JP2019090892A - 試料観察方法および試料ホルダ - Google Patents

Abstract

【課題】顕微鏡が本来有する光学性能を最大限発揮でき、顕微鏡による細胞凝集塊の高精細な観察および撮像が可能であるとともに、観察の自動化を容易にする。【解決手段】少なくとも１つの細胞凝集塊Ｓを内包したゲル状の透明なハンギングドロップＤとウエル３の透明な底部３ａとを接触させ、その接触領域が顕微鏡の対物レンズ９の有効光束が通過する大きさになるまで、ハンギングドロップＤと底部３ａとの間に相対的に近接する方向に押圧力を作用させた状態で、細胞凝集塊Ｓからの光をウエル３を介して対物レンズ９により集光して細胞凝集塊Ｓを観察する試料観察方法を提供する。【選択図】図２

Description

本発明は、試料観察方法および試料ホルダに関するものである。

近年、細胞凝集塊のような３次元培養細胞の顕微鏡画像データを得、画像解析技術を用いてスクリーニングを行い、薬効を評価する方法が注目されている。細胞凝集塊の作製方法としては、例えば、シャーレの蓋の内面に培養液とともに細胞を液滴として分注し、この液滴を反転させてハンギングドロップを形成させ、ハンギングドロップの曲面に沿う方向に、重力の分力による助けを借りてハンギングドロップ内部で細胞凝集を引き起こさせる方法が知られている（例えば、特許文献１参照。）。しかしながら、この方法は、ハンギングドロップの正確なアレイ配列がなされないので、細胞凝集塊の作製の自動化に適さないのは明らかである。

特許文献１のこの点を改善し、自動化に適するハンギングドロップを形成可能なマルチウエルプレートの構造が知られている（例えば、特許文献２参照。）。特許文献２に記載のマルチウエルプレートは、分注器から排出される液を受ける窪み部と、ハンギングドロップが形成されて保持されるハンギングドロップ形成区画と、これらに通じる導管との組がアレイ状に配列されて構成されている。特許文献２に記載のマルチウエルプレートは、特許文献１に記載の方法のように液滴を反転させる必要が無く、細胞や培養液等の分注をアレイ配列フォーマットに従ってマルチウエルプレートの上方から行うだけでハンギングドロップを形成可能としたことで、ハンギングドロップでの細胞凝集塊の作製の自動化を容易にしている。しかしながら、特許文献２は、顕微鏡での高精細の観察方法については特許文献１と同様になんら言及していない。

また、ハンギングドロップの形状は曲面からなるため、顕微鏡により観察しようとすると、ハンギングドロップと対物レンズとの間に介在する物質（例えば、ドライ対物の場合は空気。）とハンギングドロップとの屈折率差によりハンギングドロップの曲面形状がレンズとして働いてしまい、光学的な収差が生じるために高精細な観察像を得ることができない。特許文献１および特許文献２はこの点に対する解決策についてなんら言及していない。

屈折率差による観察への悪影響は、特にハンギングドロップと対物レンズとの間に介在する物質が空気の場合に顕著に現れる。そのため、ハンギングドロップをゲル化させ、これを液に浸漬させて観察することにより、屈折率差を小さくして収差の発生を改善することも考えられるが、液とハンギングドロップゲルとの屈折率も厳密には異なるので、顕微鏡が本来有する光学性能を得ることはできない。

特許文献２の技術を更に発展させ、顕微鏡による精細な観察や撮像と観察の自動化を図る技術が知られている（例えば、特許文献３参照。）。特許文献３に記載の技術は、作製したハンギングドロップ内の細胞凝集塊をハンギングドロップとともに、底面が平面なマルチウエルプレートのウエルに落下させ、細胞凝集塊が発する光をウエルの底面を介して倒立型顕微鏡の対物レンズで集光して観察や撮像を行っている。このウエルには工夫が施されており、ウエルの横断面が下方に向かって徐々に狭められ、ウエルの底面の大きさが細胞凝集塊（例えば、１００〜５００μｍ。）よりもやや大きい、例えば直径１ｍｍ程度の形状を有するようにすることで、底面に落下した細胞凝集塊のＸＹ位置（鉛直方向に交差する方向の位置）をほぼ定めることができるようになっている。これにより、観察の自動化を図るとともに、ハンギングドロップの曲面で生じる収差の影響を低減している。

独国特許発明第１０３６２００２号明細書 特許第５４９０８０３号公報 国際公開第２０１７／００１６８０号

しかしながら、特許文献３の技術では、細胞凝集塊が常にウエルの底面の中央に位置するとは限らず、細胞凝集塊がウエルの側面に接するように位置する場合は、ウエルの底面と側面との境界である稜線部分が本来対物レンズにより受光されるべき光速に干渉し、顕微鏡が本来有する光学性能を発揮できないという問題がある。この問題は、検出系だけでなく、対物レンズを介して照明を行う反射照明または反射蛍光照明や共焦点顕微鏡の場合にも生じる。また、特許文献３に記載の技術は、ハンギングドロップを落下させるために、液を加えるステップが必要になる。これは、マルチウエルプレートの全ウエルに対して行わねばならず、時間がかかり、スループットを低下させる原因となる。

本発明は上述した事情に鑑みてなされたものであって、顕微鏡が本来有する光学性能を最大限発揮でき、顕微鏡による細胞凝集塊の高精細な観察および撮像が可能であるとともに、観察の自動化が容易な試料観察方法および試料ホルダを提供することを目的としている。

上記目的を達成するために、本発明は以下の手段を提供する。
本発明の第１態様は、少なくとも１つの観察対象物を内包したゲル状の透明な試料と基板の透明な平面部とを接触させ、その接触領域が顕微鏡の対物レンズの有効光束が通過する大きさになるまで、前記試料と前記平面部との間に相対的に近接する方向に押圧力を作用させた状態で、前記観察対象物からの光を前記基板を介して前記対物レンズにより集光して前記観察対象物を観察する試料観察方法である。

本態様によれば、試料と基板の平面部とを接触させて、その接触領域が顕微鏡の対物レンズの有効光束が通過する大きさになった状態に維持することで、試料内の観察対象物から発せられる光が外部の空気や液体を介することなく試料から基板の平面部を直接透過して、対物レンズにより集光される。

これにより、試料から対物レンズまでの光路の屈折率差を低減し、試料が曲面形状を有する場合であっても試料がレンズとして作用するのを防ぎ、光学的な収差が生じるのを抑制することができる。また、観察対象物を内包するゲル状の試料と基板の平面部とを接触させた状態に維持するだけの簡易な作業なので、試料の観察を自動化することができる。したがって、顕微鏡が本来有する光学性能を最大限発揮でき、顕微鏡による観察対象物の高精細な観察および撮像が可能であるとともに、観察の自動化を容易にすることができる。

本発明の第２態様は、少なくとも１つの観察対象物を内包したゲル状の透明な試料と顕微鏡の対物レンズとを接触させ、その接触領域が前記対物レンズの有効光束が通過する大きさになるまで、前記試料と前記対物レンズとの間に相対的に近接する方向に押圧力を作用させた状態で、前記観察対象物からの光を前記対物レンズにより集光して前記観察対象物を観察する試料観察方法である。

本態様によれば、試料と対物レンズとを接触させて、その接触領域が対物レンズの有効光束が通過する大きさになった状態に維持することで、試料内の観察対象物から発せられる光が外部の空気や液体を介することなく試料から対物レンズに直接入射して集光される。

これにより、試料から対物レンズまでの光路の屈折率差を低減し、試料が曲面形状を有する場合であっても試料がレンズとして作用するのを防ぎ、光学的な収差が生じるのを抑制することができる。また、観察対象物を内包するゲル状の試料と対物レンズとを接触させた状態に維持するだけの簡易な作業なので、試料の観察を自動化することができる。したがって、顕微鏡が本来有する光学性能を最大限発揮でき、顕微鏡による観察対象物の高精細な観察および撮像が可能であるとともに、観察の自動化を容易にすることができる。

上記第１態様においては、基材により前記試料を前記平面部に接触させた状態に支持することとしてもよい。
このように構成することで、基材により、試料を安定した姿勢で基板に接触させた状態を維持することができる。

上記第１態様においては、前記試料を前記基板上に落下させて前記平面部に接触させることとしてもよい。
このように構成することで、試料の自重によって基板との接触領域を形成させることができる。

この場合において、前記試料を基材により支持した状態から該基材を振動させることにより前記試料を落下させることとしてもよい。
このように構成することで、基材により支持した試料を簡易な方法で基板上に落下させることができる。

上記第１態様においては、前記基板が内部に液体を貯留可能な形態を有し、該基板の内部に貯留されている前記液体に前記試料の少なくとも一部を浸漬させた状態で該試料と前記平面部とを接触させることとしてもよい。
このように構成することで、観察中に試料が乾燥するのを抑制することができる。

この場合においては、前記液体が、前記試料を透明にする透明化溶液であってもよい。
このように構成することで、試料に内包されている観察対象物を観察し易くすることができる。

上記各態様においては、重力により前記押圧力を生じさせることとしてもよい。
このように構成することで、試料と基板または対物レンズとの接触領域を形成させるための部材が不要となり、構成を簡略化することができる。ゲル状の試料が十分に柔軟性を有する場合に有効である。

上記各態様においては、前記顕微鏡が倒立型顕微鏡であってもよい。
上記態様においては、前記対物レンズが液浸対物レンズであってもよい。
液浸対物レンズを採用することにより、より高解像の観察画像を得ることができる。

上記各態様においては、前記試料が、ゲル状態で透明な液滴を前記観察対象物を内包させた状態でゲル化させてなることとしてもよい。
上記各態様においては、前記試料が、前記液滴を吊り下げた状態からなるハンギングドロップをゲル化させてなることとしてもよい。

このように構成することで、透明なハンギングドロップ内で観察対象物の位置が固定された試料が作製される。したがって、試料内の観察対象物から発せられる光を試料の外部で検出して、観察対象物を高精細に観察することができる。

上記各態様においては、前記観察対象物が、複数の細胞が集合してなる細胞凝集塊であってもよい。

本発明の第３態様は、少なくとも１つの観察対象物を内包したゲル状の透明な試料を接触させる透明な平面部を有する基板と、前記試料と前記平面部との接触領域が顕微鏡の対物レンズの有効光束が通過する大きさになる接触状態に維持する接触状態維持手段とを備える試料ホルダである。

本態様によれば、試料と基板の平面部とを接触させて、接触状態維持手段により、その接触領域が顕微鏡の対物レンズの有効光束が通過する大きさになった接触状態に維持することで、試料内の観察対象物から発せられる光を外部の空気や液体を介させることなく試料から基板の平面部を直接透過させて、対物レンズにより集光することができる。

これにより、試料から対物レンズまでの光路の屈折率差を低減し、試料が曲面形状を有する場合であっても試料がレンズとして作用するのを防ぎ、光学的な収差が生じるのを抑制することができる。また、観察対象物を内包するゲル状の試料と基板とを接触させた状態に維持するだけの簡易な作業なので、試料の観察を自動化することができる。したがって、顕微鏡が本来有する光学性能を最大限発揮でき、顕微鏡による観察対象物の高精細な観察および撮像が可能であるとともに、観察の自動化を容易にすることができる。

上記第３態様においては、前記接触状態維持手段が、前記試料を前記平面部に押し付ける方向に押圧する押圧部材であってもよい。
このように構成することで、試料の自重だけでは基板との接触領域を十分に確保できない場合であっても、押圧部材により、基板の平面部に試料を押し付けて十分な接触領域を確保することができる。

上記第３態様においては、前記試料を前記平面部に接触させた状態に支持する基材を備えることとしてもよい。
このように構成することで、試料を安定した姿勢で基板との接触領域を形成させることができる。

上記第３態様においては、前記基材が、液滴を前記観察対象物を内包させつつ吊り下げた状態に支持可能であり、前記試料が、前記基材により支持されている前記液滴をゲル化させてなることとしてもよい。
このように構成することで、吊り下げられた状態で、内包されている観察対象物の位置が固定された試料が作製される。したがって、試料内の観察対象物から発せられる光を試料の外部で検出して、観察対象物を高精細に観察することができる。

上記第３態様においては、前記基板が、内部に液体を貯留可能で、かつ、内部に貯留されている前記液体に前記試料の少なくとも一部を浸漬可能な形態を有することとしてもよい。
このように構成することで、基板の内部に貯留されている液体に試料の少なくとも一部を浸漬させた状態で試料と基板の平面部とを接触させて、観察中に試料が乾燥するのを抑制することができる。

上記第３態様においては、前記接触状態維持手段が、前記試料と前記平面部とが接触した状態に前記基材を位置決め可能な位置決め機構であってもよい。
このように構成することで、位置決め機構により、基材により試料を安定した姿勢に維持したまま基板との十分な接触領域を確保することができる。

上記第３態様においては、前記位置決め機構が、前記試料と前記平面部とを接触状態と非接触状態の少なくとも２つの相対位置に位置決め可能に構成されていることとしてもよい。
このように構成することで、位置決め機構により、簡易かつ精度よく試料と基板の平面部とを接触させてその状態を維持することができる。

上記第３態様においては、前記基板がアレイ状に配列されてなることとしてもよい。
このように構成することで、１度に複数の観察対象物を観察および撮像でき、観察及び撮像の効率化を図ることができる。

本発明によれば、顕微鏡が本来有する光学性能を最大限発揮でき、顕微鏡による細胞凝集塊の高精細な観察および撮像が可能であるとともに、観察の自動化を容易にすることができるという効果を奏する。

本発明の第１実施形態に係る試料観察方法を説明するフローチャートである。 本発明の第１実施形態に係る試料ホルダの縦断面図である。 本発明の第１実施形態の変形例に係るマルチウエルプレートを用いた試料ホルダの縦断面図である。 本発明の第１実施形態の第１変形例に係るマルチウエルプレートを用いた試料ホルダの縦断面図である。 （ａ）は本発明の第１実施形態の第２変形例に係る試料観察方法で用いる培養や透明化用の深いウエルの一例を示し、（ｂ）は本発明の第１実施形態の第２変形例に係る試料観察方法で用いる観察用の浅いウエルの一例を示す縦断面図である。 本発明の第１実施形態の第３変形例に係るスライドガラスを用いた試料ホルダの縦断面図である。 本発明の第２実施形態に係る試料観察方法によりハンギングドロップを落下させるハンギングドロップ形成器具等の縦断面図である。 本発明の第２実施形態の変形例に係る試料ホルダの縦断面図である。 本発明の第３実施形態に係る試料観察方法によりロッド上の液滴内の細胞凝集塊を観察する様子を説明する平面図である。

〔第１実施形態〕
本発明の第１実施形態に係る試料観察方法および試料ホルダについて、図面を参照して以下に説明する。
本実施形態に係る試料観察方法は、図１のフローチャートおよび図２に示されるように、少なくとも１つの細胞凝集塊（観察対象物）Ｓを内包したゲル状の透明なハンギングドロップ（試料）Ｄとウエル（基板）３の透明で平坦な底部（平面部）３ａとを接触させるステップＳ１と、その状態で、細胞凝集塊Ｓからの光を対物レンズ９により集光して検出し細胞凝集塊Ｓを観察するステップＳ２とを含んでいる。

ハンギングドロップＤは、例えば、ゲル化時に透明なアルギン酸ナトリウム溶液Ａの液滴が少なくとも１つの細胞凝集塊Ｓを内包して吊り下げられた状態からなっている。また、ハンギングドロップＤは、例えば、アルギン酸ナトリウム溶液Ａの液滴の表面にカルシウム溶液が噴霧されて接触することにより、化学的な反応によって、内包する細胞凝集塊Ｓの周辺近傍までゲル化されている。アルギン酸ナトリウム溶液Ａは比重が１であり、細胞凝集塊Ｓの比重よりも小さい。

この試料観察方法は、例えば、図２に示すように、ハンギングドロップＤを形成して支持するハンギングドロップ形成器具（基材）１と、ハンギングドロップＤを収容可能なウエル３と、ハンギングドロップＤとウエル３の底部３ａとが接触した状態にハンギングドロップ形成器具１を維持する位置決め機構（接触状態維持手段）５とを備える試料ホルダ７を用いて行われるようになっている。

ハンギングドロップ形成器具１は、溶液が注入される窪み部１１と、窪み部１１に注入された溶液の液滴を細胞凝集塊Ｓを内包させつつ吊り下げた状態に支持するハンギングドロップ形成区画１３と、これら窪み部１１とハンギングドロップ形成区画１３とを繋ぐ細い導管１５とを備えている。

ハンギングドロップ形成器具１は、窪み部１１、ハンギングドロップ形成区画１３および導管１５の組が１つからなるものであってもよいし、この組がアレイ状に配列されて構成されるマルチウエルプレートであってもよい。図２は、１組の窪み部１１、ハンギングドロップ形成区画１３および導管１５からなるハンギングドロップ形成器具１を示している。

窪み部１１は、導管１５とは反対側に開口する開口部１１ａを有し、開口部１１ａからテーパ状に細くなって導管１５に繋がる略円錐形状を有している。
ハンギングドロップ形成区画１３は、導管１５から次第に径方向外方に拡がる略円錐形状を有している。このハンギングドロップ形成区画１３は、アルギン酸ナトリウム溶液Ａの液滴をその下部を露出させて支持するようになっている。
導管１５は、窪み部１１からハンギングドロップ形成区画１３に貫通する貫通孔１５ａを有している。

また、ハンギングドロップ形成器具１は、窪み部１１から径方向外方に張り出すフランジ１７をさらに備えている。フランジ１７は、窪み部１１が鉛直方向上方でハンギングドロップ形成区画１３が鉛直方向下方となる向きでこれらを支持するようになっている。また、フランジ１７は、ウエル３の開口部３ｂを嵌合可能な嵌合部１７ａを有しており、ウエル３の開口部３ｂに嵌合状態に配置することができるようになっている。以下、鉛直方向をＺ方向とし、Ｚ方向に交差し互いに直交する方向をＸ方向およびＹ方向とする。

ウエル３は、光を透過可能な透明な材質により形成されている。ウエル３には、例えば、ハンギングドロップＤおよび細胞凝集塊Ｓを透明にする透明化溶液（液体）Ｗ１が貯留されている。また、ウエル３は、ステージ１９により支持されている。

位置決め機構５は、ウエル３の開口部３ｂに取り付けられ、開口部３ｂを嵌合するハンギングドロップ形成器具１のフランジ１７を位置決めするゴムなどの弾性部材２１を備えている。ウエル３の開口部３ｂにおける弾性部材２１が配置された部分は開口部３ｂにおける他の部分よりも肉厚に形成されている。この位置決め機構５は、フランジ１７により弾性部材２１が嵌合されると、弾性部材２１がその弾性力によってフランジ１７の嵌合部１７ａの内面に密着し、フランジ１７を位置決めすることができるようになっている。

ステップＳ１は、ハンギングドロップ形成器具１により支持されたハンギングドロップＤをウエル３に貯留されている透明化溶液Ｗ１に浸漬させるようになっている。そして、ハンギングドロップＤをウエル３の底部３ａに接触させて、ハンギングドロップＤとウエル３の底部３ａとの接触領域が対物レンズ９の有効光束が通過する大きさになるまで、これらハンギングドロップＤとウエル３の底部３ａとの間に相対的に近接する方向に押圧力を作用させて、位置決め機構５によりその状態に維持するようになっている。

ステップＳ２は、例えば、倒立型のライトシート顕微鏡（図示略）により、鉛直方向に直交する平面に沿う平面状に集光させた励起光をハンギングドロップＤの側方から入射させて細胞凝集塊Ｓに照射するようになっている。そして、細胞凝集塊Ｓにおいて発生する蛍光の内、ハンギングドロップＤの下部から鉛直方向下方に放射される蛍光を対物レンズ９により集光して検出するようになっている。

対物レンズ９としては、例えば、液浸対物レンズが用いられる。対物レンズ９の先端とウエル３の底部３ａとの隙間には、表面張力によって液浸溶液Ｗ２が保持されるようになっている。液浸対物レンズを採用することにより、より高解像の観察画像を得ることができる。

このように構成された試料観察方法および試料ホルダ７の作用について説明する。
本実施形態に係る試料観察方法および試料ホルダ７によりハンギングドロップＤを観察するには、まず、ハンギングドロップ形成器具１により細胞凝集塊Ｓを内包するゲル状のハンギングドロップＤを形成する。

具体的には、アルギン酸ナトリウム溶液Ａとともに細胞（図示略）をハンギングドロップ形成器具１の窪み部１１に分注し、重力によって導管１５の貫通孔１５ａを介してハンギングドロップ形成区画１３に移動させ、細胞を内包したアルギン酸ナトリウム溶液Ａの液滴が吊り下げられた状態からなるハンギングドロップＤを形成させる。そして、ハンギングドロップＤ内で細胞を培養して観察目的の細胞凝集塊Ｓを形成させる

ハンギングドロップＤを構成するアルギン酸ナトリウム溶液Ａは細胞凝集塊Ｓよりも比重が小さいので、細胞凝集塊Ｓは、重力によりハンギングドロップＤの最下点近傍に落ち着く。したがって、窪み部１１に分注するアルギン酸ナトリウム溶液Ａの量を決めておくことにより、細胞凝集塊ＳのＸ，Ｙ方向の位置だけでなくＺ方向の位置も一定にすることができる。また、ハンギングドロップ形成器具１を用いることで、ハンギングドロップＤを形成するためにアルギン酸ナトリウム溶液Ａの液滴を反転させる必要もない。

次に、例えば、図示しない超音波や加圧によりカルシウム溶液を霧化させるネブライザー装置等によりカルシウム溶液を霧化し、ハンギングドロップ形成器具１により支持されているハンギングドロップＤの表面に霧状のカルシウム溶液を接触させて内部に浸透させ、内包する細胞凝集塊Ｓの周辺近傍までアルギン酸ナトリウム溶液Ａをゲル化させる。これにより、略透明なハンギングドロップＤ内で細胞凝集塊Ｓの位置が固定された試料が作製される。

そして、図１に示すように、ハンギングドロップ形成器具１により支持されているハンギングドロップＤをウエル３内に貯留されている透明化溶液Ｗ１に浸漬させて、ハンギングドロップＤおよび細胞凝集塊Ｓを透明にする透明化処理を施す。ハンギングドロップＤを透明化溶液Ｗ１等の溶液に浸漬させることで、観察中にハンギングドロップＤが乾燥するのを抑制することもできる。

なお、直径が３００μｍを超えるような大きな細胞凝集塊Ｓを観察する場合は、観察のための励起光が細胞凝集塊Ｓの内部に到達できず、細胞凝集塊Ｓの内部構造を観察することができないことがある。透明化処理を施すことで、細胞凝集塊Ｓが大きい場合であっても、観察のための励起光を細胞凝集塊Ｓの内部まで到達し易くすることができる。これにより、細胞凝集塊Ｓの大きさに関わらず、細胞凝集塊Ｓの内部構造を容易に観察することができる。

次に、ハンギングドロップＤの下部をウエル３の底部３ａに接触させ、その接触領域が顕微鏡の対物レンズ９の有効光束が通過する大きさになるように、ハンギングドロップ形成器具１を押し込んでフランジ１７によりウエル３の弾性部材２１を嵌合させる。これにより、弾性部材２１の弾性力によってフランジ１７が位置決めされ、ハンギングドロップＤとウエル３の底部３ａとの接触領域が顕微鏡の対物レンズ９の有効光束が通過する大きさになった状態に維持される。

次に、この状態で、ライトシート顕微鏡により、外部からウエル３内に平面状の励起光を入射させてハンギングドロップＤの側方から内部の細胞凝集塊Ｓに照射し、細胞凝集塊Ｓから鉛直方向下方に放射される蛍光を対物レンズ９により集光して検出する。

この場合において、ハンギングドロップＤとウエル３の底部３ａとが接触して、その接触領域が対物レンズ９の有効光束が通過する大きさに維持されているので、ハンギングドロップＤの細胞凝集塊Ｓから発せられる蛍光が外部の空気や液体を介することなくウエル３の底部３ａを直接透過して、対物レンズ９により集光される。

これにより、ハンギングドロップＤから対物レンズ９までの光路の屈折率差を低減し、ハンギングドロップＤが曲面形状を有する場合であってもハンギングドロップＤがレンズとして作用するのを防ぎ、光学的な収差が生じるのを抑制することができる。例えば、ゲル状のアルギン酸ナトリウム溶液Ａが１．３３程度の屈折率で、透明化溶液Ｗ１が１．４５程度の屈折率を有する場合であっても、その屈折率差の影響を受けず、光学的な劣化が生じるのを防ぐことができる。また、細胞凝集塊Ｓを内包するゲル状のハンギングドロップＤとウエル３の底部３ａとを接触させた状態に維持するだけの簡易な作業なので、細胞凝集塊Ｓの観察を自動化することができる。

したがって、本実施形態に係る試料観察方法および試料ホルダ７によれば、顕微鏡が本来有する光学性能を最大限発揮でき、顕微鏡による細胞凝集塊Ｓの高精細な観察および撮像が可能であるとともに、観察の自動化を容易にすることができる。

なお、ライトシート顕微鏡により観察することで、細胞凝集塊Ｓにおける励起光の焦点位置と検出光軸とを一致させるとともに、励起光の入射平面に対物レンズ９の焦点面を一致させることにより、対物レンズ９の焦点面に沿う広い範囲において発生する蛍光を対物レンズ９により１度に集光して、細胞凝集塊Ｓにおける観察部位の鮮明な蛍光画像を容易に取得することができる。

本実施形態においては、図３に示すように、ハンギングドロップ形成器具１として、窪み部１１、ハンギングドロップ形成区画１３および導管１５の組がアレイ配列されたマルチウエルプレートを採用することとしてもよい。このようにすることで、自動分注が容易であり、スクリーニングを目的とした大量の細胞凝集塊Ｓの撮像を高スループットで行うことができる。

本実施形態は以下のように変形することができる。
本実施形態においては、位置決め機構として弾性部材２１を採用することとしたが、第１変形例としては、例えば、図４に示すように、ハンギングドロップ形成器具１およびフランジ１７の自重により、ハンギングドロップＤをウエル３の底部３ａに押し付けて、対物レンズ９の有効光束が通過する大きさの接触領域を確保することしてもよい。図４は、窪み部１１、ハンギングドロップ形成区画１３および導管１５の組が３行×４洌にアレイ配列されたマルチウエルプレートを採用した例を示している。

また、第２変形例としては、図５（ａ），（ｂ）に示すように、基板として、深さが異なる２種類のウエル３´，３´´を用意しておき、ハンギングドロップＤ内で細胞を培養したりハンギングドロップＤおよび細胞凝集塊Ｓを透明化したりするときは、ハンギングドロップＤが底部３ａに接触しない図５（ａ）に示すような深いウエル３´を使い、観察時にはハンギングドロップＤと底部３ａとの十分な接触領域を確保することができる図５（ｂ）に示すような浅いウエル３´´を使うこととしてもよい。

この場合、例えば、フランジ１７の嵌合部１７ａの内面に突起または窪みを設けるとともに、図５（ｂ）に示す観察用の深いウエル３´´の開口部３ｂの外面に窪みまたは突起を設けて、これらをノッチ機構（位置決め機構）２３として機能させることとしてもよい。そして、このノッチ機構２３により、ハンギングドロップＤを押し込んでウエル３´´の底部３ａとの十分な接触領域を確保した状態を維持できるようにしてもよい。

また、第３変形例として、ハンギングドロップＤをウエル３の透明化溶液Ｗ１に浸漬させないこととしてもよい。
この場合、例えば、図６に示すように、基板として透明な平面部２５ａを有するスライドガラス２５を採用し、ハンギングドロップ形成器具１により支持したハンギングドロップＤをスライドガラス２５の上方から平面部２５ａに押し付けて、対物レンズ９の有効光束が通過する大きさの接触領域を確保することしてもよい。この場合、例えば、ステージ１９によりスライドガラス２５を支持するとともに、ロボットハンド（位置決め機構）２７等でフランジ１７を把持して、ハンギングドロップＤとスライドガラス２５の平面部２５ａとの接触状態を維持することとしてもよい。

〔第２実施形態〕
次に、本発明の第２実施形態に係る試料観察方法および試料ホルダについて説明する。
本実施形態に係る試料観察方法および試料ホルダは、例えば、図７に示すように、基板としてウエル３に代えて透明な平面部２５ａを有するスライドガラス２５を採用し、ハンギングドロップＤをスライドガラス２５上に落下させて平面部２５ａに接触させる点で第１実施形態と異なる。
以下、第１実施形態に係る試料観察方法および試料ホルダ７と構成を共通する箇所には、同一符号を付して説明を省略する。

本実施形態に係る試料観察方法は、図７に示すように、超音波振動子のような加振器２９により、ハンギングドロップＤを支持しているハンギングドロップ形成器具１を振動させて、ハンギングドロップＤをスライドガラス２５上に落下させるようになっている。これにより、ハンギングドロップＤを構成していたアルギン酸ナトリウム溶液Ａのゲル状の透明な液滴（試料）Ｂとスライドガラス２５の平面部２５ａとが接触し、その液滴Ｂの自重によって平面部２５ａとの接触領域が形成される。

そして、アルギン酸ナトリウム溶液Ａの液滴Ｂの自重によってウエル３の底部３ａとの接触領域が対物レンズ９の有効光束が通過する大きさに維持された状態で、液滴Ｂに内包されている細胞凝集塊Ｓからの光を対物レンズ９により集光して検出し細胞凝集塊Ｓを観察するようになっている。

したがって、本実施形態に係る試料観察方法によれば、ゲル状のハンギングドロップＤの柔軟性が高い場合には、ハンギングドロップＤをスライドガラス２５上に落下させるだけのより簡易な方法で、落下したゲル状の液滴Ｂとスライドガラス２５の平面部２５ａとの間に対物レンズ９の有効光束が通過する十分な大きさの接触領域を形成させることができる。

本実施形態においては、図８に示すように、接触状態維持手段として、アルギン酸ナトリウム溶液Ａのゲル状の液滴Ｂをスライドガラス２５の平面部２５ａに押し付ける方向に押圧する押圧部材（接触状態維持手段）３１を採用することとしてもよい。スライドガラス２５および押圧部材３１により、試料ホルダ３３が構成される。

このようにすることで、ゲル状の液滴Ｂの自重だけではスライドガラス２５の平面部２５ａとの接触領域を十分に確保できない場合であっても、押圧部材３１により、スライドガラス２５の平面部２５ａにゲル状の液滴Ｂを押し付けて、対物レンズ９の有効光束が通過する大きさの接触領域を確保し、その状態を維持することができる。

〔第３実施形態〕
次に、本発明の第３実施形態に係る試料観察方法について説明する。
本実施形態に係る試料観察方法および試料ホルダは、例えば、図９に示すように、基板を採用せず、アルギン酸ナトリウム溶液Ａのゲル状の透明な液滴（試料）Ｂと対物レンズ９とを接触させる点で第１実施形態と異なる。
以下、第１実施形態および第２実施形態に係る試料観察方法と構成を共通する箇所には、同一符号を付して説明を省略する。

本実施形態に係る試料観察方法は、図９に示すように、分注器３５を用いてロッド３７の端面３７ａにアルギン酸ナトリウム溶液Ａを細胞とともに分注して端面３７ａ上に液滴Ｂを形成し、液滴Ｂ内で細胞を培養して観察目的の細胞凝集塊Ｓを形成させるようになっている。そして、ロッド３７の端面３７ａ上の液滴Ｂにカルシウム溶液を噴霧して内部に浸透させ、内包する細胞凝集塊Ｓの周辺近傍まで液滴Ｂをゲル化させるようになっている。

次いで、ゲル状のアルギン酸ナトリウム溶液Ａの屈折率に合わせた光学設計の対物レンズ９を鉛直方向下方を向けて配置し、図示しない移動機構によりロッド３７を移動させて、その対物レンズ９に下方からゲル状の液滴Ｂを押し付けるようになっている。そして、ゲル状の液滴Ｂと対物レンズ９との接触領域が対物レンズ９の有効光束が通過する大きさになるまで、ゲル状の液滴Ｂを対物レンズ９に近接させる方向に押圧力を作用させた状態で、細胞凝集塊Ｓからの蛍光を対物レンズ９により集光して細胞凝集塊Ｓを観察するようになっている。

この場合、ゲル状の液滴Ｂの弾性力により、その弾性力の範囲内で押し付け量を変えることで対物レンズ９の光軸方向の焦点を変更することができる。そして、ゲル状の液滴Ｂと対物レンズ９との接触領域が対物レンズ９の有効光束が通過する大きさになった状態を維持して観察することで、ゲル状の液滴Ｂから対物レンズ９までの光路の屈折率差を低減し、ゲル状の液滴Ｂが曲面形状を有する場合であっても液滴Ｂがレンズとして作用するのを防ぎ、光学的な収差が生じるのを抑制することができる。

したがって、本実施形態に係る試料観察方法によれば、ウエル３のような基板を用いることなく、顕微鏡が本来有する光学性能を最大限発揮でき、顕微鏡による細胞凝集塊Ｓの高精細な観察および撮像が可能であるとともに、観察の自動化を容易にすることができる。

以上、本発明の実施形態について図面を参照して詳述してきたが、具体的な構成はこの実施形態に限られるものではなく、本発明の要旨を逸脱しない範囲の設計変更等も含まれる。例えば、本発明を上記各実施形態および変形例に適用したものに限定されることなく、これらの実施形態および変形例を適宜組み合わせた実施形態に適用してもよく、特に限定されるものではない。

また、例えば、第１実施形態においてはウエル３が全域に亘って透明な底部３ａを有し、第２実施形態においてはスライドガラス２５が全域に亘って透明な平面部２５ａを有することとしたが、これらウエル３の底部およびスライドガラス２５の平面部の全域が透明である必要はなく、ウエル３の底部やスライドガラス２５が部分的に、細胞凝集塊Ｓからの蛍光を透過可能な大きさの透明な平面部を有することとしてもよい。

１ ハンギングドロップ形成器具（基材）
３，３´´ ウエル（基板）
３ａ 底部（平面部）
５ 位置決め機構（接触状態維持手段）
７，３３ 試料ホルダ
９ 対物レンズ
２３ ノッチ機構（位置決め機構、接触状態維持手段）
２５ スライドガラス（基板）
２５ａ 平面部
３１ 押圧部材（接触状態維持手段）
Ｂ 液滴（試料）
Ｄ ハンギングドロップ（試料）
Ｓ 細胞凝集塊（観察対象物）
Ｗ１ 透明化溶液（液体）

Claims (21)

1. 少なくとも１つの観察対象物を内包したゲル状の透明な試料と基板の透明な平面部とを接触させ、その接触領域が顕微鏡の対物レンズの有効光束が通過する大きさになるまで、前記試料と前記平面部との間に相対的に近接する方向に押圧力を作用させた状態で、前記観察対象物からの光を前記基板を介して前記対物レンズにより集光して前記観察対象物を観察する試料観察方法。
2. 少なくとも１つの観察対象物を内包したゲル状の透明な試料と顕微鏡の対物レンズとを接触させ、その接触領域が前記対物レンズの有効光束が通過する大きさになるまで、前記試料と前記対物レンズとの間に相対的に近接する方向に押圧力を作用させた状態で、前記観察対象物からの光を前記対物レンズにより集光して前記観察対象物を観察する試料観察方法。
3. 基材により前記試料を前記平面部に接触させた状態に支持する請求項１に記載の試料観察方法。
4. 前記試料を前記基板上に落下させて前記平面部に接触させる請求項１に記載の試料観察方法。
5. 前記試料を基材により支持した状態から該基材を振動させることにより前記試料を落下させる請求項４に記載の試料観察方法。
6. 前記基板が内部に液体を貯留可能な形態を有し、
   該基板の内部に貯留されている前記液体に前記試料の少なくとも一部を浸漬させた状態で該試料と前記平面部とを接触させる請求項１、請求項３から請求項５のいずれかに記載の試料観察方法。
7. 前記液体が、前記試料を透明にする透明化溶液である請求項６に記載の試料観察方法。
8. 重力により前記押圧力を生じさせる請求項１から請求項７のいずれかに記載の試料観察方法。
9. 前記顕微鏡が倒立型顕微鏡である請求項１から請求項８のいずれかに記載の試料観察方法。
10. 前記対物レンズが液浸対物レンズである請求項１から請求項９のいずれかに記載の試料観察方法。
11. 前記試料が、ゲル状態で透明な液滴を前記観察対象物を内包させた状態でゲル化させてなる請求項１から請求項１０のいずれかに記載の試料観察方法。
12. 前記試料が、前記液滴を吊り下げた状態からなるハンギングドロップをゲル化させてなる請求項１１に記載の試料観察方法。
13. 前記観察対象物が、複数の細胞が集合してなる細胞凝集塊である請求項１から請求項１２のいずれかに記載の試料観察方法。
14. 少なくとも１つの観察対象物を内包したゲル状の透明な試料を接触させる透明な平面部を有する基板と、
    前記試料と前記平面部との接触領域が顕微鏡の対物レンズの有効光束が通過する大きさになる接触状態に維持する接触状態維持手段とを備える試料ホルダ。
15. 前記接触状態維持手段が、前記試料を前記平面部に押し付ける方向に押圧する押圧部材である請求項１４に記載の試料ホルダ。
16. 前記試料を前記平面部に接触させた状態に支持する基材を備える請求項１４に記載の試料ホルダ。
17. 前記基材が、液滴を前記観察対象物を内包させつつ吊り下げた状態に支持可能であり、
    前記試料が、前記基材により支持されている前記液滴をゲル化させてなる請求項１６に記載の試料ホルダ。
18. 前記基板が、内部に液体を貯留可能で、かつ、内部に貯留されている前記液体に前記試料の少なくとも一部を浸漬可能な形態を有する請求項１６または請求項１７に記載の試料ホルダ。
19. 前記接触状態維持手段が、前記試料と前記平面部とが接触した状態に前記基材を位置決め可能な位置決め機構である請求項１６から請求項１８のいずれかに記載の試料ホルダ。
20. 前記位置決め機構が、前記試料と前記平面部とを接触状態と非接触状態の少なくとも２つの相対位置に位置決め可能に構成されている請求項１９に記載の試料ホルダ。
21. 前記基板がアレイ状に配列されてなる請求項１４から請求項２０のいずれかに記載の試料ホルダ。

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