JP2013515235A - 液体中の細胞および/または粒子を調製するためのユニットおよび装置ならびに顕微分析法 - Google Patents
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Abstract
Description
「L5178Ytk+/-」タイプのマウスリンパ腫細胞(Mouse lymphoma cells)を、T−175フラスコ内で、10%の馬不活性血清(horse inactivated serum)、2mMのL-グルタミン酸、および1%のペニシリン/ストレプトマイシン抗生物質(pen/strep antibiotics)を含むRPMI1640培地(すべての培地は、米国・カリフォルニア州・カールスバッドのライフテクノロジーズコーポレーションより市販されている)の懸濁液中で、75%のコンフルエンシー(密集度)および95%の生存率まで成長させる。
混合物は、米国・ニュージャージー州のベクトン・ディッキンソン社から市販されている「ファルコン353077(Falcon 353077)」タイプの96穴プレートで、60μlの生育培地で8000個の細胞を用いて、37℃で24時間、5%のCO2の条件でインキュベーションを行う。混合物は、ジメチルスルホキシドDMSO中(場合によっては水中)に溶解され、最終的なDMSO濃度は1%となる。陽性対照として、15μg/mlのメチルメタンスルホン酸(MMS)を使用した。
ドイツ・イエナのサイバイオ株式会社(CyBio AG)から市販されている「サイビーウェル(CyBi-well)」タイプの自動分注器の96個のヘッドを用いて、250μlのピペット先端部で5回攪拌した後、細胞懸濁液のうち50μlをインキュベーションプレートから反転したファンネルプレートの室部(図4および図5に示すウェルプレート200の室部20を参照)に移動させる。
固定後、過剰な水分を振り払った状態でプレートガラスを1分間乾燥させ、前準備として、リン酸緩衝生理食塩水(PBS)に5分間浸した。細胞が堆積した表面と反対側のプレート底面が、再蒸留水(ddH2O)で素早く洗い流され、プレートは装着の準備が整っている。
細胞を湿潤状態に維持して、細胞形態および人工染色の望ましくない変化を防ぐため、細胞をアガロースヒドロゲルで被覆することが有益であることが判明した。このため、米国・ミズーリ州にあるシグマアルドリッチ社(Sigma-Aldrich Corporation)から市販されている「低融点低ゲル化温度アガロースタイプVII(low-melting point low gelling temperature agarose type VII)」を、850Wの電子レンジでPBS内に溶解して、最終的に2%(w/v)の溶液(final 2% weight/volume solution)とする。粉体を完全に溶解させるには、数分間にわたり、数回の沸騰および攪拌を繰り返す必要がある。米国・ミズーリ州のシグマアルドリッチ社から市販されている「ヘキスト(Hoechst)」タイプの染色剤(1μM(H2O))を用いた細胞の核の染色と、米国・カリフォルニア州・カールスバッドのライフテクノロジーズコーポレーションより市販されている「セルマスクレッド(cell mask red)」タイプの染色剤(1μg/ml(PBS))を用いた細胞の細胞質の染色は、さらに洗浄工程を必要とすることなく、アガロースゲル内で行うことができる。これは、染色剤ヘキストが、溶液中で実質的に非蛍光性であり、DNAと結合する際にのみ蛍光性となることや、共焦点励起と検出によって画像の取得が行われることで、飛躍的に背景のピンぼけを減少することができることによるものである。染色剤を含む液体アガロース溶液は50℃に維持され、25mlの使い捨てピペットを用いてプレートの上に注がれる。溶液は、表面張力によりプレート上に留まり、縁部から溢れ出ることはない。20〜30分後、ゲルが硬化し、プレートガラスと同じ会社から市販されている、プレートガラス「ネクステリオン(Nexterion)」用の専用蓋付きフレーム内にプレートを装着することができる。
96個のフィーチャーを備えるプレートガラスの回転ディスク型共焦点蛍光顕微鏡法(spinning-disc confocal fluorescence microscopy)を、ドイツ・ハンブルグのパーキンエルマー・セルラー・テクノロジーズ社(PerkinElmer Cellular Technologies)から市販されているハイスループットの自動画像システム「オペラ QEHS(Opera QEHS)」で行った。核染色剤(ヘキスト)および細胞質染色剤(セルマスクレッド)は、それぞれ405nmと635nmで固体レーザによって励起された。
照明光源の励起強度と継続時間は、各実験ごとに調節され、標識効率に違いを生じさせ、明るさおよびコントラストを最適化して、色あせを最小限にする(典型的には、50mWのレーザ出力、200〜2000msの積算時間)。
各スポットでは、典型的には25組の走査画像が、LCPLF 20x NA 0.4 エア対物レンズ(LCPLF 20x NA 0.4 air objective lens)(日本のオリンパス株式会社から入手可能)および最適化されたフィルタセットを通して、2つの独立した高量子効率12ビットCCDカメラ(1.3メガピクセルモノクローム)によって記録された。未処理の照射不均一性、画像シフトまたは歪みはすべて、校正試料から別々に得られた画像を用いて補正された。
共焦点顕微鏡写真は、パーキンエルマー社の「オペラ」画像システムの所有ソフトウェア環境「アカペラ(Acapella)2.0」を用いて分析した。これらは、共にドイツ・ハンブルグのパーキンエルマー・セルラー・テクノロジーズ社から市販されている。最初に、核染色画像のセグメンテーションによって、各細胞の位置を特定した。核の位置が特定され、核の輪郭と領域が測定されると、細胞質染色剤のセグメンテーションにより細胞の輪郭が決定される。
さらに、ドイツ・ミュンヘンのデフィニエンス・アーゲー社(Definiens AG)から市販されている画像分析ソフト「イーコグニション(eCognition)」により、小核を含む試料の画像を分析した。
Claims (17)
- 液体に含まれる細胞および/または粒子を調製するユニット(10)であって、
細胞および/または粒子を含む液体を貯蔵するとともに、所定の外力、特に遠心力が加わると、当該細胞および/または粒子を含む貯蔵した液体を、出口開口部(22)を通して放出するように構成された貯蔵室(20)と、
前記貯蔵室(20)の出口開口部(22)に隣接して配され、前記貯蔵室(20)の出口開口部(22)が通じる通路(30)であり、前記出口開口部(22)よりも大きな断面を有し、前記出口開口部(22)から前記通路(30)に移行する部分の壁が縁部(32)を形成する通路(30)と、
前記細胞および/または粒子を含む放出された液体を受ける観察部材(50)と、
前記通路(30)と前記観察部材(50)との間で、前記観察部材(50)に隣接して配された吸収手段(40)であり、前記細胞および/または粒子を含む液体が前記観察部材(50)へと移動するのを許容する開口部(42)を有する吸収手段(40)と、
を含み、
前記吸収手段(40)は、観察のために前記観察部材(50)上に前記細胞および/または粒子を残すように、前記観察部材(50)上で前記細胞および/または粒子を含む液体からさらに液体を取り除くことを特徴とするユニット(10)。 - 前記出口開口部(22)と前記通路(30)との間の移行部分で、前記縁部(32)の壁が90度の角度(α)を含むことを特徴とする請求項1に記載のユニット(10)。
- 前記貯蔵室(20)は、ドーム型または漏斗型部分(25)と、当該ドーム型または漏斗型部分に隣接する円筒形状部分(26)とを含むことを特徴とする請求項1または請求項2に記載のユニット(10)。
- 前記貯蔵室(20)は、前記細胞および/または粒子を含む液体を所定量収容するように構成され、前記所定量は、1μl〜1000μl、特に10μl〜100μl、とりわけ50μlであることを特徴とする先行する請求項のうちのいずれか一項に記載のユニット(10)。
- 前記貯蔵室(20)は、前記貯蔵室(20)の前記出口開口部(22)とは反対側の端部にベント開口部(24)を含むことを特徴とする先行する請求項のうちのいずれか一項に記載のユニット(10)。
- 前記観察部材(50)は、光学観察用のスライドガラスであることを特徴とする先行する請求項のうちのいずれか一項に記載のユニット(10)。
- 前記開口部(42)を囲繞する前記吸収手段(40)の部分は、前記液体を所定の速度で吸収するように、所定の厚さを有することを特徴とする先行する請求項のうちのいずれか一項に記載のユニット(10)。
- 前記開口部(42)を囲繞する前記吸収手段(40)の壁部は、前記観察部材(50)側に予備曲げされており、ユニット(10)を組み立てる際、この予備曲げ部分が前記観察部材(50)に強固に取り付けられることを特徴とする請求項7に記載のユニット(10)。
- 請求項1から請求項8のいずれか一項に記載されたユニット(10)を複数、個別に含む調製装置であって、当該個別のユニット(10)が相互汚染しないように相互に分離されていることを特徴とする調製装置。
- 96穴プレート(200)または384穴プレートを含み、前記複数の個別のユニット(10)の貯蔵室(20)は、当該96穴プレートまたは384穴プレートの穴によってそれぞれ形成されることを特徴とする請求項9に記載の調製装置。
- 前記個別のユニット(10)の観察部材(50)を形成する観察プレート(500)をさらに含むことを特徴とする請求項9または請求項10に記載の調製装置。
- 前記個別のユニット(10)の吸収手段(40)を形成する第1(400)および第2(402)吸収シートをさらに含み、当該第1吸収シート(400)が、前記観察プレート(500)に直接隣接し接触して配され、当該第2吸収シート(402)が、前記観察プレート(500)から離れた面で、前記第1吸収シート(400)に直接隣接し接触して配され、前記第2吸収シート(402)は、前記第1吸収シート(400)の吸収能力に加えて吸収能力を有することを特徴とする請求項11に記載の調製装置。
- 前記個別の吸収手段(40)を前記個別の観察部材(50)に強固に取り付けるため、前記個別のユニット(10)にそれぞれ圧縮力を付与するバネプレート(600)をさらに含むことを特徴とする請求項9から請求項12のいずれか一項に記載の調製装置。
- 前記バネプレート(600)は、前記個別のユニット(10)の個数に応じて複数の螺旋状バネ(604)を含み、各螺旋状バネ(604)が各個別のユニット(10)に作用することを特徴とする請求項13に記載の調製装置。
- 液体に含まれる細胞を調製するための方法であって、
非接着性細胞を含む液体を貯蔵室(20)に供給するステップと、
接着力および/または表面張力のみにより、前記貯蔵室(20)内の前記非接着性細胞を含む液体を重力に抗して保持するステップと、
前記液体を前記貯蔵室(20)から観察部材(50)上に放出するため、前記非接着性細胞を含む液体に対して、さらに所定の外力、特に遠心力を加えるステップと、
前記観察部材(50)から前記液体を取り除き、観察のために前記非接着性細胞を前記観察部材(50)上に残すステップと
を含むことを特徴とする方法。 - 前記細胞が堆積した前記観察部材(50)上に、ヒドロゲルを含む被膜を塗布するステップをさらに含み、前記ヒドロゲルは、前記細胞に特有の成分に結合可能で、所定波長の光で励起する際に蛍光を放つ少なくとも一種類の染色剤を含むことを特徴とする請求項15に記載の方法。
- 請求項15または請求項16に記載された方法を用いて前記細胞を調製するステップと、
当該調製された細胞を顕微鏡の下にセットするステップと、
顕微鏡画像を解析するステップと、
を含むことを特徴とする細胞の顕微分析方法。
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