WO2013047655A1 - ｉＰＳ細胞用培養容器 - Google Patents

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WO2013047655A1
WO2013047655A1 PCT/JP2012/074880 JP2012074880W WO2013047655A1 WO 2013047655 A1 WO2013047655 A1 WO 2013047655A1 JP 2012074880 W JP2012074880 W JP 2012074880W WO 2013047655 A1 WO2013047655 A1 WO 2013047655A1
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WO
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cell
water
well
soluble resin
cells
Prior art date
Application number
PCT/JP2012/074880
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English (en)
French (fr)
Inventor
亮平 塚田
武司 佐倉
Original Assignee
住友ベークライト株式会社
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M23/00—Constructional details, e.g. recesses, hinges
    • C12M23/02—Form or structure of the vessel
    • C12M23/12—Well or multiwell plates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0696—Artificially induced pluripotent stem cells, e.g. iPS
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2535/00—Supports or coatings for cell culture characterised by topography

Definitions

  • the present invention relates to a culture vessel for iPS cells.
  • iPS cells can be differentiated into a large number of cells, such as ES cells (embryonic stem cells), by introducing several types of genes into somatic cells. It is a cell that has the ability to self-replicate.
  • IPS cells that proliferate indefinitely while maintaining an undifferentiated state have multipotency to differentiate into various tissue cells. Therefore, various studies in the field of so-called regenerative medicine, transplantation treatment using tissues obtained by differentiation. It is the target of. In addition, since iPS cells are established from the patient's own somatic cells, iPS cells have a low possibility of immune rejection, and have low ethical research and development hurdles, and can be the mainstay of regenerative medicine.
  • EB bodies embryoid bodies
  • iPS cell aggregates corresponding to embryoid bodies (EB bodies) in ES cells.
  • the formation of EB bodies is the first step in inducing differentiation of ES cells in vitro.
  • formation of cell aggregates requires culturing iPS cells in a floating state in which iPS cells are not allowed to adhere to a culture vessel. In the adhesion culture using a normal culture vessel, cell aggregates are not formed, and iPS cells adhere to each other, spread, and start non-specific differentiation.
  • hanging drop culture is a method of culturing cells in a culture solution that hangs down in the form of water droplets. That is, first, mineral oil and a buffer solution are added to the holes (wells) of the multiwell plate. Next, the culture suspension containing iPS cells is spotted into droplets at positions corresponding to each well of the lid of the multi-well plate. Then, the iPS cell is cultured by covering the multiwell plate with the lid.
  • the hanging drop method has problems such as a low success rate of cell aggregate formation, inability to observe with a microscope, a small amount of cell aggregates that can be formed at one time, and complicated operation.
  • Patent Document 1 describes a culture vessel having a recess in order to solve these problems.
  • cells are put into the concave portion of the culture vessel, and then cell aggregates are formed.
  • the opening width of the recess is as narrow as 100 ⁇ m to 300 ⁇ m and the container shape is also special, the culture container of Patent Document 1 cannot be said to be highly versatile.
  • Patent Document 1 still has room for improvement from the viewpoint of efficiently forming high-quality iPS cell aggregates from iPS cells.
  • an object of the present invention is to provide a culture vessel for iPS cells that can efficiently form high-quality iPS cell aggregates at a higher level.
  • a culture vessel for iPS cells having two or more wells,
  • the well has a bottom having a substantially U-shaped cross section in the vertical direction and a substantially circular opening, and at least a curved surface portion of the bottom has low cell adhesion, and a curvature radius of the bottom ( R ′) is 1.0 mm or more and 2.6 mm or less,
  • the curved surface of the low cell adhesion is formed by a cell low adhesion treatment or a cell non-adhesion treatment using a water-soluble resin
  • the iPS cell culture vessel, wherein the water-soluble resin is at least one of compounds represented by the following formulas (Ia) and (Ib).
  • the well is formed by at least one of the compound represented by the formula (Ia) and the compound represented by the formula (Ib). iPS cell culture vessel.
  • high-quality iPS cell aggregates can be efficiently formed at a higher level.
  • FIG. 1 shows a cross section of a culture well of an iPS cell culture vessel according to the present invention.
  • FIG. 2 shows a cross-section of a culture well having a depression with a low cell adhesion surface at the bottom of the well of an iPS cell culture vessel according to the present invention.
  • FIG. 3 shows an aggregate of iPS cells according to Example 1 of the present invention.
  • FIG. 4 shows an aggregate of iPS cells according to Example 2 of the present invention.
  • FIG. 5 shows an aggregate of iPS cells according to Example 3 of the present invention.
  • FIG. 6 shows an aggregate of iPS cells according to Example 4 of the present invention.
  • FIG. 7 shows an aggregate of iPS cells according to Example 5 of the present invention.
  • FIG. 8 shows an aggregate of iPS cells according to Example 6 of the present invention.
  • FIG. 9 shows the culture state of iPS cells according to Comparative Example 1 of the present invention.
  • FIG. 10 shows the culture state of iPS cells according to Comparative Example 2 of the present invention.
  • the important point in the culture vessel of the present invention is that, as shown in FIG. 1, the inner side surface of the well is reduced in diameter toward the bottom, and the reduced diameter portion (bottom) is called a round bottom or V bottom. It has a well having a hemispherical or conical shape. When a multiwell plate having such wells is used, one cell aggregate is formed in a uniform size per well. That is, it is possible to form a higher quality cell aggregate and further to form an embryoid body.
  • the cell culture container shown in FIG. 1 has two or more wells having a bottom portion having a substantially U-shaped cross section in the vertical direction and a substantially circular opening, as will be described later.
  • the curved surface portion of the inner surface of the bottom portion preferably the entire well inner surface has low cell adhesion.
  • the inner surface of the bottom of each well has a predetermined shape. In this way, by forming the well so that the reduced diameter portion becomes conical or hemispherical, when the cells are seeded in the well, the cells gather on the bottom of the container due to their own weight, and the cell aggregates are formed. It becomes easier to form.
  • the culture container of the present invention can be formed of a resin material (resin material).
  • This resin material can mold the culture container into a disposable type.
  • the resin material can easily form the culture vessel into various shapes.
  • the resin material include polypropylene resins, polyethylene resins, polyolefin resins such as ethylene-propylene copolymers, or cyclic polyolefin resins, polystyrene resins such as polystyrene and acrylonitrile-butadiene-styrene resins, polycarbonate resins, and polyethylene resins.
  • Methacrylic resins such as terephthalate resin, polymethyl methacrylate resin, vinyl chloride resin, polybutylene terephthalate resin, polyarylate resin, polysulfone resin, polyethersulfone resin, polyetheretherketone resin, polyetherimide resin, polytetrafluoroethylene Fluorine resin such as polymethylpentene resin, acrylic resin such as polyacrylonitrile, and fiber resin such as propionate resin.
  • polystyrene resin is particularly preferable in terms of moldability and sterilization required for the culture container.
  • the culture container of the present invention may be formed of a water-soluble resin material as described later.
  • the resin material is preferably a compound represented by the formula (Ia) described later, a compound represented by the formula (Ib), or a mixture thereof. Since these compounds are water-soluble, it is not necessary to provide a water-soluble resin coating layer described later on the inner surface of the well. Therefore, the manufacturing process of the cell culture container can be simplified, and the manufacturing cost of the cell culture container can be reduced.
  • the culture container When producing the culture container of the present invention from the above resin material, the culture container can be produced, for example, by injection molding, blow molding, or injection blow molding.
  • the curvature radius (R ′) of the bottom of each well is 2.6 mm or less, preferably 2.0 mm or less. This makes it possible for iPS cells to gather at the bottom with sufficient density and to form a higher quality cell aggregate.
  • the medium replacement efficiency ratio of the amount of the medium to be aspirated and removed with respect to the total amount of the medium
  • the curvature radius (R ′) of the bottom is 3.5 mm or less, it is sufficient to produce an EB body that is a cell aggregate.
  • the radius of curvature at the bottom is 3.5 mm, the collection of cells is insufficient and a clean cell aggregate cannot be produced.
  • the curvature radius (R ′) of the bottom is 2.6 mm or less, it is possible to form a high-quality cell aggregate.
  • the radius of curvature (R ′) is set to 1.0 mm or more, the aggregation of dead cells generated during culture on the bottom surface does not become too dense, and the microscopic property with an inverted microscope is excellent. Therefore, it is possible to accurately observe the cells or embryoid bodies in the wells.
  • the diameter of the above-mentioned substantially circular opening (3) 4.0 mm or more, the operability when using the multi-dispenser is excellent.
  • the diameter of the opening (3) is 11.0 mm or less, 48 or more wells can be provided per culture vessel.
  • the volume of the well (1) is preferably 80 ⁇ L or more and 500 ⁇ L or less. By doing so, it is possible to add a sufficient amount of medium per well to form one cell, for example, an embryoid-like (EB) body of mouse ES cells or human ES cells.
  • EB embryoid-like
  • the volume of the well (1) is more preferably 80 ⁇ L or more and 200 ⁇ L or less. By doing so, the amount of medium and reagent used can be reduced.
  • each culture well has the following structure. That is, as shown in FIG. 1, a straight line (a) is created by extending the ridge line on the inner surface of the culture well (1) beyond the bottom (2) of the culture well. Next, a straight line (b) extending vertically from the center of the opening (3) to the bottom (2) beyond the bottom (2) of the culture well is prepared.
  • the angle ( ⁇ ) at which the straight line (a) and the straight line (b) intersect is preferably 3 ° or more and 30 ° or less. By doing so, the cells in the medium are more likely to gather at the bottom (2), and the dispenser chip operation during medium replacement is also facilitated.
  • the crossing angle is preferably 5 ° or more and 15 ° or less. By doing so, the substantially U-shaped bottom (2) and the inner surface are connected more smoothly. As a result, cells in the medium are more likely to gather at the bottom (2), and an EB body having a better shape can be formed.
  • At least one indentation (4) having a low cell adhesion surface is provided in the lowermost surface of each well.
  • the volume of the indentation (4) is not particularly limited, but is 1.0 ⁇ 10 ⁇ 8 mL or more and 5.0 ⁇ 10 ⁇ 2 mL or less. With such a capacity, cell clumps are formed in the recess, and the work of sucking the old medium with a dispenser can be easily performed without sucking the cell clumps in the recess when replacing the medium. .
  • the volume of the indentation (4) is more preferably 2.0 ⁇ 10 ⁇ 7 mL or more and 2.0 ⁇ 10 ⁇ 2 mL or less. Thereby, even if the cell aggregate in the dent grows, the remaining amount of the old medium can be reduced when exchanging the medium without the cell aggregate protruding from the dent.
  • the volume of the depression (4) is more preferably 1.0 ⁇ 10 ⁇ 6 mL or more and 2.0 ⁇ 10 ⁇ 3 mL or less. With such a capacity, medium can be efficiently exchanged for embryonic stem cell embryoid bodies of a size suitable for differentiation induction studies and epithelial cell aggregates of a size suitable for stimulation response studies.
  • the shape of the indentation (4) is not particularly limited, but is preferably a shape in which cells are likely to collect at the bottom, such as a shape whose cross section is formed in a substantially U shape, a substantially V shape, a substantially trapezoidal shape, or the like. . If the cross section is formed in a substantially U shape, the depression (4) has excellent cell aggregability and excellent positional stability after the formation of aggregates. preferable.
  • the number of recesses provided in one well is not particularly limited, and one or more recesses may be formed as necessary.
  • the well needs to be formed on the lowermost surface of the well so that cells seeded in the well gather in the well.
  • the cell culture container of this invention can form the cell low-adhesive surface of a well in each aspect mentioned above by performing the following cell low-adhesion processing or cell non-adhesion processing.
  • the cell non-adhesion treatment is preferably a hydrophilic treatment on the substrate surface of the well.
  • the surface hydrophilization treatment mentioned here includes the following treatment methods. (1) Method of cross-linking and fixing a water-soluble resin to the inner surface of the culture vessel (2) Method of applying a hydrophilic resin to the inner surface of the culture vessel
  • cell low adhesion treatment or cell non-adhesion treatment is not necessary.
  • This method is characterized in that a water-soluble resin is coated on the inner surface of a culture vessel and crosslinked to form a water-soluble resin coating layer.
  • the water-soluble resin referred to here is a resin that hydrates with water molecules by ionic bonds or hydrogen bonds, and as a result, dissolves in water.
  • the water-soluble resin is a resin having a necessary and sufficient amount of ionic or polar side chains with respect to the main chain in the molecule in order to dissolve in water.
  • water-soluble resin means what can melt
  • water-soluble resin examples include saponified polyvinyl acetate, polyvinyl pyrrolidone, polyethylene glycol, polyacrylamide, polymethacrylamide, polyhydroxyethyl methacrylate, polypentaerythritol triacrylate, polypentaerythritol tetraacrylate, polydiethylene glycol diester.
  • examples thereof include copolymers of acrylates and monomers constituting them, and copolymers of 2-methacryloyloxyethyl phosphorylcholine with other monomers (such as butyl methacrylate).
  • a resin having a structure comprising at least one selected from saponified products of polyvinyl acetate, polyvinyl pyrrolidone, and polyethylene glycol and the following reactive group is preferable.
  • stimulation with respect to various cells can be suppressed, and the formation speed of a cell aggregate, a formation rate, and the quality of the formed cell aggregate can be improved.
  • the reactive group includes, for example, a functional group containing a nitrogen atom, a functional group containing a sulfur atom, a functional group containing a bromine atom, a functional group containing a chlorine atom, and a functional group not containing any of these atoms. Is mentioned.
  • Specific examples include a functional group containing an azide group, a functional group containing a diazo group, a functional group containing a diazide group, and the like.
  • a functional group containing an azide group is preferable. Thereby, the adhesion amount of the cell to the inner surface of a cell culture container can be reduced.
  • the saponified product of polyvinyl acetate refers to, for example, polyvinyl alcohol or a copolymer of vinyl alcohol and another compound. Furthermore, for example, a saponified product of vinyl alcohol and modified vinyl acetate modified with a reactive group such as hydrophilic group modification, hydrophobic group modification, anion modification, cation modification, amide group modification or acetoacetyl group is also included.
  • the average degree of polymerization is not particularly limited, but is preferably 100 to 10,000, particularly preferably 200 to 5,000. If the average degree of polymerization is less than the lower limit, it may be difficult to form a film uniformly on the surface of the cell culture container. If the upper limit is exceeded, the viscosity of the water-soluble resin is increased and workability is increased. May decrease.
  • the saponification degree of the saponified product of polyvinyl acetate is not particularly limited, but is preferably 20 mol% or more and 100 mol% or less, particularly 50 mol% of the whole polyvinyl acetate. As mentioned above, 95 mol% or less is preferable.
  • a water-soluble resin for example, those containing a structural unit represented by the following formula (Ia) and / or (Ib) are preferable.
  • a uniform film can be formed at a practical wavelength of 300 to 500 nm, and the amount of cells adhering to the inner surface of the cell culture vessel can be reduced.
  • the effect of reducing the formation of a plurality of cell aggregates can be particularly improved.
  • the compound represented by the above formula (Ia) has water solubility. Therefore, it becomes difficult for cells to adhere to the inner surface of the cell culture container or the water-soluble resin coating layer. Moreover, in the water-soluble resin coating layer, the phenyl group exists away from the inner surface of the cell culture container. Therefore, the presence of the phenyl group makes it difficult for cells to adhere to the inner surface of the cell culture container. Therefore, in the present invention, it is preferable to use the compound represented by the above formula (Ia) as the water-soluble resin.
  • the compound represented by the above formula (Ib) has a sulfur-containing cyclic group bonded to R and a sodium sulfonate group bonded to a phenyl group. Since this sulfur-containing cyclic group has a bulky structure, the structure of the compound represented by the formula (Ib) is three-dimensional. Therefore, when a water-soluble resin coating layer is provided on the inner surface of the cell culture container, the sulfur-containing cyclic group and phenyl group are separated from the inner surface of the cell culture container. This makes it difficult for cells to adhere to the inner surface of the cell culture container.
  • the phenyl group exists away from the inner surface of the cell culture vessel.
  • a sodium sulfonate group bonded to a phenyl group is present near the surface of the water-soluble resin coating layer. Since the sodium sulfonate group has high water solubility, it becomes difficult for cells to adhere to the water-soluble resin coating layer. Therefore, in the present invention, it is preferable to use the compound represented by the above formula (Ib) as the water-soluble resin.
  • the compound represented by the formula (Ia) is also water-soluble, when the compound represented by the formula (Ia) and the compound represented by the formula (Ib) are used in combination, the cells It becomes difficult to adhere by the inner surface of the culture vessel or the water-soluble resin coating layer. Therefore, in the present invention, it is more preferable to use a combination of the compound represented by the above formula (Ia) and the compound represented by the above formula (Ib) as the water-soluble resin.
  • R in the compound represented by the formula (Ia) or (Ib) of the water-soluble resin is not particularly limited as long as it is an alkyl group having a carbonyl and an amine (also referred to as an imino group). What is represented by (II) is preferable. This facilitates the synthesis of the polar side chain.
  • the cell culture container When immersing the cell culture container in the water-soluble resin, it is preferable to immerse the cell culture container in a state in which the water-soluble resin is dissolved in a solvent.
  • a solvent used in that case, water or a mixture of water and an organic solvent can be used in order to increase the solubility.
  • the solubility of the water-soluble resin can be increased by using 5 to 40% by volume of an alcohol aqueous solution as the solvent. It becomes high and a uniform water-soluble resin coating layer can be formed.
  • the concentration of the water-soluble resin to be dissolved is preferably 0.01 to 30% by weight, particularly preferably 0.1 to 10% by weight.
  • the concentration of the water-soluble resin is too low or too high, a uniform coating layer cannot be obtained, a sufficient cell adhesion reduction effect cannot be obtained, and a good cell aggregate is not formed.
  • the thickness of the water-soluble resin coating layer using the water-soluble resin is preferably from 100 nm to 5,000 nm, and more preferably from 150 nm to 1,000 nm.
  • Examples of the method for coating the inner surface of the culture vessel with the water-soluble resin include spin coating, dipping, or dispensing the water-soluble resin solution onto the inner surface of the culture vessel and then discharging the solution by tilting the vessel. Can do. After bringing the water-soluble resin into contact with the inner surface of the culture vessel by such a method, the water-soluble resin coating layer can be formed by drying the water-soluble resin solution remaining on the inner surface of the culture vessel.
  • the production method of the present invention is characterized by having a water-insoluble cured film modification step of curing the water-soluble resin coating layer and modifying it into a water-insoluble cured film layer after the above step.
  • a surface having a high density ionic or polar side chain can be constructed.
  • the ionic or polar side chain constructed on this surface hydrates with water molecules by electrostatic interaction or hydrogen bonding when in contact with the culture medium.
  • the inner surface of the culture vessel is substantially a dense hydrated layer of water molecules.
  • This hydrated layer suppresses stimulation of the cells from the surface of the substrate of the cell culture container, and a qualitatively good cell aggregate is rapidly formed. By doing so, it is possible to prevent the water-soluble resin coating layer from being dissolved and released when the culture solution is brought into contact, and to obtain water resistance necessary for the culture vessel.
  • the method for curing the water-soluble resin coating layer is not particularly limited, and has a functional group for curing, for example, a radiation-reactive, photosensitive, or heat-reactive functional group, on the side chain of the water-soluble resin.
  • This is a method that is made possible by introducing a water-soluble resin and curing the introduced portion.
  • a photosensitive functional group a diazo group, an azide group, a simmonyl group, etc. may be mentioned, and if it is a thermally reactive and radiation reactive functional group, a vinyl group, an epoxy group, etc. may be mentioned. it can.
  • a water-soluble resin having a photosensitive functional group that can be cured rapidly and can be cured with simple equipment is particularly preferable.
  • a functional group containing an azide group is particularly preferable.
  • a curing reaction at a practical wavelength of 230 to 500 nm, and it is possible to improve the formability of the film due to excellent resolution.
  • the water-soluble resin coating layer on the inner surface of the well in advance and curing the coating layer to modify the water-insoluble cured coating layer, the same thickness as the water-soluble resin coating layer having the above thickness is obtained.
  • a water-insoluble cured film layer having a thickness can be obtained.
  • Another advantage of using a water-soluble resin is that unreacted resin can be easily washed away by washing the surface with water after the water-soluble resin is cured. If the eluate is confirmed due to poor curing reactivity or the like, a washing step is provided after curing to reduce the eluate and obtain a better cell aggregate generation rate.
  • hydrophilic resin to be applied examples include poly-2-hydroxyethyl methacrylate (poly-HEMA), a phosphorylcholine group-containing polymer compound, and a polyethylene glycol chain-containing polymer compound, but are not particularly limited thereto.
  • poly-HEMA poly-2-hydroxyethyl methacrylate
  • phosphorylcholine group-containing polymer compound examples include a phosphorylcholine group-containing polymer compound, and a polyethylene glycol chain-containing polymer compound, but are not particularly limited thereto.
  • 100 ⁇ L of a 2% ethanol solution of poly-HEMA can be dispensed into the well of the cell culture container, and the ethanol can be evaporated to form a poly-HEMA layer on the well surface of the cell culture container. After evaporation, the poly-HEMA layer is washed with ultrapure water or a buffer solution to remove excess poly-HEMA molecules that are not adsorbed on the well surface of the cell culture vessel.
  • the hydrophilic treatment of the surface of the well is only the adsorption phenomenon of the polymer compound to the container surface. Therefore, when the method (2) is used, the effect of low cell adhesion or cell non-adhesion is weak compared to the method (1), but it is advantageous that the process of the method is simple.
  • Examples of the sterilization that is an essential condition of the culture container include ethylene oxide gas sterilization, dry heat sterilization, steam sterilization, and radiation sterilization.
  • radiation sterilization using ⁇ rays or electron beams is preferable, and mass production is performed.
  • ⁇ -ray sterilization is particularly preferable from the viewpoint of radiolucency.
  • the absorbed dose of radiation is not particularly limited. However, if the absorbed dose is too low, sterility is not ensured, and if the absorbed dose is too high, the cell culture container and the water-soluble resin coating layer may be deteriorated.
  • the cell culture container prepared as described above has the following characteristics.
  • the substrate surface of the cell culture container is non-cell-adhered and the bottom of the well is formed in a conical or hemispherical shape, the cells tend to gather at the bottom and easily form cell aggregates.
  • the formed cell aggregate can be used for fluorescence and luminescence measurement with the plate as it is.
  • the cell culture container of the present invention may be provided with a temperature control means (not shown).
  • a temperature control means include a thermostat, a mantle heater (jacket heater) and a water bath provided in the cell culture container so as to cover the outer surface of the well, and a heating wire embedded in the cell culture container. It is done. If the cell culture container is provided with a temperature control means, the cells can be easily cultured simply by setting the temperature of the temperature control means to a temperature for culturing the cells (for example, 37 ° C.).
  • Example 1 A 96-well multiwell plate was molded by injection molding using polystyrene resin (manufactured by PS Japan, HF77) as the resin material.
  • the shape of each well was as shown in FIG. 1, and the curvature radius of the well bottom was 2.0 mm.
  • plasma treatment oxygen plasma 10 minutes
  • a plasma treatment apparatus SERIES7000 manufactured by BRANSON / IPC
  • ADP compound of formula (Ia) manufactured by Toyo Gosei Kogyo Co., Ltd. (average degree of polymerization of water-soluble resin 1600, introduction rate of photosensitive group 0.65 mol%))
  • ADP compound of formula (Ia) manufactured by Toyo Gosei Kogyo Co., Ltd. (average degree of polymerization of water-soluble resin 1600, introduction rate of photosensitive group 0.65 mol%))
  • Example 2 Using a polystyrene resin (manufactured by PS Japan Co., Ltd., HF77) as a resin material, a 96-well multi-well plate was formed by injection molding, and the curvature radius of the well bottom surface was 2.6 mm. A cell culture vessel (plate) was obtained.
  • a polystyrene resin manufactured by PS Japan Co., Ltd., HF77
  • Example 3 Instead of polyvinyl alcohol having azide group in the side chain (compound of formula (Ia)) as a water-soluble resin, polyvinyl alcohol having azide group in the side chain (RSP: compound of formula (Ib)) manufactured by Toyo Gosei Kogyo Co., Ltd. A cell culture container (plate) was obtained in the same manner as in Example 1 except that it was used.
  • Example 4 Instead of polyvinyl alcohol (compound of formula (Ia)) having an azide group in the side chain as a water-soluble resin, two types of polyvinyl alcohol having an azide group in the side chain (AWP: Toyo Gosei Kogyo Co., Ltd.) Except for using the compound (average polymerization degree of water-soluble resin 1600, introduction rate of photosensitive group 0.65 mol%) and Toyo Gosei Kogyo RSP: compound of formula (Ib), the same manner as in Example 1 was used. A cell culture vessel (plate) was obtained.
  • Example 5 A 96-well multi-well plate was formed by injection molding using polystyrene resin (PS77, HF77) as a resin material, and the same procedure as in Example 3 was performed except that the curvature radius of the well bottom surface was 2.6 mm. A cell culture vessel (plate) was obtained.
  • PS77, HF77 polystyrene resin
  • Example 6 Using a polystyrene resin (manufactured by PS Japan Co., Ltd., HF77) as a resin material, a 96-well multi-well plate was formed by injection molding, and the curvature radius of the well bottom surface was 2.6 mm. A cell culture vessel (plate) was obtained.
  • a polystyrene resin manufactured by PS Japan Co., Ltd., HF77
  • Example 1 Cells were obtained in the same manner as in Example 1 except that a 96-well multi-well plate was formed by injection molding using polystyrene resin (manufactured by PS Japan, HF77) as the resin material, and the curvature radius of the well bottom surface was 3.2 mm. A culture vessel (plate) was obtained.
  • polystyrene resin manufactured by PS Japan, HF77
  • Comparative Example 2 A 35 ⁇ petri dish (manufactured by Sumitomo Bakelite Co., Ltd., MS-1035R) having a flat bottom surface was used.
  • Example 3 Cells were obtained in the same manner as in Example 3 except that a 96-well multiwell plate was formed by injection molding using polystyrene resin (manufactured by PS Japan, HF77) as the resin material, and the curvature radius of the well bottom surface was 3.2 mm. A culture vessel (plate) was obtained.
  • polystyrene resin manufactured by PS Japan, HF77
  • Example 4 Cells were obtained in the same manner as in Example 4 except that a 96-well multi-well plate was formed by injection molding using polystyrene resin (manufactured by PS Japan, HF77) as the resin material, and the curvature radius of the well bottom surface was 3.2 mm. A culture vessel (plate) was obtained.
  • a suspension was prepared. Dispense 100 ⁇ L / well of the cell suspension into the plates of Examples 1 to 6 and Comparative Examples 1, 3 and 4 and 2 mL each into the petri dish of Comparative Example 2 at 37 ° C. under 5% CO 2 atmosphere. The cells were cultured. After dispensing of the cell suspension, it was confirmed by microscope whether or not embryoid bodies were formed in each well at the time of 30 minutes, 2 hours, 4 hours, and 96 hours.
  • the iPS culture vessel of the present invention By using the iPS culture vessel of the present invention, it is possible to perform culturing while maintaining the cell function, and it is also possible to use it for assays using functional cells.

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Abstract

　本発明は、２個以上のウェルを有するｉＰＳ細胞用培養容器であって、前記ウェルが、その垂直方向における断面が略Ｕ字形状の底部及び、略円形の開口部を有し、かつ、前記底部の少なくとも曲面部分が細胞低接着性であると共に、前記底部の曲率半径（Ｒ'）が、１．０ｍｍ以上、２．６ｍｍ以下であり、前記細胞低接着性の前記曲面は、水溶性樹脂を用いた細胞低接着化処理または細胞非接着化処理にて形成され、前記水溶性樹脂が、式（Ｉａ）および（Ｉｂ）で表される化合物の少なくとも一方であることを特徴とするｉＰＳ細胞用培養容器である。本発明のｉＰＳ細胞用培養容器を用いることで、簡便に均一なｉＰＳ細胞の胚様体の形成を可能とし、さらに胚様体を用いたアッセイにも使用可能である。

Description

ｉＰＳ細胞用培養容器
　本発明は、ｉＰＳ細胞用培養容器に関する。
　ｉＰＳ細胞は、体細胞へ数種類の遺伝子を導入することにより、ＥＳ細胞（胚性幹細胞）のように非常に多くの細胞に分化できる分化万能性と、その細胞の分裂増殖を経てもそれを維持できる自己複製能を持たせた細胞である。
　未分化状態を維持したまま無限増殖するｉＰＳ細胞は、様々な組織細胞に分化する多分化能を有することから、分化により得られた組織を用いた移植治療、いわゆる再生医療の分野で様々な研究の対象となっている。また、ｉＰＳ細胞は、患者本人の体細胞から樹立されることから、免疫拒絶の可能性が低く、さらには倫理面での研究開発のハードルが低く、再生医療の主力となりうる細胞である。
　ｉＰＳ細胞を様々な組織に分化誘導するためには、ＥＳ細胞における胚様体（ｅｍｂｒｙｏｉｄ　ｂｏｄｙ：ＥＢ体）に相当するｉＰＳ細胞凝集体を形成させる方法が最も広く用いられておる。ＥＢ体の形成は、ｉｎ　ｖｉｔｒｏでのＥＳ細胞の分化誘導におけるファーストステップとなる。また、細胞凝集体の形成には、ｉＰＳ細胞を培養容器に接着させない浮遊状態でｉＰＳ細胞を培養することが必要である。通常の培養容器を使用した接着培養では、細胞凝集体は形成されず、iＰＳ細胞は、互いに接着し、伸展し、非特異的な分化を開始する。
　ｉＰＳ細胞を浮遊状態で培養するために最も広く用いられている方法は、懸垂培養（ハンギングドロップ培養）と呼ばれる方法である。ハンギングドロップ培養は、その名のとおり、水滴状に垂れ下げた培養液の中で細胞を培養する方法である。すなわち、まず、マルチウェルプレートの穴（ウェル）に、ミネラルオイルと緩衝液を添加する。次に、マルチウェルプレートの蓋の、各ウェルに対応する位置に、ｉＰＳ細胞を含む培養懸濁液を液滴となるようにスポッティングする。その後、マルチウェルプレートにその蓋をかぶせて、ｉＰＳ細胞を培養する。しかし、ハンギングドロップ法においては、細胞凝集体形成の成功率が低い、顕微鏡観察ができない、一度に形成できる細胞凝集体の量が少ない、操作が煩雑である、等の問題がある。
　特許文献１では、これら問題を解決するために、凹部を有する培養容器が記載されている。特許文献１では、培養容器の当該凹部に細胞を入れ、その後、細胞の凝集体を形成している。しかし、凹部の開口幅が１００μｍ～３００μｍと狭く、また、容器形状も特殊であるので、特許文献1の培養容器は汎用性に高いとは言えない。
特開２０１０－２００７４８号公報
　特許文献１に記載の技術は、なお、ｉＰＳ細胞から、効率よく、質の高いｉＰＳ細胞凝集体を形成するという観点から、改善の余地があった。
　そこで、本発明は、より高いレベルにて、効率よく、質の高いｉＰＳ細胞凝集体を形成することを可能にするｉＰＳ細胞用培養容器を提供することを目的としている。
　そこで、本発明者等が鋭意検討した結果、２個以上のウェルを有する培養容器において、各ウェルの内面を、水溶性樹脂を用いて細胞低接着化処理または細胞非接着化処理させた。さらにウェルを所定の形状とすることにより、細胞凝集塊を形成することが可能となった。その結果、上記目的を達成することができることを見出して、本発明を完成させた。
　すなわち、このような目的は、下記（１）～（４）に記載の本発明により達成される。
（１）２個以上のウェルを有するｉＰＳ細胞用培養容器であって、
　前記ウェルが、その垂直方向における断面が略Ｕ字形状の底部及び、略円形の開口部を有し、かつ、前記底部の少なくとも曲面部分が細胞低接着性であると共に、前記底部の曲率半径（Ｒ'）が、１．０ｍｍ以上、２．６ｍｍ以下であり、
　前記細胞低接着性の前記曲面は、水溶性樹脂を用いた細胞低接着化処理または細胞非接着化処理にて形成され、
　前記水溶性樹脂が、下記式（Ｉａ）および（Ｉｂ）で表される化合物の少なくとも一方であることを特徴とするｉＰＳ細胞用培養容器。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000004
（２）前記ウェルの前記底部に前記細胞低接着性の表面を有するくぼみが少なくとも一つ内設されていることを特徴とする（１）項に記載のｉＰＳ細胞用培養容器。
（３）前記各ウェルの内面全体が、前記細胞低接着性であることを特徴とする（１）項に記載のｉＰＳ細胞用培養容器。
（４）前記ウェルは、前記式（Ｉａ）で表される化合物と、前記式（Ｉｂ）で表される化合物との少なくとも一方で形成されていることを特徴とする（１）項に記載のｉＰＳ細胞用培養容器。
　本発明によれば、より高いレベルにて、効率よく、質の高いｉＰＳ細胞凝集塊を形成することが可能になる。
図１は、本発明によるｉＰＳ細胞培養容器の培養ウェルの断面を示す。 図２は、本発明によるｉＰＳ細胞培養容器のウェルの底部に細胞低接着性の表面を有するくぼみを有する培養ウェルの断面を示す。 図３は、本発明実施例１によるｉＰＳ細胞の凝集塊を示す。 図４は、本発明実施例２によるｉＰＳ細胞の凝集塊を示す。 図５は、本発明実施例３によるｉＰＳ細胞の凝集塊を示す。 図６は、本発明実施例４によるｉＰＳ細胞の凝集塊を示す。 図７は、本発明実施例５によるｉＰＳ細胞の凝集塊を示す。 図８は、本発明実施例６によるｉＰＳ細胞の凝集塊を示す。 図９は、本発明比較例１によるｉＰＳ細胞の培養状態を示す。 図１０は、本発明比較例２によるｉＰＳ細胞の培養状態を示す。
　本発明の培養容器において重要な点は、図１にて示したように、ラウンドボトムやＶボトムと呼ばれるように、ウェルの内側面が底面に向かって縮径し、縮径部分（底部）が半球若しくは円錐状の形状に形成されたウェルを有する点にある。このようなウェルを有するマルチウェルプレートを使用すると、１ウェルに１個の細胞凝集塊が均一な大きさで形成される。すなわち、より質の高い細胞凝集塊を形成し、さらに胚様体を形成することを可能にする。図１に示される細胞培養容器は、後述するように、ウェルの垂直方向における断面が略Ｕ字形状の底部、及び、略円形の開口部を有するウェルを２個以上有している。また、前記底部の内面の少なくとも曲面部分、好ましくはウェル内面全体が細胞低接着性である。さらに、当該各ウェルの底部の内面が所定の形状を有する。このように、縮径部分を円錐状、半球状になるようにウェルを形成することにより、細胞をウェルに播種した際に、細胞自身の自重により細胞が容器底面に集合し、細胞凝集塊が形成されやすくなる。
　本発明の培養容器は、樹脂製の材料（樹脂材料）で成形することができる。この樹脂材料は、上記培養容器をディスポーザルタイプに成形することができる。それに加え、樹脂材料は、培養容器を種々の形状に容易に成形することができる。上記樹脂材料としては、例えば、ポリプロピレン樹脂、ポリエチレン樹脂、エチレン-プロピレン共重合体等のポリオレフィン系樹脂または環状ポリオレフィン系樹脂、ポリスチレン、アクリロニトリル－ブタジエン－スチレン系樹脂等のポリスチレン系樹脂、ポリカーボネート樹脂、ポリエチレンテレフタレート樹脂、ポリメチルメタクリレート樹脂等のメタクリル系樹脂、塩化ビニル樹脂、ポリブチレンテレフタレート樹脂、ポリアリレート樹脂、ポリサルホン樹脂、ポリエーテルサルホン樹脂、ポリエーテルエーテルケトン樹脂、ポリエーテルイミド樹脂、ポリテトラフルオロエチレン等のフッ素系樹脂、ポリメチルペンテン樹脂、ポリアクリロニトリル等のアクリル系樹脂、プロピオネート樹脂等の繊維系樹脂等が挙げられる。これらの中でも培養容器に求められる成形性、滅菌性の点においてポリスチレン樹脂が特に好ましい。
　また、本発明の培養容器は、後述するような水溶性樹脂材料で成形されていてもよい。この場合、樹脂材料としては、後述する式（Ｉａ）で表される化合物、式（Ｉｂ）で表される化合物またはそれらの混合物であることが好ましい。これらの化合物は水溶性を有するため、後述する水溶性樹脂被覆層をウェルの内表面に設ける必要がない。したがって、細胞培養容器の製造プロセスを簡易化できるとともに、細胞培養容器の製造コストも低減することもできる。
　上記樹脂材料から本発明の培養容器を製造する場合、例えば射出成形、ブロー成形、インジェクションブロー成形により、培養容器を製造することができる。
　また、本発明においては、各ウェルの底部の曲率半径（Ｒ'）を２．６ｍｍ以下、好ましくは２．０ｍｍ以下とする。これによりｉＰＳ細胞同士が充分な密度で底部に集まり、より質の高い細胞凝集塊を形成することを可能にする。
　また、底部の曲率半径（Ｒ'）が２．６ｍｍを越える従来の培養容器に比べて、本発明の培養容器のウェル形状が底部（２）に向けて細くなるため、底部（２）から従来の培養容器と同じ高さで培地を吸引した場合の培地交換効率（培地全体量に対する吸引除去する培地量の割合）に優れる点も本発明の大きな特徴の一つである。
　ＥＳ細胞培養の場合、底部の曲率半径（Ｒ'）が３．５ｍｍ以下で有れば、細胞凝集塊であるＥＢ体を作製するのに十分である。一方、ｉＰＳ細胞の場合、底部の曲率半径が３．５ｍｍでは、細胞の集まりが不十分であり、きれいな細胞凝集塊を作製できない。しかし、底部の曲率半径（Ｒ'）が２．６ｍｍ以下であれば、質の高い細胞凝集塊を形成することが可能である。
　更に、曲率半径（Ｒ'）を１．０ｍｍ以上とすることにより、培養時に発生する死細胞の底面への凝集が高密度になりすぎることなく、倒立顕微鏡による顕鏡性に優れる。その為、ウェル内の細胞または胚様体の観察を正確に行うことができる。
　また、前述の略円形の開口部（３）の直径を４．０ｍｍ以上とすることで、マルチディスペンサーを使用する場合の操作性に優れる。一方、開口部（３）の直径を１１．０ｍｍ以下とすることで、培養容器１枚あたり４８個以上の複数のウェルを設けることができる。
　ウェル（１）の容量は、８０μＬ以上、５００μＬ以下であることが好ましい。こうすることで、１ウェルあたり１個の細胞、例えばマウスＥＳ細胞やヒトＥＳ細胞の胚様（ＥＢ）体を形成するに必要充分な量の培地を添加することができる。
　ウェル（１）の容量は、より好ましくは８０μＬ以上、２００μＬ以下である。こうすることで、培地や試薬の使用量を減らすことができる。
　各培養ウェルは、以下の構造とすることがさらに好ましい。すなわち、図１に示すように、培養ウェル（１）の内側面の稜線を上記培養ウェルの底部（２）を越えて延長した直線（ａ）を作成する。次に、上記開口部（３）の中心から底部（２）に前記培養ウェルの底部（２）を越えて、垂直に延長した直線（ｂ）を作成する。この直線（ａ）と直線（ｂ）と、が交差する角度（θ）が３°以上、３０°以下であることが好ましい。こうすることで、培地中の細胞がより底部（２）に集まりやすくなり、更に培地交換の際のディスペンサーチップ操作も容易となる。前記交差角度は、５°以上、１５°以下であることが好ましい。こうすることで、略Ｕ字形状の底部（２）と内側面とがよりなだらかにつながる形状となる。その結果、培地中の細胞が更に底部（２）に集まりやすくなり、より良好な形状のＥＢ体を形成させることができる。
　また、図２に示したように、各ウェルの最下部面に細胞低接着性の表面を有するくぼみ（４）が少なくとも１つ内設されているのが好ましい。この構成により、播種した細胞が効率よくウェル最下部面のくぼみに集まるため、細胞凝集塊の形成性に優れる。
　このくぼみ（４）の容量は、特に限定されないが、１．０×１０－８ｍＬ以上、５．０×１０－２ｍＬ以下である。このような容量であれば、くぼみの中に細胞凝集塊が形成され、培地交換の際にくぼみの中の細胞凝集塊を吸い取らずに古い培地をディスペンサーで吸引する作業を容易におこなう事が出来る。くぼみ（４）の容量が、２．０×１０－７ｍＬ以上、２．０×１０－２ｍＬ以下であることがより好ましい。これにより、くぼみの中の細胞凝集塊が成長しても、くぼみから細胞凝集塊がはみ出すことなく、培地交換の際には古い培地の残量を少なくする事が出来る。くぼみ（４）の容量は、更に好ましくは、１．０×１０－６ｍＬ以上、２．０×１０－３ｍＬ以下である。このような容量であれば、分化誘導研究に適したサイズの胚性幹細胞胚様体や刺激応答研究に適したサイズの上皮細胞凝集塊に対して、効率よく培地交換をおこなう事が出来る。
　くぼみ（４）の形状は特に限定するものではないが、その断面が略Ｕ字、略Ｖ字、略台形等に形成された形状の様に、細胞が底部に集まりやすい形状であることが好ましい。くぼみ（４）の形状は、その断面が略Ｕ字形状に形成されていれば、そのくぼみ（４）は細胞の凝集性に優れ、凝集塊形成後の位置的な安定性に優れるため、特に好ましい。
　ひとつのウェルに内設されるくぼみの数は、特に限定されず、必要に応じて１～複数個形成してもよい。但し、ウェルに播種した細胞がくぼみに集まるように、くぼみはウェルの最下部面に形成されている必要がある。
　また、本発明の細胞培養容器は、上述した各態様において、ウェルの細胞低接着性の表面は、以下の細胞低接着化処理または細胞非接着化処理を行うことで形成することができる。この細胞非接着化処理としては、ウェルの基材表面の親水化処理であることが好ましい。ここで言うところの表面親水化処理には以下の処理方法がある。
（１）水溶性樹脂を培養容器の内面に架橋して固定する方法
（２）親水性樹脂を培養容器の内部表面に塗布する方法
　なお、細胞培養容器が後述の水溶性樹脂材料で成形される場合には、細胞低接着化処理または細胞非接着化処理は不要である。
　まず、（１）の方法について詳しく述べる。
　この方法は、水溶性樹脂を培養容器内面に被覆させて架橋し、水溶性樹脂被覆層を形成させることを特徴とする。
　ここで言う水溶性樹脂とは、水分子とイオン結合もしくは水素結合により水和し、その結果として水に溶解する樹脂である。言い換えれば、水溶性樹脂とは、水に溶解するために、分子内の主鎖に対して必要充分な量のイオン性もしくは極性の側鎖を持つ樹脂である。なお、ここで水溶性樹脂とは、２５℃の水１００ｇに対して１．０ｇ以上溶解可能なものをいう。
　上記水溶性樹脂としては、例えば、ポリ酢酸ビニルのケン化物、ポリビニルピロリドン、ポリエチレングリコール、ポリアクリルアミド、ポリメタアクリルアミド、ポリヒドロキシエチルメタアクリレート、ポリペンタエリスリトールトリアクリレート、ポリペンタエリスリトールテトラアクリレート、ポリジエチレングリコールジアクリレート、およびそれらを構成するモノマー同士の共重合体、また２－メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリンと他のモノマー（例えばブチルメタクリレート等）との共重合体等が挙げられる。これらの中でもポリ酢酸ビニルのケン化物、ポリビニルピロリドン、ポリエチレングリコールの中から選ばれる１種以上と下記反応基とからなる構造を有する樹脂が好ましい。これにより、種々の細胞に対する刺激を抑制し、細胞凝集塊の形成速度、形成率、および形成した細胞凝集塊の質を向上することができる。
　なお、前記反応基としては、例えば、窒素原子を含む官能基、硫黄原子を含む官能基、臭素原子を含む官能基、塩素原子を含む官能基、およびそれらのいずれの原子も含まない官能基等が挙げられる。
　具体的には、アジド基を含む官能基、ジアゾ基を含む官能基、ジアジド基を含む官能基等が挙げられる。これらの中でも、アジド基を含む官能基が好ましい。これにより、細胞培養容器の内面への細胞の接着量を低減することができる。
　ここで、ポリ酢酸ビニルのケン化物とは、例えば、ポリビニルアルコールまたはビニルアルコールと他の化合物との共重合体をいう。さらには、例えば、ビニルアルコールと、親水基変性、疎水基変性、アニオン変性、カチオン変性、アミド基変性またはアセトアセチル基のような反応基変性させた変性酢酸ビニルとのケン化物等も含まれる。
　また、前記水溶性樹脂として重合体を用いる場合、その平均重合度は、特に限定されないが、１００～１０，０００が好ましく、特に２００～５，０００が好ましい。平均重合度が前記下限値未満であると細胞培養容器の表面に均一に皮膜を成形するのが困難となる場合があり、前記上限値を超えると前記水溶性樹脂の粘度が高くなり作業性が低下する場合がある。
　また、上記ポリ酢酸ビニルのケン化物を用いる場合、上記ポリ酢酸ビニルのケン化物のケン化度は、特に限定されないが、該ポリ酢酸ビニル全体の２０ｍｏｌ％以上、１００ｍｏｌ％以下が好ましく、特に５０ｍｏｌ％以上、９５ｍｏｌ％以下が好ましい。
　このような水溶性樹脂としては、例えば下記式（Ｉａ）および／または（Ｉｂ）で表される構成単位を含むものが好ましい。これにより、実用的な３００～５００ｎｍの波長で均一な皮膜を形成する事ができ、細胞培養容器の内面への細胞の接着量を低減することができる。また、複数の細胞凝集塊が形成されることを低減する効果を特に向上することができる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000005
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000006

　上記式（Ｉａ）で表される化合物は、水溶性を有している。そのため、細胞が細胞培養容器の内面または水溶性樹脂被覆層に接着しにくくなる。また、水溶性樹脂被覆層では、フェニル基が細胞培養容器の内面から離間して存在する。そのため、フェニル基の存在により、細胞が細胞培養容器の内面に接着しにくくなる。したがって、本発明では、水溶性樹脂として、上記式（Ｉａ）で表される化合物を用いることが好ましい。
　上記式（Ｉｂ）で表される化合物は、Ｒに結合する硫黄含有環状基と、フェニル基に結合するスルホン酸ナトリウム基とを有している。この硫黄含有環状基はかさ高い構造であるため、上記式（Ｉｂ）で表される化合物の構造は立体的になっている。そのため、細胞培養容器の内面に水溶性樹脂被覆層を設けたとき、硫黄含有環状基やフェニル基が細胞培養容器の内面から離間する。これにより、細胞が細胞培養容器の内面に接着しにくくなる。
　それに加え、上述したように、フェニル基が細胞培養容器の内面から離間して存在する。換言すると、水溶性樹脂被覆層の表面付近には、フェニル基に結合するスルホン酸ナトリウム基が存在している。スルホン酸ナトリウム基は水溶性が高いため、細胞が水溶性樹脂被覆層に接着しにくくなる。したがって、本発明では、水溶性樹脂として、上記式（Ｉｂ）で表される化合物を用いることが好ましい。
　さらに、上記式（Ｉａ）で表される化合物も水溶性を有するため、上記式（Ｉａ）で表される化合物と上記式（Ｉｂ）で表される化合物とを組み合わせて用いると、細胞が細胞培養容器の内面または水溶性樹脂被覆層により接着しにくくなる。したがって、本発明では、水溶性樹脂として、上記式（Ｉａ）で表される化合物と上記式（Ｉｂ）で表される化合物とを組み合わせて用いることがより好ましい。
　前記水溶性樹脂の式（Ｉａ）または（Ｉｂ）で表される化合物中のＲは、カルボニルとアミン（イミノ基ともいう）を有するアルキル基であれば特に限定するものではないが、例えば下記式（ＩＩ）で表されるものが好ましい。これにより前記極性の側鎖の合成が容易に行える。
　細胞培養容器を、水溶性樹脂に浸漬する際、水溶性樹脂を溶媒に溶解した状態で浸漬することが好ましい。その際に使用する溶媒は、水もしくは、溶解度を高めるために水と有機溶媒の混合物を使用することができる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000007
　例えば、前記式（Ｉａ）および／または（Ｉｂ）で示される水溶性樹脂を使用する場合には、５ないし４０容量％のアルコール水溶液を前記溶媒として使用することで、水溶性樹脂の溶解性が高くなり、均一な水溶性樹脂被覆層を形成することができる。
　溶解する水溶性樹脂の濃度は０．０１ないし３０重量％が好ましく、特に０．１ないし１０重量％が好ましい。
　ここで水溶性樹脂の濃度が低すぎても、高すぎても、均一な被覆層が得られず、充分な細胞の接着低減効果が得られず、良好な細胞凝集塊が形成されない。
　上記水溶性樹脂を用いた水溶性樹脂被覆層の厚みとしては、１００ｎｍ以上５，０００ｎｍ以下が好ましく、１５０ｎｍ以上１，０００ｎｍ以下がより好ましい。水溶性樹脂被覆層の厚みを上記下限値以上にすることにより、細胞が細胞培養容器の基材から受ける物理的な刺激をより抑えることができる。また、水溶性樹脂被覆層の厚みを上記上限値以下とすることにより、水溶性樹脂被覆層に取り込まれるたんぱく質の量を少なくし、たんぱく質を介した細胞の接着を抑えることが出来る。そのため、細胞凝集塊形成率を更に向上させることができる。
　上記水溶性樹脂を培養容器内面に被覆させる方法としては、例えば、スピンコート、ディッピング、または上記水溶性樹脂溶液を培養容器内面に分注した後、容器を傾けて溶液を排出する方法を用いることができる。この様な方法で培養容器内面に水溶性樹脂を接触させた後、培養容器内面に残留した水溶性樹脂溶液を乾燥させることで水溶性樹脂被覆層を形成することができる。
　本発明の製造方法においては、上記工程後に、上記水溶性樹脂被覆層を硬化させて非水溶性硬化皮膜層に変性する非水溶性硬化皮膜変性工程を有することを特徴とする。
　上記水溶性樹脂被覆層を非水溶性硬化皮膜層に変性することで、密度の高いイオン性もしくは極性の側鎖を持つ表面を構築することができる。この表面に構築されたイオン性もしくは極性の側鎖は、培養液と接触した際に、静電相互作用もしくは水素結合により水分子と水和する。これによって、培養容器の内表面は実質的に水分子の密な水和層となる。この水和層は細胞に対する細胞培養容器の基材表面からの刺激を抑制し、質的に良好な細胞凝集塊が迅速に形成されることとなる。こうすることで、培養液を接触させた際に、水溶性樹脂の被覆層が溶解、遊離することを防ぎ、培養容器として必要な耐水性を獲得することができる。
　上記水溶性樹脂被覆層を硬化させる方法は、特に限定するものではなく、水溶性樹脂の側鎖に、硬化させるための官能基、例えば放射線反応性、感光性、熱反応性の官能基を有する水溶性樹脂を導入し、この導入部分を硬化させることで可能となる方法である。例えば、感光性の官能基であれば、ジアゾ基、アジド基、シンモナイル基等が挙げられ、また、熱反応性および放射線反応性の官能基であれば、ビニル基、エポキシ基等を挙げることができる。これらの中でも硬化処理を迅速におこなうことができ、簡易な設備で硬化させることができる感光性の官能基を有する水溶性樹脂が特に好ましい。
　上記感光性の官能基としては、式（Ｉａ）、（Ｉｂ）に示したように、アジド基を含む官能基が特に好ましい。これを用いることにより、実用的な２３０～５００ｎｍの波長で硬化反応させることができ、更に優れた解像性により皮膜の形成性を向上することができる。このように、ウェルの内表面に予め水溶性樹脂被覆層を形成し、該被覆層を硬化させて非水溶性硬化皮膜層に変性する工程によって、上記の厚みの水溶性樹脂被覆層と同等の厚みの非水溶性硬化皮膜層を得ることができる。
　水溶性樹脂を使用するもう一つの利点としては、水溶性樹脂の硬化後に表面を水で洗浄することで、未反応の樹脂を容易に洗い流すことができるという点である。もし、硬化反応性が悪い等の原因で溶出物が確認された場合は、硬化後に洗浄工程を設けることにより、溶出物を低減し、更に良好な細胞凝集塊生成率を得ることができる。
　次に、（２）の方法について述べる。
　塗布する親水性樹脂としては、ポリ－２－ヒドロキシエチルメタクリレート（ポリ－ＨＥＭＡ）、ホスホリルコリン基含有高分子化合物、ポリエチレングリコール鎖含有高分子化合物等があるが、特にこれらに限定する物ではない。
　例えば、ポリ－ＨＥＭＡの２％エタノール溶液を細胞培養容器のウェル内に１００μＬ分注し、エタノールを蒸発させ、細胞培養容器のウェル表面にポリ－ＨＥＭＡの層を形成させることができる。蒸発後、超純水や緩衝液でポリ－ＨＥＭＡの層を洗浄することで、細胞培養容器のウェル表面に吸着していない余分なポリ－ＨＥＭＡ分子を除去することができる。
　（１）の方法に比べ、（２）の方法は、ウェルの表面の親水化処理が高分子化合物の容器表面への吸着現象だけである。したがって、（２）の方法を用いた場合、細胞低接着性または細胞非接着性効果は（１）の方法に比べて弱いが、方法のプロセスが簡便であることが利点である。
　培養容器の必須条件である滅菌に関しては、例えば、エチレンオキサイドガス滅菌、乾熱滅菌、蒸気滅菌、放射線滅菌等が挙げられるが、γ線あるいは電子線を用いた放射線滅菌が好ましく、大量生産を行う場合は放射線透過性の点でγ線滅菌が特に好ましい。
　放射線の吸収線量については特に限定するものではない。しかし、吸収線量が低すぎると滅菌性は確保されず、吸収線量が高すぎると細胞培養容器および水溶性樹脂被覆層が劣化してしまう場合がある。
　前記のようにして作製された細胞培養容器は、以下の特徴を有する。
　細胞培養容器の基材表面が細胞非接着処理され、ウェルの底部が円錐状、または半球状に形成されているので、細胞が底部に集まり易く、細胞凝集塊を形成しやすい。
　また、形成した細胞凝集塊をそのままのプレートで蛍光、発光測定に用いることが可能である。
　なお、本発明の細胞培養容器は、図示しない温調手段を備えていてもよい。このような温調手段としては、ウェルの外面を覆うように、細胞培養容器に備えられた、恒温器、マントルヒーター（ジャケットヒーター）およびウォータバス、細胞培養容器に埋め込まれた電熱線などが挙げられる。細胞培養容器が温調手段を備えていれば、細胞を培養する温度（例えば、３７℃）に温調手段の温度を設定するだけで、細胞を簡単に培養することができる。
　以下、本発明を実施例に基づいて詳細に説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。
（実施例１）
　樹脂材料としてポリスチレン樹脂(ＰＳジャパン社製、ＨＦ７７)を用いて、射出成形により９６ウェルマルチウェルプレートを成形した。各ウェルの形状は、図１に示したとおりであり、ウェル底面の曲率半径を２．０ｍｍとした。
　前処理として、得られたプレートにプラズマ処理装置（ＢＲＡＮＳＯＮ／ＩＰＣ社製　ＳＥＲＩＥＳ７０００）を用いてプラズマ処理（酸素プラズマ１０分）を行い、プレート表面に濡れ性を付与した。
　次に、水溶性樹脂として側鎖にアジド基を有するポリビニルアルコール（東洋合成工業社製　ＡＷＰ：式（Ｉａ）の化合物（水溶性樹脂の平均重合度１６００、感光基の導入率０．６５ｍｏｌ％））を着色樹脂にて遮光したポリプロプレン容器中で、２５容量％エタノール水溶液に溶解し、０．３重量％の水溶性樹脂溶液を調整した。
　上述のプレートに、自動分注機（ＢｉｏＴｅｃ社製、オートセラウォッシャーＡＭＷ－９６ＳＸ）を使用し、１ウェルにつき１００μＬの前述の水溶性樹脂溶液を加えた。１分後、プレートを裏返して溶液を充分廃棄した。該プレートを２５℃で１７時間一次乾燥した後、ＵＶランプで２５０ｎｍのＵＶ光を２．０ｍＷ／ｃｍ２×３０秒間ウェルに照射して、水溶性樹脂を硬化した。その後、超純水でウェルを３回繰り返し洗浄し、乾燥させた。その後、γ線を吸収線量５．８ｋＧｙでウェルに照射（ラジエ工業株式会社）して、本発明の細胞培養容器（プレート）を得た。
（実施例２）
　樹脂材料としてポリスチレン樹脂(ＰＳジャパン社製、ＨＦ７７)を用いて、射出成形により９６ウェルマルチウェルプレートを成形し、ウェル底面の曲率半径を２．６ｍｍとした以外は、実施例１と同様にして細胞培養容器（プレート）を得た。
（実施例３）
　水溶性樹脂として側鎖にアジド基を有するポリビニルアルコール（式（Ｉａ）の化合物）の代わりに、側鎖にアジド基を有するポリビニルアルコール（東洋合成工業会社製　ＲＳＰ：式（Ｉｂ）の化合物）を用いた以外は、実施例１と同様にして細胞培養容器（プレート）を得た。
（実施例４）
　水溶性樹脂として側鎖にアジド基を有するポリビニルアルコール（式（Ｉａ）の化合物）の代わりに、側鎖にアジド基を有する２種類のポリビニルアルコール（東洋合成工業社製　ＡＷＰ：式（Ｉａ）の化合物（水溶性樹脂の平均重合度１６００、感光基の導入率０．６５ｍｏｌ％）と、東洋合成工業会社製　ＲＳＰ：式（Ｉｂ）の化合物）を用いた以外は、実施例１と同様にして細胞培養容器（プレート）を得た。
（実施例５）
　樹脂材料としてポリスチレン樹脂(ＰＳジャパン社製、ＨＦ７７)を用いて、射出成形により９６ウェルマルチウェルプレートを成形し、ウェル底面の曲率半径を２．６ｍｍとした以外は、実施例３と同様にして細胞培養容器（プレート）を得た。
（実施例６）
　樹脂材料としてポリスチレン樹脂(ＰＳジャパン社製、ＨＦ７７)を用いて、射出成形により９６ウェルマルチウェルプレートを成形し、ウェル底面の曲率半径を２．６ｍｍとした以外は、実施例４と同様にして細胞培養容器（プレート）を得た。
（比較例１）
　樹脂材料としてポリスチレン樹脂(ＰＳジャパン社製、ＨＦ７７)を用いて、射出成形により９６ウェルマルチウェルプレートを成形し、ウェル底面の曲率半径３．２ｍｍとした以外は、実施例１と同様にして細胞培養容器（プレート）を得た。
（比較例２）
　ウェルの底面が平面である３５φシャーレ（住友ベークライト社製、ＭＳ－１０３５Ｒ）を使用した。　
（比較例３）
　樹脂材料としてポリスチレン樹脂(ＰＳジャパン社製、ＨＦ７７)を用いて、射出成形により９６ウェルマルチウェルプレートを成形し、ウェル底面の曲率半径３．２ｍｍとした以外は、実施例３と同様にして細胞培養容器（プレート）を得た。
（比較例４）
　樹脂材料としてポリスチレン樹脂(ＰＳジャパン社製、ＨＦ７７)を用いて、射出成形により９６ウェルマルチウェルプレートを成形し、ウェル底面の曲率半径３．２ｍｍとした以外は、実施例４と同様にして細胞培養容器（プレート）を得た。
　実施例１ないし６および比較例１ないし４にて得られた細胞培養容器のそれぞれについて、以下の評価を行った。
（１）ヒトｉＰＳ細胞を用いた胚様体の形成
　ヒトｉＰＳ細胞を、Ｙ－２７６３２（ＣＡＬＢＩＯＣＨＥＭ社製、６８８０００）を１０μＭ含む培養液（ダルベッコ改変ＭＥＭ／Ｆ１２培地＋２０％Ｋｎｏｃｋｏｕｔ　ｓｅｒｕｍ　ｒｅｐｒａｃｅｍｅｎｔ＋２ｍＭ　グルタミン＋１％非必須アミノ酸＋０．１ｍＭメルカプトエタノール）中で１時間培養した。その後、ＴｒｙｐＬＥ Ｓｅｌｅｃｔ（ＧＩＢＣＯ社製）を使用し、ヒトｉＰＳ細胞を単細胞に分散させた。次に、Ｙ－２７６３２を１０μＭ含む培養液を用いて、（１）９０，０００ｃｅｌｌｓ／ｍＬ、（２）６０，０００ｃｅｌｌｓ／ｍＬ、（３）３０，０００ｃｅｌｌｓ／ｍＬで前記単細胞を分散させた細胞懸濁液を調製した。該細胞懸濁液を実施例１～６、比較例１、３、４のプレートに１００μＬ／ウェルずつ、比較例２のシャーレには２ｍＬづつ分注し、３７℃、５％ＣＯ２雰囲気下にて細胞を培養した。細胞懸濁液の分注後、３０分、２時間、４時間、９６時間の経過時点で、各ウェルについて胚様体が形成されているかどうかを顕微鏡で確認した。
　図３，４に示すように、本発明によるｉＰＳ細胞培養容器のウェル中では、正確に１個の凝集塊が形成されていることが分かった。一方、図９の比較例１では、主となる凝集塊の他に小さい複数の凝集塊が形成されていた。したがって、ウェル底面の曲率半径３．２ｍｍでは、ｉＰＳ細胞の単一の凝集塊が形成しにくいことがわかった。また、比較例２のウェルの底部が平面の細胞培養容器では、図１０の様に凝集塊が複数個形成されていた。このように、比較例１および２の細胞培養容器は本発明の目的には合わないことが明確となった。
　また、図５、７に示すように、水溶性樹脂として式（Ｉｂ）で表される化合物を用いた細胞培養容器のウェル中では、正確に１個の凝集塊が形成されていることが分かった。さらに、図６、８に示すように、水溶性樹脂として式（Ｉａ）で表される化合物と式（Ｉｂ）で表される化合物との両方を用いた細胞培養容器のウェル中でも、正確に１個の凝集塊が形成されていることが分かった。
　一方、比較例３、４で得られた細胞培養容器のウェル中では、主となる凝集塊の他に複数の小さい凝集塊が形成されていた。したがって、ウェル底面の曲率半径が３．２ｍｍでは、ｉＰＳ細胞の単一の凝集塊が形成しにくいことがわかった。
　本発明のｉＰＳ用培養容器を用いることで、細胞機能を維持した培養が可能であり、さらに機能細胞を用いたアッセイにも使用可能である。

Claims (4)

  1. 　２個以上のウェルを有するｉＰＳ細胞用培養容器であって、
    　前記ウェルが、その垂直方向における断面が略Ｕ字形状の底部及び、略円形の開口部を有し、かつ、前記底部の少なくとも曲面部分が細胞低接着性であると共に、前記底部の曲率半径（Ｒ'）が、１．０ｍｍ以上、２．６ｍｍ以下であり、
    　前記細胞低接着性の前記曲面は、水溶性樹脂を用いた細胞低接着化処理または細胞非接着化処理にて形成され、
    　前記水溶性樹脂が、下記式（Ｉａ）および（Ｉｂ）で表される化合物の少なくとも一方であることを特徴とするｉＰＳ細胞用培養容器。
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000001
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000002
  2. 　前記ウェルの前記底部に前記細胞低接着性の表面を有するくぼみが少なくとも一つ内設されていることを特徴とする請求項１に記載のｉＰＳ細胞用培養容器。
  3. 　前記各ウェルの内面全体が、前記細胞低接着性であることを特徴とする請求項１に記載のｉＰＳ細胞用培養容器。
  4. 　前記ウェルは、前記式（Ｉａ）で表される化合物と、前記式（Ｉｂ）で表される化合物との少なくとも一方で形成されている請求項１に記載のｉＰＳ細胞用培養容器。
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