CN1637132A - 细胞培养容器、以及培养细胞 - Google Patents

Abstract

本发明的目的在于提供通过简便而且简单的构造可以防止剥离时对细胞的损伤、促进营养物的运输、旧废物排出的细胞培养容器。为了解决上述课题，本发明的特征是：于细胞培养容器的底面形成相当直径在10nm以上10μm以下，高在10nm以上1mm以下的突起群的细胞培养容器。通过该特征可以提供使培养液进入到细胞的下部，在促进细胞必需的营养物的供给和细胞放出的旧废物的排出的同时，通过使细胞和容器进行点接触可以防止在细胞剥离时发生的细胞损伤的细胞培养容器。

Description

细胞培养容器、以及培养细胞

【技术领域】

本发明涉及到细胞培养容器和用该容器培养的培养细胞。

【背景技术】

近年来，用于医疗目的的细胞培养的技术进步，实际上已应用于皮肤的移植等。另外，也取得了由少量细胞向皮肤等组织以及角膜、齿、骨、脏器等复杂的器官进行自家移植或他家移植方面的培养技术的进步。

在细胞的培养中可以使用玻璃制或树脂制的培养皿等容器。例如，象以下那样的培养皿。有用移液管使得表面都一样地将所定浓度的胶原溶液分注涂布后，干燥15分钟～72分钟。或将所定浓度的胶原溶液涂布于硅膜等具有伸缩性的培养基材上，于15～42℃的培养箱中使其聚合20～120分钟后，将该硅膜等具有伸缩性的培养基材于UV灯下放置15分钟～72小时，胶原干燥后，再用磷酸缓冲液弄湿，然后通过使其伸展10～40％后进行固定等手法做成细胞培养用培养皿的方法(参照专利文献1)。

另外，作为其他的细胞培养容器公布了以下那样的培养容器。在培养容器的底面涂布因温度不同可进行亲水性、疏水性转换的聚合物，通过用紫外线照射等固定可以制作适合培养后细胞的剥离的培养容器(参照专利文献2)。

【专利文献1】

特开2002-142751号公报(实施例A)

【专利文献2】

特开平5-244938号公报(实施例1)

【发明内容】

如果利用上述第一种方法可以在与细胞具有亲和性的胶原上培养细胞，但由于细胞和培养容器贴附力强，细胞的剥离困难。对于这样的贴附力，如果通过机械剥离细胞，会对细胞造成物理损伤，如果通过胰蛋白酶等酶进行化学处理，存在着细胞表面的膜蛋白被破坏后，移植后细胞向组织的定居率低下的问题。

上述第2种方法通过调整培养容器表面的亲水性，使细胞表面的贴附力减少可以解决剥离的问题。然而，细胞培养容器表面的状态被限定于特定物质，此外还存在着例如制作对应于各种各样细胞的任意的表面状态、制作培养容器所需要的时间的缩短、促进向片层状细胞的中央部的营养物运输、旧废物排出等课题。

本发明的目的在于提供简便而且结构简单，剥离时不损伤细胞、促进营养物运输、旧废物排出的细胞培养容器。

为了解决上述课题，本发明的第1项是特征为于细胞培养容器的底面形成相当直径在10nm以上10μm以下，高在10nm以上1mm以下的突起群的细胞培养容器。通过该发明可以提供使培养液进入到细胞的下部，在促进细胞必需的营养物的供给和细胞放出的旧废物的排出的同时，通过使细胞和容器进行点接触可以防止在细胞剥离时发生的细胞损伤的细胞培养容器。另外，为了进一步促进营养物的运输、旧废物排出，突起群具有培养液流动的间隙最好。而使用所谓的相当直径的用语由于突起的断面不一定为圆形，而且还有椭圆、多角形、非对称形等形状，在本发明中为了将这些形状都包括在内，所以使用相当直径。本发明中，相当直径为突起物底面的截面的直径。

为了使培养液遍及细胞培养容器的表面，需要对表面进行亲水性处理。然而，由于培养的细胞的种类不同有时需要对容器表面进行疏水性处理、或用金属或蛋白质覆盖容器表面。为此，本发明就是要提供只对于细胞培养容器形成的突起群与细胞接触的顶端部实施细胞培养需要的疏水化处理、用金属包覆、用蛋白质包覆等对于细胞培养所必需的处理的细胞培养容器。

另外，在对于培养的细胞要求取向性等、特定的形状等时，有时可以根据培养的细胞的形状对细胞培养容器的底面进行部分疏水性处理等特定的处理。本发明提供对容器表面有选择地实施了对细胞培养容器表面的突起群的顶端部实施疏水性、用金属包覆、用蛋白质包覆等对于细胞培养所必需的处理的细胞培养容器。

通过应用本发明，可以提供简便而且结构简单，剥离时不损伤细胞、促进营养物运输、旧废物排出的细胞培养容器。由于通过使用突起群的形状效果给出了上述效果，所以可以简便地进行形成加工，与以往相比，由于不导入新的药品或处理装置，所以也可以获得所谓不必重新考虑废弃的方法的效果。

【附图的简单说明】

图1：是表示本发明的细胞培养容器的一个例子的模式图。

图2：是表示本发明的细胞培养容器的另外一个例子的模式图。

图3：是表示本发明的细胞培养容器的第3个例子的模式图。

图4：是表示在细胞培养容器表面形成突起群的手法的模式图。

图5：是表示只对突起群的顶端进行表面修饰的表面修饰法的模式图。

图6：是表示在突起群顶端部形成处理分布的修饰法的模式图。

图7：是表示本发明的细胞培养容器的使用法的模式图。

图8：是在第1个实施例中制作的突起物集合体的扫描电子显微镜照片的模式图。

图9：是表示对突起物放大后的扫描电子显微镜照片的模式图。

图10：是表示柱状微小突起物的制造工序的模式图。

图11：是在第4个实施例中制作的细胞培养容器的一个例子的模式图。

图12：是在第4个实施例中制作的细胞培养容器上柱状微小突起物的放大图的模式图。

【符号说明】

100细胞培养容器  101突起物集合体  102表面处理  401容器  402金属模  403金属模的形状  501表面处理  502印模  503表面处理剂  701培养液  702细胞  801柱状微小突起物  802基底

【具体实施方式】

以下参照图，就本发明的细胞培养容器进行详细说明。

图1是表示本发明中细胞培养容器100的鸟瞰图。在加入了细胞、以及其培养液的容器100的底面形成了相当直径在10nm以上10μm以下，高在10nm以上1mm以下的突起物集合体101。另外在突起物集合体101中形成了用于使培养液容易流动的间隙103。

为了减少与细胞的接触面积，图1的突起物集合体101的相当直径比细胞的直径小得多，例如设定为细胞的直径的五分之一以下。另外由于需要使培养液充分浸透到突起物的下部，所以这些突起物的高度要充分高，例如在相当直径以上，最好是相当直径的5倍以上。然而，从构造强度观点考虑最好在100倍以下。

图2是表示对本发明的细胞培养容器100中的突起群的顶端进行表面处理后的状态的鸟瞰图。在加入了细胞、以及其培养液的容器100的底面形成了相当直径在10nm以上10μm以下，高在10nm以上1mm以下的突起物集合体101，只对该突起物的顶端部实施疏水化处理、用金属包覆、用蛋白质包覆等对细胞培养所必需的处理102。

图3是表示对本发明的细胞培养容器100中的突起物的顶端部的一部分进行表面处理后的状态的鸟瞰图。在加入了细胞、以及其培养液的容器100的底面形成了相当直径在10nm以上10μm以下，高在10nm以上1mm以下的突起物集合体101，只对该突起物的一部分的顶端部实施疏水化处理、用金属包覆、用蛋白质包覆等对细胞培养所必需的处理102。

本发明中对细胞培养容器100的材质没有特别限定，可以根据所期望的加工精度、表面特性、光学活性、强度等进行选择。具体来说可以使用聚乙烯、聚丙烯、聚乙烯醇、聚偏氯乙烯、聚对苯二甲酸乙二醇酯、聚氯乙稀、聚苯乙烯、ABS树脂、AS树脂、丙烯酸树脂、聚酰胺、聚缩醛、聚对苯二甲酸丁二醇酯、玻璃强化聚对苯二甲酸乙二醇酯、聚碳酸酯、变性聚苯醚、聚苯硫醚、聚醚醚酮、液晶性聚合物、氟树脂、ポリアレ-ト、聚砜、聚醚砜、聚酰胺-酰亚胺、聚醚-酰亚胺、热塑性聚酰亚胺等热塑性树脂、或酚醛树脂、蜜胺树脂、尿素树脂、环氧树脂、不饱和聚酯树脂、醇酸树脂、硅树脂、邻苯二甲酸二烯丙酯树脂、聚酰胺二马来酰亚胺、聚二酰胺三氮杂茂等热固化性树脂、以及使用他们之中2种以上混合的材料。另外也可以使用石英、玻璃类等无机物。

本发明中对突起物集合体101的材质虽然没有特别限定，但仍要根据所期望的加工精度、表面特性、光学活性、强度等由上述的树脂组合物、或石英、玻璃类等无机物构成。突起物的强度成为问题时，这些突起物最好是由与细胞培养容器同样的材料构成，做成一体化。

图4示出了在本发明中的细胞培养容器的底面形成突起群的手法。通过对容器401加热之后软化、将可形成微细凹凸图形的金属模402压在容器401上，将金属模402的微细形状403转印在容器401上，可以得到形成突起群的细胞培养容器100。

金属模402上的微细形状403要求使细胞培养容器400上的突起群给出上述效果所需要的大小，希望相当直径在10nm以上10μm以下，高在10nm以上1mm以下。为此，金属模至少含有金属、碳或硅等无机物、以及树脂组合物中一种，该表面形状可以通过光平版印刷法、电子线直接描绘法、粒子线束加工法、扫描探针加工法等微细加工法和微粒子的自己组织化、或通过这些手法形成的依靠模(マスタ)的毫微印刷法、射出成型法、无电解镀法等经形状转印形成的。另外，图4中，作为形成突起群的手法，可以使用将金属模压在软化的容器的所谓的印刷法，显然也可以通过其他的以射出成型法为代表的树脂的成型法、或不使用金属模，通过激光加工法等进行直接加工。

在本发明中，细胞培养容器根据需要可以通过浸渍到使用含有过氧化氢或臭氧等氧化剂的溶剂的溶剂中或紫外线照射、等离子体处理等气相处理等进行亲水化处理、或通过浸渍于溶液等用蛋白质包覆、或镀膜、通过气相蒸镀法进行金属包覆、通过光或电子线、粒子线等进行表面改性，实施细胞培养所需要的表面处理。

接下来利用图5说明只对本发明中突起群的顶端的表面修饰法。形成突起群，对于全面实施必需的表面处理的细胞培养容器100，使在表面附着处理剂503的印模502贴附，如果需要，通过实施加热、光照射等，可以只对与印模502接触的突起物集合体101的顶端部实施所期望的表面处理501。

印模502需要均等地与细胞培养容器100表面的很多的突起物集合体101贴附。因此希望印模502由具有必要弹性的硅橡胶、树脂膜、金属薄膜等弹性体构成。另外就象图6所示的那样，通过预先在印模502形成凹凸601，可以形成对突起群顶端部进行处理的分布。

作为处理剂503如树脂涂胶、硅润滑油、氟系包覆剂等疏水化剂或含有蛋白质的溶剂。在将处理剂503涂布于印模502时，通过处理剂的有无、浓度等不同附加上面内分布也可形成对突起群顶端部的处理分布。另外通过加热等直接使突起群集合体101的顶端部变化时可以省略处理剂503。

图7示出了本发明的细胞培养容器的使用法。用培养液701充满细胞培养容器100内部，在突起物集合体101的上面配置细胞702。然后，通过常规方法培养细胞。本发明的细胞培养容器100由于细胞702和容器的接触为点接触，所以可以防止在细胞702的剥离时发生的损伤。另外，根据培养的细胞702不同，使突起物集合体101的形状或突起物集合体101的表面处理变化，可以剥离时无损伤地形成品质好的培养细胞。而所谓培养细胞是包括器官中代表性的可组织化的培养细胞在内的概念。

以下，通过实施例对本发明进一步详细叙述。

【实施例1】

以下对本发明的一个实施例进行说明。图8是在本实施例中制作的突起物集合体101的扫描型电子显微镜照片的模式图。突起物集合体101由许多柱状微小突起物801构成。柱状微小突起物801的材质是聚苯乙烯，分子量为2000至60万，而且分子量的上限可以扩张到600万。

图9是对突起物集合体101放大的扫描电子显微镜照片的模式图。柱状微小突起物801的高度为3μm，一边的长度，在根部为300nm。柱状突起物801上部约1μm的部分是平滑的表面状态，由根部开始约2μm的部分的表面为条纹模样。

另外柱状微小突起物801由于底面的一边为300nm，高3μm，所以可知高与一边的比为10，大于1。

另外，柱状微小突起物801顶端部比底面部小，可知为扇形状。在本实施例中，虽然柱状微小突起物801的形状为从根部到顶端逐渐变细的形状，但也可以是例如从根部到顶端变细，顶端部具有粗部分的蘑菇样的形状。本发明的柱状微小突起物801，其特征之一是具有从根部到顶端逐渐变细的部分。

另外，柱状微小突起物801可以由与基底802同样的聚苯乙烯构成。

另外，柱状微小突起物801与基底802连接，做成一体化。

另外，由于突起物的顶端部是由突起物的底面部开始变小，为扇形状，所以可以获得从基板难于去掉突起物的效果。另外，由于突起物与基底的材料相同，所以可以获得从基底难于去掉突起物的效果。另外，由于突起物与基板一体化，所以可以获得从基板难于去掉突起物的效果。

另外在本实施例中，柱状微小突起物801与基底802的材料都使用聚苯乙烯，但作为细胞培养容器的材质也可以使用先前例举的材料。

上述柱状微小突起物801可以用如下所述的方法制作。图10是柱状微小突起物801的制造工序。将容器401加热到100℃，用压力4MPa将在1.0μm间隔的全面形成直径0.5μm、深1.0μm的微细孔的金属模402压在表面上，压300s。于加压装置内冷却到70℃后，将金属模402和容器401从加压装置中取出，沿着垂直方向向上拉使金属模402从容器401剥离，制作具有柱状微小突起物801的细胞培养容器100。金属模402是晶体取向(100)、直径25mm的硅晶片，为了防止与成型时的容器401粘结，通过氟系的脱模剂实施脱模处理的柱状微小突起物801的宽高比约是金属模402的宽高比的3倍。虽然这样高的宽高比的构造通过在金属模402上形成宽高比大的凹凸，也可以在细胞培养容器100上形成，但如果使用本实施例的手法，可以获得由比较容易做成的低的宽高比的金属模402能够形成高的宽高比的柱状微小突起物801的效果。

另外，在本实施例中，虽然在容器401中使用聚苯乙烯，但容器401并不限定于聚苯乙烯，例如可以是聚碳酸酯等有机物、玻璃等无机物、或这些物质的层叠构造体。

另外，本实施例中，对于金属模402可以使用晶体取向(100)、直径25mm的硅片，特别是晶体取向为(100)，材质没有必要是单晶硅，可以是镍等金属薄膜或PDMS(polydimethylsiloxane)等有机物。另外，为了防止由加热的容器401将金属模402脱模时损伤容器401或柱状微小突起物801，希望对金属模402用氟系、或硅系等脱模剂包覆。

另外，通过调整金属模402的凹部的深度或容器401的材质，可以控制柱状微小突起物801的直径或高度。

另外，通过将金属模402的凹部的开口面积扩大，可以控制柱状微小突起物801的底部的大小。

另外，通过控制金属模402的凹部的位置，可以控制形成柱状微小突起物801的位置。

另外，柱状微小突起物801的材料为热塑性，通过调整柱状微小突起物801形成时的温度，显然可以获得容易控制柱状微小突起物801形状的效果。

另外，柱状微小突起物801的材料为光固化性，通过在柱状微小突起物801形成时使光入射，显然可以获得容易控制柱状微小突起物801形状的效果。

【实施例2】

以下对本发明的其他实施例进行说明。图1是表示本实施例制作的细胞培养容器100的鸟瞰图。细胞培养容器100具有以厚度为2mm的聚苯乙烯为主要成分的直径35mm的皿状形状。在细胞培养容器100的底面使用实施例1示出的手法在直径30mm的区域形成突起物集合体101。另外，在突起物集合体101形成后作为亲水化处理实施氧等离子体处理(100W、30s)。使50μg/mL的胶原I溶液(Cultrex^Bovine CollagenI、溶剂：0.02M醋酸水溶液)包覆比突起物集合体101的高度薄的表面亲水化PDMS制的平滑图形贴附在该突起物集合体101的顶端部，只有突起物集合体101的顶端部粘着胶原I溶液。除去平滑图形后，于室温下，保持1小时后，通过用PBS(磷酸缓冲液)洗净，只有在突起物集合体101的顶端部加上来自胶原的修饰，进行了适于细胞培养的表面处理。

在本实施例中，虽然在细胞培养容器100使用聚苯乙烯，但不限于聚苯乙烯，只要实施表面处理具有亲和性，也可以是例如聚碳酸酯等有机物、玻璃等无机物、或这些物质的层叠构造体。另外，将细胞培养容器100的大小做成直径35mm，突起物集合体101的形成区域做成直径30mm，这些可以根据培养的细胞的大小改变。另外，突起物集合体101最好是设置间隙103进行配置，在本实施例中，就象图1所示那样的十字形状，设置间隙103。这样一来，通过形成间隙103，培养液容易流动，对于细胞可以更有效地提供营养素。另外，也可有效地排出细胞培养时的细胞的旧废物。

另外，在本实施例中，在突起物集合体101形成后利用作为蛋白质一种的胶原进行修饰，但不限于这一手法，也可以根据进行培养的细胞的种类、以及细胞培养容器100、以及突起物集合体101的材质实施氧等离子体处理(例如100W、30s)、紫外线照射、通过浸渍于过氧化氢水、臭氧水等进行亲水化处理、导入氨基、羧基、甲基、CF3基等代表性官能团等实施适当的不同的表面处理。通过图5、6示出的手法只对突起物集合体101的一部分实施这样的表面处理，可以控制培养的细胞的形状。

【实施例3】

以下示出使用本发明的细胞培养容器100培养细胞的例子。图7是表示使用本实施例2制作的细胞培养容器100培养细胞的样子的模式图。

以浸泡的状态将培养液加入到细胞培养容器100中，在细胞培养容器100中按照常规方法培养正常人表皮角化细胞(使用培养基HuMedia-KB2(クラボウ公司生产)。37℃，5％CO2下)。结果在细胞培养容器中表皮角化细胞正常附着，增殖成片层状。

培养开始14天后，在培养的细胞的上面覆盖上直径2cm的聚偏氟乙烯(PVDF)膜，通过吸引培养基，将在细胞培养容器100上生长的片层状表皮角化细胞与PVDF膜一起从细胞培养容器100剥离下来。该片层状表皮角化细胞可以很容易地从PVDF膜上剥离下来。从细胞培养容器100通过剥离对片层状表皮角化细胞的损伤与使用通常的玻璃皿等时相比可以大幅度减轻。

【实施例4】

以下示出使用本发明的细胞培养容器100培养细胞、提高细胞剥离性的例子。

图11是使用实施例1的手法在本实施例制作的细胞培养容器100的形状的例子。图12是构成细胞培养容器100上的突起物集合体101的柱状微小突起物801的放大图。在本实施例中，为了研究培养的细胞的剥离性与构成突起物集合体101的柱状微小突起物801的形状的关系，将柱状微小突起物801的直径R做成180nm、240nm、500nm、2μm4种那样的形成4个细胞培养容器100。形成的柱状微小突起物801的高度H在4个细胞培养容器100中都是3μm。柱状微小突起物801的排列就象图11、图12所示那样，是2维正方格子状，相邻的柱状微小突起物801的间隔D是直径R的2倍。

为了进行剥离性的评价，于各个细胞培养容器100上将人间叶系干细胞(CAMBREX公司，Cyroh MSCNo 2051)接种到培养基(CAMBREX公司，ブレツトキツトMSCGM(间叶系干细胞增殖用培养基))中，于37℃、5％CO2下的培养箱内培养5天。为了比较，在一般使用的动物细胞培养用皿(Cornign公司)中也于同样的条件下培养人间叶干细胞。

剥离性是通过使5日培养后的细胞培养容器100上的人间叶系干细胞在培养基中产生的水流进行剥离来评价的。通过在250μl用电动吸液管(EDP plus EP-250)装配容量200μl吸液管头，从细胞培养容器100的底面附近相对于底面70度的角度吐出培养中使用的培养基产生水流。

表1示出了在显微镜观察下，吐出一次培养基后，观察细胞培养容器100上的细胞的剥离的结果。确认在本发明中形成的任一种细胞培养容器100中，与作为比较例使用的动物细胞培养用皿进行比较，人间叶系干细胞的剥离性增加。表明从细胞培养容器100的人间叶系干细胞的剥离性依赖于柱状微小突起物801的直径R，直径大的R＝2μm时，剥离能力也最大。由此表明作为附着性细胞的人间叶系干细胞的附着力在柱状微小突起物801上变小，剥离性优越。

表1

		实施例A	实施例B	实施例C	实施例D	比较例
							吐出量(μl)	吐出速度(μl/sec)	R＝180nm	R＝240nm	R＝500nm	R＝2μm	动物细胞培养用皿
50	56	-	-	-	-	-
							112	-	±	±	+	-
	192	+	+	+	+	-
							100	56	-	-	-	-	-
112	±	±	+	++	-
						192		++	++	++	++	-
200	56	-	-	-	-								-
						112	±	+	+	++	-
	192	++	++	++	+++							-

+++：剥离非常好，++：剥离比较好，+：可剥离，±：可少量剥离，-：完全不能剥离

Claims (15)

1、一种细胞培养容器，其特征是：在细胞培养容器中具有于该细胞培养容器的底面形成的相当直径在10nm以上10μm以下，高在10nm以上1mm以下的突起群。

2、权利要求1所述的细胞培养容器，其特征是：于该细胞培养容器的底面形成的突起群的相当直径比在该细胞培养容器内中进行培养的细胞的直径还小。

3、权利要求1所述的细胞培养容器，其特征是：于该细胞培养容器的底面形成的突起群的相当直径是在该细胞培养容器内进行培养的细胞的直径的五分之一以下。

4、权利要求1所述的细胞培养容器，其特征是：于该细胞培养容器的底面形成的突起群中，其间隔比在该细胞培养容器内中进行培养的细胞的直径还小。

5、权利要求1所述的细胞培养容器，其特征是：细胞培养容器与突起群是同一材料，被做成一体化。

6、权利要求1所述的细胞培养容器，其特征是：对细胞培养容器的整体、或其一部分实施了亲水处理、疏水化处理、形成金属层、或包覆有机物质中任一种以上处理。

7、权利要求1所述的细胞培养容器，其特征是：对特定区域有选择地实施了亲水处理、疏水化处理、形成金属层、或包覆有机物质中任一种以上处理。

8、权利要求1所述的细胞培养容器，其特征是：对构成突起群的各个突起物有选择地实施了亲水处理、疏水化处理、形成金属层、或包覆有机物质中任一种以上处理。

9、权利要求1所述的细胞培养容器，其特征是：只对突起群的顶端部实施亲水处理、疏水化处理、形成金属层、或包覆有机物质的处理。

10、权利要求1所述的细胞培养容器，其特征是：突起群具有在细胞培养容器表面可以通过液体的列状间空出的区域。

11、一种细胞培养容器，其特征是：具有用于加入培养液的容器和在该容器底面形成的突起群，该容器与突起群是同一材料。

12、权利要求11所述的细胞培养容器，其特征是：于该细胞培养容器的底面形成的突起群的相当直径比在该细胞培养容器内中进行培养的细胞的直径还小。

13、权利要求11所述的细胞培养容器，其特征是：于该细胞培养容器的底面形成的突起群的相当直径是在该细胞培养容器内中进行培养的细胞的直径的五分之一以下。

14、权利要求11所述的细胞培养容器，其特征是：于该细胞培养容器的底面形成的突起群中，其间隔比在该细胞培养容器内中进行培养的细胞的直径还小。

15、一种培养细胞，其特征是：该细胞是通过权利要求1所述的培养容器培养的。

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