溶液の３ ｍｌずつを各ウェルに加え、培養プレートをポリエチレンフィルムで覆った。プ レートは室温の暗所で１２時間養生した。各細胞培養ウェルの底部にあるアミノ 化したポリオルガノシロキサン表面を２０ｍＭ　ＨＥＰＥＳバッファーを２回使 って簡単に洗浄し、次いで、最後にＨＥＰＥＳバッファーを加え、アミノ化した 表面に１５分間置いたままにした０次に、粘着テープをプレートの底部から注意 深くはがして、細胞培養フード中で培養プレートに紫外線を１２時間当てて殺菌 し、殺菌したプレートを殺菌条件下でプラスチック包装中で密封した。

Ｘ韮邸ｌ 実施例１において、作成した培養プレートは、第４〜７図に示す真空装置を取付 けた状態で細胞を接種し、培養した。この装置は周期的に毎分４０回の割合で各 ウェル底部を２０％延伸した１ｍ胞培養が完結した後、光学的に透明な生体適合 性のポリオルガノシロキサン膜は、エラストマー状基質から細胞を除去すること なしに、細胞の顕微鏡検査を可能にした。エラストマー状基質は、また、サンプ リングに適していることが判り、ナイフ、コルク空あけ器、冠状のこパンチの何 れでも首尾良く切断できた。これらの付着した細胞を有する切断セグメントはス ライド上に乗せ、蛍光性試薬で染色し、顕ｇ＆鏡で検査した。

Ｘ組医旦 実施例１の工程をくり返したが、その際、遠心分離の代りに、プレートは一２０ °Ｃで５日間置き（ｉｎｃｕｂａｔｅ）　、−ｒ−ラスト？−が徐々に脱気され 、樹脂が平らになるようにした０次にプレートを冷蔵庫から取り出し、実施例１ に従って硬化し、アミノ化した。

犬旌遡Ａ 実施例１に従って、生体適合性ポリオルガノシロキサン組成物のウェル底部を作 成したが、その際、アミン化は次の方法により行った。各硬化ポリオルガノシロ キサンウェル底部を１ａ＋１のＩＮＨＣＪと接触させ、次いで１ｍｌのＩＭ　Ｎ Ｈ４ＯＨを加えた。各試薬は３０分間加えた場所にそのままにして置き、次いで デカントした。プレートを水で洗い、乾燥し、実施例１に従って殺菌し包装した 。

衷臣盟至 実施例４に従って、生体適合性ポリオルガノシロキサン組成物ウェル底部を作成 したが、その際、ＮＨ４ＯＨを添加し、水で洗浄した後、ウェル底部をグルタル アルデヒドおよびペプチドで次のように処理した。

各ウェルに１ｍｌの１ナノモルタルタルアルデヒドを加えた０次いで、各ウェル はアミンおよびカルボキシル基官能性を持ったペプチド水溶液と接触させた。ペ プチド水溶液を充分に加え、ウェル底部ＯＨ（Ｒ−アルギニン、Ｇ＝ニブリシン Ｄ−アスパラギン酸、Ｓ−セリン）の水溶液であった。３０分後に、実施例１に 従い、板を洗い、乾かし、殺菌し、包装した。

特定の実施態様と実施方法について、本発明を記載したが、本発明は以下に記載 する特許請求の範囲によってのみ制限される可きである。

手続補正書

Claims (49)

【特許請求の範囲】
1. １．アミン、カルボン酸、あるいは元素炭素からなる群から選ばれた物質を表面 に取り込んだポリオルガノシロキサン組成物を含むことを特徴とする生体適合性 樹脂。
2. ２．前記物質がアミンであり、該アミンが１級アミンであることを特徴とする請 求の範囲第１項に記載の生体適合性樹脂。
3. ３．前記ポリオルガノシロキサン組成物が表面にペプチドを取り込んでいること を精微とする請求の範囲第１項に記載の生体適合性樹脂。
4. ４．前記ペプチドがカルボキシル基終端ペプチドを含有するとを特徴とする請求 の範囲第３項に記載の生体適合性樹脂。
5. ５．前記カルボキシル基終端ペプチドがアミン官能性を持つことを特徴とする請 求の範囲第４項に記載の生体適合性樹脂。
6. ６．前記カルボキシル基終端ペプチドがそのアミン官能性により前記ポリオルガ ノシロキサンの表面に取り込まれていることを特徴とする前記請求の範囲第５項 に記載の生体適合性樹脂。
7. ７．前記ポリオルガノシロキサン組成物がダウーコーニングＭＤＸ４−４２１０ クリーングレードエラストマー、メディカルグレードシリコーン油、および触媒 の混合物の硬化したものを含むことを特徴とする前記請求の範囲第１項に記載の 生体適合性樹脂。
8. ８．１級アミン含有シラン、カルボキシル基含有シラン、１級アミン含有シロキ サンおよびカルボキシル基含有シロキサンからなる群がら選ばれた組成物を表面 でコ−キュアーしたポリオルガノシロキサン組成物を含むことを特徴とする生体 適合性樹脂。
9. ９．前記ポリオルガノシロキサン組成物とコ−キュアーされる前記組成物が３− アミノプロピルトリエトキシシラン、２−アミノエチルトリメトキシシラン、ト リメチルシリル蟻酸、３−（トリクロロシリル）酪酸および１，１，１−トリク ロロ−Ｎ−（トリメチルシリル）シラナミンからなる群から選はれることを特徴 とする請求の範囲第８項に記載の生体適合性樹脂。
10. １０．ａ）ポリオルガノシロキサン表面を塩酸、弗酸および臭化水素酸からなる 群から選ばれる酸に接触させ、ｂ）ポリオルガノシロキサン表面を水酸化アンモ ニウム、塩化アンモニウムおよび炭酸水素アンモニウムからなる群から選ばれた アミンと接触させ、次いで該アミンをデカントし、ｃ）前記ポリオルガノシロキ サン表面を水で洗浄する段階を含むことを特徴とするポリオルガノシロキサン組 成物の表面処理法。
11. １１．段階ｃ）が、前記ポリオルガノシロキサン表面を水で洗浄し、時系列的に 表面をアルデヒドおよびペプチド水溶液と接触させ、次いで水で洗浄することを 特徴とする請求の範囲第１０項に記載の方法。
12. １２．段階ｃ）が、前記ポリオルガノシロキサン表面を水で洗浄し、時系列的に 前記表面をグルタルアルデヒドおよびアミンとカルボキシル基官能性を持つペプ チド水溶液と接触させ、次いで水で洗浄する段階を含むことを特徴とする請求の 範囲第１０項に記載の方法。
13. １３．前記段階ａ）がポリオルガノシロキサン表面を０．５〜１．０ｍｌ／ｃｍ ２の１Ｎ塩酸と接触させる段階を含むことを特徴とする請求の範囲第１０項に記 載の方法。
14. １４．段階ｂ）がポリオルガノシロキサン表面を０．５〜１ｍｌ／ｃｍ２の１Ｍ 水酸化アンモニウムと接触させる段階を含むことを特徴とする請求の範囲第１０ 項に記載の方法。
15. １５．ｄ）前記ポリオルガノシロキサン組成物を培養細胞を支持する固体手段中 に組込み、細胞培養基質を形成する段階を含むことを特徴とする請求の範囲第１ ０項に記載の方法。
16. １６．請求の範囲第１０〜１５項に記載の方法によって得られることを特徴とす る製品。
17. １７．ポリオルガノシロキサン組成物を１級アミン含有シラン、カルボキシル基 含有シラン、１級アミン含有シロキサンおよびカルボキシル基含有シロキサンか らなる群から選ばれた化合物からなる近接層とコ−キュアーすることを含むポリ オルガノシロキサン組成物の表面処理方法。
18. １８．前記ポリオルガノシロキサン組成物が３−アミノプロピルトリエトキシシ ラン、２−アミノエチルトリメトキシシラン、トリメチルシリル蟻酸、３−（ト リクロロシリル）酪酸、および１，１，１−トリクロロ−Ｎ−（トリメチルシリ ル）シランアミンからなる群から選択され、かつ水溶液あるいは緩衝キャリアー 水溶液中に懸濁された化合物と、前記近接した組成物を略室温で約２４時間維持 することにより、コ−キュアーすることを特徴とする請求の範囲第１７項に記載 の方法。
19. １９．約６０℃で大気圧下に約１５分間で硬化することを特徴とする請求の範囲 第１７項に記載の方法。
20. ２０．請求の範囲第１７〜１９項の何れかの方法で作られたことを特徴とする製 品。
21. ２１．培養細胞を支持する固体手段を含み、該固体手段が、アミン、カルボン酸 あるいは元素炭素からなる群から選ばれる物質を表面に取り込んだポリオルガノ シロキサン組成物を含む少なくとも一表面を持つことを特徴とする細胞培養基質 。
22. ２２．前記物質がアミンであり、該アミンが１級アミンであることを特徴とする 請求の範囲第２１項に記載の細胞培養基質。
23. ２３．前記ポリオルガノシロキサン組成物がその表面にペプチドを取り込んでい ることを特徴とする請求の範囲第２１項に記載の細胞培養基質。
24. ２４．前記ペプチドがカルボキシル基終端ペプチドを含むことを特徴とする請求 の範囲第２３項に記載の細胞培養基質。
25. ２５．前記カルボキシル基終端ペプチドがアミン官能性を有することを特徴とす る請求の範囲第２４項に記載の細胞培養基質。
26. ２６．前記カルボキシル基終端ペプチドが前記ポリオルガノシロキサンの表面に そのアミン官能性により取り込まれていることを特徴とする請求の範囲第２１項 に記載の細胞培養基質。
27. ２７．前記ポリオルガノシロキサン組成物が、ダウーコーニングＭＤＸ４−４２ １０クリーングレードエラストマー、メディカルグレードシリコーン油および触 媒の混合物の硬化したものを含むことを特徴とする請求の範囲第２１項に記載の 細胞培養基質。
28. ２８．前記ポリオルガノシロキサン組成物がその表面を１級アミン含有シラン、 カルボキシル基含有シラン、１級アミン含有シロキサンおよびカルボキシル基含 有シロキサンからなる群から選ばれた組成物とコ−キュアーされることを特徴と する請求の範囲第２１項に記載の細胞培養基質。
29. ２９．前記ポリオルガノシロキサン組成物とコ−キュアーされる組成物が３−ア ミノプロピルトリエトキシシラン、２−アミノエチルトリメトキシシラン、トリ メチルシリル蟻酸、３−（トリクロロシリル）酪酸および１，１，１−トリクロ ロ−Ｎ−（トリメチルシリル）シラナミンからなる群から選ばれることを特徴と する請求の範囲第２８項に記載の細胞培養基質。
30. ３０．ポリオルガノシロキサン組成物を含む少なくとも一表面を持ち、細胞培養 を支持する固体手段を含み、前記ポリオルガノシロキサン組成物の表面を ａ）塩酸、弗酸、臭化水素酸からなる群から選ばれた酸と接触させ、酸を傾瀉し 、 ｂ）水酸化アンモニウム、塩化アンモニウムおよび炭酸水素アンモニウムからな る群から選ばれるアミンと接触させ、デカントし、ｃ）水で洗浄することを特徴 とする細胞培養基質。
31. ３１．段階ｃ）が、前記ポリオルガノシロキサン表面を水で洗浄し、時系列的に 前記表面をアルデヒドならびにペプチド水溶液と接触させ、前記表面を水で洗浄 する段階を含むことを特徴とする請求の範囲第３０項に記載の細胞培養基質。
32. ３２．段階ｃ）が前記ポリオルガノシロキサン表面を水で洗浄し、時系列的に前 記表面をグルタルアルデヒドおよびアミンとカルボキシル基の両官能性を持つペ プチドの水溶液と接触させ、前記表面を水で洗浄する段階を含むことを特徴とす る請求の範囲第３０項に記載の細胞培養基質。
33. ３３．段階ａ）が、ポリオルガノシロキサン表面を０．５〜１ｍｌ／ｃｍ２の１ Ｎ塩酸と接触させる段階を含むことを特徴とする請求の範囲第３０項に記載の細 胞培養基質。
34. ３４．段階ｂ）が、ポリオルガノシロキサン表面を０．５〜１ｍｌ／ｃｍ２の１ Ｍ水酸化アンモニウム水溶液と接触させる段階を含むことを特徴とする請求の範 囲第３０項に記載の細胞培養基質。
35. ３５．前記ポリオルガノシロキサン組成物を細胞培養を支持する固体手段上に組 入れる段階を含むことを特徴とする請求の範囲第３０項に記載の細胞培養基質。
36. ３６．細胞培養を支持する固体手段を含み、該固体手段がポリオルガノシロキサ ンを含む表面を少なくとも一つ有し、該ポリオルガノシロキサン組成物が１級ア ミン含有シラン、カルボキシル基含有シラン、１級アミン含有シロキサンおよび カルボキシル基含有シロキサンからなる群から選ばれる化合物を含有する近接層 とともに硬化することにより処理された表面を持つことを特徴とする細胞培養基 質。
37. ３７．前記ポリオルガノシロキサン組成物が３−アミノプロピルトリエトキシシ ラン、２−アミノエチルトリメトキシシラン、トリメチルシリル蟻酸、３−（ト リクロロシリル）酪酸、および１，１，１−トリクロロ−Ｎ−（トリメチルシリ ル）シラナミンから選ばれる化合物を懸濁した水溶液あるいは緩衝キャリアー水 溶液の近接層とコ−キュアーされ、このコ−キュアーは近接組成物を略室温で、 実質的に光なしで、約２４時間維持することにより行うことを特徴とする請求の 範囲第３６項に記載の細胞培養基質。
38. ３８．前記ともに硬化する処理を６０℃、大気圧下で約４５分間行うことを特徴 とする請求の範囲第３６項に記載の細胞培養基質。
39. ３９．前記固体手段がマルチウェルポリスチレンプレートであることを特徴とす る請求の範囲第２１項、第３０項あるいは第３６項に記載の細胞培養基質。
40. ４０．前記ウェルの各々がその底部に前記ポリオルガノシロキサン組成物を含む ことを特徴とする請求の範囲第３９項に記載の細胞培養基質。
41. ４１．前記ポリオルガノシロキサン組成物が前記ウェルの各々の底部と積層物を 形成することを特徴とする請求の範囲第４０項に記載の細胞培養基質。
42. ４２．前記ウェルの各々の実質的に全ウェル底部が前記ポリオルガノシロキサン 組成物の単一層を含むことを特徴とする請求の範囲第４０項に記載の細胞培養基 質。
43. ４３．前記ポリオルガノシロキサン組成物が前記ウェルの各々の底部に有るアン カーリングに接着していることを特徴とする請求の範囲第４２項に記載の細胞培 養基質。
44. ４４．一つ以上のウェルを有する細胞培養プレートを含み、前記ウェルの各々が 少なくとも部分的にエラストマー状膜で形成された実質的に平らな底部を有し、 前記エラストマー状膜が細胞培養と細胞付着を許す、処理された上面を持ってい ることを特徴とする細胞培養基質。
45. ４５．一つ以上のウェルを有する少なくとも一つの細胞培養プレートを含み、前 記ウェルが各々生体適合性ポリオルガノシロキサン組成物で作られるエラストマ ー状膜で少なくとも部分的に形成される実質的に平らな底部を有し、前記エラス トマー状膜に真空の引張り力を制御的に加える真空手段を含むことを特徴とする 細胞培養に応力を加える装置。
46. ４６．前記真空手段が、制御手段により真空源に接続される真空プレナムを含み 、前記培養プレートが前記真空プレナムにより担持され、かつ該真空プレナムと 接触し、前記真空プレナムが前記真空を前記エラストマー状膜の底面に連絡する 手段を含むことを特徴とする請求の範囲第４５項に記載の装置。
47. ４７．前記真空プレナムが少なくとも一つの真空溝をその上表面に有する平らな 板であり、前記プレナムの上表面に隣接し、前記培養プレートの下部に位置する 実質的に平らなガスケットを含み、前記ガスケットが貫通した１つ以上のアパチ ャーを有し、該アパチャーが下部に有る真空溝と上部に有る培養プレートのエラ ストマー状膜と一致して配列されかつ両者の間に伸びており、シールされたエア チェンバーが形成され、該エアチェンバーはエラストマー状膜から、アパチャー と真空溝等を経由して前記真空源に至ることを特徴とする請求の範囲第４６項に 記載の装置。
48. ４８．前記プレナムと前記真空源の間に配置された流通手段を含み、真空の前記 真空プレナムへの適用を制御する制御手段を含むことを特徴とする請求の範囲第 ４７項に記載の装置。
49. ４９．前記流通手段がソレノイドバルブであり、前記制御手段が前記ソレノイド バルブに電気的に接続されるコンピューターであることを特徴とする請求の範囲 第４８項に記載の装置。