JP2019086375A - 顕微鏡観察用サンプルの作製方法およびサンプル作製キット - Google Patents
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Abstract
【課題】顕微鏡による観察対象物の高精細な観察および撮像が可能なサンプルを容易に作製するとともに、サンプルの作製の自動化を容易にする。【解決手段】少なくとも1つのスフェロイドSを内包しゲル化時または固体化時に略透明である媒質溶液Aの表面に、この媒質溶液Aをゲル化または固体化させる液体Bを霧状、泡状またはその媒質溶液Aよりも小さな体積の液滴状で接触させて、媒質溶液Aをゲル化または固体化させる顕微鏡観察用サンプルの作製方法を提供する。【選択図】図3
Description
本発明は、顕微鏡観察用サンプルの作製方法およびサンプル作製キットに関するものである。
近年、スフェロイドやオルガノイドなど3次元的に培養した細胞凝集塊の顕微鏡観察が注目されている。細胞凝集塊の作製としては、例えばシャーレの蓋の内面に培養液とともに細胞を液滴として分注し、この液滴を反転させてハンギングドロップを形成させ、ハンギングドロップの曲面に沿う方向に、重力の分力による助けを借りてハンギングドロップ内部で細胞凝集を引き起こさせる方法が知られている(例えば、特許文献1参照。)。しかしながら、この方法は、ハンギングドロップの正確なアレイ配列がなされないので、細胞凝集塊の作製の自動化に適さないのは明らかである。
特許文献1の技術を改善し、自動化に適するハンギングドロップを形成可能なマルチウエルプレートの構造が知られている(例えば、特許文献2参照。)。特許文献2に記載のマルチウエルプレートは、分注器から排出される液を受ける窪み部と、ハンギングドロップが形成されて保持されるハンギングドロップ形成区画と、これらに通じる導管との組がアレイ状に配列されて構成されている。特許文献2に記載のマルチウエルプレートは、特許文献1に記載の方法のように液滴を反転させる必要が無く、細胞や培養液等の分注をアレイ配列フォーマットに従ってマルチウエルプレートの上方から行うだけでハンギングドロップを形成可能としたことで、ハンギングドロップでの細胞凝集塊の作製の自動化を容易にしている。しかしながら、特許文献2は、顕微鏡での高精細の観察方法については特許文献1と同様になんら言及していない。
特許文献2の技術を更に発展させ、顕微鏡による精細な観察や撮像を行えるようにした技術が知られている(例えば、特許文献3参照。)。特許文献3に記載の技術は、作製したハンギングドロップ内の細胞凝集塊をハンギングドロップとともに、底面が平面で透明なマルチウエルプレートのウエルに落下させ、細胞凝集塊が発する光をウエルの底面を介して倒立型顕微鏡の対物レンズで集光して観察や撮像を行っている。
しかしながら、特許文献3の技術では、細胞凝集塊がウエルの側面に接するように位置する場合は、ウエルの底面と側面との境界である稜線部分が対物レンズで受光されるべき光束に干渉し、顕微鏡が本来有する光学性能を発揮できない。特にライトシート顕微鏡による観察では、細胞凝集塊に対して側面から励起光を照射するため、細胞凝集塊がウエルの側面に接している部分の観察が非常に困難である。このため、ウエルの底面と細胞凝集塊とが接しないように固定する必要がある。
また、より高精細な観察のため、細胞凝集塊が含まれるハンギングドロップをゲル化し、ハンギングドロップと同等の屈折率を有する液中にハンギングドロップを配置して細胞凝集塊を観察することが望まれているところ、2液以上の溶液を単純に混合させてハンギングドロップをゲル化させる方法では、ハンギングドロップの溶液全体をゲル化させるため、ハンギングドロップ内部の流動性が失われてしまう。また、溶液としてアルギン酸ナトリウムを用いたハンギングドロップに対してピペットによりゲル化液(カルシウムイオンを含む溶液。)を入れる方法では、ピペット先端で溶液が直ちにゲル化してしまうため、ゲル化液をハンギングドロップ全体に撹拌させることが困難という問題がある。さらに、これらの方法では、分注器やロボットを用いた自動化は非常に困難という問題がある。
本発明は上述した事情に鑑みてなされたものであって、顕微鏡による観察対象物の高精細な観察および撮像が可能なサンプルを容易に作製することができるとともに、自動化が容易な顕微鏡観察用サンプルの作製方法およびサンプル作製キットを提供することを目的としている。
上記目的を達成するために、本発明は以下の手段を提供する。
本発明の第1態様は、少なくとも1つの観察対象物を内包しゲル化時または固体化時に略透明である媒質溶液の表面に、該媒質溶液をゲル化または固体化させる液体を霧状、泡状または前記媒質溶液よりも小さな体積の液滴状で接触させて、前記媒質溶液をゲル化または固体化させる顕微鏡観察用サンプルの作製方法である。
本発明の第1態様は、少なくとも1つの観察対象物を内包しゲル化時または固体化時に略透明である媒質溶液の表面に、該媒質溶液をゲル化または固体化させる液体を霧状、泡状または前記媒質溶液よりも小さな体積の液滴状で接触させて、前記媒質溶液をゲル化または固体化させる顕微鏡観察用サンプルの作製方法である。
本態様によれば、霧状、泡状または媒質溶液よりも小さな体積の液滴状の液体が観察対象物を内包した媒質溶液の表面に接触して、媒質溶液がゲル化または固体化することで、略透明な媒質溶液内に観察対象物が収容されたサンプルが作製される。
これにより、このサンプルの観察対象物から発せられる光をゲル状または固体状の媒質溶液の外部で検出し、観察対象物を高精細に観察することができる。また、液体を霧状、泡状または媒質溶液よりも小さな体積の液滴状で媒質溶液の表面に接触させることで、媒質溶液が液体に混ざって散るのを防ぐことができる。そして、観察対象物を内包させた媒質溶液の表面に液体を接触させるだけの簡易な作業なので、サンプルの作製を自動化することができる。したがって、顕微鏡による観察対象物の高精細な観察および撮像が可能なサンプルを容易に作製することができるとともに、サンプルの作製の自動化も容易にすることができる。
上記態様においては、超音波の照射または加圧により前記液体を霧化させることとしてもよい。
このように構成することで、一般的な方法で液体を簡易に霧状にすることができる。
このように構成することで、一般的な方法で液体を簡易に霧状にすることができる。
上記態様においては、前記液体を接触させる前記媒質溶液の表面を露出させて基材により前記媒質溶液を支持させることとしてもよい。
このように構成することで、基材により媒質溶液を安定した姿勢に維持して液体と接触させることができる。
このように構成することで、基材により媒質溶液を安定した姿勢に維持して液体と接触させることができる。
上記態様においては、前記基材が、棒状、カップ状、ウエル状、リング状、綿棒状、平坦もしくは表面に凹凸を有する板状、スポンジ状、または、多孔質状の形態を有することとしてもよい。
上記態様においては、前記基材により該基材の表面に前記観察対象物を内包した前記媒質溶液を水滴状に付着させた状態に支持させることとしてもよい。
このように構成することで、簡易な形状の基材を用いて、表面張力を利用して媒質溶液を維持することができる。
このように構成することで、簡易な形状の基材を用いて、表面張力を利用して媒質溶液を維持することができる。
上記態様においては、前記基材により前記観察対象物を内包した前記媒質溶液の液滴を吊り下げた状態に支持させることとしてもよい。
このように構成することで、媒質溶液の液滴をウエル等から離間させた状態に維持しつつ、重力によって媒質溶液の液滴内で観察対象物の位置を安定させることができる。
このように構成することで、媒質溶液の液滴をウエル等から離間させた状態に維持しつつ、重力によって媒質溶液の液滴内で観察対象物の位置を安定させることができる。
上記態様においては、前記観察対象物が、細胞、細胞凝集塊、細胞組織、スフェロイドまたはオルガノイドからなる生物由来材料であってもよいし、前記観察対象物が、蛍光、発光、りん光または色素を有する非生物由来材料であってもよい
上記態様においては、前記媒質溶液に内包させた前記生物由来材料が観察のための形態になるまで待機した後に、前記媒質溶液をゲル化または固体化させることとしてもよい。
このように構成することで、観察に適した形態になった生物由来材料を観察対象物として観察することができる。
このように構成することで、観察に適した形態になった生物由来材料を観察対象物として観察することができる。
上記態様においては、前記媒質溶液が、アルギン酸ナトリウムを含み前記生物由来材料を育成可能な培地であり、前記液体が、2価金属イオンを含む水溶液であることとしてもよい。
このように構成することで、安価で入手し易い媒質溶液を用いて、容易にゲル化または固体化させるとともに、生物由来材料を育成しながら観察することができる。また、育成させた生物由来材料を移し替える必要がなく、スループットを向上して、安価にスクリーニングを行うことができる。
このように構成することで、安価で入手し易い媒質溶液を用いて、容易にゲル化または固体化させるとともに、生物由来材料を育成しながら観察することができる。また、育成させた生物由来材料を移し替える必要がなく、スループットを向上して、安価にスクリーニングを行うことができる。
上記態様においては、前記媒質溶液を前記観察対象物の周辺近傍までゲル化または固体化させることとしてもよい。
このように構成することで、ゲル化または固体化した略透明な媒質溶液内で観察対象物の位置が固定されたサンプルを作製することができる。
このように構成することで、ゲル化または固体化した略透明な媒質溶液内で観察対象物の位置が固定されたサンプルを作製することができる。
上記態様においては、前記媒質溶液の前記液体が接触する露出した表面のみをゲル化または固体化させることとしてもよい。
このように構成することで、観察対象物を内包した媒質溶液がこぼれたり乾燥したりするのを防ぐことができる。
このように構成することで、観察対象物を内包した媒質溶液がこぼれたり乾燥したりするのを防ぐことができる。
本発明の第2態様は、媒質溶液を観察対象物を内包させた状態で支持する基材と、該基材により支持されている前記媒質溶液の表面に、該媒質溶液をゲル化または固体化させる液体を霧状、泡状または前記媒質溶液よりも小さな体積の液滴状で接触させる液体接触手段とを備えるサンプル作製キットである。
本態様によれば、観察対象物を内包させた媒質溶液を基材により支持して、液体接触手段によりその表面に霧状、泡状または媒質溶液よりも小さな体積の液滴状の液体を接触させるだけで、媒質溶液を容易かつ確実にゲル化または固体化させて、略透明な媒質溶液内に観察対象物が収容されたサンプルを作製することができる。したがって、顕微鏡による観察対象物の高精細な観察および撮像が可能なサンプルを容易に作製することができるとともに、サンプルの作製の自動化も容易にすることができる。
本発明に係る顕微鏡観察用サンプルの作製方法およびサンプル作製キットによれば、顕微鏡による観察対象物の高精細な観察および撮像が可能なサンプルを容易に作製することができるとともに、サンプルの作製の自動化を容易にすることができるという効果を奏する。
本発明の一実施形態に係る顕微鏡観察用サンプルの作製方法およびサンプル作製キットについて、図面を参照して以下に説明する。
本実施形態に係る顕微鏡観察用サンプルの作製方法は、図1のフローチャート、図2および図3に示すように、ゲル化時または固体化時に透明な媒質溶液Aの液滴に少なくとも1つのスフェロイド(観察対象物、生物由来材料)Sを内包させて、媒質溶液Aの液滴が吊り下げられた状態からなるハンギングドロップDを形成するステップS1と、ハンギングドロップDの表面に媒質溶液Aをゲル化または固体化させる液体Bを霧状で接触させて、化学反応によりハンギングドロップDをゲル化または固体化させるステップS2とを含んでいる。
本実施形態に係る顕微鏡観察用サンプルの作製方法は、図1のフローチャート、図2および図3に示すように、ゲル化時または固体化時に透明な媒質溶液Aの液滴に少なくとも1つのスフェロイド(観察対象物、生物由来材料)Sを内包させて、媒質溶液Aの液滴が吊り下げられた状態からなるハンギングドロップDを形成するステップS1と、ハンギングドロップDの表面に媒質溶液Aをゲル化または固体化させる液体Bを霧状で接触させて、化学反応によりハンギングドロップDをゲル化または固体化させるステップS2とを含んでいる。
この顕微鏡観察用サンプルの作製方法は、例えば、図4に示すように、ハンギングドロップDを形成して支持するハンギングドロップ形成器具(基材)1と、ハンギングドロップ形成器具1を支持する支持具9と、液体Bを貯留する容器11と、ハンギングドロップDに液体Bを接触させる超音波霧化装置(液体接触手段)13とを備えるゲル化装置15を用いて行うようになっている。これらハンギングドロップ形成器具1および超音波霧化装置13により、サンプルを作製するためのサンプル作製キット17が構成される。
ハンギングドロップ形成器具1は、図2および図3に示すように、媒質溶液Aが注入される窪み部3と、窪み部3に注入された媒質溶液Aの液滴をスフェロイドSを内包させつつ吊り下げた状態に支持するハンギングドロップ形成区画5と、これら窪み部3とハンギングドロップ形成区画5とを繋ぐ細い導管7とを備えている。
窪み部3は、導管7とは反対側に開口する開口部3aを有し、開口部3aからテーパ状に細くなって導管7に繋がる略円錐形状を有している。
ハンギングドロップ形成区画5は、導管7から次第に径方向外方に拡がる略円錐形状を有している。このハンギングドロップ形成区画5は、媒質溶液Aの液滴をその下部の表面を露出させて支持するようになっている。
導管7は、窪み部3からハンギングドロップ形成区画5に貫通する貫通孔7aを有している。
ハンギングドロップ形成区画5は、導管7から次第に径方向外方に拡がる略円錐形状を有している。このハンギングドロップ形成区画5は、媒質溶液Aの液滴をその下部の表面を露出させて支持するようになっている。
導管7は、窪み部3からハンギングドロップ形成区画5に貫通する貫通孔7aを有している。
このハンギングドロップ形成器具1は、支持具9により、窪み部3が鉛直方向上方でハンギングドロップ形成区画5が鉛直方向下方となる向きで支持されて、容器11内で液体Bのやや上方に配置されるようになっている。以下、鉛直方向をZ方向とし、Z方向に直交しかつ互いに直交する方向をX方向およびY方向とする。
支持具9は、ハンギングドロップ形成器具1を把持する器具ばさみ19と、鉛直方向に沿って延びるスタンド21と、スタンド21から鉛直方向に交差する方向に延び器具ばさみ19を把持するクランプ23とを備えている。
超音波霧化装置13は、容器11の液体B内に配置されており、超音波を発生して液体Bを微細な霧状にし、発生した霧状の液体Bを容器11内に充満させることができるようになっている。
超音波霧化装置13は、容器11の液体B内に配置されており、超音波を発生して液体Bを微細な霧状にし、発生した霧状の液体Bを容器11内に充満させることができるようになっている。
媒質溶液Aとしては、例えば、アルギン酸ナトリウムを含む生物由来材料を育成可能な培地が用いられる。媒質溶液Aはゲル化時に透明である。アルギン酸塩であればナトリウム塩に限られない。また、アルギン酸ナトリウムは重量%で0.5%以上が好ましいが、これに限定されるものではない。この媒質溶液Aは比重が1であり、スフェロイドSの比重よりも小さい。
液体Bとしては、例えば、2価の金属イオン(カルシウム、マグネシウム、ストロンチウム等)を含む水溶液である塩化カルシウム水溶液等が用いられる。塩化カルシウムはモル濃度で100mM以上が好ましいが、これに限定されるものではない。
このように構成された顕微鏡観察用サンプルの作製方法およびサンプル作製キット17の作用について説明する。
本実施形態に係る作製方法およびサンプル作製キット17により顕微鏡観察用サンプルを作製するには、まず、ハンギングドロップ形成器具1の窪み部3に上方から媒質溶液Aを分注する。窪み部3に分注された媒質溶液Aは、重力によって導管7の貫通孔7aを通って下方に移動し、ハンギングドロップ形成区画5により液滴が吊り下げられた状態に支持される。
本実施形態に係る作製方法およびサンプル作製キット17により顕微鏡観察用サンプルを作製するには、まず、ハンギングドロップ形成器具1の窪み部3に上方から媒質溶液Aを分注する。窪み部3に分注された媒質溶液Aは、重力によって導管7の貫通孔7aを通って下方に移動し、ハンギングドロップ形成区画5により液滴が吊り下げられた状態に支持される。
そして、ハンギングドロップ形成区画5により吊り下げられた状態に支持されている媒質溶液Aの液滴の下部からその液滴内にスフェロイドSを挿入する。これにより、図2に示すように、スフェロイドSを内包して、媒質溶液Aの液滴が吊り下げられた状態からなるハンギングドロップDが形成される(ステップS1)。
ハンギングドロップDを構成する媒質溶液AはスフェロイドSよりも比重が小さいので、スフェロイドSは、重力によりハンギングドロップDの界面に沿って移動してハンギングドロップDの最下点近傍に落ち着く。したがって、窪み部3に分注する媒質溶液Aの量を決めておくことにより、液滴内でのスフェロイドSのX,Y方向の位置だけでなくZ方向の位置も一定にすることができる。また、ハンギングドロップ形成器具1を用いることで、ハンギングドロップDを形成するために媒質溶液Aの液滴を反転させる必要もない。
次に、図4に示すように、ハンギングドロップDを形成したハンギングドロップ形成器具1を支持具9により支持して容器11内の液体Bの上方に配置し、超音波霧化装置13を作動させて液体Bを霧化させる。そして、容器11内に霧状の液体Bを充満させて、図3に示すように、ハンギングドロップDの表面に液体Bを霧状で接触させる。
そのまま霧状の液体B内にハンギングドロップDを30分静置させ、ハンギングドロップDの露出する下部の表面から内部に液体Bを浸透させて、スフェロイドSの周辺近傍までハンギングドロップDをゲル化させる(ステップS2)。これにより、例えば、図5(a)〜(d)に示すように、略透明なハンギングドロップD内でスフェロイドSが最下部の位置に固定されたサンプルが作製される。
以上説明したように、本実施形態に係る顕微鏡観察用サンプルの作製方法およびサンプル作製キット17によれば、スフェロイドSを内包させた媒質溶液Aの液滴をハンギングドロップ形成器具1により支持して、超音波霧化装置13によりその液滴の表面に霧状の液体Bを接触させるだけで、媒質溶液Aの液滴を容易かつ確実にゲル化させて、略透明な液滴内にスフェロイドSが収容されたサンプルを作製することができる。
そして、このサンプルのスフェロイドSから発せられる光をその液滴の外部で検出し、スフェロイドSを高精細に観察することができる。また、例えば、媒質溶液Aの液滴を液体Bの溶液内に浸漬させると、媒質溶液Aの液滴が液体Bに混ざって散ってしまうが、液体Bを霧状で媒質溶液Aの液滴の表面に接触させることで、媒質溶液Aの液滴が液体Bに混ざって散るのを防ぎ、ハンギングドロップDの形状を維持したまま媒質溶液Aの液滴をゲル化させることができる。また、スフェロイドSを内包させた媒質溶液Aの液滴の表面に液体Bを接触させるだけの簡易な作業なので、サンプルの作製を自動化することができる。したがって、顕微鏡によるスフェロイドSの高精細な観察および撮像が可能なサンプルを容易に作製することができるとともに、サンプルの作製の自動化も容易にすることができる。
なお、ゲル化されたハンギングドロップDに内包されているスフェロイドSの観察は、例えば、ライトシート顕微鏡(図示略)により行うことができる。この場合、図6に示すように、鉛直方向に直交する平面に沿う平面状に集光させた励起光をハンギングドロップDの側方から入射させてスフェロイドSに照射することとすればよい。そして、スフェロイドSにおいて発生した蛍光の内、ハンギングドロップDの下部から鉛直方向下方に放射される蛍光を対物レンズ(図示略)により集光して検出することとすればよい。ここで、スフェロイドSにおける励起光の焦点位置と検出光軸とを一致させるとともに、励起光の入射平面に対物レンズの焦点面を一致させることにより、対物レンズの焦点面に沿う広い範囲において発生する蛍光を対物レンズにより1度に集光して、スフェロイドSにおける観察部位の鮮明な蛍光画像を容易に取得することができる。
本実施形態においては、基材として、窪み部3、ハンギングドロップ形成区画5および導管7の組が1つからなる単体のハンギングドロップ形成器具1を例示して説明したが、これら窪み部3、ハンギングドロップ形成区画5および導管7の組がアレイ状に配列されて構成されるマルチウエルプレートを採用することとしてもよい。このようなマルチウエルプレートを採用することにより、自動分注が容易であり、スクリーニングを目的とした大量のスフェロイドSの撮像を高スループットで行うことができる。
また、本実施形態においては、例えば、媒質溶液Aの液滴に生物由来材料である細胞(図示略)を内包させて、ハンギングドロップD内でその細胞が観察のための形態になるまで待機した後に、媒質溶液Aの液滴をゲル化または固体化させることとしてもよい。
この場合、例えば、ステップS1により、媒質溶液Aの液滴に少なくとも1つの細胞を内包させてハンギングドロップDを形成した後、媒質溶液Aの液滴内で細胞を培養させてスフェロイドSが形成させ、その後、ステップS2により、ハンギングドロップDの表面に液体Bを霧状で接触させて、ハンギングドロップDをゲル化または固体化させることとしてもよい。
このようにすることで、観察に適した形態になったスフェロイドSを観察対象物として観察することができる。また、ハンギングドロップD内で細胞Sを培養してスフェロイドSを形成することで、スフェロイドSを移し替える必要がなく、スループットを向上して、安価にスクリーニングを行うことができる。
また、本実施形態においては、液体接触手段として、超音波霧化装置13を例示して説明したが、液体Bを霧化できるものであればよく、例えば、超音波や加圧により液体Bを霧化させるネブライザー装置等、これに限定されるものではない。また、液体Bを霧化させることに代えて、例えば、液体Bを泡状やスプレーのように媒質溶液Aの液滴よりも小さな体積の液滴状にして媒質溶液Aの液滴の表面に接触させることとしてもよい。この場合、例えば、液体接触手段として、スプレー装置、スパッタリング装置またはポンプ等を採用することとしてもよい。
また、本実施形態においては、観察対象物として、スフェロイドSを例示して説明したが、これに代えて、例えば、細胞、細胞凝集塊、細胞組織またはオルガノイド等からなる生物由来材料を採用してもよい。細胞としては、例えば、ヒト、マウス、ラット、イヌ、サル、ウサギ、ヤギ、ウシ、ウマ、ブタ、ネコなど脊椎動物由来の細胞、ショウジョウバエ、カイコなど無脊椎動物由来の細胞、酵母、大腸菌など菌類、ES細胞やiPS細胞などの多能性幹細胞、間葉系幹細胞、脂肪幹細胞、造血幹細胞、神経幹細胞、肝幹細胞、筋幹細胞等の幹細胞などが挙げられる。また、観察対象物として、蛍光、発光、りん光または色素を有する非生物由来材料を採用してもよい。
また、本実施形態においては、基材として、ハンギングドロップ形成器具1を例示して説明したが、液体Bを接触させる媒質溶液Aの表面を露出させてハンギングドロップDを支持することができるものであればよく、例えば、棒状、カップ状、ウエル状、リング状、綿棒状、平坦もしくは表面に凹凸を有する板状、スポンジ状、または、多孔質状の形態を有するものであってもよい。特に、媒質溶液Aを付着させて支持し易いよう表面加工されているものが好ましい。
また、基材は、例えば、ガラス等を含む無機物質、または、合成ゴム、ジメチルシロキサン、シリコーン樹脂、天然ゴム、フッ素化ポリマー、ポリウレタン、ポリエチレン、ポリエチレンテレフタレート、ポリ塩化ビニル、リオレフィンポリカーボネート、ポリスチレン、ポリジメチルシロキサン、ポリシロキサン系ポリマー、ポリメチルアクリレート、ポリメチルハイドロゲンシロキサン、ポリメチルメタクリレート、メチルハイドロジェンシロキサンなど類似物質、誘導体、フレンドなどを含む有機物質によって製作されるものとすればよい。これらの原料を単一もしくは複数使用して作製されるものでもよい。
本実施形態は以下のように変形することができる。
第1変形例としては、例えば、図7(a)〜(c)に示すように、基材として、容積が小さいウエル状の形態を有する容器、例えばマイクロウエル25を採用することとしてもよい。この場合、ハンギングドロップDを形成するステップS1に代えて、図7(a)に示すように、マイクロウエル25にスフェロイドSと一定量の媒質溶液Aを注ぎ、マイクロウエル25の開口から媒質溶液Aの表面を露出させることとすればよい。
第1変形例としては、例えば、図7(a)〜(c)に示すように、基材として、容積が小さいウエル状の形態を有する容器、例えばマイクロウエル25を採用することとしてもよい。この場合、ハンギングドロップDを形成するステップS1に代えて、図7(a)に示すように、マイクロウエル25にスフェロイドSと一定量の媒質溶液Aを注ぎ、マイクロウエル25の開口から媒質溶液Aの表面を露出させることとすればよい。
次いで、ハンギングドロップDをゲル化または固体化させるステップS2に代えて、図7(b)に示すように、マイクロウエル25内の媒質溶液Aに霧状の液体Bを吹き付け、媒質溶液Aの露出している表面に液体Bを霧状で接触させて、図7(c)に示すように、露出している媒質溶液Aの表面をゲル化させることとすればよい。このようにすることで、マイクロウエル25内の媒質溶液Aの液こぼれや乾燥を防止することができる。
第2変形例としては、例えば、図8(a)〜(c)に示すように、基材として、平坦もしくは表面に凹凸を有する板状のスライドグラス(疎水性コートが望ましい。)27を採用することとしてもよい。この場合、ステップS1に代えて、図8(a)に示すように、スライドグラス27の一表面に媒質溶液Aを滴下して水滴状に付着させ、その水滴にスフェロイドSを内包させるとともに水滴の表面を露出させることとすればよい。
次いで、ステップS2に代えて、図8(b)に示すように、スライドグラス27上の媒質溶液Aに霧状の液体Bを吹き付け、媒質溶液Aの露出している表面に液体Bを霧状で接触させて、図8(c)に示すように、露出している媒質溶液Aの表面をゲル化させることとすればよい。このようにすることで、スライドグラス27上に付着させた媒質溶液Aの水滴の液こぼれや乾燥を防止することができる。
本変形例においては、スライドグラス27の上面に媒質溶液Aを水滴状に付着させた状態でゲル化させることとしたが、これに代えて、媒質溶液Aを水滴状に付着させたスライドグラス27をひっくり返し、スライドグラス27の下面にスフェロイドSを内包しつつ付着した状態の媒質溶液Aの水滴に液体Bを霧状で接触させてゲル化させることとしてもよい。
また、本変形例においては、例えば、図9(a)に示すように、媒質溶液Aを含むシート状の生体サンプル(観察対象物)S´をスライドグラス27上に配置し、図9(b)に示すように、スライドグラス27上の生体サンプルS´に霧状の液体Bを吹き付けることとしてもよい。このようにすることで、図9(c)に示すように、シート状の生体サンプルS´の表面をゲル化させ、スライドグラス27に生体サンプルS´を固定することができる。
第3変形例としては、例えば、図10(a)〜(c)に示すように、基材として、スポンジ状または多孔質状の形態を有するものやコラーゲンゲルで作製したものを採用することとしてもよい。この場合、ステップS1に代えて、図10(a)に示すように、細胞培養用スポンジ(基材)29に細胞(観察対象物、図示略。)を含んだ媒質溶液Aを染み込ませることとしてもよい。
次いで、ステップS2に代えて、図10(b)に示すように、細胞培養用スポンジ29に霧状の液体Bを吹き付けて、細胞培養用スポンジ29内の媒質溶液Aの表面に液体Bを霧状で接触させることとしてもよい。このようにすることで、図10(c)に示すように、細胞培養用スポンジ29に染み込んでいる媒質溶液Aをゲル化させ、細胞培養用スポンジ29内に細胞を固定することができる。
以上、本発明の実施形態について図面を参照して詳述してきたが、具体的な構成はこの実施形態に限られるものではなく、本発明の要旨を逸脱しない範囲の設計変更等も含まれる。例えば、本発明を上記実施形態および変形例に適用したものに限定されることなく、これらの実施形態および変形例を適宜組み合わせた実施形態に適用してもよく、特に限定されるものではない。
また、例えば、上記実施形態およびその変形例においては、媒質溶液Aとしてアルギン酸ナトリウムを含む水溶液を採用し、液体Bとして2価の金属イオンを含む水溶液を例示して説明したが、媒質溶液A,液体Bとしてそれぞれ他の水溶液を採用し、その媒質溶液Aの表面に液体Bを接触させることで観察および測定に適した粘弾性を与えることができればよく、これに限定されるものではない。例えば、媒質溶液Aの表面に媒質溶液Aをゲル化または固体化する液体Bを霧状、泡状または媒質溶液よりも小さな体積の液滴状で接触させて、媒質溶液Aをゲル化または固体化させることとしてもよい。
1 ハンギングドロップ形成器具(基材)
13 超音波霧化装置(液体接触手段)
17 サンプル作製キット
25 マイクロウエル(基材)
27 スライドグラス(基材)
29 細胞培養用スポンジ(基材)
A 媒質溶液
B 液体
S スフェロイド(観察対象物)
S´ 細胞(観察対象物)
13 超音波霧化装置(液体接触手段)
17 サンプル作製キット
25 マイクロウエル(基材)
27 スライドグラス(基材)
29 細胞培養用スポンジ(基材)
A 媒質溶液
B 液体
S スフェロイド(観察対象物)
S´ 細胞(観察対象物)
Claims (13)
- 少なくとも1つの観察対象物を内包しゲル化時または固体化時に略透明である媒質溶液の表面に、該媒質溶液をゲル化または固体化させる液体を霧状、泡状または前記媒質溶液よりも小さな体積の液滴状で接触させて、前記媒質溶液をゲル化または固体化させる顕微鏡観察用サンプルの作製方法。
- 超音波の照射または加圧により前記液体を霧化させる請求項1に記載の顕微鏡観察用サンプルの作製方法。
- 前記液体を接触させる前記媒質溶液の表面を露出させて基材により前記媒質溶液を支持させる請求項1または請求項2に記載の顕微鏡観察用サンプルの作製方法。
- 前記基材が、棒状、カップ状、ウエル状、リング状、綿棒状、平坦もしくは表面に凹凸を有する板状、スポンジ状、または、多孔質状の形態を有する請求項3に記載の顕微鏡観察用サンプルの作製方法。
- 前記基材により該基材の表面に前記観察対象物を内包した前記媒質溶液を水滴状に付着させた状態に支持させる請求項3に記載の顕微鏡観察用サンプルの作製方法。
- 前記基材により前記観察対象物を内包した前記媒質溶液の液滴を吊り下げた状態に支持させる請求項3に記載の顕微鏡観察用サンプルの作製方法。
- 前記観察対象物が、細胞、細胞凝集塊、細胞組織、スフェロイドまたはオルガノイドからなる生物由来材料である請求項1から請求項6のいずれかに記載の顕微鏡観察用サンプルの作製方法。
- 前記観察対象物が、蛍光、発光、りん光または色素を有する非生物由来材料である請求項1から請求項6のいずれかに記載の顕微鏡観察用サンプルの作製方法。
- 前記媒質溶液に内包させた前記生物由来材料が観察のための形態になるまで待機した後に、前記媒質溶液をゲル化または固体化させる請求項7に記載の顕微鏡観察用サンプルの作製方法。
- 前記媒質溶液が、アルギン酸ナトリウムを含み前記生物由来材料を育成可能な培地であり、
前記液体が、2価金属イオンを含む水溶液である請求項7または請求項9に記載の顕微鏡観察用サンプルの作製方法。 - 前記媒質溶液を前記観察対象物の周辺近傍までゲル化または固体化させる請求項1から請求項9のいずれかに記載の顕微鏡観察用サンプルの作製方法。
- 前記媒質溶液の前記液体が接触する露出した表面のみをゲル化または固体化させる請求項1から請求項9のいずれかに記載の顕微鏡観察用サンプルの作製方法。
- 媒質溶液を観察対象物を内包させた状態で支持する基材と、
該基材により支持されている前記媒質溶液の表面に、該媒質溶液をゲル化または固体化させる液体を霧状、泡状または前記媒質溶液よりも小さな体積の液滴状で接触させる液体接触手段とを備えるサンプル作製キット。
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2018
- 2018-10-24 EP EP18202295.4A patent/EP3480300A1/en not_active Withdrawn
- 2018-10-31 US US16/176,976 patent/US20190136180A1/en not_active Abandoned
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2021192083A1 (ja) * | 2020-03-25 | 2021-09-30 | オリンパス株式会社 | 観察用サンプル、観察用サンプルの作製方法およびサンプル作製システム |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
US20190136180A1 (en) | 2019-05-09 |
EP3480300A1 (en) | 2019-05-08 |
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