CN103443264A - 类胚体形成用培养容器 - Google Patents

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CN103443264A CN201280014035XA CN201280014035A CN103443264A CN 103443264 A CN103443264 A CN 103443264A CN 201280014035X A CN201280014035X A CN 201280014035XA CN 201280014035 A CN201280014035 A CN 201280014035A CN 103443264 A CN103443264 A CN 103443264A
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佐仓武司
塚田亮平
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Sumitomo Bakelite Co Ltd
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Abstract

根据本发明，提供能够以更高的水平高效率地形成质量高的类胚体的类胚体形成用培养容器。本发明涉及一种类胚体形成用培养容器，其具有2个以上的孔，其特征在于：上述孔具有垂直方向的截面为大致U字形状的底部和大致圆形的开口部，并且，上述底部内表面的至少曲面部分为细胞低粘附性的，并且上述底部内表面的曲率半径（R'）为1.0mm以上3.5mm以下，上述细胞低粘附性的表面通过使用水溶性树脂的细胞低粘附化处理或细胞非粘附化处理而形成。

Description

类胚体形成用培养容器
技术领域
本发明涉及类胚体形成用培养容器。
本申请基于2011年3月30日在日本申请的特愿2011-76621号主张优先权，在此援用其内容。
背景技术
胚胎干细胞（embryonic stem cell：ES细胞）是通过将胚泡的内部细胞块接种在饲养细胞上、并添加白血病抑制因子（leukemia inhibitoryfactor：LIF）进行培养而得到的。
维持未分化状态无限增殖的ES细胞具有分化成各种各样的组织细胞的多能性，因此，在使用通过分化得到的组织的移植治疗、所谓的再生医疗的领域中成为各种研究的对象。
为了将ES细胞分化诱导成各种各样的组织，最广泛使用的是形成被称为类胚体（embryoid body：EB体）的伪胚胎的方法，EB体的形成是在体外（in vitro）的ES细胞的分化诱导的第一步。另外，EB体的形成需要将ES细胞以不粘附于培养容器的浮游状态培养，在使用通常的培养容器的粘附培养中，不形成EB体，进行粘附、伸展，开始非特异性的分化。
为了以浮游状态培养ES细胞，最广泛使用的是被称为悬滴培养（hanging drop culture）的方法。悬滴培养正如其名，是在以水滴状垂下的培养液中培养细胞的方法。即，向多孔板的孔中添加矿物油和缓冲液，在多孔板的盖的与各孔上重叠的位置，点上包含ES细胞的培养悬浊液使其成为液滴，盖上多孔板进行培养。但是，在悬滴法中，存在EB体形成的成功率低、不能进行显微镜观察、一次能够形成的EB体的量少、操作繁琐等问题。
在专利文献1中，为了解决这些问题，提出了类胚体形成用培养容器的制造方法、通过上述制造方法制造的类胚体形成用培养容器、和该容器的用途，其中，上述类胚体形成用培养容器的制造方法的特征在于，包括：使水溶性树脂覆盖在培养容器内表面形成水溶性覆盖层的水溶性树脂覆盖层形成工序；和在上述工序后，使上述水溶性覆盖层固化而改性为非水溶性固化膜层的非水溶性固化膜改性工序。
现有技术文献
专利文献
专利文献1：日本特开2008-178367号公报。
发明内容
发明要解决的技术问题
然而，专利文献1中记载的技术，从由ES细胞高效率地形成质量高的类胚体的观点出发，仍有改善的余地。
因此，本发明的目的是提供能够以更高的水平高效率地形成质量高的类胚体的类胚体形成用培养容器。
用于解决技术问题的手段
因此，本发明的发明人潜心研究，结果发现，在具有2个以上的孔的培养容器中，通过将各孔的内表面使用水溶性树脂进行细胞低粘附化处理或细胞非粘附化处理、并且形成为规定的形状，能够生成细胞凝集块溶剂，其结果能够实现上述目的，从而完成了本发明。
即，上述目的可通过下述（1）～（4）中记载的本发明来实现。
（1）一种类胚体形成用培养容器，其具有2个以上的孔，其特征在于：
上述孔具有垂直方向的截面为大致U字形状的底部和大致圆形的开口部，并且，上述底部内表面的至少曲面部分为细胞低粘附性的，并且上述底部内表面的曲率半径（R'）为1.0mm以上3.5mm以下，
上述细胞低粘附性的表面通过使用水溶性树脂的细胞低粘附化处理或细胞非粘附化处理而形成。
（2）如（1）中记载的类胚体形成用培养容器，其特征在于，上述水溶性树脂为由下述式（Ia）或（Ib）表示的化合物：
Figure BDA0000383903570000031
r1=1～1000，r2=40～4995，r3=0～4000，
n=1、2或3，R为具有羰基和胺的烷基，
Figure BDA0000383903570000032
r1=1～1000，r2=40～4995，r3=0～4000，
R为具有羰基和胺的烷基。
（3）如（1）或（2）中记载的类胚体形成用培养容器，其特征在于：在上述孔的最下部表面，内设有至少一个具有细胞低粘附性的表面的凹陷。
（4）如（1）～（3）中任一项中记载的类胚体形成用培养容器，其特征在于：上述各孔的内表面整体为细胞低粘附性的。
根据本发明，能够以更高的水平高效率地形成质量高的细胞凝集块。
附图说明
图1表示培养孔截面形状。
图2是示意性地表示在培养孔的最下部表面设置有凹陷的状态的图。
具体实施方式
在本发明的培养容器中重要的点在于：当使用如图1所示，被称为圆底或V底的侧面向底面缩径、且缩径部分为半球或者圆锥状的多孔板时，在1个孔中以均匀的大小形成1个细胞凝集块，能够形成质量更高的细胞凝集块，并进一步形成类胚体。在图1中，如后所述，表示如下的方式：具有2个以上的孔，该孔具有垂直方向的截面为大致U字形状的底部、和大致圆形的开口部，并且上述底部内表面的至少曲面部分、优选孔内表面整体为细胞低粘附性的，该各孔的底部内表面具有规定的形状。通过这样以缩径部分成为圆锥状或半球状的方式形成孔，当在孔中接种细胞时，容易利用细胞本身的自重在容器底面聚集而形成细胞凝集块。
本发明的培养容器能够由树脂制的材料成形。该树脂材料能够使上述培养容器为一次性类型，而且能够容易地成形为各种形状。作为上述树脂材料，例如可以列举：聚丙烯树脂、聚乙烯树脂、乙烯-丙烯共聚物等聚烯烃类树脂或环状聚烯烃类树脂；聚苯乙烯、丙烯腈-丁二烯-苯乙烯类树脂等聚苯乙烯类树脂；聚碳酸酯树脂；聚对苯二甲酸乙二醇酯树脂；聚甲基丙烯酸甲酯树脂等甲基丙烯酸类树脂；氯乙烯树脂；聚对苯二甲酸丁二醇酯树脂；聚丙烯酸酯树脂；聚砜树脂；聚醚砜树脂；聚醚醚酮树脂；聚醚酰亚胺树脂；聚四氟乙烯等氟类树脂；聚甲基戊烯树脂；聚丙烯腈等丙烯酸类树脂；丙酸酯树脂等纤维素类树脂等。其中，从培养容器所要求的成形性、灭菌性的方面出发，特别优选聚苯乙烯树脂。
在由上述树脂材料制造本发明的培养容器的情况下，例如能够通过注射成形、吹塑成形、注射吹塑成形来制造。
另外，在本发明中，将各孔的底部内表面的曲率半径（R'）设为3.5mm以下，优选设为3.0mm以下。由此，细胞彼此以充分的密度聚集，能够形成质量更高的细胞凝集块。
另外，与底部内表面的曲率半径（R'）超过3.5mm的以往的培养容器相比，孔形状向底部（2）变细，因此，在相同的高度从底部（2）吸引培养基的情况下的培养基更换效率（吸引除去的培养基量相对于培养基总量的比例）优异，这一点也是本发明的主要特征之一。
另外，通过将曲率半径（R'）设为1.0mm以上，培养时产生的死细胞不会以过高的密度向底面凝集，利用倒置显微镜的显微镜观察性优异，因此，能够准确地进行孔内的细胞或类胚体的观察。
另外，通过将上述的大致圆形的开口部（3）的直径设为4.0mm以上，使用多头分配器的情况下的操作性优异，通过设为11.0mm以下，能够在每1个培养容器中设置48个以上的多个孔。
孔（1）的容量优选为80μL以上500μL以下。通过这样，能够在每1个孔中添加形成1个细胞、例如小鼠ES细胞或人ES细胞的类胚（EB）体所需要的充分量的培养基。
孔（1）的容量更优选为80μL以上200μL以下。通过这样，能够使培养基或试剂的使用量减少。
各培养孔进一步优选形成为以下的结构。即，优选如图1所示，将培养孔（1）的侧面的棱线延长超过上述培养孔的底部（2）得到的直线（a）、与从上述开口部（3）的中心垂直地延长超过上述培养孔的底部（2）得到的直线（b）交叉的角度（θ）为3°以上30°以下。通过这样，培养基中的细胞更容易向底部（2）聚集，另外，培养基更换时的分配器吸头（dispenser tip）操作也变得容易。上述角度（θ）更优选为5°以上15°以下。通过这样，成为大致U字形状的底部（2）与侧面更平滑地连接的形状，培养基中的细胞更容易聚集，能够形成更良好的形状的EB体。
另外，如图2所示，优选在各孔的最下部表面，内设有至少1个具有细胞低粘附性的表面的凹陷（4），通过该结构，接种的细胞高效率地向孔最下部的凹陷聚集，因此，细胞凝集块的形成性优异。
该凹陷（4）的容量没有限定，但是，当容量为1.0×10-8mL以上5.0×10-2mL以下时，能够在凹陷中形成细胞凝集块、并且在培养基更换时不吸取凹陷中的细胞凝集块而容易地进行用分配器吸引旧培养基的操作。当凹陷的容量为2.0×10-7mL以上2.0×10-2mL以下时，凹陷中的细胞凝集块即使生长，也不会超出凹陷，在培养基更换时能够使旧培养基的剩余量减少，因此优选。更优选的是，当凹陷的容量为1.0×10-6mL以上2.0×10-3mL以下时，对于适合于分化诱导研究的尺寸的胚胎干细胞类胚体或适合于刺激响应研究的尺寸的上皮细胞凝集块，能够高效率地进行培养基更换。
凹陷（4）的形状没有特别限定，但是，优选为截面形状为大致U字、大致V字、大致梯形等那样细胞容易聚集在底部的形状，当截面形状为大致U字形状时，细胞的凝集性优异，凝集块形成后的位置稳定性优异，因此特别优选。
与一个孔内接的凹陷的数量没有特别限定，可以根据需要形成1个～多个。但是，为了使得在孔中接种的细胞聚集在凹陷中，凹陷需要形成在孔的最下部。
另外，在本发明中，在上述的各方式中，孔的细胞低粘附性的表面能够通过进行以下的细胞低粘附化处理或细胞非粘附化处理而形成。作为该细胞非粘附化处理，优选为基材表面的亲水化处理。在此所说的表面亲水化处理，有以下的处理方法。
（1）水溶性树脂在培养容器内表面的交联固定
（2）利用亲水性树脂进行的表面涂布
首先，对（1）的方法进行详细说明。
该方法的特征在于，使水溶性树脂覆盖在培养容器内表面并进行交联形成水溶性覆盖层，从而形成水溶性树脂覆盖层。
在此所说的水溶性树脂，是指通过与水分子的离子键或氢键进行水合，作为其结果溶解于水的树脂，换言之，水溶性树脂是指为了溶解于水，具有分子内的主链所需要的充分量的离子性或极性的侧链的树脂。此外，在此，水溶性树脂是指相对于25℃的水100g能够溶解1.0g以上的树脂。
作为上述水溶性树脂，例如可以列举：聚乙酸乙烯酯的皂化物、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙二醇、聚丙烯酰胺、聚甲基丙烯酰胺、聚甲基丙烯酸羟乙酯、聚季戊四醇三丙烯酸酯、聚季戊四醇四丙烯酸酯、聚乙二醇二丙烯酸酯、和构成它们的单体彼此的共聚物、以及2-甲基丙烯酰氧乙基磷酸胆碱与其他单体（例如甲基丙烯酸丁酯等）的共聚物等。其中，优选包含选自聚乙酸乙烯酯的皂化物、聚乙烯吡咯烷酮和聚乙二醇中的1种以上与上述反应基团的结构。由此，能够抑制对各种细胞的刺激，使细胞凝集块的形成速度、形成率、和形成的细胞凝集块的质量提高。
在此，聚乙酸乙烯酯的皂化物，是指例如聚乙烯醇或乙烯醇与其他化合物的共聚物。另外，例如还包括：乙烯醇与经过亲水基改性、疏水基改性、阴离子改性、阳离子改性、酰胺基改性或乙酰乙酰基那样的反应基团改性的改性乙酸乙烯酯的皂化物等。
另外，在使用聚合物作为上述水溶性树脂的情况下，其平均聚合度没有特别限定，但是优选为100～10000，特别优选为200～5000。当平均聚合度小于上述下限值时，存在难以在细胞培养容器的表面均匀地成形为膜的情况，当平均聚合度超过上述上限值时，存在上述水溶性树脂的粘度升高、操作性降低的情况。
另外，在使用上述聚乙酸乙烯酯的皂化物的情况下，上述聚乙酸乙烯酯的皂化物的皂化度没有特别限定，但是优选为该聚乙酸乙烯酯整体的20mol％以上100mol％以下，特别优选为50mol％以上95mol％以下。
作为这样的水溶性树脂，优选包含例如由下述式（Ia）或（Ib）表示的结构单元的树脂。由此，能够在实用的300～500nm的波长形成均匀的膜，能够使细胞的粘附量降低，使细胞凝集块形成效果特别提高。
Figure BDA0000383903570000071
r1=1～1000，r2=40～4995，r3=0～4000，
n=1、2或3，R为具有羰基和胺的烷基，
Figure BDA0000383903570000081
r1=1～1000，r2=40～4995，r3=0～4000，
R为具有羰基和胺的烷基。
上述水溶性树脂的由式（Ia）或（Ib）表示的R只要为具有羰基和胺的烷基就没有特别限定，例如优选由下述式（II）表示的基团。由此，能够容易地进行上述极性的侧链的合成。
在将细胞培养容器浸渍在水溶性树脂中时，优选以将水溶性树脂溶解在溶剂中的状态进行浸渍，此时使用的溶剂，能够使用水，或者为了提高溶解度，能够使用水与有机溶剂的混合物。
Figure BDA0000383903570000082
例如，在使用由上述式（Ia）或（Ib）表示的水溶性树脂的情况下，通过使用5～40容量％的醇水溶液作为上述溶剂，水溶性树脂的溶解性提高，能够形成均匀的覆盖层。
溶解的水溶性树脂的浓度优选为0.01～30重量％，特别优选为0.1～10重量％。
在此，水溶性树脂的浓度不论是过低，还是过高，都得不到均匀的覆盖层，得不到充分的细胞的粘附降低效果，无法形成良好的细胞凝集块。
作为使用上述水溶性树脂的覆盖层的厚度，优选为100nm以上5000nm以下，更优选为150nm以上1000nm以下。通过使覆盖层的厚度为上述下限值以上，能够进一步抑制细胞从基材受到的物理性刺激，通过使覆盖层的厚度为上述上限值以下，能够使进入覆盖层的蛋白质的量减少，抑制经由蛋白质的细胞的粘附，因此，能够使细胞凝集块形成率进一步提高。
作为使上述水溶性树脂覆盖在培养容器内表面的方法，例如，能够使用旋涂、浸涂或将上述水溶性树脂溶液分注在培养容器内表面后，使容器倾斜将溶液排出的方法。在以这样的方法使水溶性树脂与培养容器内表面接触后，使残留在培养容器内表面的水溶性树脂溶液干燥，由此能够形成水溶性树脂覆盖层。
在本发明的制造方法中，其特征在于，在上述工序后，具有使上述水溶性树脂覆盖层固化而改性为非水溶性固化膜层的非水溶性固化膜改性工序。
通过将上述水溶性树脂覆盖层改性为非水溶性固化膜层，能够形成具有密度高的离子性或极性的侧链的表面。在该表面形成的离子性或极性的侧链，在与培养液接触时，通过静电相互作用或氢键与水分子进行水合，培养容器表面实质上成为水分子致密的水合层，该水合层抑制基材表面对细胞的刺激，可迅速地形成质量良好的细胞凝集块。通过这样，在与培养液接触时，能够防止水溶性树脂的覆盖层溶解、游离，能够获得作为培养容器所需要的耐水性。
使上述水溶性树脂覆盖层固化的方法没有特别限定，能够在水溶性树脂的侧链导入具有用于使其固化的官能团、例如放射线反应性、感光性、热反应性的官能团的水溶性树脂，使该部分固化。例如，作为感光性的官能团，可以列举重氮基、叠氮基、肉桂酰基等，另外，作为热反应性和放射线反应性的官能团，能够列举乙烯基、环氧基等。其中特别优选能够迅速地进行固化处理、并且能够利用简易的设备进行固化的具有感光性的官能团的水溶性树脂。
作为上述感光性的官能团，特别优选如式（Ia）、（Ib）所示，含有叠氮基的官能团。通过使用该官能团，能够在实用的230～500nm的波长使其反应，能够利用更优异的分辨率使膜的形成性提高。这样，通过在表面预先形成水溶性树脂覆盖层，使该覆盖层固化而改性为非水溶性固化膜层的工序，能够得到与上述厚度的覆盖层同等厚度的膜层。
作为使用水溶性树脂的另一个优点，是通过在固化后用水清洗表面，能够容易地冲洗掉未反应的树脂。如果在因为固化反应性差等原因而确认到溶出物的情况下，通过在固化后增加清洗工序，能够使溶出物减少，得到更良好的细胞凝集块生成率。
接着，对（2）的方法进行说明。
作为涂布的亲水性树脂，有聚甲基丙烯酸-2-羟乙酯（聚-HEMA）、含有磷酰胆碱基的高分子化合物、含有聚乙二醇链的高分子化合物等，但是并不特别限定于这些。
例如，将聚-HEMA的2％乙醇溶液在容器内分注100μL，使乙醇蒸发，能够在容器表面形成聚-HEMA的层。蒸发后，通过用超纯水或缓冲液进行清洗，能够将没有吸附在容器表面的多余的聚-HEMA分子除去。
与（1）的方法相比，（2）的方法中，表面的亲水化仅是高分子化合物在容器表面的吸附现象，因此效果弱，但是优点是方法简便。
关于作为培养容器的必须条件的灭菌，例如，可以列举环氧乙烷气体灭菌、干热灭菌、蒸气灭菌、放射线灭菌等，优选使用γ射线或电子射线的放射线灭菌，在进行大量生产的情况下，在放射线透过性的方面特别优选γ射线灭菌。
对于放射线的吸收剂量没有特别限定，但是，当吸收剂量过低时，无法确保灭菌性，当吸收剂量过高时，存在细胞培养容器和覆盖层劣化的情况。
如上所述制作的培养容器具有以下的特征。
基材表面为经过细胞非粘附处理的圆锥状或半球状，因此，细胞容易聚集在底部，容易形成细胞凝集块。
另外，能够将形成的细胞凝集块直接在原来的板中用于荧光、发光测定。
实施例
以下，根据实施例对本发明详细地进行说明，但是本发明并不限于此。
（实施例1～5）
使用聚苯乙烯树脂（PS日本株式会社制造，HF77）树脂作为树脂材料，通过注射成形，成形96孔多孔板。各孔的形状如图1所示，在实施例1～5中，将缩径部的角度分别设为3°、5°、10°、20°、30°。
使用等离子体处理装置（BRANSON／IPC公司制造SERIES7000）对得到的板进行等离子体处理（氧等离子体10分钟），作为前处理对板表面赋予润湿性。
接着，作为水溶性树脂，将在侧链具有叠氮基的聚乙烯醇（东洋合成工业株式会社制造AWP：式（Ia）的化合物（水溶性树脂的平均聚合度1600、感光基团的导入率0.65mol％）），在用着色树脂遮光的聚丙烯容器中溶解于25容量％乙醇水溶液，制备0.3重量％的溶液。
在上述板中，使用自动分注机（BioTec公司制造，Auto Sera WasherAMW-96SX），对每1个孔添加100μL的上述的水溶性树脂溶液，浸渍1分钟后，将板翻转将溶液充分废弃，在25℃一次干燥17小时后，用UV灯以2.0mW／cm2×30秒钟照射250nm的UV光使水溶性树脂固化。然后，用超纯水反复清洗3次，干燥后，以吸收剂量5.8kGy照射γ射线（RADIA工业株式会社），得到本发明的培养容器（板）。
（比较例1）
在实施例1中，除了从利用等离子体处理赋予亲水性的工序到在水溶性树脂中的浸渍、和在水溶性树脂中的浸渍、固化、清洗、干燥为止的各工序以外，与实施例1同样地操作得到培养容器（板）。
（比较例2）
将96孔多孔板的各孔的缩径部的角度设为2°，除此以外，与实施例1同样地操作得到培养容器（板）。
（比较例3）
将96孔多孔板的各孔的缩径部的角度设为35°，除此以外，与实施例1同样地操作得到培养容器（板）。
（比较例4）
准备孔的底面为平面的96孔多孔板（住友电木株式会社制造，MS-8096F），除此以外，与实施例1同样地操作得到培养容器（板）。
对于实施例1～5和比较例1～4中得到的各个培养容器，进行以下的评价。
（1）使用小鼠ES细胞的类胚体形成
制备将小鼠ES细胞以7500cells／mL的浓度分散在培养液（Dulbecco改良MEM＋15％胎牛血清）中形成的细胞悬浊液，在上述板中以100μL／孔分注在96个孔中，在37℃、5％CO2气氛下培养5天。
5天后，对于各孔，在显微镜下确认类胚体的形成。
（2）小鼠ES细胞类胚体分化为心肌的确认
接着，将培养得到的类胚体以1个／孔转移到24孔多孔板（住友电木株式会社制造，MS-80240）后，以500μL／孔分注培养液（Dulbecco改良MEM＋15％胎牛血清），在5％CO2气氛下培养5天。5天后，对于各孔，在显微镜下确认心肌细胞特有的跳动。
其结果如表1所示，在使用本发明的容器的实施例1～5中，在全部孔中均看到了球状并且单一的类胚体的形成。另外，得到的类胚体均确认到了心肌细胞特有的跳动。
另一方面，在比较例1中，在全部孔中，细胞粘附、伸展，没有形成类胚体，完全没有确认到心肌细胞特有的跳动。
在比较例2中，在全部孔中确认到了类胚体的形成，但是在类胚体的周边沉淀有死细胞，观察到心肌细胞特有的跳动的孔的比例大幅下降为11.5％。
在比较例3中，在全部孔中确认到了类胚体的形成，但是在半数以上的孔内看到了多个类胚体的形成。观察到心肌细胞特有的跳动的孔的比例为一半以下的47.9％。
另外，在比较例4中，在全部孔中确认到了类胚体的形成，但是在80％以上的孔内看到了多个类胚体的形成。观察到心肌细胞特有的跳动的孔的比例大幅下降为27.1％。
[表1]
Figure BDA0000383903570000131
产业上的可利用性
通过使用本发明的细胞凝集块制作用培养容器，能够实现维持细胞功能的培养，另外也能够用于使用功能细胞的试验。因此，本发明在产业上极为有用。

Claims (4)

1.一种类胚体形成用培养容器，其具有2个以上的孔，其特征在于：
所述孔具有垂直方向的截面为大致U字形状的底部和大致圆形的开口部，并且，所述底部内表面的至少曲面部分为细胞低粘附性的，并且所述底部内表面的曲率半径R'为1.0mm以上3.5mm以下，
所述细胞低粘附性的表面通过使用水溶性树脂的细胞低粘附化处理或细胞非粘附化处理而形成。
2.如权利要求1所述的类胚体形成用培养容器，其特征在于：
所述水溶性树脂为由下述式（Ia）或（Ib）表示的化合物：
Figure FDA0000383903560000011
r1=1～1000，r2=40～4995，r3=0～4000，
n=1、2或3，R为具有羰基和胺的烷基，
Figure FDA0000383903560000021
r1=1～1000，r2=40～4995，r3=0～4000，
R为具有羰基和胺的烷基。
3.如权利要求1或2所述的类胚体形成用培养容器，其特征在于：
在所述孔的最下部表面，内设有至少一个具有细胞低粘附性的表面的凹陷。
4.如权利要求1～3中任一项所述的类胚体形成用培养容器，其特征在于：
所述各孔的内表面整体为细胞低粘附性的。
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