KR20120098895A - 액체 속에 함유된 세포 및/또는 입자를 제조하기 위한 유닛 및 장치, 및 현미경 분석 방법 - Google Patents
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Abstract
액체 속에 포함된 세포의 제조를 위한 유닛(10)은 세포를 포함하는 액체를 저장하고 미리 결정된 외력 특히, 원심력 적용시 배출구(22)를 통하여 보관된 액체를 방출할 수 있도록 구성된 저장 챔버(20)를 포함한다. 배출구(22)에 이웃하여 배치된 통로(30)는 배출구(22) 보다 더 큰 단면을 갖는다. 배출구(22)로부터 통로(30)로 전환되는 벽은 에지(32)를 형성한다. 유닛은 방출되는 액체를 수용하기 위한 관찰 부재(observation member)(50) 및 통로(30)와 관찰 부재(50) 사이에 관찰 부재(50)와 이웃하여 배치된 흡수 수단(absorbing means)(40)를 추가적으로 포함한다. 흡수 수단(40)은 방출된 액체가 관찰 부재(50) 상으로 이동할 수 있도록 하는 개구(aperture)(42)를 가지며 관찰을 위하여 세포가 관찰 부재(50) 상에 남겨지도록 액체를 제거한다.
Description
본 발명은 액체 속에 함유된 부착성(adherent) 또는 비-부착성 세포 및/또는 입자의 제조에 관한 것이다.
제조 유닛(preparation unit)은 액체 속에 함유된, 생물학적 세포를 관찰하기 위한 제약 산업에 잘 공지되어 있다. 예를 들면, 이러한 제조 유닛은 미국 왈탐 위만 스트리트(Waltham Wyman street) 81 소재의 써모 피셔 사이언티픽 인크.(Thermo Fishcer Scientific Inc.) 사로부터 상품명 "샨돈 EZ 싱글 사이토펀넬(Shandon EZ Single Cytofunnel)"로 판매되고 있다. 이러한 유닛은 저장 챔버(storage chamber), 필터 카드(filter card) 및 광학 유리 슬라이드를 포함한다.
상응하는 필터 카드는 고 흡수성 물질로 제조되며 중앙에 구멍을 갖는다. 대개, 필터 카드는 유리 슬라이드에 인접하게 배열되어, 필터 카드의 구멍이 유리 슬라이드 위에 침적 구역(deposition area)을 한정한다. 결과적으로, 침적 구역은 필터 카드의 고 흡수성 물질에 의해 둘러싸여 있다.
초기에, 세포를 함유하는 액체는 유리 슬라이드로부터 분리된 저장 챔버 속에 유지된다. 제조 유닛을 전용 원심분리기(dedicated centrifuge), 예를 들면, "샨돈 사이토스핀 4 사이토원심분리기(Shandon Cytospin 4 Cytocentrifuge)" 속에 위치시키고, 제조 유닛을 특정 속도로 회전시키면, 회전 작용은 제조 유닛을 기울여서 세포를 함유하는 액체를 필터 카드 속의 구멍을 통해 저장 챔버로부터 유리 슬라이드 위의 침적 구역으로 방출시킨다. 일단 세포를 함유하는 액체가 침적 구역에 도달하면, 액체는 필터 카드의 고 흡수성 물질에 의해 제거되고 세포는 유리 슬라이드의 침적 구역 위에 잔류한다. 이후에, 유리 플레이트는 제조 유닛으로부터 분리되어 세포의 현미경 관찰을 위해 전달될 수 있다.
상기 기술한 윈심분리기는 12개의 제조 유닛을 동시에 처리할 수 있지만, 보다 효과적이고 효율적인 제조 유닛 및/또는 제조 장치가 요구된다.
따라서, 본 발명의 목적은 액체 속에 함유된 세포 및/또는 입자의 제조 유닛, 제조 장치 및, 이들을 매우 효과적이고, 신뢰할만하며 고 품질로 제조하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명에 따라, 이러한 과제는 각각의 독립 청구항에 따르는 제조 유닛, 제조 장치 및 방법에 의해 해결된다. 본 발명에 따르는 제조 유닛 및 제조 장치의 추가적인 실시양태들은 종속 청구항들에 구체화되어 있다.
특히, 본 발명은, 세포 및/또는 입자를 함유하는 액체를 저장하고 미리 결정된 외력, 특히 원심력을 적용하는 경우 배출구(exit opening)를 통해 세포 및/또는 입자를 함유하는 저장된 액체를 방출하도록 구성된 저장 챔버를 포함하는, 액체속에 함유된 세포 및/또는 입자를 제조하기 위한 유닛을 제안한다. 통로는, 통로 내로 인도하는 저장 챔버의 배출구를 갖는, 저장 챔버의 배출구에 인접하게 배열된다. 통로는 배출구의 단면적(cross-section)보다 더 큰 단면적을 갖는다. 배출구로부터 통로로의 전환(transition)에서, 벽은 에지(edge)를 형성한다. 유닛은 세포 및/또는 입자를 함유하는 방출된 액체를 수용하기 위한, 및 통로와 관찰 부재(observation member) 사이에 관찰 부재와 인접하게 배열된 흡수 수단을 추가로 포함한다. 흡수 수단은 세포 및/또는 입자를 함유하는 액체가 구멍을 통해 관찰 부재 위로 이동되도록 하는 구멍을 갖는다. 흡수 수단은 관찰 부재 위에 세포 및/또는 입자를 함유하는 액체로부터 액체를 추가로 제거하여 관찰을 위하여 세포 및/또는 입자가 관찰 부재 상에 남겨지도록 한다.
본 발명에 따른 제조 유닛은 세포, 특히 비-부착성 세포 또는 액체 속에 원래 함유된 기타 입자를 를 비용-효율적이고 신뢰할만하며 고 품질로 제조하기 위한 작고 단순한 유닛이다.
액체는 어떠한 추가의 외력(external force)을 적용할 필요없이 액체에 작용하는 중력에 대하여 매달리는 상태로 저장 챔버 속에 저장된다. 이는 저장 챔버 또는 이의 배출구의 적합한 형태에 의해 바람직하게 영향받을 수 있는, 접착력 및/또는 표면장력에 의해 달성된다. 따라서, 액체는 저장 챔버 속에 신뢰할만하게 유지될 수 있으므로 저장 챔버로부터 액체를 방출하기 전에 액체가 제어되지 않고 흡수 수단과 접촉되는 것을 방지한다.
또한, 세포 및/또는 입자의 세심한 처리가 보장된다. 제조 동안의 손상은 감소되거나 완전히 방지되어 세포 사망률 및/또는 입자 변형이 감소된다. 더욱이, 세포의 막힘(clogging)이 방지됨으로써 다수의 제조에 걸쳐 고도의 재현가능한 결과를 제공한다. 이는, 동시에 수행되는 세포 또는 입자를 함유하는 다양한 액체를 처리하는, 다중-웰 플레이트(multi-well plate)에 의해 다수의 제조 유닛이 제공되는 경우 특히 유리하다.
또한, 본 발명에 따른 제조 유닛을 사용하여, 세포 및 입자를 균일한 조건하에서 저장 챔버 속에 담겨진 액체 속에 침전시킬 수 있다. 이러한 침전은 세포 및 입자가 들어있는 액체가 방출 되는 동안 기본적으로 방해받지 않고 잔류한다. 따라서, 침적 구역 상에서 수득되는 세포 분배는 매우 균일하다. 균일한 분배는, 이들이 양호한 관찰 조건을 제공하기 때문에 특히 자동 영상 분석을 위해 유리하다.
예를 들면, 본 발명에 따른 유닛은 제약 산업에서 세포 및/또는 입자의 제조에 사용될 수 있다.
접착력 및/또는 표면장력을 사용한 저장 챔버 내의 액체의 보유는 저장 챔버의 배출구에 배열된 에지를 사용하여 증진된다. 결과적으로, 액체는 추가의 외력의 적용없이 저장 챔버의 어떠한 배향에서도 저장 챔버 내에 신뢰할만하게 유지질 수 있다.
원심분리 공정은 비-부착성 세포를 관찰 챔버에 부착시키기 위해서 특히 유리한데, 이는 접착성 화학물질의 사용을 피할 수 있기 때문이다. 접착성 화학물질은, 예를 들면, 세포외 매트릭스 단백질과의 상호작용에 의해, 세포의 유도 상태를 잠재적으로 변경시키는 위험을 지닌다.
본 발명에 따른 유닛의 제1 실시양태에서, 배출구와 통로 사이의 전환에서 에지의 벽은 90도의 각을 포함한다. 이러한 전환은 제조하기 용이하다. 그러나, 예를 들면, 스태거 형태(staggered shape) 또는 90도 이외의 각을 포함하는 에지와 같은 다른 유형의 전환이 또한 가능하다.
각은 에지를 형성하는 벽의 재질의 특성과 액체의 특성 사이에 양호한 조화를 제공하도록 크기를 조절할 수 있다. 예를 들면, 높은 크리핑 능력(creeping capability)을 갖는 액체에 있어서, 에지는 피크의 형태를 가질 수 있으며, 즉 90도 미만의 각을 포함할 수 있다.
본 발명에 따르는 제조 유닛의 추가의 실시양태에서, 저장 챔버는 돔 형태(dome-shaped) 또는 깔때기 형태의 부분 및 돔 형태 또는 깔때기 형태의 부분에 인접한 원통형태 부분을 포함한다. 본 발명에 따르는 제조 유닛의 추가의 실시양태에서, 저장 챔버는 미리 결정된 용적의 세포 및/또는 입자를 함유하는 액체를 포함하도록 구성되며, 상기 미리 결정된 용적은 1 ㎕ 내지 1000 ㎕, 특히 10 ㎕ 내지 100 ㎕이며, 특히 50 ㎕이다. 이는 작은 용적의 액체 제제를 가공하는 제약 산업에서 전형적으로 사용되는 양이다.
본 발명에 따른 제조 유닛의 추가의 실시양태에서, 저장 챔버는 배출구 반대편의 저장 챔버의 말단에 배열된 통기구(vent opening)를 포함한다. 이는 원심분리 동안에 저장 챔버로부터 저장된 액체를 세심하고 균일하게 방출할 수 있도록 한다. 방출된 액체에 의해 남겨진 공간은 통기구(vent opening)를 통해 기체, 예를 들면, 공기로 충전된다. 따라서, 액체의 불균일한 또는 부주의한 방출로부터 야기되는 액체 중에 함유된 세포 또는 입자에 대한 임의의 부정적인 영향을 방지할 수 있다.
더욱이, 저장 챔버에 로딩(loading)하기 위해, 세포 및/또는 입자를 함유하는 액체를 상기 통기구를 통해 저장 챔버 내로 유리하게 분배할 수 있다. 특히, 이는 세포 및/또는 입자를 갖는 액체를 함유하는 피펫의 개방 말단을 통기구 주변의 벽 위에 두고, 이후 피펫 속에 함유된 액체 위에 압력을 가하여 액체가 통기구를 통해 저장 챔버를 향해 이동하도록 함으로써 성취될 수 있다. 저장 챔버의 벽이 액체에 의해 습윤됨에 따라, 세포 및/또는 입자를 함유하는 액체는 저장 챔버 내로 흡입된다. 제조 유닛은 저장 챔버를 흡수 수단 및/또는 관찰 부재와 결합함으로써 예비-조립될 수 있으며, 이후 액체를 피펫팅 로봇을 이용하여 저장 챔버에 로딩할 수 있다. 통기구를 통해 저장 챔버에 로딩시키는 것이 바람직하지만, 반대편 말단으로부터 저장 챔버로의 로딩 또한 가능함이 언급되어야 한다.
본 발명에 따른 제조 유닛의 추가의 실시양태에서, 관찰 부재는 광학적 관찰을 위한 슬라이드이다. 특히, 광학적 관찰을 위한 슬라이드는 투명한 슬라이드, 예를 들면, 현미경 슬라이드와 같은 유리 슬라이드이며, 코팅되거나 코팅되지 않을 수 있다.
본 발명에 따른 제조 유닛의 추가의 실시양태에서, 흡수 수단은 필터 페이퍼를 포함한다. 필터 페이퍼는 높은 흡수 용량을 제공하며 비교적 저렴하다. 물론, 필터 페이퍼 이외의 흡수 수단을 또한 사용할 수 있다.
본 발명에 따르는 제조 유닛의 추가의 양태에서, 구멍을 둘러싸는 흡수 수단의 부위는 액체에 대한 미리 결정된 흡수 속도를 달성하기 위하여 예정된 두께를 갖는다. 흡수 속도는 세포 및/또는 입자가 흡수 수단을 향하여 및 당해 수단 내로 이동하는 액체와 함께 끌려나가기 보다는 관찰 부재 위에 침착될 수 있도록 하기 위하여 조절되는 파라메터이다.
흡수 수단은 흡수 속도를 조절하기 위하여 흡수 수단이 압축된 구명에 직접 인접한 내부 영역 및 흡수 수단이 압축되지 않고 높은 흡수 용량을 갖는 상기 내부 영역을 둘러싸는 외부 영역을 포함하는 계단 형태를 가질 수 있다. 이는 다량의 액체의 제거뿐만 아니라 흡수 속도의 조절을 가능하게 하며, 인접하게 배열된 유닛의 경우에 교차 오염을 추가로 방지한다.
바람직하게는, 구멍에 인접한 흡수 수단의 표면은 편평, 평면, 균일 또는 매끄러우며, 세포가 침적되는 관찰 부재 위의 구멍 또는 구역 내로 누출되는 섬유가 전혀없다. 이는 제조 공정의 높은 재현성을 제공한다.
저장 챔버의 배출구로 이어지는 통로는 추가의 에지를 형성하도록 성형될 수 있으며, 이는 유닛의 조립시 흡수 수단을 관찰 부재에 대하여 압축하여 흡수 수단과 관찰 부재 사이의 갭을 방지한다. 이는 세포 및/또는 입자가 관찰 부재 상의 침적 구역으로부터 이탈하는 것을 방지하며 또한 인접하게 배열된 유닛들 사이의 교차 오염을 방지한다.
본 발명에 따른 제조 유닛의 추가의 실시양태에서, 구멍을 둘러싸는 흡수 수단의 벽 부분은 관찰 부재를 향해 사전에-굽혀져서, 유닛의 조립시 당해 부위가 관찰 부재에 견고하게 부착된다. 이러한 형태로, 관찰 부재와 흡수 수단 사이의 갭이 방지된다.
본 발명은 위에서 기술한 바와 같이 다수의 개별 제조 유닛을 포함하는 제조 장치를 추가로 제안하며, 상기 개별 유닛은 교차 오염에 대하여 상호격리된다. 이러한 장치를 사용하여 다수의 제조가 동시에 수행될 수 있으므로, 세포 및/또는 입자의 자동화된 처리량 제조, 관찰 및/또는 분석이 가능하게 된다.
본 발명에 따른 제조 장치의 하나의 실시양태는 96 웰-플레이트 또는 384 웰-플레이트를 포함하며, 다수의 개별 유닛의 저장 챔버는 각각 96 웰-플레이트 또는 384 웰-플레이트의 웰(well)에 의해 형성된다. 이는, 개별 유닛의 저장 챔버가 웰들 사이의 표준화된 거리 및 표준화된 풋-프린트(foot-print)를 갖는 소형의 표준 웰-플레이트 속에 조합되는 이점을 가지므로 이러한 다중-웰 플레이트를 위한 표준 장치에 의해 매우 효율적으로 처리될 수 있다. 예를 들면, 이러한 플레이트의 개개의 웰의 모든 저장 챔버를 동시에 로딩할 수 있다.
추가의 실시양태에서, 본 발명에 따른 제조 장치는 개개 유닛의 관찰 부재를 형성하는 관찰 플레이트를 포함한다. 따라서, 개별 유닛의 관찰 부재는 자동화된 영상 분석을 통해 효율적인 관찰을 제공하기 위해 결합적으로 처리될 수 있다.
추가의 실시양태에서, 본 발명에 따른 제조 장치는 개별 유닛의 흡수 수단을 형성하는 제1 및 제2 흡수 시트(sheet)를 포함하며, 여기서 제1 흡수 시트는 관찰 플레이트에 직접 인접하게 및 이와 접촉되게 배열되며, 제2 흡수 시트는 관찰 플레이트로부터 멀어지는 측면에 제1흡수 시트에 인접하게 및 이와 접촉되게 배열된다. 제2 흡수 시트는 제1 흡수 시트의 것에 부가적인 흡수 용량을 갖는다(예를 들면, 제2 흡수 시트의 흡수 용량은 제1 흡수 시트의 것보다 더 클 수 있다). 이는, 흡수되는 액체의 총량이 증가할 수 있고 개개의 제조 세포의 상호 분리가 개선되고, 이에 따라 교차 오염의 위험이 감소하는 이점을 갖는다.
추가의 실시양태에서, 본 발명에 따르는 제조 장치는 각각의 관찰 부재에 대한 각각의 흡수 수단의 견고한 부착을 성취하기 위하여 개별 유닛에 개별적인 압축력을 적용하기 위한 스프링 플레이트(spring plate)를 포함한다. 압축력은 갭을 방지하기 위해 관찰 부재에 대하여 흡수 수단을 견고하게 압축시킨다(상기 참조). 또한, 이러한 압축은 제1 흡수 시트의 두께의 개개의 변화를 상쇄한다.
본 발명에 따르는 제조 장치의 추가의 양태에서, 스프링 플레이트는 개별 유닛의 수에 상응하는 복수의 나선형 스프링을 포함한다. 각각의 나선형 스프링은 개개 유닛에 작용한다. 이는 개별적인 압력이 각각의 개별 제조 유닛에 가해져서, 이들 사이에 배열되는 각각의 흡수 수단을 갖는 개개의 저장 챔버를 향해 관찰 플레이트의 개개의 부분을 압축시킨다. 나선형 스프링은 예를 들면 콘(cone) 형태일 수 있다.
본 발명은 추가로, 세포를 포함하는 액체를 저장 챔버 속으로 분배하는 단계; 접착력(adhesion force) 및/또는 표면장력의 수단 만에 의해 중력에 대하여 저장 챔버 내에 세포를 함유하는 액체를 유지하는 단계; 저장 챔버로부터 관찰 부재상으로 액체를 방출시키기 위하여, 세포를 함유하는 액체에 추가적인 미리 결정된 외력, 특히 원심력을 적용하는 단계; 및 관찰을 위하여 관찰 부재 상에 세포를 남기도록 관찰 부재로부터 액체를 제거하는 단계를 포함하는 액체 속에 함유된 세포(특히, 배타적이지는 않지만 비-부착성 세포)를 제조 방법을 포함한다.
추가의 미리 결정된 외력, 특히 원심력의 적용을 통해, 세포는 관찰 부재의 표면에 부착된다. 또한, 세포는 상기한 힘의 적용을 통해 편평해져서 세포 내의 구조물들이 훨씬 빈번하게 서로의 상부에 보다는 서로에게 측방향으로 인접하게 놓이도록 한다. 이는 세포 구조의 현미경 분석을 향상시키는데, 그 이유는 현미경 영상이 본질적으로 3차원 세포 구조의 2차원 투영이기 때문이다. 이는, 세포가 노출되는 물질이, 엔도좀, 미토콘드리아, 핵 또는 미세핵(micro-nuclei)과 같은, 세포의 구조 또는 성분에 대해 지닐 수 있는 유전자독성 효과의 측정을 위해 특히 관련될 수 있다.
관찰 부재 위에 세포를 침적시킨 후에, 세포를 건조시킨 다음 현미경 분석을 수행할 때, 본 발명에 따르는 제조방법의 하나의 실시양태는 상부에 침적된 세포를 갖는 관찰 부재 상에 하이드로겔을 포함하는 코팅(coating)을 적용시키는 단계를 추가로 포함한다. 하이드로겔은 세포의 특정 성분에 결합할 수 있는 적어도 하나의염색물(stain)를 포함한다. 세포의 특정 성분에 결합된 염색물은 미리 결정된 파장의 광으로 여기되는 경우 형광성인 반면, 이러한 특정 세포 성분에 결합되지 않는 한 형광성이 아니다.
예를 들면, 하이드로겔은 관찰 부재 위에 침적된 세포를 습윤 상태로 유지시키는 아가로즈 하이드로겔일 수 있다. 하이드로겔은 관찰 부재(예를 들면, 현미경 슬라이드) 또는 위에서 언급한 관찰 플레이트 위에 침적된 세포의 형태를 유지시키는 것과 관해서 유리할 수 있다. 위에서 언급한 아가로즈 하이드로겔과 같은 하이드로겔은 실온에서 젤라틴과 유사한 상태로 존재하며, 즉 필수적으로 고체이다. 이는 세포를 오염되는 것뿐만 아니라 건조되어 버리는 것으로부터 보호한다. 그러나, 염색제의 분자와 같은 소분자는 하이드로겔 내에서 실질적으로 자유롭게 이동가능하며 하이드로겔을 통해 및 세로 내로 확산하여, 이들이 예를 들면 세포의 핵, 미세핵, 기타 특정 성분과 같은 특정한 세포 성분, 또는 세포 경계에 결합한다.
이러한 실시양태는 유리한 데, 그 이유는 현미경 분석을 위해 현미경하에 염색된 세포를 사용하여 관찰 부재를 위치시키기 전에 세포 내로 확산되지 않는 어떠한 과량의 염색물을 관찰 부재로부터 세척하면서, 관찰 부재 위에 침적된 세포에 염색물을 적용하는 것과 대조적으로, 세척하는 단계가 완전히 생략되기 때문인데, 그 이유는 염색물이 하이드로겔 속에 이미 함유되어 있고 임의의 과량의 염색물을 세척할 필요없이 세포내로 확산되기 때문이다.
따라서, 본 발명의 다른 국면은,
- 본 발명에 따르는 상기 언급된 제조방법을 사용하여 세포를 제조하고,
- 세포를 미리 결정된 파장을 갖는 광으로 조명하고,
- 제조된 세포를 현미경 하에 위치시키며,
- 현미경 영상을 분석하는 단계들을 포함하여, 세포를 현미경 분석하는 방법에 관한 것이다.
세포 내로 확산되고 세포의 특정 성분에 결합하는 염색물만이, 미리 결정된 파장의 광을 사용하여 조명한 후에 형광성을 나타낸다. 예를 들면, 염색물은 세포의 잠재적인 미세핵 및 핵에 결합하도록 조정될 수 있다. 따라서, 세포가 현미경 분석 전에 노출되는 특정 물질이 유전자독성일 수 있는 미세핵의 형성을 측정할 수 있다.
추가의 염색물이 제공되고 세포 내로 확산되어 세포 경계에 결합된 경우, 및 세포가 추가의 미리 결정된 파장의 광으로 조명된 후에, 추가의 염색물은 또한 형광성을 나타내어 세포의 경계 뿐만 아니라 세포 내의 어떠한 특정 구조물도 명확히 볼 수 있게 되고, 이에 따라 현미경 영상의 콘트라스트(contrast)가 추가로 증진된다.
본 발명은 예시적인 실시양태를 이용하고 첨부한 도면들을 참조로 하여 이후에 더 상세히 기술한다.
도 1은 본 발명에 따른 개별 제조 유닛의 일 실시양태의 단면도이다;
도 2는 본 발명에 따른 제조 장치의 일 실시양태의 분해 투시도이다;
도 3은 도 2의 제조 장치의 측면도이다;
도 4는 도 3의 선 IV-IV를 따르는 단면도이다;
도 5는 도 4의 상세한 부분 V의 확대도이다;
도 6은 도 4의 상세한 부분 VI의 확대도이다;
도 7은 도 2의 상세한 부분 VII의 확대도이다;
도 8은 조립된 상태에서 도 2의 제조 장치의 측면도이다;
도 9는 도 8의 선 IX-IX를 따르는 단면도이다;
도 10은 도 9의 상세한 부분 X의 확대도이다;
도 11은 조립된 상태에서 도 2의 제조 장치의 투시도이다;
도 12는 상부에 세포가 침적되고, 염색제를 함유하는 하이드로겔로 덮여진, 도 2의 장치의 관찰 플레이트의 상세도이다;
도 13은 본 발명에 따른 장치 및 방법으로 제조된 비-부착성 세포의 영상의 예이다;
도 14는 본 발명에 따른 장치 및 방법을 사용하여 수행한 미세핵 시험의 분석 결과의 예이다.
도 2는 본 발명에 따른 제조 장치의 일 실시양태의 분해 투시도이다;
도 3은 도 2의 제조 장치의 측면도이다;
도 4는 도 3의 선 IV-IV를 따르는 단면도이다;
도 5는 도 4의 상세한 부분 V의 확대도이다;
도 6은 도 4의 상세한 부분 VI의 확대도이다;
도 7은 도 2의 상세한 부분 VII의 확대도이다;
도 8은 조립된 상태에서 도 2의 제조 장치의 측면도이다;
도 9는 도 8의 선 IX-IX를 따르는 단면도이다;
도 10은 도 9의 상세한 부분 X의 확대도이다;
도 11은 조립된 상태에서 도 2의 제조 장치의 투시도이다;
도 12는 상부에 세포가 침적되고, 염색제를 함유하는 하이드로겔로 덮여진, 도 2의 장치의 관찰 플레이트의 상세도이다;
도 13은 본 발명에 따른 장치 및 방법으로 제조된 비-부착성 세포의 영상의 예이다;
도 14는 본 발명에 따른 장치 및 방법을 사용하여 수행한 미세핵 시험의 분석 결과의 예이다.
도 1은 본 발명에 따른 액체에 함유된 세포 및/또는 입자의 제조를 위한 개별 제조 유닛(10)의 일 실시양태에서의 단면도를 나타낸다.
제조 유닛(10)은 세포 현탁액을 저장하기 위한 저장 챔버(20)를 포함한다. 저장 챔버(20)는 돔 형태 또는 깔때기 형태 부분(25), 및 돔 형태 부분(25)에 인접한 원통형태 부분(26)을 포함한다. 저장 챔버(20)는 미리 결정된 용적의 세포 현탁액을 함유하도록 구성될 수 있는 데, 이는 일반적으로 1 ㎕ 내지 1000 ㎕, 특히 10 ㎕ 내지 100 ㎕이며, 특히 50 ㎕이다. 돔 형태 부분(25)으로부터 먼 말단에, 저장 챔버(20)는 배출구(22)를 포함한다. 저장 챔버(20)는 돔 형태의 부분(25) 내로 인도되는 통기구(24)를 추가로 포함한다.
원통형태 통로(30)는 저장 챔버(20)의 배출구(22)에 인접하게 배열된다. 통로(30)는 배출구(22)의 단면적보다 더 큰 단면적을 갖는다. 특히, 통로(30)는 저장 챔버(20)의 배출구(22)와 함께 공동축으로 정렬된다. 배출구(22)로부터 통로(30)로의 전환에서 벽은 에지(32)를 형성한다. 본 발명의 실시양태에서, 에지(32)는 90도의 각 α를 포함한다.
필터 페이퍼으로서 구현된 흡수 수단(40)은, 저장 챔버(20)의 배출구(22)에서 떨어진 측면 위의, 통로(30)에 인접하게 배열된다. 필터 페이퍼(40)는 플롯팅 페이퍼 또는 크로마토그래피 페이퍼, 특히 영국 런던 브렌트포드 소재의 왓트만 리미티드(Whatman Ltd) 사로부터 구입할 수 있는 Grade 17 Chr 페이퍼일 수 있다. 필터 페이퍼(40)는 구멍(42)을 갖는다. 구멍(42)은 원통형태 통로(30)와 공동축으로 정렬된다.
유리 슬라이드(50)로서 구현된 관찰 부재(50)는 필터 페이퍼(40)에 인접하게 배열되어 필터 페이퍼(40)가 통로(30)와 유리 슬라이드(50) 사이에 배열되도록 한다. 더욱이, 제조 유닛(10)의 통로는 필터 페이퍼(40)에 인접하게 배열되는 추가적인 에지(34)를 형성하도록 형성된다. 에지(34)는 필터 페이퍼(40)를 유리 슬라이드(50)를 향하여 압축시켜 필터 페이퍼(40)와 유리 슬라이드(50) 사이의 갭을 방지한다.
부분(25) 및 (26)은, 중력 이외의 외력이 가해지지 않는 한 액체와 액체 중에 함유된 세포를 포함하는 세포 현탁액을 저장하기 위한 저장 챔버(20)의 내부 빈 공간을 형성한다. 이러한 관점에서, 접착력 및/또는 표면장력과 관련된 에지(32)는 중력에 대하여 저장 챔버(20) 속에 세포 현탁액을 유지하는 데 도움을 준다. 그러나, 미리 결정된 원심력을 적용하는 경우, 세포 현탁액은 배출구(22)를 통해 저장 챔버로부터 방출된다. 공기는 이후에 통기구(24)를 통해 저장 챔버(20) 속으로 유동하여, 방출된 세포 현탁액에 의해 뒤에 남겨지는 빈 공간을 채울 수 있다. 또한, 통기구(24)를 사용하여, 통기구(24) 둘레의 벽 위에 피펫의 말단을 놓고, 피펫 속의 세포 현탁액에 미리 결정된 압력을 가함(예를 들면, 피펫을 스퀴징함)으로써 저장 챔버(20) 내에 세포 현탁액을 충전시켜서, 세포 현탁액이 통기구(24)를 통해 넓혀진 돔 형태의 부분 내로 끌려 들어간 다음 저장 챔버(20)의 원통형 부분(26) 내로 이동시킨다.
통로(30) 및 구멍(42)은, 저장 챔버(20)로부터 방출되는 세포 현탁액이 저장 챔버(20)로부터 유리 슬라이드(50)로 이동할 수 있도록 한다. 유리 슬라이드(50)는, 구멍(42)을 통해 방출된 세포 현탁액을 수용하는 작용을 한다. 필터 페이퍼(40)의 구멍(42)은 수용된 세포 현탁액과 접촉하도록 구성되어 세포 현탁액으로부터 액체를 제거하도록 하고 유리 슬라이드(50) 위에 침적된 세포가 남도록 한다. 액체의 흡수 속도는 구멍(42) 주변의 필터 페이퍼(40)의 부분의 높이에 의해 조절될 수 있다. 일단 액체가 흡수되고 세포가 유리 슬라이드(50) 위에 침적되면, 유리 슬라이드(50)는 영상화 장치, 예를 들면, 현미경 또는 플레이트 리더(plate reader)로 이동될 수 있다.
도 2는 본 발명에 따른 제조 장치의 일 실시양태의 분해 투시도를 나타낸다. 상기 제조 장치는 상이한 플레이트 및 시트의 적층물을, 다시 말해서 하부에서 상부로 다음 순서로: 기저 플레이트 (700), 스프링 플레이트 (600), 중간 플레이트 (602), 관찰 플레이트 (500) (예: 유리 플레이트), 제1 흡수 시트 (400) (예: 제1 필터 시트), 제2 흡수 시트 (402) (예: 제2 필터 시트), 웰-플레이트(200) (예: 깔때기 플레이트) 및 커버 플레이트 (702)를 포함한다.
제조 장치는 96개의 개개 유닛을 포함한다(참조: 도 1). 웰 플레이트 (200)는 저장 챔버 (20) 및 통로 (30)를 포함하며, 제1 흡수 시트 (400)는 흡수 수단 (40)을 포함하며, 관찰 플레이트 (500)는 관찰 부재 (50)을 포함한다.
중간 플레이트 (602)는 개별 제조 유닛(10) 위의 스프링-플레이트(600)의 개별적인 스프링에 의해 가해진 상이한 압력을 보상하는 작용을 한다. 또한, 중간 플레이트(602)는 스프링 플레이트(600)의 스프링(604)에 의한 관찰 플레이트(500)의 스크랫칭(acratching)을 방지한다(참조: 도 7의 상세한 부분 VII).
기저 플레이트(700)는 다수의 페그(peg; 706)를 포함하는 데, 이는 플레이트들을 조립 동안에 적절한 정렬로 적층되도록 돕는다. 상기 페그(706)는 스프링 플레이트(600) 및 웰-플레이트(200)의 상응하는 구멍과 맞물린다. 또한, 클램프(704)가 나타나 있는데, 이는 소형의 제조 장치로서 함께 조립되고 압축된 적층물을 유지시키는 데 적합하다. 이러한 목적으로, 클램프(704)는 U자형이며, 여기서 2개의 굽혀진 에지가, 기저 플레이트(700) 및 커버 플레이트(702)의 측벽에 존재하는 홈(groove) 속에 맞물리게 구성된다.
도 3은 도 2의 제조 장치의 측면도를 나타내고 도 4는 동일한 도면부호를 참조하는 도 3의 선(IV-IV)을 따른 단면도를 나타낸다. 웰 플레이트(200)의 일부분을 나타내는 상세한 부분 V는 도 5에 확대하여 나타내었고, 제1 흡수 시트(400)의 부분을 나타내는 상세한 부분 VI은 도 6에 확대하여 나타내었다. 이들 부분은 하기에 보다 상세히 기술한다.
도 5는 도 3의 웰-플레이트(200)의 상세한 부분 V의 확대도를 나타낸다. 상세한 부분 V는 웰-플레이트(200)의 96개의 개별 제조 유닛들 중의 2개의 부분을 나타낸다. 개별 유닛의 각각의 부분은 저장 챔버(20) 및 개개의 세포 현탁액을 개별적으로 저장하고 방출하기 위한 통로(30)를 포함한다.
도 6은 도 3의 제1 흡수 시트(400)의 상세한 부분 VI의 확대도를 나타낸다. 상기 상세한 부분은 흡수 시트(400)로 둘러싸인 구멍(42)을 포함하는 흡수 시트(400)의 96개의 개별 유닛들 중의 하나의 완전한 유닛을 나타낸다. 흡수 시트(400)는 구멍(42)을 둘러싸고 작은 두께를 갖는 내부 영역(44), 및 내부 영역(44)을 둘러싸고 내부 영역(44)의 두께보다 큰 두께를 갖는 외부 영역(45)을 갖는 구멍(42)을 둘러싸는 부위 내에 단계형 단면을 갖는다. 작은 두께의 내부 영역(44)은 흡수 시트(400)를 압축시킴으로써 수득할 수 있다. 이러한 압축을 사용하여, 액체의 흡수 속도를 목적하는 속도로 조정할 수 있다. 외부 영역(45)은 압축되지 않은 채로 남겨져서 제거되는 액체에 대하여 높은 흡수 용량을 나타낸다.
도 7은 2개의 나선형 스프링(604)을 갖는, 도 2의 스프링 플레이트(600)의 상세한 부분의 확대도이다. 나선형 스프링(604)은 스프링 플레이트(600)와 중간 플레이트(602) 사이에 배열된다. 각각의 나선형 스프링(604)은 개개의 유닛(10)에서 작용한다(참조: 도 1). 따라서, 각각의 스프링(604)의 힘은 중간 플레이트(602)의 상응하는 부위에 개별적인 압력을 가하는 데, 이는 다시, 관찰 플레이트(500)의 상응하는 부위에 압력을 가하여 개별 저장 챔버(20)를 포함하는 웰-플레이트(200)을 향해 압축된다.
나선형 스프링(604)은 콘 형태일 수 있으며, 스프링 플레이트(600)에 인접하게 배열되는 큰 직경을 갖는 스프링 윈도우(spring window) 및 중간 플레이트(602)를 향한 방향으로 감소하는 와인딩(winding)의 직경을 가질 수 있다.
도 8은 조립된 상태의 도 2의 제조 장치의 측면도를 나타내고, 도 9는 도 8의 선 IX-IX을 따르는 단면도를 나타낸다. 2개의 클램프(704)(단지 하나만 나타냄)는 소형의 제조 장치로서 플레이트 및 시트의 조립되고 압축된 적층물을 함께 지지하고 있다. 이는, 기저 플레이트(700) 및 커버 플레이트(702)의 측벽에 있는 홈(groove) 내로 맞물리는 각각의 클램프(704)의 2개의 구부러진 에지의 도움으로 성취된다. 제조 장치의 상세한 부분 X는 도 10에 나타냈으며 하기에 보다 상세히 추가로 기술한다.
도 10은 도 9의 제조 장치의 상세한 부분 X의 확대도를 나타내며, 특히 상기 상세한 부분은 2개의 완전히 조립된 제조 유닛(10)을 나타낸다. 제2의 흡수 시트(402)는 관찰 플레이트(500)로부터 떨어진 측면 위의 제1 흡수 시트(400)에 인접하고 이와 접촉하도록 배열된다. 제2 흡수 시트(402)는 제1 흡수 시트(400)보다 더 높은 흡수 용량을 갖는다. 이는 흡수 시트에 의해 흡수될 수 있는 액체의 총량을 증가시키며, 개별 제조 세포의 상호 분리를 증진시켜 교차-오염의 위험을 감소시킨다.
도 11은 조립된 상태의 도 2에 따른 제조 장치의 투시도를 나타내며, 여기서 적층물은 2개의 클램프(704)(단지 하나의 클램프만을 나타냄)로 함께 클램핑된 기저 플레이트(700) 및 커버 플레이트(702)를 포함한다. 조립된 상태에서, 제조 장치는 매우 치밀하고 견고하며 원심분리기 내로 용이하게 위치시킬 수 있다. 이 실시양태에서, 제조 장치는 표준 풋프린트(footprint)를 갖는다. 따라서, 임의의 조정없이 통상적인 원심분리기, 예를 들면, "샨돈 사이토스핀 4 사이토원심분리기" 내로 위치시킬 수 있다.
도 2 내지 11에 따른 제조 장치는 교차-오염에 대하여 상호 분리된 개별 유닛(10)을 포함하며 이에 따라 동시에 수행되는 다수의 제조에 적합하다. 웰-플레이트(200)는 웰들 사이의 표준화된 거리를 갖고 표준화된 풋-프린트를 갖는 치밀한 방식의 개별 유닛(10)의 통로(30) 및 저장 챔버(20)를 제공한다. 관찰 플레이트(500)는 개별 유닛(10)의 관찰 부재(50)를 제공하여 관찰 부재(50)가 자동화된 영상 분석을 통해 효율적인 관찰을 제공하도록 함께 처리할 수 있다. 제1 흡수 시트(400)는, 관찰 플레이트(500)로부터 액체를 제거하는, 그러나, 조절된 흡수 속도로 제거하여 흡수 동안에 액체와 함께 세포가 끌려나가는 것을 방지하는 제1 수단으로서 작용한다. 제2 흡수 시트(402)는 액체를 제거하는 데 있어서, 및 개별 제조 유닛의 상호 분리를 증진시키기 위하여 제1 흡수 시트(400)를 보조하는 작용을 한다.
중간 플레이트(602)는 스프링 플레이트(600)의 스프링(604)에 의해 가해진 개개의 압축력을 균일하게 분배하는 작용을 하고 스프링(604)에 의해 관찰 플레이트(500)의 스크랫칭을 방지한다. 스프링 플레이트(600)는 압축력을 플레이트와 시트의 적층물에 적용하는 작용을 하는 데, 이러한 적층물은 기저 플레이트(700), 커버 플레이트(702) 및 클램프(704)의 도움으로 치밀하고 견고한 방식으로 함께 유지된다. 페그(706)는 조립 동안에 플레이트들의 적층물을 적절하게 정렬하는 작용을 한다. 압축력을 증가시키는 것이 바람직한 경우, 추가의 이격(spacer) 플레이트를 변하지 않고 잔류하는 나머지 적층물과 함께 삽입할 수 있다(이에 따라, 스프링 플레이트(600)의 스프링의 압축을 증가시킨다). 전체 조립된 제조 장치는 표준 원심분리기 내로 위치시켜서 다수의 세포 제조가 동시에 수행될 수 있도록 한다.
위에서 언급한 바와 같이, 하나 이상의 염색물을 함유하는 하이드로겔을 관찰 부재 또는 관찰 플레이트 위에 각각 침적된 세포에 적용하는 것이 유리할 수 있다. 하이드로겔은 적어도 하나의 염색물을 함유할 수 있으며, 상기 염색물은 세포의 특정 성분에 결합할 수 있다. 예를 들면, 하이드로겔은 아가로즈 하이드로겔이고 2개의 염색물을 함유하는 데, 하나는 세포의 특정 성분 또는 구조, 예를 들면, 핵 또는 미세핵에 결합하도록 조정되며, 다른 염색물은 세포 경계에 결합하도록 조정된 것일 수 있다. 특정 성분 또는 구조, 또는 세포 경계에 각각 결합되는 경우, 각각의 염색물은 각각의 미리 결정된 파장의 광으로 여기되는 경우 형광성인 반면, 이러한 특정 세포 성분, 구조 또는 경계에 결합되지 않는 한 형광성이 아니다.
아가로즈 하이드로겔은, 관찰 부재 또는 관찰 플레이트 위에 침적된 세포들의 형태를 유지시키는 것과 관련하여 유리할 수 있는 습윤 상태에서 관찰 부재 위에 침적된 세포를 유지시킨다. 위에서 언급한 아가로즈 하이드로겔과 같은 하이드로겔은 실온에서, 본질적으로 고체인 것으로 말해지는 젤라틴과 유사한 상태로 존재한다. 이는 세포가 건조되는 것 뿐만 아니라 오염되는 것도 보호한다. 그러나, 염색물의 분자와 같은 소분자는 하이드로겔 속에서 실질적으로 자유로이 이동가능하며 하이드로겔을 통해 세포 내로 확산되어, 이들은 특정 세포 성분, 예를 들면, 핵, 미세핵, 세포의 다른 전용 성분, 또는 세포 경계에 결합한다.
상부에 세포가 침적되고 염색물을 함유하는 하이드로겔(502)로 덮여진 관찰 플레이트(500)의 상세한 사항은 도 12에 개략적으로 나타내었다. 이와 같이 제조된 관찰 플레이트(500)는 미리 결정된 시간 동안 저장되어 염색물이 세포(501) 내로 확산되고 핵 및 잠재적 미세핵 및 세포 경계에 각각 결합하도록 할 수 있도록 한다. 이 후, 세포를 현미경 분석하여 세포 및 세포 구조의 고 콘트라스트 현미경 상을 수득할 수 있다.
상기 방법의 보다 상세한 예는 다음에 기술할 것이다:
세포 배양
"L5178Ytk+/-" 타입의 마우스 림프종 세포는 10% 말 불활성화된 혈청(horse inactivated serum), 2 mM L-글루타민, 및 1% 펜/스트렙(pen/strep) 항생제를 함유하는 RPMI 1640 배지 속에서 T-175 플라스크 속의 현탁액 중에서 75% 컨플루언시(confluency) 및 95% 생존율로 부유배양하였다(모든 배지는 미국 캘리포니아주 칼스배드 소재의 라이프 테크놀러지즈 코포레이션에서 입수가능하다).
화합물 배양
화합물 배양은 미국 뉴저지주 벡톤 딕킨슨(Beckton Dickinson)에서 입수가능한 "Falcon 353077" 타입의 96웰 플레이트에서 60㎕ 성장 배지에 8000개 세포를 사용하여 37℃, 5% CO2에서 24시간 동안 수행하였다. 화합물들은 디메틸 설폭사이드 DMSO (가끔 물에)에 1%의 최종 DMSO 농도로 용해시킨다. 양성 대조군으로서, 15㎍/ml 메틸메탄설포네이트(MMS)를 사용하였다.
세포 원심분리 및 고정
250㎕ 피펫 팁을 사용하여 5회 혼합한 후에, 독일 제나(Jena) 소재의 사이바이오 아게(Cybio AG) 사에서 입수할 수 있는 "CyBi-well" 타입의 96헤드의 자동화된 피펫터(pipetor)를 이용하여 세포 현탁액 중에서 50㎕를 배양 플레이트로부터 역 깔때기 플레이트(inverted funnel plate)[참조: 도 4 및 도 5에 나타낸 웰 플레이트(200)의 챔버(20)]의 챔버들 속으로 이동시킨다.
세포 제조 장치는 본질적으로 도 2에 나타낸 바와 같이 조립한다. 동일한 강도의 96개의 나선형 스프링으로 이루어진 스프링 플레이트(600)를 프레임의 기저 플레이트(700)의 상부에 위치시키고 보호를 위해 얇고 가요성인 금속 중간 플레이트로 덮는다. 다음으로 적층된 조립체에서, 전용 유리 플레이트(500)는 세포를 수용하기 위한 관찰 플레이트로서 작용한다. 상기 플레이트는 독일 제나 소재의 쇼트 테크니컬 글래스 솔루션즈 게엠베하(Schott Technical Glass Solutions GmbH)에서 입수할 수 있는 "넥스테리온(Nexterion)" 유리 플레이트일 수 있다. 2개의 천공된 필터 페이퍼 플레이트(400) 및 (402)가 사용되며, 각각 SBS-표준 간격(SBS = Society for Biomolecular Science)으로 96개의 구멍을 갖는다. 유리 플레이트(500)와 접촉되는 제1 필터 플레이트(400)는 96개의 샘플 스팟(sample spot)들 각각의 경계들을 형성하고 원심분리 동안에 현탁액으로부터 배지를 제거하기 위한 것이다(3.5mm 직경의 구멍). 한정된 속도로 균일하고 등방성인 액체 제거를 성취하기 위하여, 필터 물질을 0.5 mm의 두께로 각각의 웰을 둘러싸는 고리의 형태로 압축시켰다. 느슨한 접촉으로 제1 필터 플레이트(400)의 상부에 놓이는 제2 필터 플레이트(402)는 제1 필터 플레이트(400)의 보유 용량을 증가시키기 위한 것이며 역 깔때기 플레이트(200)의 에지(32) 주변에 잘 맞도록 하기 위해 보다 큰 구멍(7.0 mm 직경)을 포함한다. 세포 현탁액으로 채워진 깔때기 플레이트(200)를 제1 필터 플레이트(400)의 상부에 주의깊게 위치시키고 제2 필터 플레이트(402)의 구멍 속에 맞춘다. 조립체는 제조 장치의 커버 플레이트로 마무리된다. 수동 레버 프레스로 사전에 압축시키고, 제조 장치를 실질적으로 공간을 차지하지 않는 측면으로부터 2개의 금속 브라켓(704)를 이용하여 고정시켜서, 전체 장치가, 시판되는 원심분리기 예를 들면, 독일 헤라에우스(Heraeus)로부터 입수할 수 있는 유형 "멀티퓨즈(Multifuse) 1S"의 마이크로-타이터 플레이트 버켓(micro-titer plate bucket) 내로 맞추어진다. 상기 특정한 원심분리기는, 5분 동안 유지되는, 1000RPM의 설정 원심분리 속도로 즉시 가속된다. 제조 장치를 분해한 후에, 플레이트를 대기에서 1분 동안 건조시킨 다음, 고정을 위해 하룻밤 동안 및 저장을 위해 1주까지 70% 에탄올/물 속에 침지시킨다.
오염 및
마운팅
예비조건화로서 5분간 고정시킨 후, 유리 플레이트를, 과량의 액체를 진탕제거하고 1분간 건조시키고 인산염 완충된 염수(PBS) 속에 침지시켰다. 세포가 침적된 표면 반대쪽의 플레이트의 바닥면을 이중 증류수(ddH2O)로 2회 신속하게 세정한 후, 플레이트를 계수하기 위해 준비하였다.
세포를 습윤 상태로 유지시키고 세포 형태의 바람직하지 않은 변화 및 염색제 인공물을 방지하기 위하여, 세포를 아가로즈 하이드로겔로 덮는 것이 유리함이 입증되었다. 이러한 목적으로, 시그마-알드리히 코포레이션(Sigma-Aldrich Corporation, 미국 미주리주 소재)에서 시판하는 "저-융점 저 겔화 온도 아가로즈 타입 VII"을 850W의 마이크로웨이브파 오븐에서 PBS 중 최종 2% 중량/용적 용액이 되도록 용해하였다. 분말이 완전히 용해되기 전까지 수분이 걸리며 수회의 비등 및 혼합 주기가 요구된다. 시그마 알드리히 코포레이션(미국 미주리주 소재)로부터 시판되는 "훽스트(Hoechst)" 타입의 염색제[1μM (H2O)]을 이용한 세포핵 염색, 및 라이프테크놀로지스 코포레이션(Life Technologies Corporation, 미국 캘리포니아주 칼스바드 소재)로부터 시판되는 "세포 차폐 레드(cell mask red)" 타입의 염색제[1㎍/ml (PBS)]를 사용한 세포질 염색은 추가의 세척 단계를 필요로하지 않으므로 아가로즈 겔 속에서 수행될 수 있다. 이는, 염색제 훽스트가 용액 속에서 실질적으로 비-형광성이며 DNA에 결합되는 경우에만 형광성이라는 사실 및 영상 획득이 공촛점 여기(confocal excitation) 및 검출에 의해 수행된다는 사실에 기인하므로, 아웃 포커스(out-of-focus) 배경은 현저히 감소된다. 염색제를 함유하는 액체 아가로즈 용액을 50℃에서 유지시키고 25ml의 1회용 피펫을 사용하여 플레이트 위에 붓는다. 용액은 표면 장력으로 인하여 플레이트 상에 머무르고 에지 위로 넘치지 않는다. 20 내지 30분 후, 겔이 경화되고 플레이트를 유리에서와 같이 동일한 회사로부터 시판되는 유리 "넥스테리온(Nexterion)"에 대한 전용의 뚜껑이 있는 틀 속에 장착할 수 있다.
영상
96개 특징들을 갖는 유리 플레이트의 회전-디스크 공촛점 형광 현미경을 독일 함부르크에 소재하는 회사 퍼킨엘머 셀룰러 테크놀로지스(PerkinElmer Cellular Technologies)로부터 시판되는 고-처리량 자동화 영상 시스템 "오페라(Opera) QEHS" 상에서 수행하였다. 핵 염색제(훽스트) 및 세포질 염색제(세포 차폐 레드)를 고체상 레이저에 의해 각각 405nm 및 635nm에서 여기(exciting)시켰다.
조명원의 여기 강도(excitation intensity) 및 지속 기간은 휘도(brightness) 및 콘트라스트를 최적화하며 퇴색(bleaching)을 최소화하기 위하여 각각의 실험에서 표지 효율 차이를 고려하여 조절하였다(일반적으로, 50mW 레이저 출력, 200 내지 2000 ms 통합 시간).
각각의 점, 일반적으로 주사 영상(scanning image)의 25개 쌍을 LCPLF 20x NA 0.4 공기 대물렌즈[일본 올림푸스(Olympus) 사에서 시판] 및 최적화된 여과기 세트를 통해 2개의 독립된 고 양자-효율 12 비트 CCD 카메라(1.3 메가 화소 모노크롬)에 의해 기록하였다. 임의의 잔류성 조명 이질성, 영상 이동 또는 왜곡은 교정 시료로부터의 별도로 획득된 영상을 사용하여 교정하였다.
영상 분석
공촛점 현미경 사진을 둘다 독일 함부르크 소재의 퍼킨엘머 셀룰러 테크놀로지스로부터 구입가능한 퍼킨엘머의 "오페라" 영상 시스템의 등록된 소프트웨어 환경 "아카펠라(Acapella) 2.0"을 사용하여 분석하였다. 첫째로, 각각의 세포의 위치를 핵 염색 영상의 분할로 확인하였다. 핵이 국재화되고 이들의 윤곽 및 영역이 측정되면, 세포의 윤곽을 세포질 염색의 분할로 측정하였다.
또한, 미세 핵-함유 시료의 영상은 독일 뮌헨에 소재하는 데피니엔스 아게(Definiens AG) 사로부터 시판되는 영상 분석 소프트웨어 "이코그니션(eCognition)"을 이용하여 분석하였다.
도 13은 기술된 장치 및 방법으로 제조한 비-부착성 세포의 영상의 예를 나타낸다. 상부 열의 영상에서 세포는 상기 언급한 염색제 "훽스트"로 염색된 반면, 하부 열에서 세포는 또한 상기 언급된 염색제 "세포 차폐 레드"로 염색되었다. 좌측 컬럼에서, 세포는 처리되지 않은 반면, 우측 컬럼에서 세포는 유전독성 화합물로 처리되었다. 알 수 있는 바와 같이, 미처리된 유리 표면에 잘 달라붙는 상기 기술된 장치 및 방법으로 제조된 세포는 평편하게 전개됨으로써 세포내 구조가 잘 분리된다.
도 14는 기술된 장치 및 방법을 사용하여 수행된 미세핵 시험 분석 결과의 예를 나타낸다. 실험은 그래프 위의 범례에 나타낸 바와 같이, 4일의 상이한 날에 반복하여 수행하였다. 모든 세포에 대한 미세핵-함유 세포의 비를 그래프에 나타낸 바와 같이, 물질 농도에 대해 플롯팅한다. 상부 열은 비-유전독성인 것으로 공지된 물질을 함유하는 반면, 하부 열은 유전독성인 것으로 공지된 물질을 함유한다. 그래프로부터 모든 3개의 물질들이 정확하게 분류되었음을 알 수 있다. 플레이트 #13 및 #14는 음성 대조군으로서 임의의 독성 물질없이 DMSO(디메틸 설폭사이드)로만 처리하고, 이는 특히 하부 열에 나타낸 그래프에서 알 수 있다. 표기된 물질의 12개 희석물로 세포를 희석하였다. 농도 범위는 최대 농도(니트로퀴놀린 옥사이드 및 미토마이신 C에 대해 10μM, 모든 다른 물질에 대해 100μM), 희석 인자 1.5, 및 희석 횟수로 정의된다. 미세핵을 함유하지 않는 세포 및 1 내지 3개의 미세핵을 함유하는 세포를 통상의 제조된 영상 프로세싱 알고리즘을 사용하여 계수하였다. 그래프에서, 니트로퀴놀린 옥사이드 및 미토마이신 C에 대한 데이타는 디스플레이 목적의 경우에서만 10의 인자로 우측으로 이동시켰다.
Claims (17)
- 액체 속에 함유된 세포 및/또는 입자를 제조하기 위한 유닛(unit)(10)으로서,
상기 세포 및/또는 입자 함유 액체를 저장하고 미리 결정된 외력, 특히 원심력 적용시 배출구(exit opening)(22)를 통하여 상기 저장된 세포 및/또는 입자 함유 액체를 방출하도록 구성된 저장 챔버(storage chamber)(20);
통로 내로 인도하는 저장 챔버(20)의 배출구(22)를 갖는, 저장 챔버(20)의 배출구(22)에 인접하게 배열된 통로(passage)(30)로서,
상기 통로(30)는 배출구(22)의 단면적 보다 더 큰 단면적을 가지며, 상기 배출구(22)로부터 통로(30)로의 전환에서 벽은 에지(edge)(32)를 형성하는 통로;
방출되는 세포 및/또는 입자 함유 액체를 수용하기 위한 관찰 부재(observation member)(50); 및
통로(30)와 관찰 부재(50) 사이에 관찰 부재(50)와 인접하게 배열된 흡수 수단(absorbing means)(40)으로서,
상기 흡수 수단(40)은 세포 및/또는 입자 함유 액체가 구멍(42)을 통해 관찰 부재(50) 위로 이동하도록 하는 구멍(aperture)(42)을 가지며,
상기 흡수 수단(40)은 세포 및/또는 입자 함유 액체로부터 액체를 추가로 제거하여 관찰을 위하여 세포 및/또는 입자가 관찰 부재(50) 상에 남겨지도록 하는 흡수 수단
을 포함하는 유닛(10). - 제1항에 있어서,
상기 배출구(22)와 통로(30) 사이의 전환에서 에지(32)의 벽은 90도의 각(α)을 포함하는 유닛(10). - 제1항 또는 제2항에 있어서,
상기 저장 챔버(20)는 반구-형태(dome-shaped) 또는 깔대기-형태(funnel-shaped)의 부분(portion)(25) 및 상기 반구-형태 또는 깔대기-형태의 부분에 인접한 원통-형태(cylinderically-shaped)의 부분(26)을 포함하는 유닛(10). - 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 저장 챔버(20)는 미리 결정된 부피의 세포 및/또는 입자 함유 액체를 V포함하도록 구성된 것이며,
상기 미리 설정된 부피는 1 μl 내지 1000 μl, 특히 10 μl 내지 100 μl, 특히 50 μl인 유닛(10). - 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 저장 챔버(20)가 배출구(22) 반대편의 저장 챔버(20)의 말단에 배열된 통기구(24)를 포함하는 유닛(10). - 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 관찰 부재(50)가 광학적 관찰을 위한 슬라이드인 유닛(10). - 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 구멍(42)을 둘러싸는 흡수 수단(40)의 부분이 액체에 대한 미리 결정된 흡수 속도를 달성하기 위하여 미리 결정된 두께를 갖는 유닛(10). - 제7항에 있어서,
상기 구멍(42)을 둘러싸는 흡수 수단(40)의 벽 부분이 관찰 부재(50)를 향해 사전에 굽혀져서, 유닛(10)의 조립시 당해 사전에 굽혀진 부분이 관찰 부재(50)에 견고히 부착되는 유닛(10). - 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 따른 복수의 개별 유닛(10)을 포함하는 제조 장치로서,
상기 개별 유닛(10)이 교차-오염에 대하여 상호 격리된 제조 장치. - 제9항에 있어서,
96 웰-플레이트(200) 또는 384 웰-플레이트를 포함하는 제조 장치로서,
상기 복수의 개별 유닛(10)의 저장 챔버(20)가 각각 96 웰-플레이트 또는 384 웰-플레이트의 벽에 의해 형성되는 제조 장치. - 제9항 또는 제10항에 있어서,
개별 유닛(10)의 관찰 부재(50)를 형성하는 관찰 플레이트(500)를 추가로 포함하는 제조 장치. - 제11항에 있어서,
개별 유닛(10)의 흡수 수단(40)을 형성하는 제1 (400) 및 제2 (402) 흡수 시트를 추가로 포함하는 제조 장치로서,
제1 흡수 시트(400)가 관찰 플레이트(500)에 직접 인접하게 및 이와 접촉하게 배열되고, 제2 흡수 시트(402)가 관찰 플레이트(500)로부터 멀어지는 측면에 제1 흡수 시트(400)에 인접하게 및 이와 접촉하도록 배열되고, 제2 흡수 시트(402)가 제1 흡수 시트(400)의 것에 부가적인 흡수 용량을 갖는 제조 장치. - 제9항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 각각의 관찰 부재(50)에 대한 각각의 흡수 수단(40)의 견고한 부착을 성취하기 위하여 상기 개별 유닛(10)에 개별적인 압축력을 적용하기 위한 용수철 플레이트(600)를 추가로 포함하는 제조 장치. - 제13항에 있어서,
상기 용수철 플레이트(600)가 각각의 나선형의 용수철(604)이 개별 유닛(10)에 작용하는, 개별 유닛(10)의 수에 상응하는 복수의 나선형의 용수철(604)을 포함하는 제조 장치. - 액체 속에 함유된 세포의 제조 방법으로서,
비부착성 세포를 포함하는 액체를 저장 챔버(20) 속으로 분배하는 단계;
접착력(adhesion force) 및/또는 표면장력의 수단 만에 의해 중력에 대하여 저장 챔버(20) 내에 비부착성 세포를 함유하는 액체를 유지하는 단계;
저장 챔버(20)로부터 관찰 부재(50) 상으로 액체를 방출시키기 위하여, 비부착성 세포를 함유하는 액체에 추가적인 미리 결정된 외력, 특히 원심력을 적용하는 단계; 및
관찰을 위하여 관찰 부재 상에 비부착성 세포를 남기도록 관찰 부재(50)로부터 액체를 제거하는 단계를 포함하는 제조 방법. - 제15항에 있어서,
상부에 세포가 침적된 관찰 부재(50) 상에 하이드로겔을 포함하는 코팅을 적용하는 단계를 추가로 포함하는 방법으로서,
상기 하이드로겔이 세포의 특정한 성분(dedicated component)에 결합할 수 있고 미리 결정된 파장의 빛에 의해 여기되어 형광을 띠는 염색제를 적어도 하나 포함하는 방법. - 제15항 또는 제16항의 방법을 사용하여 세포를 제조하는 단계;
상기 제조된 세포를 현미경 아래 위치시키는 단계; 및
현미경 이미지를 분석하는 단계를 포함하는 세포의 현미경 분석 방법.
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