JP2023138062A - 細胞取扱部材及び細胞取扱部材の製造方法 - Google Patents

Abstract

【課題】底部や細胞懸濁液に影響を及ぼすことなく、細胞が側壁に接着することを抑制することが可能な、細胞取扱部材、及び該細胞取扱部材の製造方法を提供する。【解決手段】細胞取扱部材１０は、底部１１と、底部１１に連続する側壁１２と、を備え、底部１１と側壁１２とにより、細胞Ｃを保持する空間Ｓが形成され、側壁１２のうち、底部１１と側壁１２とが連続している部分に、凹部２０が形成されている。凹部２０の高さは、１．０μｍ以上３．０μｍ以下である。【選択図】図２

Description

本開示は、細胞取扱部材及び細胞取扱部材の製造方法に関する。

従来、細胞収容部を備える各種の部材が知られている。このような部材は、細胞の培養、保存及び検査等を目的としている。細胞収容部を備える部材においては、細胞が部材の側壁へ意図せず接着するという問題がある。

特許第６８５６２２５号公報

これに対して従来、細胞の接着を低減するために、細胞収容部内に細胞非接着性の物質をコーティングするなどの手法がとられている。しかしながら、細胞収容部の壁面のみを選択的にコーティングすることや、コーティングを長期的に安定させることは困難である。さらにコーティング物質が剥離して細胞懸濁液に混入したり、細胞収容部の底面もコーティングされることにより、底面の機能が低減したりするおそれもある。

本開示は、底部や細胞懸濁液に影響を及ぼすことなく、細胞が側壁に接着することを抑制することが可能な、細胞取扱部材及び細胞取扱部材の製造方法を提供する。

本実施の形態による細胞取扱部材は、底部と、前記底部に連続する側壁と、を備え、前記底部と前記側壁とにより、細胞を保持する空間が形成され、前記側壁のうち、前記底部と前記側壁とが連続している部分に、凹部が形成され、前記凹部の高さは、１．０μｍ以上３．０μｍ以下である。

本実施の形態による細胞取扱部材において、前記凹部は、前記底部に沿う方向に延びてもよい。

本実施の形態による細胞取扱部材において、前記凹部は、前記空間から見て外側に向けて湾曲する弧状の断面を有してもよい。

本実施の形態による細胞取扱部材において、前記凹部の深さは、２００ｎｍ以上４５０ｎｍ以下であってもよい。

本実施の形態による細胞取扱部材において、前記側壁の高さ方向に複数の前記凹部が形成されていてもよい。

本実施の形態による細胞取扱部材において、前記凹部は、凹部上側頂部と、凹部底部とを有し、前記凹部上側頂部は、前記凹部の最も上側に位置し、前記凹部底部は、前記凹部のうち最も深い位置にあり、断面において、前記底部の内面に平行かつ前記凹部底部を通過する水平線と、前記凹部底部と前記凹部上側頂部とを結ぶ直線とのなす角は、７５°以下であってもよい。

本実施の形態による細胞取扱部材において、前記凹部は、凹部下側内面と、凹部底部と、凹部上側内面とを有し、前記凹部底部は、前記凹部のうち最も深い位置にあり、前記凹部下側内面は、前記凹部底部よりも下側に位置し、前記凹部上側内面は、前記凹部底部よりも上側に位置し、断面において、前記凹部下側内面又は前記凹部上側内面の接線と、前記底部の内面に平行かつ前記凹部底部を通過する水平線とのなす角のうち前記側壁の外面側に開いた角の角度が０°以上１０５°以下となる領域を、前記底部の外面の垂線に投影したときの投影像が連続しており、かつ前記投影像の高さ方向距離は、４５０ｎｍ以下となってもよい。

本実施の形態による細胞取扱部材において、前記凹部は、凹部下側内面と、凹部底部と、凹部上側内面とを有し、前記凹部底部は、前記凹部のうち最も深い位置にあり、前記凹部下側内面は、前記凹部底部よりも下側に位置し、前記凹部上側内面は、前記凹部底部よりも上側に位置し、断面において、前記凹部下側内面又は前記凹部上側内面の接線と、前記底部の内面に平行かつ前記凹部底部を通過する水平線とのなす角のうち前記側壁の外面側に開いた角の角度が０°以上１０５°以下となる領域を、前記底部の外面の垂線に投影したときの投影像が連続しており、かつ前記投影像の高さ方向距離は、４５０ｎｍ超であり、前記角度が０°以上１０５°以下となる前記領域と、当該領域に隣接しかつ前記角度が０°以上１０５°以下となる他の領域までの高さ方向距離は、４５０ｎｍ超であってもよい。

本実施の形態による細胞取扱部材において、前記凹部に、前記側壁の高さ方向に延びる隔壁が設けられていてもよい。

本実施の形態による細胞取扱部材は、細胞収容容器又は送液部材であってもよい。

本実施の形態による細胞取扱部材の製造方法は、本実施の形態による細胞取扱部材の製造方法であって、前記底部と前記側壁とを有する基板を準備する工程と、前記側壁のうち、前記底部と前記側壁とが連続している部分に、ＤＲＩＥ法により凹部を形成する工程と、を備える。

本実施の形態によれば、底部や細胞懸濁液に影響を及ぼすことなく、細胞が側壁に接着することを抑制できる。

図１は、一実施の形態による細胞取扱部材を示す断面図である。 図２は、一実施の形態による細胞取扱部材を示す部分拡大断面図（図１のII部拡大図）である。 図３は、一実施の形態による細胞取扱部材を示す部分拡大斜視図である。 図４は、細胞取扱部材の変形例を示す部分拡大断面図である。 図５は、凹部を示す部分拡大断面図である。 図６（ａ）、（ｂ）は、一実施の形態による細胞取扱部材の製造方法を示す断面図である。 図７は、細胞収容容器である細胞取扱部材を示す部分断面斜視図である。 図８は、細胞懸濁液の送液部材である細胞取扱部材を示す部分断面斜視図である。 図９は、マイクロ流路デバイスである細胞取扱部材を示す部分断面斜視図である。 図１０は、細胞懸濁液の撹拌又は振盪を伴う培養容器である細胞取扱部材を示す断面図である。 図１１は、細胞懸濁液の輸送を伴う保管容器である細胞取扱部材を示す断面図である。 図１２（ａ）、（ｂ）は、それぞれ実施例と比較例１による側壁及び底部を示す走査型電子顕微鏡写真である。 図１３は、第１変形例による細胞取扱部材を示す部分拡大斜視図である。 図１４は、第１変形例による細胞取扱部材を示す断面図（図１３のXIV－XIV線断面図）である。 図１５は、第２変形例による細胞取扱部材を示す部分拡大断面図である。 図１６は、比較例２による細胞取扱部材を示す部分拡大断面図である。

以下、図面を参照しながら各実施の形態について具体的に説明する。以下に示す各図は、模式的に示したものである。そのため、各部の大きさ、形状は理解を容易にするために、適宜誇張している。また、技術思想を逸脱しない範囲において適宜変更して実施することが可能である。なお、以下に示す各図において、同一部分には同一の符号を付しており、一部詳細な説明を省略する場合がある。また、本明細書中に記載する各部材の寸法等の数値及び材料名は、実施の形態としての一例であり、これに限定されるものではなく、適宜選択して使用できる。本明細書において、形状や幾何学的条件を特定する用語、例えば平行や直交、垂直等の用語については、厳密に意味するところに加え、実質的に同じ状態も含む。また、説明の便宜上、上方又は下方という語句を用いて説明する場合があるが、上下方向が逆転してもよい。

本明細書において、ある部材又はある領域等のある構成が、他の部材又は他の領域等の他の構成の「上に（又は下に）」あるとする場合、特段の限定がない限り、他の構成の直上（又は直下）にある場合に限らない。ある部材又はある領域等のある構成が、他の部材又は他の領域等の他の構成の「上に（又は下に）」あるとは、他の構成の上方（又は下方）において間に別の構成要素が含まれている場合も含む。

図１乃至図３を参照して、本実施の形態による細胞取扱部材の構成について説明する。図１は、本実施の形態による細胞取扱部材１０を示す断面図である。図２は、本実施の形態による細胞取扱部材１０の部分拡大断面図である。図３は、本実施の形態による細胞取扱部材１０の部分拡大斜視図である。

本明細書において、細胞取扱部材１０は、Ｘ軸及びＹ軸によって形成されるＸＹ平面上に配置される。またＺ軸は、Ｘ軸及びＹ軸に垂直な軸であり、鉛直方向に平行な方向である。本明細書において、Ｚ軸方向を高さ方向ともいう。図１及び図２は、Ｚ軸及びＸ軸によって形成されるＺＸ平面に沿う断面図である。

図１乃至図３に示すように、本実施の形態による細胞取扱部材１０は、底部１１と、底部１１に連続する側壁１２とを備える。底部１１と側壁１２とにより、細胞Ｃを保持する空間Ｓが形成されている。側壁１２のうち、底部１１と側壁１２とが連続している部分１２ｃに、凹部２０が形成されている。

本実施の形態による細胞取扱部材１０は、細胞Ｃを取り扱うための部材である。細胞取扱部材１０は、細胞収容部材又は細胞懸濁液の送液部材であってもよい。具体的には、細胞取扱部材１０は、シャーレ、フラスコ、ビーカー、プレート、チャンバースライド、ボトル、バッグ、タンク、バイアル、試験管、チューブ、シリンジ、流路などの形状を持った部材であって、内面にさらにウェルや溝などを有していても良い。

細胞取扱部材１０は、細胞収容容器であっても良い。細胞収容容器は、空間Ｓ内で細胞Ｃを底部１１に一定時間留めるように収容する容器である。この場合、細胞取扱部材１０は、側壁１２上に天部１４を有していても良い。この場合、底部１１、側壁１２及び天部１４によって閉じた空間Ｓが形成されても良い。細胞収容容器としては、例えば細胞Ｃを培養する細胞培養容器であっても良い。細胞培養容器としては、例えばシャーレ、フラスコ、マルチウェルプレート、チャンバースライド、ビーカー、プレート、ボトル、又はバッグ、タンク等が挙げられる。

また細胞取扱部材１０の底部１１には、特殊加工が施されていても良い。このような特殊加工としては、例えば、温度応答性ポリマー被覆、機能性ペプチド被覆、微細凹凸加工、又は高分子パターニング等が挙げられる。本実施の形態によれば、底部１１と側壁１２とが連続している部分１２ｃに凹部２０が形成されていることにより、後述するように、側壁１２に細胞Ｃが接着することを抑制できる。これにより、特殊加工の機能がより発揮されやすくなる。例えば、側壁１２に接着した細胞Ｃが剥離せず、底部１１に形成された細胞シートの回収が困難になることを抑制できる。

細胞取扱部材１０は、細胞懸濁液用の送液部材であっても良い。送液部材は、細胞Ｃを空間Ｓ内で底部１１上に留めることなく流すデバイスであっても良い。送液部材としては、例えば細胞Ｃを流すシリンジ、キャピラリー、チューブ、バイアル、又はマイクロ流路デバイス等であっても良い。この場合、細胞取扱部材１０は、側壁１２上に天部１４を有していても良い。

このほか細胞取扱部材１０としては、例えば細胞Ｃの撹拌、還流、振盪又は輸送を伴うタンク、ボトル、バッグ、バイアル、試験管等の各種培養容器又は保存容器等であっても良い。

細胞Ｃとしては、特に限定されないが、例えば、受精卵、卵細胞、ＥＳ細胞（胚性幹細胞）及びｉＰＳ細胞（人工多能性幹細胞）が挙げられる。卵細胞は、未受精の卵細胞をさし、未成熟卵母細胞及び成熟卵母細胞が含まれる。受精卵は、受精後、卵割により２細胞期、４細胞期、８細胞期と細胞数が増えてゆき、桑実胚を経て、胚盤胞へと発生する。受精卵には、２細胞胚、４細胞胚及び８細胞胚などの初期胚、桑実胚、胚盤胞（初期胚盤胞、拡張胚盤胞及び脱出胚盤胞を含む）が含まれる。胚盤胞は、胎盤を形成する潜在能力がある外部細胞と胚を形成する潜在能力がある内部細胞塊からなる胚を意味する。ＥＳ細胞は胚盤胞の内部細胞塊から得られる未分化な多能性又は全能性細胞を指す。ｉＰＳ細胞は、体細胞（主に線維芽細胞）へ数種類の遺伝子（転写因子）を導入することにより、ＥＳ細胞に似た分化万能性を持たせた細胞を指す。すなわち、細胞には、受精卵や胚盤胞のように複数の細胞の集合体も包含される。細胞は、哺乳動物及び鳥類の細胞、特に哺乳動物の細胞であっても良い。哺乳動物は、温血脊椎動物を指し、例えば、ヒト及びサルなどの霊長類、マウス、ラット及びウサギなどの齧歯類、イヌ及びネコなどの愛玩動物、ならびにウシ、ウマ及びブタなどの家畜が挙げられる。本実施の形態において、とりわけ細胞Ｃが接着性である場合に、細胞Ｃの側壁１２への接着を抑制する効果を好適に得られる。

細胞Ｃの直径は、２．０μｍ以上であっても良く、４．０μｍ以上であっても良い。また細胞Ｃの直径は、１００μｍ以下であっても良く、１０．０μｍ以下であっても良い。細胞Ｃは、細胞懸濁液中に含まれた状態で空間Ｓに保持されていても良い。このような細胞懸濁液は、細胞Ｃと液体とを含む。細胞懸濁液に含まれる液体は、細胞培養液、培地等の培養液であっても良い。

細胞取扱部材１０を構成する材料は特に限定されない。細胞取扱部材１０は、細胞Ｃの観察を外部から目視や顕微鏡等、光学的に行う場合、可視光を透過する透明材料が好ましい。透明材料として、例えばポリジメチルシロキサン（以下、ＰＤＭＳという）等のシリコーンゴム、アクリル、ポリスチレン等の各種樹脂材料やガラス、ゲル等が挙げられる。これらの中でも、安価で量産しやすい点から、ポリスチレン樹脂が好ましい。本実施の形態によれば、後述するように、側壁１２に細胞Ｃが接着することが抑制される。これにより、細胞取扱部材１０が例えばマルチウェルプレートである場合に、細胞Ｃが側壁１２に接着することにより細胞Ｃを顕微鏡で観察できなくなることを抑えられる。細胞取扱部材１０の材料としては、透明材料以外では、シリコン、白金等の金属などが挙げられる。また、細胞取扱部材１０が互いに異なる材料からなる複数の部材から構成されていても良く、単一の材料から構成されていても良い。

図１乃至図３に示すように、細胞取扱部材１０は、底部１１と、底部１１に連続する側壁１２と、を備える。側壁１２の、底部１１の反対側の端部には、開口部１３が形成されている。開口部１３は天部１４によって覆われていても良い。細胞Ｃは、開口部１３から空間Ｓに導入されても良く、天部１４に形成された図示しない孔から空間Ｓに導入されても良い。

底部１１は、底部内面１１ａと底部外面１１ｂとを有する。底部内面１１ａと底部外面１１ｂとは互いに平行であっても良い。底部内面１１ａに微細加工等により凹凸が形成されている場合、底部内面１１ａのうち凹凸が形成されていない部分が底部外面１１ｂに平行であっても良い。底部外面１１ｂは、細胞取扱部材１０の使用時に鉛直方向下方を向く面である。また底部外面１１ｂは、細胞取扱部材１０の外方を向く面であり、載置台等に設置される面である。底部内面１１ａは、細胞取扱部材１０の使用時に鉛直方向上方を向く面である。底部内面１１ａは、空間Ｓ側を向く面であり、細胞Ｃが保持される面である。本実施の形態において、底部内面１１ａはＸＹ平面に平行な平坦面である。なお、これに限らず、底部内面１１ａに凹凸が形成されていてもよい。

側壁１２は、底部１１から高さ方向（Ｚ軸方向）に延びている。側壁１２は、側壁内面１２ａと側壁外面１２ｂとを有する。側壁内面１２ａのうち凹部２０が形成されていない部分と、側壁外面１２ｂとは互いに平行である。側壁外面１２ｂは、細胞取扱部材１０の使用時に外方を向く面である。側壁内面１２ａは、細胞取扱部材１０の使用時に内方を向く面である。側壁内面１２ａは、空間Ｓ側を向く面である。本実施の形態において、側壁内面１２ａのうち、凹部２０が形成されていない開口部１３側の部分は、ＹＺ平面に平行な平坦面である。なお、これに限らず、側壁内面１２ａの全域にわたって凹部２０が形成されていてもよい。

側壁１２のうち、底部１１と側壁１２とが連続している部分１２ｃに、凹部２０が形成されている。凹部２０は、側壁内面１２ａから側壁外面１２ｂに向けて凹むように形成される。図２の断面に示すように、底部１１と側壁１２とが連続している部分１２ｃは、側壁内面１２ａの下端部（開口部１３の反対側の端部）に位置する。なお、図４に示すように、底部内面１１ａの周縁が湾曲している場合、連続している部分１２ｃとは、断面において底部内面１１ａ及び側壁内面１２ａを構成する曲線の曲率の変化が最も大きくなる箇所をいう。

図２に示すように、凹部２０は、空間Ｓから見て外側に向けて湾曲する弧状の断面を有する。凹部２０の断面は、円弧状又は楕円弧状であっても良い。この場合、凹部２０は、側壁内面１２ａの高さ方向に沿って複数形成されている。複数の凹部２０は、全体として断面視で波形状を有している。

図３に示すように、凹部２０は、底部１１の底部内面１１ａに沿う方向に延びている。凹部２０は、底部１１に沿う方向に複数形成されていても良い。凹部２０は、線状に延びる溝であっても良い。この場合、凹部２０の長さ方向は、Ｙ軸方向に平行である。なお、例えば細胞取扱部材１０が細胞培養用シャーレ等である場合、底部内面１１ａが平面視で円形である。この場合、凹部２０の長さ方向は、底部内面１１ａの外周に沿って円形となっても良い。凹部２０は、連続的な一本の線状に延びていても良く、断続的な破線状に延びていても良い。凹部２０の長さ方向距離（Ｙ軸方向距離）は、側壁内面１２ａのうち、細胞Ｃの接着を抑えたい領域の長さに対応して良い。例えば、凹部２０の長さ方向距離は、０．４５μｍ以上２０．０μｍ以下としても良い。

細胞取扱部材１０が細胞収容容器である場合、凹部２０は、細胞収容容器の周方向全域に設けられていても良い。あるいは、凹部２０は、細胞収容容器の周方向の一部に設けられていても良い。また細胞取扱部材１０がマイクロ流路デバイス等の送液部材である場合、複数の凹部２０は、送液部材の流路の長さ方向全域に設けられていても良い。あるいは、複数の凹部２０は、送液部材の流路の長さ方向の一部に設けられていても良い。

また複数の凹部２０は、少なくとも底部内面１１ａの近傍に存在する。具体的には、複数の凹部２０が存在する領域の高さＨ１（図１参照）は、底部内面１１ａから少なくとも５μｍ以上であることが好ましく、１０μｍ以上とすることがさらに好ましい。本実施の形態において、複数の凹部２０は、高さ方向に互いに連続して形成されている。なお、これに限らず、複数の凹部２０は、高さ方向に断続的に形成されていても良い。これにより、細胞Ｃが側壁内面１２ａに沿って上昇することを抑制できる。

図５は、最も下方（底部１１側）に位置する凹部２０の周辺を拡大して示す断面図である。図５に示すように、各凹部２０は、凹部下側頂部２１と、凹部下側内面２２と、凹部底部２３と、凹部上側内面２４と、凹部上側頂部２５とを有する。凹部下側頂部２１は、各凹部２０の最も下側（底部１１側）に位置する。凹部下側内面２２は、凹部下側頂部２１から凹部底部２３に向けて延びる。凹部下側内面２２は、凹部底部２３より底部１１側に位置する。この場合、凹部下側内面２２は、側壁１２の外側に向かって湾曲する湾曲面である。凹部底部２３は、各凹部２０のうち最も深い位置にある。すなわち凹部底部２３は、凹部下側頂部２１と凹部上側頂部２５とを接続する接続線Ｌ１から最も遠い位置にある。凹部上側内面２４は、凹部底部２３から凹部上側頂部２５に向けて延びる。凹部上側内面２４は、凹部底部２３より上側（開口部１３側）に位置する。この場合、凹部上側内面２４は、側壁１２の外側に向かって湾曲する湾曲面である。凹部上側頂部２５は、各凹部２０の最も上側（開口部１３側）に位置する。凹部上側頂部２５は、空間Ｓ側に向けて鋭角的に突出する。凹部上側頂部２５は、上方に隣接する凹部２０の凹部下側頂部２１と同一の位置に存在しても良い。

また凹部下側頂部２１と凹部上側頂部２５との高さ方向距離を凹部２０の高さＨ２とする。このとき、凹部２０の高さＨ２は、１．０μｍ以上としても良く、１．１μｍ以上としても良い。凹部２０の高さＨ２は、３．０μｍ以下としても良く、２．０μｍ以下としても良い。一般に、単層の接着細胞の厚みは、２．９±０．６μｍ程度であることが知られている（例えば、Technical report: Cell thickness measurements by confocal fluorescence microscopy on C3H10T1/2 and V79 cells - PubMed (nih.gov)参照）。このため、凹部２０の高さＨ２を上記範囲とすることにより、底部内面１１ａに吸着した細胞Ｃが凹部２０に嵌まり込むことを抑え、細胞Ｃが凹部上側内面２４に接着することを抑制できる。凹部２０の高さＨ２とは、細胞取扱部材１０の底部１１のうち、細胞Ｃを保持する空間Ｓを形成する面（例えば底部内面１１ａ）の反対側を向く面（例えば底部外面１１ｂ）を水平面に静置した場合に、凹部上側頂部２５を通る水平線ＨＬ１と下側頂部２１を通る水平線ＨＬ２との間の距離をいう。凹部２０の高さＨ２は、走査型電子顕微鏡により凹部２０の断面を観察し、観察画像を画像解析ソフトウェア等を用いて測定する等の手法により測定できる。

複数の凹部２０が設けられている場合、複数の凹部２０の高さＨ２が同一であっても良い。あるいは、複数の凹部２０の高さＨ２が互いに異なっても良い。この場合、最も下方（底部１１側）に位置する凹部２０の高さＨ２が最も高くても良い。

また図５において、凹部下側頂部２１と凹部上側頂部２５とを接続する接続線Ｌ１と凹部底部２３との距離を凹部２０の深さＤ１とする。このとき、凹部２０の深さＤ１は、２００ｎｍ以上としても良く、３００ｎｍ以上としても良い。凹部２０の深さＤ１は、４５０ｎｍ以下としても良く、４００ｎｍ以下としても良い。平面での実験において、細胞は幅４５０ｎｍよりも狭いストライプ状の領域には接着できないことが知られている（例えば、http://webpark1390.sakura.ne.jp/research/nanopattern/nanopattern.html参照）。このため、凹部２０の深さＤ１を上記範囲とすることにより、細胞Ｃが凹部下側内面２２に接着することを抑えられる。これにより、細胞Ｃが側壁内面１２ａに沿って上昇することを抑制できる。凹部２０の深さＤ１とは、上記接続線Ｌ１から凹部２０内に向けた水平線の距離が最も長くなる場所と、上記接続線Ｌ１とを結ぶ、上記水平線に平行な線分の長さをいう。凹部２０の深さＤ１は、走査型電子顕微鏡により凹部２０の断面を観察し、観察画像を画像解析ソフトウェア等を用いて測定する等の手法により測定できる。

複数の凹部２０が設けられている場合、複数の凹部２０の深さＤ１が同一であっても良い。あるいは、複数の凹部２０の深さＤ１が互いに異なっても良い。この場合、最も底部１１に近い凹部２０の深さＤ１が最も深くても良い。

また図５において、底部内面１１ａに平行かつ凹部底部２３を通過する水平線ＨＬと、凹部底部２３と凹部上側頂部２５とを結ぶ直線Ｌ２とのなす角を角度θ１とする。このとき、角度θ１は、４０°以上としても良く、５５°以上としても良い。角度θ１は、７５°以下としても良く、７０°以下としても良い。角度θ１を上記範囲とすることにより、凹部上側内面２４が「返し」として機能し、細胞Ｃが凹部上側内面２４を上昇することを抑制できる。なお、凹部上側内面２４は、直線Ｌ２と交わらないことが好ましい。

さらに、凹部下側内面２２又は凹部上側内面２４の接線Ｌ３と、水平線ＨＬとのなす角のうち側壁外面１２ｂ側に開いた角の角度θ２が０°以上１０５°以下となる領域Ａ１（太線の領域）を、底部外面１１ｂの垂線ＶＬに投影することを想定する。このときの投影像ＰＩが連続しており、かつ投影像ＰＩの高さ方向距離Ｈ３は、４５０ｎｍ以下となることが好ましい。これにより、細胞Ｃが側壁内面１２ａに接着することをさらに抑制できる。

あるいは、上記投影像ＰＩが連続しており、かつ投影像ＰＩの高さ方向距離Ｈ３が４５０ｎｍ超であっても良い。この場合、接線Ｌ３と水平線ＨＬとのなす角度θ２が０°以上１０５°以下となる領域Ａ１と、当該領域Ａ１に隣接しかつ上記角度θ２が０°以上１０５°以下となる他の領域Ａ２までの高さ方向距離Ｈ４は、４５０ｎｍ超となることが好ましい。これにより、仮に細胞Ｃが側壁内面１２ａに接着した場合でも、細胞Ｃが側壁内面１２ａに沿って上昇することを抑制できる。

次に、本実施の形態による細胞取扱部材１０の製造方法について説明する。

まず、図６（ａ）に示すように、底部１１と、底部１１に連続する側壁１２とを有する基板１０ａを準備する。基板１０ａは、底部１１と側壁１２とによって取り囲まれることにより、空間Ｓが形成されている。この場合、一枚の基材に対して空間Ｓを切削することにより底部１１と側壁１２とを形成しても良い。あるいは、底部１１と側壁１２とが別部材から構成されても良い。この場合、底部１１上に、空間Ｓに対応する開口を有する側壁１２を積層しても良い。

続いて、図６（ｂ）に示すように、側壁１２のうち、底部１１と側壁１２とが連続している部分１２ｃに、凹部２０を形成する。これにより、本実施の形態による細胞取扱部材１０が得られる。底部１１と側壁１２とが別部材から構成される場合、あらかじめ側壁１２の端部に凹部２０を形成してもよい。この場合、前述した凹凸形状を形成できる公知の方法から、用いる材質などによって適宜選択すればよい。例えば側壁１２上に硬化性樹脂組成物を塗布して塗膜を形成し、所望の凹凸形状を有する金属や樹脂製の凹凸形成用原版の凹凸形状を、前記硬化性樹脂組成物の塗膜に賦型する。その後、当該硬化性樹脂組成物を硬化させることにより微細凹凸構造体を形成し、前記微細凹凸構造体を凹凸形成用原版から剥離する方法を用いても良い。あるいは、基材上に、ポリメタクリル酸メチル（ＰＭＭＡ）などアクリル系樹脂等の熱可塑性樹脂を塗布して塗膜を形成し、当該塗膜を熱可塑性樹脂のガラス転移温度以上に加熱して当該熱可塑性樹脂を液状とする。その後、所望の微細凹凸形状を有する微細凹凸構造体形成用原版の凹凸形状を、前記熱可塑性樹脂組成物の塗膜に賦型し、当該熱可塑性樹脂のガラス転移温度以下に冷却して、前記原版を剥離する方法を用いても良い。また、集束イオンビーム加工などの手法を用いて側壁１２に直接凹部２０を形成してもよい。側壁１２がシリコンから構成される場合、例えばドライエッチング法により側壁１２に凹部２０を形成しても良い。ドライエッチング法としては、例えばボッシュプロセスを用いたＤＲＩＥ（Deep Reactive Ion Etching）法等が用いられる。

このように、側壁１２の材料がシリコンであり、ＤＲＩＥ法により凹部２０が形成される場合、側壁１２へ凹部２０を容易に形成できる。また、凹部２０の周辺の部材が側壁１２の他の部分から遊離して異物となる可能性が少ない。なお、凹部２０は、側壁１２を形成するための底面方向のエッチングと同時に形成されても良い。この場合、側壁１２を個別に加工する工程を設ける必要がなく効率的である。底部１１と側壁１２が別部材により構成される場合は、部材の材質や使用目的に応じて接着剤、熱、超音波、素材の自己吸着性等の公知の接合技術を利用し、底部１１と側壁１２とを接合できる。またはシリコンリングなどの治具を用いて底部１１と側壁１２とを密着させた状態で空間Ｓを形成してもよい。

このほか、本実施の形態による細胞取扱部材１０は、微小な流路構造を有するマイクロデバイスの製造に用いられている方法など、公知の微細加工法を利用して製造できる。該微細加工法としては、例えばフォトリソグラフィ法、電子ビームリソグラフィー法、ナノインプリント法、エッチング法、切削法等が挙げられる。

次に、このような構成からなる本実施の形態の作用について説明する。

まず、細胞取扱部材１０には、複数の細胞Ｃが収容又は導入され、細胞Ｃが空間Ｓ内に保持される。例えば細胞取扱部材１０が細胞収容容器である場合、細胞Ｃは、空間Ｓ内で細胞収容容器の底部１１に一定時間留めるように収容される。あるいは、細胞取扱部材１０がマイクロ流路デバイス等の送液部材である場合、複数の細胞Ｃは、流路を構成する空間Ｓ内で底部１１に沿って移動する。

空間Ｓ内において、細胞Ｃは底部１１上に保持される。細胞Ｃは、直接底部１１上に収容又は導入されても良く、細胞懸濁液に含まれる状態で収容又は導入されても良い。複数の細胞Ｃは底部１１上で広がり、一部の細胞Ｃは、側壁１２のうち、底部１１と側壁１２とが連続している部分１２ｃに達する。このとき細胞Ｃは、側壁１２に細胞接着したり、底部１１から側壁１２へ移動し、意図せず側壁１２を上昇したりすることが考えられる。

これに対して本実施の形態においては、側壁１２のうち、底部１１と側壁１２とが連続している部分１２ｃに凹部２０が形成されている。凹部２０は、側壁１２の外側に向けて湾曲する弧状の断面を有する。これにより、細胞Ｃと側壁１２との接触面積を小さくできる。この結果、底部１１と側壁１２とが連続している部分１２ｃに達した細胞Ｃが、側壁１２に接着することを抑制できる。また、仮に細胞Ｃが側壁１２に接着した場合でも、側壁１２との接着面積が狭いため、細胞Ｃを側壁１２から容易に剥離できる。

また本実施の形態によれば、凹部２０が、側壁１２の外側に向けて湾曲する弧状の断面を有する。この場合、凹部２０の凹部上側内面２４は、凹部底部２３側から上方に向かうにつれて、空間Ｓ側に向けて延びる。凹部上側内面２４は、底部１１から伸展してくる細胞Ｃを底部１１側に戻す「返し」のような役割を果たす。この場合、細胞Ｃが凹部上側内面２４を上昇するためにより多くのエネルギーが必要となる。このため、細胞Ｃが凹部上側内面２４に沿って開口部１３方向へ伸展することが困難になる（図２の矢印参照）。これにより、側壁１２のうち、底部１１と側壁１２とが連続している部分１２ｃに達した細胞Ｃが側壁１２に沿って上昇することを抑制できる。

また本実施の形態によれば、側壁１２が凹部２０を有することにより、側壁１２が撥水性を有する。これにより、細胞取扱部材１０から例えば細胞懸濁液等の液体を排出する際に、凹部２０への液体の侵入を抑制し、液体が側壁１２へ残存することを抑制できる。

また本実施の形態によれば、側壁１２が凹部２０を有することにより、側壁１２の表面積が増加する。これにより、側壁１２の外部との熱のやりとりが活発になり、細胞取扱部材１０の熱伝導性が向上する。

また本実施の形態によれば、凹部２０は、底部１１に沿う方向に延びる。これにより、ピラー構造等と比較して空間Ｓに保持された細胞懸濁液等の液体に流れが生じる場合に、このような流れを妨げることがない。なお、細胞懸濁液等の液体に流れが生じる場合とは、例えば細胞懸濁液等の液体を撹拌したり、液体を送液したりする場合が挙げられる。

また、図７に示すように、例えば細胞取扱部材１０が細胞収容容器である場合、通常、細胞Ｃは底部１１に沈降するか細胞懸濁液等の液体中に浮遊する。細胞Ｃは重力に従い沈降し、底部１１で接着増殖することが考えられる。この際、底部１１と側壁１２とが連続している部分１２ｃに近い細胞Ｃは、接着又は分裂増殖等の過程を経て、側壁１２にも接着進展しようとする。本実施の形態においては、側壁１２が凹部２０を有することにより、細胞接着性を低下させ、側壁１２への細胞Ｃの移動を抑制できる。

また、細胞取扱部材１０が細胞収容容器である場合、細胞取扱部材１０は、シリンジ等、細胞収容容器内で流れが生じ得る容器であっても良い。図８に示すように、細胞取扱部材１０は、細胞懸濁液の送液部材であっても良い。例えば図９に示すように、細胞取扱部材１０がマイクロ流路デバイスである場合、細胞取扱部材１０は、流路５１と、流路５１に連通する開口部５２とを有する。開口部５２には、細胞懸濁液が導入されるか、又は、開口部５２から細胞懸濁液が排出される。流路５１を構成する側壁１２の材料は細胞接着性をもつことが多い。また流路５１内に導入した細胞懸濁液が滞留した場合、細胞Ｃが重力に従って沈降し、底部１１に接着する場合がある。本実施の形態においては、底部１１に接着した細胞Ｃが側壁１２に沿って進展していくことを凹部２０によって抑制できる。これにより、接着した細胞Ｃによって流路５１の断面積が狭められたり、流路５１が閉塞したりすることを抑制できる。

図１０に示すように、細胞取扱部材１０は、細胞懸濁液の撹拌又は振盪を伴う培養容器であっても良い。撹拌又は振盪を伴う培養を行う際、細胞が浮遊した状態で培養されることを期待する場合があるが、細胞懸濁液の流れが不十分な箇所においては、底面へ意図しない細胞接着が発生するおそれがある。本例においては、底部１１に接着した細胞Ｃが側壁１２に沿って進展していくことを凹部２０によって抑制できる。これにより細胞Ｃの培養空間の減少や、接着細胞数の増加を抑制できる。

図１１に示すように、細胞取扱部材１０は、細胞懸濁液の輸送を伴う保管容器であっても良い。細胞懸濁液の輸送や保管においては、底面へ意図しない細胞接着が発生する可能性がある。本例においては、底部１１に接着した細胞Ｃが側壁１２に沿って進展していくことを凹部２０によって抑制できる。これにより、細胞Ｃの回収時の収率の低下を防ぐことができる。また、細胞懸濁液の保管や輸送の際には保管容器を冷蔵又は冷凍することもある。仮に側壁にコーティングを施すことによって側壁への細胞接着性を低減させた場合、温度変化によるコーティング剤の機能の低下や剥離が懸念される。このため、コーティングを用いない本例を好適に利用できる。

［実施例］
次に、本実施の形態における具体的実施例について説明する。

（実施例）
図１に示す細胞取扱部材（実施例）を作製した。この場合、まず基材となるシリコンウエハをＤＲＩＥ法にてエッチングし、底部と側壁とを有する空間を形成した。また、側壁に複数の溝状の凹部を形成した。底部から５μｍの高さまでに形成された凹部の高さの平均値は、１．１６μｍであった。凹部の深さの平均値は、４００ｎｍであった。次に、複数の凹部を形成したウエハ上にＣＣＬ１６３細胞を２．０×１０^５ｃｅｌｌ滴下した。その後、側壁上に天部となるカバーガラスを密着させた。次に、細胞取扱部材（実施例）をインキュベーター内に静置し、細胞を培養した。培養を開始して２４時間後、カバーガラスを取り外し、４％パラホルムアルデヒドを用いて細胞を固定した。固定した細胞をエタノール上昇系列によって脱水し、走査型電子顕微鏡を用いて観察した。この結果、側壁に接着した細胞はほとんど観察されなかった（図１２（ａ）参照）。

（比較例１）
側壁に凹部を形成しなかったこと、以外は、上述した細胞取扱部材（実施例）と同様に、細胞取扱部材（比較例１）を作製した。実施例の場合と同様に細胞を播種したのち側壁が平滑面となる向きに部材を転回させた状態で培養し、培養した細胞を走査型電子顕微鏡を用いて観察した。この結果、側壁に多数の細胞が接着していることが観察された（図１２（ｂ）参照）。

（比較例２）
キュリバイオ社製の微細凹凸培養基材である細胞取扱部材（35mm NanoSurface Dish、比較例２）を準備した。細胞取扱部材（比較例２）において、図１６に示すように、側壁の凹部の断面形状は矩形状であった。なお、側壁の凹部の深さは６００ｎｍであり、側壁の凹部の高さは８００ｎｍであった。実施例の場合と同様に細胞を培養し、培養した細胞を走査型電子顕微鏡を用いて観察した。この結果、側壁に多数の細胞が伸展していることが観察された（図１２（ｃ）参照）。

［変形例］
次に、図１３乃至図１５を参照して、本実施の形態の各変形例について説明する。図１３乃至図１５は、それぞれ本実施の形態の変形例を示す図である。図１３乃至図１５において、図１乃至図１２に示す形態と同一部分には同一の符号を付して詳細な説明は省略する。

（第１変形例）
図１３及び図１４は、細胞取扱部材１０の第１変形例を示している。図１３及び図１４に示す変形例は、凹部２０に隔壁２６が設けられている点が異なるものであり、他の構成は上述した図１乃至図１２に示す実施の形態と略同一である。

図１３及び図１４に示す細胞取扱部材１０において、凹部２０は、側壁１２の外側に向けて湾曲する弧状の断面を有する。また、凹部２０に、側壁１２の高さ方向に延びる隔壁２６が設けられている。隔壁２６は、１つの凹部２０内に複数設けられていても良い。この場合、隔壁２６同士は、凹部２０の長さ方向に間隔を空けて配置されていても良い。また、１つの凹部２０内の隔壁２６と、当該凹部２０に隣接する凹部２０内の隔壁２６とが連続していても良い。

図１４に示すように、凹部２０の長さ方向に沿う断面において、隔壁２６は、２つの隔壁面２６ａを有する。２つの隔壁面２６ａ同士は隔壁頂部２６ｂで接続されている。凹部２０の長さ方向に沿う断面において、隔壁頂部２６ｂの角度は鋭角であっても良い。隔壁２６の幅（凹部２０の長さ方向に沿う長さ）Ｗ１は、３０ｎｍ以上であっても良く、４０ｎｍ以上であっても良い。隔壁２６の幅Ｗ１は、９０ｎｍ以下であっても良く、６０ｎｍ以下であっても良い。また隔壁２６の同士の間隔（凹部２０の長さ方向に沿う長さ）Ｐ１は、２４０ｎｍ以上であっても良く、８００ｎｍ以上であっても良い。隔壁２６の間隔Ｐ１の上限は特に限定されないが、例えば１００００ｎｍ以下であっても良く、１５００ｎｍ以下であっても良い。

このように、凹部２０に隔壁２６が設けられていることにより、側壁１２の表面積が増加する。これにより、側壁１２の外部との熱のやりとりが活発になり、細胞取扱部材１０の熱伝導性が向上する。

（第２変形例）
図１５は、細胞取扱部材１０の第２変形例を示している。図１５に示す変形例は、凹部２０の断面形状が異なるものであり、他の構成は上述した図１乃至図１２に示す実施の形態と略同一である。

図１５に示す細胞取扱部材１０において、凹部２０は、側壁１２の外側に向けて凹む断面を有する。凹部２０は、側壁内面１２ａの高さ方向に沿って複数形成されている。この場合、凹部２０の断面は、連続する複数の線分から構成されている。複数の凹部２０は、全体として断面視でジグザグ形状を有している。

凹部２０は、凹部下側頂部２１と、凹部下側内面２２と、凹部底部２３と、凹部上側内面２４と、凹部上側頂部２５とを有する。凹部下側内面２２は、凹部下側頂部２１から凹部底部２３に向けて延びる。この場合、凹部下側内面２２の断面は、凹部下側頂部２１から凹部底部２３に向かって折れ線状に延びる。なお、これに限らず、凹部下側内面２２の断面は、凹部下側頂部２１から凹部底部２３に向かって一直線状に延びても良い。凹部底部２３の断面は、外側に向けて鋭角的に突出しても良い。凹部上側内面２４は、凹部底部２３から凹部上側頂部２５に向けて延びる。この場合、凹部上側内面２４の断面は、凹部底部２３から側壁１２の内側に向かって折れ線状に延びる。なお、これに限らず、凹部上側内面２４の断面は、凹部底部２３から凹部上側頂部２５に向かって一直線状に延びても良い。凹部上側頂部２５は、空間Ｓ側に向けて鋭角的に突出する。

上記各実施の形態及び各変形例に開示されている複数の構成要素を必要に応じて適宜組合せることも可能である。あるいは、上記各実施の形態及び各変形例に示される全構成要素から幾つかの構成要素を削除してもよい。

１０ 細胞取扱部材
１１ 底部
１１ａ 底部内面
１１ｂ 底部外面
１２ 側壁
１２ａ 側壁内面
１２ｂ 側壁外面
１２ｃ 部分
１３ 開口部
１４ 天部
２０ 凹部
２１ 凹部下側頂部
２２ 凹部下側内面
２３ 凹部底部
２４ 凹部上側内面
２５ 凹部上側頂部
２６ 隔壁
Ｃ 細胞
Ｓ 空間

Claims (11)

1. 底部と、
   前記底部に連続する側壁と、を備え、
   前記底部と前記側壁とにより、細胞を保持する空間が形成され、
   前記側壁のうち、前記底部と前記側壁とが連続している部分に、凹部が形成され、
   前記凹部の高さは、１．０μｍ以上３．０μｍ以下である、細胞取扱部材。
2. 前記凹部は、前記底部に沿う方向に延びる、請求項１に記載の細胞取扱部材。
3. 前記凹部は、前記空間から見て外側に向けて湾曲する弧状の断面を有する、請求項１又は２に記載の細胞取扱部材。
4. 前記凹部の深さは、２００ｎｍ以上４５０ｎｍ以下である、請求項１乃至３のいずれか一項に記載の細胞取扱部材。
5. 前記側壁の高さ方向に複数の前記凹部が形成されている、請求項１乃至４のいずれか一項に記載の細胞取扱部材。
6. 前記凹部は、凹部上側頂部と、凹部底部とを有し、
   前記凹部上側頂部は、前記凹部の最も上側に位置し、
   前記凹部底部は、前記凹部のうち最も深い位置にあり、
   断面において、前記底部の内面に平行かつ前記凹部底部を通過する水平線と、前記凹部底部と前記凹部上側頂部とを結ぶ直線とのなす角は、７５°以下である、請求項１乃至５のいずれか一項に記載の細胞取扱部材。
7. 前記凹部は、凹部下側内面と、凹部底部と、凹部上側内面とを有し、
   前記凹部底部は、前記凹部のうち最も深い位置にあり、
   前記凹部下側内面は、前記凹部底部よりも下側に位置し、
   前記凹部上側内面は、前記凹部底部よりも上側に位置し、
   断面において、前記凹部下側内面又は前記凹部上側内面の接線と、前記底部の内面に平行かつ前記凹部底部を通過する水平線とのなす角のうち前記側壁の外面側に開いた角の角度が０°以上１０５°以下となる領域を、前記底部の外面の垂線に投影したときの投影像が連続しており、かつ前記投影像の高さ方向距離は、４５０ｎｍ以下となる、請求項１乃至６のいずれか一項に記載の細胞取扱部材。
8. 前記凹部は、凹部下側内面と、凹部底部と、凹部上側内面とを有し、
   前記凹部底部は、前記凹部のうち最も深い位置にあり、
   前記凹部下側内面は、前記凹部底部よりも下側に位置し、
   前記凹部上側内面は、前記凹部底部よりも上側に位置し、
   断面において、前記凹部下側内面又は前記凹部上側内面の接線と、前記底部の内面に平行かつ前記凹部底部を通過する水平線とのなす角のうち前記側壁の外面側に開いた角の角度が０°以上１０５°以下となる領域を、前記底部の外面の垂線に投影したときの投影像が連続しており、かつ前記投影像の高さ方向距離は、４５０ｎｍ超であり、
   前記角度が０°以上１０５°以下となる前記領域と、当該領域に隣接しかつ前記角度が０°以上１０５°以下となる他の領域までの高さ方向距離は、４５０ｎｍ超である、請求項１乃至６のいずれか一項に記載の細胞取扱部材。
9. 前記凹部に、前記側壁の高さ方向に延びる隔壁が設けられている、請求項１乃至８のいずれか一項に記載の細胞取扱部材。
10. 細胞収容容器又は送液部材である、請求項１乃至９のいずれか一項に記載の細胞取扱部材。
11. 請求項１乃至１０のいずれか一項に記載の細胞取扱部材の製造方法であって、
    前記底部と前記側壁とを有する基板を準備する工程と、
    前記側壁のうち、前記底部と前記側壁とが連続している部分に、ＤＲＩＥ法により凹部を形成する工程と、を備えた、細胞取扱部材の製造方法。

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