CN102665917A - 用于制备液体中的细胞和/或颗粒的单元和装置以及用于显微镜分析的方法 - Google Patents
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Abstract
用于制备在液体中含有的细胞的单元(10)，其包括贮藏室(20)，该贮藏室设定成用于储存含细胞的液体和当应用预定的外力，特别是离心力时，通过出口(22)释放储存的液体。与出口(22)邻近排列的通道(30)具有比出口(22)的横截面更大的横截面。出口(22)至通道(30)的过渡处的壁形成了边缘(32)。该单元还包括用于接收释放的液体的观察构件(50)和在通道(30)和观察构件(50)之间的与观察构件(50)邻近排列的吸收装置(40)。该吸收装置具有孔，允许释放的液体移动到观察构件(50)上，并除去液体以使细胞留在观察构件(50)上用于观察。
Description
本发明涉及在液体中含有的贴壁细胞或非贴壁细胞和/或颗粒的制备。
对于观察在液体中含有的生物细胞，制备单元在药物工业中是熟知的。例如，此类制备单元在来自公司Thermo Fisher Scientific Inc.，81 WymanStreet，Waltham，美国以名称“Shandon EZ Single Cytofunnel”是可得到的。该单元包括贮藏室、过滤卡(filter card)和光学载玻片。
对应的过滤卡由高吸收性材料制备，并在中心具有孔。通常，过滤卡与载玻片邻近排列，以使过滤卡的孔限定载玻片上的沉积区域。因此，该沉积区域被过滤卡的高吸收性材料围绕。
最初，将含细胞的液体保持在与载玻片分离的贮藏室中。在将制备单元放置在例如，“Shandon Cytospin 4 Cytocentrifuge”中的专用离心机后，并以一定的速度旋转制备单元时，旋转作用斜置制备单元，从而通过过滤卡中的孔，将含细胞的液体从贮藏室释放到载玻片上的沉积区域。一旦含细胞的液体达到沉积区域，该液体将通过过滤卡的高吸收性材料除去，将细胞留在载玻片的沉积区域。然后可以将玻璃板与制备单元分离并进一步用于细胞的显微镜观察。
尽管上述离心机可以同时处理12个制备单元，但期望的是更有效且高效的制备单元和/或制备装置。
因此，本发明的目的是提供用于高效地、可靠地且高质量地制备液体中含有的细胞和/或颗粒的制备单元、制备装置和方法。
根据本发明，该任务通过根据各个独立权利要求的制备单元、制备装置和方法解决。在从属权利要求中描述了根据本发明的制备单元和制备装置的其他实施方案。
具体而言，本发明涉及用于制备在液体中含有的细胞和/或颗粒的单元，其包括经配置用于储存含细胞和/或颗粒的液体，并在应用预定的外力，特别是离心力时，通过出口释放储存的含细胞和/或颗粒的液体的贮藏室。通道与贮藏室的出口邻近排列，贮藏室的出口通向通道。通道具有比出口的横截面更大的横截面。从出口过渡到通道处的壁形成了边缘。该单元还包括用于接收释放的含细胞和/或颗粒的液体的观察构件，以及在通道和观察构件之间与观察构件邻近排列的吸收装置(absorbing means)。该吸收装置具有孔，其允许含细胞和/或颗粒的液体通过孔流到观察构件上。该吸收装置还从观察构件上的含细胞和/或颗粒的液体中除去液体，以使细胞和/或颗粒留在观察构件上用于观察。根据本发明的制备单元是用于划算地、可靠地且高质量地制备细胞，特别是非贴壁细胞或者液体中原本含有的其他颗粒的小型且简单的单元。
在不需要应用任何额外的外力的情况下，抵抗作用于液体的重力，将液体以悬挂状态储存于贮藏室中。这通过粘附力和/或表面张力实现，所述粘附力和/或表面张力可以通过贮藏室或者其出口的合适形状有利地影响。因此，该液体可以可靠地维持在贮藏室中，从而防止在从贮藏室中释放液体前，该液体与吸收装置不受控制地接触。
此外，确保细胞和/或颗粒的小心处理。降低或者完全避免制备期间的损伤，导致了细胞死亡率和/或颗粒变形的减少。此外，避免了细胞的堵塞，从而对于多种制备物，提供了高度可重复的结果。在平行进行含细胞或者颗粒的多种液体的处理的情况下，如果通过多孔板提供多个制备单元，那么这是特别有利的。
此外，使用根据本发明的制备单元，可以在均一条件下，在贮藏室中维持的液体中沉淀细胞和颗粒。在释放具有细胞和颗粒的液体期间，该沉淀基本上保持不变。因此，分布在沉积区域上的所得细胞是非常均匀的。均匀分布是有利的，因为它们提供了好的观察条件，特别是对于自动图像分析。
作为实例，根据本发明的单元可以在药物工业中用于制备细胞和/或颗粒。
通过在贮藏室的出口处排列的边缘，借助于粘附力和/或表面张力，增强了贮藏室中液体的保留。因此，在没有应用额外的外力的情况下，液体可以以贮藏室的任一方向可靠地维持在贮藏室中。
对于非贴壁细胞与观察室的附着，离心处理是特别有利的，因为可以避免使用粘着性化学物。粘着性化学物具有风险，它们可能改变细胞的诱导状态，例如，通过与胞外基质蛋白质相互作用。
在根据本发明的单元的第一个实施方案中，出口和通道之间过渡处边缘的壁包括90度的角度。此种过渡是容易生产的。然而，其他形状的过渡也是可能的，例如交错形或者包括除90度以外的角度的边缘。
该角度可以是这样的尺寸，以提供液体的特性与形成边缘的壁的材料的特性之间的良好匹配。例如，对于具有高蠕动能力(creeping capability)的液体，边缘可以具有峰的形状(the shape of a peak)，即其可以包括小于90度的角度。
在根据本发明的制备单元的其他实施方案中，贮藏室包括圆顶形或者漏斗形部分以及邻接圆顶形或者漏斗形部分的圆柱形部分。在根据本发明的制备单元的其他实施方案中，贮藏室经构造以含有预定体积的含细胞和/或颗粒的液体，其中预定体积为1μl至1000μl之间，特别地10μl至100μl之间，和特别地50μl。其是在药物工业中通常使用的量，其中将处理少量的液体制备物。
在根据本发明的制备单元的其他实施方案中，贮藏室包括在贮藏室的出口对面末端处排列的通风口。这允许在离心期间从贮藏室中小心且均一地释放所储存的液体。通过通风口，将释放的液体所留下的空间用气体，例如空气填充。因此，可以防止由于液体的非均一或者不小心释放造成的对在液体中含有的细胞或者颗粒的任何不利影响。
此外，对于装填贮藏室，可以通过该通风口将含细胞和/或颗粒的液体有利地分配到贮藏室中。具体而言，其可以这样实现，将含具有细胞和/或颗粒的液体的移液器的开口端放置在通风口周围的壁上，并然后将压力应用于移液器中含有的液体，以使液体经通风口流向贮藏室。随着贮藏室的壁被液体浸湿，含细胞和/或颗粒的液体被吸入到贮藏室中。制备单元可以是预装配的，即通过将贮藏室与吸收装置和/或观察室组合，并然后借助于移液机器人用液体装填贮藏室。然而，应当提及，尽管优选的是通过通风口装填贮藏室，但还可以从相反端装填贮藏室。
在根据本发明的制备单元的其他实施方案中，观察室是用于光学观察的载片。具体而言，用于光学观察的载片是透明的载片，例如，载玻片如显微镜载片，并且可以是包被的或者未包被的。
在根据本发明的制备单元的其他实施方案中，吸收装置包括滤纸。滤纸提供了高的吸收能力并且相对便宜。当然，也可以使用除滤纸外的吸收装置。
在根据本发明的制备单元的其他实施方案中，围绕在孔周围的吸收装置部分具有预定的厚度，以实现对液体的预定吸收速度。吸收速度是可以控制的参数，以允许细胞和/或颗粒停留在观察构件上，而不是随移向并进入吸收装置的液体一起移走。
吸收装置可以具有台阶形状(step-shape)，以使其包括直接与孔邻近的内区域，在内区域吸收装置是压缩的，以控制吸收速度，还包括内区域周围的外区域，在外区域吸收装置是未压缩的，并具有高的吸收能力。这使得能够控制吸收速度以及除去大量的液体，并且还能在邻近排列单元的情况下防止交叉污染。
优选地，与孔邻近的吸收装置的表面是平坦的、水平的、平滑的或者光滑的，并且没有任何纤维泄露到孔中或者观察构件上的区域中，其中细胞沉积在所述孔或区域。这提供了制备方法的高度可再现性。
可以塑造贮藏室的出口通往的通道，以形成另外的边缘，其在单元的组装时使吸收装置施压于观察构件，以防止吸收装置与观察构件之间的间隙。这防止了细胞和/或颗粒从观察构件上的沉积区域中逸出，并且还防止了邻近排列的单元之间的交叉污染。
在根据本发明的制备单元的其他实施方案中，孔周围的吸收装置的壁部分是向观察构件预弯曲的，以致在单元的组装时，该部分可以与观察构件紧密连接。在这种构造的情况下，避免了观察构件与吸收装置之间的间隙。
本发明还涉及包括如上所述的多个独立制备单元的制备装置，其中独立单元对于交叉污染是互相分离的。用这种装置，可以平行进行多个制备，从而能够进行细胞和/或颗粒的自动化高通量制备、观察和/或分析。
根据本发明的制备装置的一个实施方案包括96孔板或者384孔板，其中多个独立单元的贮藏室分别由96孔板或者384孔板的孔形成。其具有这样的优点，独立单元的贮藏室组合在紧凑的标准孔板中，所述紧凑的标准孔板具有孔间的标准化距离，并具有标准化的足迹(foot-print)，使得可以通过此类多孔板的标准装置非常有效地处理它们。例如，可以同时装填该平板的各个孔的全部贮藏室。
在其他实施方案中，根据本发明的制备装置包括形成独立单元的观察构件的观察板。因此，可以共同地处理独立单元的观察构件，以通过自动化图像分析提供有效的观察。
在其他实施方案中，根据本发明的制备装置包括形成独立单元的吸收装置的第一和第二吸收层，其中第一吸收层与观察板直接邻近地排列并与观察板接触，并且其中第二吸收层在远离观察板的侧面上与第一吸收层邻近排列并与第一吸收层接触。第二吸收层具有的吸收能力增加了第一吸收层的吸收能力(例如，第二吸收层的吸收能力可以高于第一吸收层的吸收能力)。其具有这样的优点，可以增加吸收的液体的总量，并改进了各个制备细胞的相互分离，从而降低了交叉污染的风险。
在其他实施方案中，根据本发明的制备装置包括用将各个压缩力施加于独立单元的弹簧板，以实现各个吸收装置与各个观察构件的紧密连接。该压缩力将吸收装置牢牢地压在观察构件上，以防止间隙(参见上文)。此外，压缩还补偿了第一吸收层的厚度的个体变化。
在根据本发明的制备装置的其他实施方案中，弹簧板包括对应于独立单元的数目的多个螺旋形弹簧。每一螺旋形弹簧作用于一个独立单元。这导致将各个压力应用于每一独立制备单元，观察板的各个部分挤压向各个贮藏室，各个吸收装置排列其间。螺旋形弹簧例如，可以是圆锥形的。
本发明还涉及用于制备在液体中含有的细胞(特别是但并非仅仅是非贴壁细胞)的方法，包括步骤：将含细胞的液体分配到贮藏室中；仅通过粘附力和/或表面张力，抵抗其重力，将含细胞的液体维持在贮藏室中；将额外的预定外力，特别地离心力应用于含细胞的液体以将液体从贮藏室中释放到观察构件上；从观察构件中除去液体，将细胞留在观察构件上用于观察。
通过应用额外的预定外力，特别地离心力，将细胞与观察构件的表面连接。此外，通过应用所述力，使细胞展平，以使细胞内结构更多相互侧面相邻地伸展而是重叠。这改进了细胞结构的显微分析，因为显微图像基本上是三维细胞结构的两维投影。这可能与暴露于细胞的物质对细胞的结构或者组分，例如对内体、线粒体、细胞核或者微核的基因毒性作用的测定特别相关。
当细胞沉积在观察构件上后，可以干燥细胞并然后进行显微镜分析，根据本发明的制备方法的一个实施方案还包括将包含水凝胶的涂层应用在其上具有沉积的细胞的观察构件上的步骤。水凝胶含有至少一种染料，其能与细胞的专门组分结合。与细胞的专门组分结合的染料当用预定波长的光激发时是发荧光的，而只要其不与该专门细胞组分结合，其是不发荧光的。
作为实例，水凝胶可以是琼脂糖水凝胶，其使在观察构件上沉积的细胞保持在湿润状态。对于维持沉积在观察构件(例如显微镜载片)上或者前述观察板上的细胞的形态学，水凝胶是有利的。在室温，水凝胶如前述琼脂糖水凝胶以类似于明胶的状态存在，即其基本上为固体。其使细胞免于干枯并免于受到污染。然而，小分子如染料的分子基本上可以在水凝胶中自由移动，并通过水凝胶扩散到细胞中，在那里它们与专门的细胞组分，例如细胞核、微核、细胞的其他专门组分，或者与细胞边界结合。
该实施方案是有利的，因为与将染料应用于沉积在观察构件上的细胞、从观察构件中洗去任何过量的未扩散到细胞中的染料、然后将具有染色细胞的观察构件放置在显微镜下用于显微镜分析相反，洗涤步骤可以完全省去，因为染料已经包含于水凝胶中并扩散到细胞中，不需洗去任何过量的染料。
因此，本发明的另一方面涉及用于细胞的显微镜分析的方法，包括步骤
-使用根据本发明的前述制备方法制备细胞，
-用预定波长的光照明细胞
-将制备的细胞放置在显微镜下和
-分析显微镜图像。
在用预定波长的光照明后，只有已经扩散到细胞中并与细胞的专门组分结合的染料才显示出荧光。例如，染料可适合于与细胞的胞核和潜在的微核结合。因此，可以测定微核的形成，所述微核的形成可以作为在显微镜分析之前细胞所暴露的特定的物质可以是基因毒性的指示。
如果提供了其他染料并其扩散到细胞中且与细胞边界结合，并且在用其他预定波长的光照明细胞后，其他染料也显示出荧光，以至于细胞的边界以及细胞内的任一专门结构都清楚可见，因而进一步增强了显微镜图像的反差。
通过示例性实施方案和参考附图的方式，在下文中更详细地描述了本发明。其显示于：
图1根据本发明的独立制备单元的实施方案的横截面图；
图2根据本发明的制备装置的实施方案的立体透视图；
图3图2的制备装置的侧视图；
图4沿图3的线IV-IV的横截面图；
图5图4的细节V的放大图；
图6图4的细节VI的放大图；
图7图2的细节VII的放大图；
图8在组装状态中图2的制备装置的侧视图；
图9沿图8的线IX-IX的横截面图；
图10图9的细节X的放大图；
图11在组装状态中图2的制备装置的透视图，
图12图2的装置的观察板的细节，其中其上沉积了细胞，并用含染料的水凝胶覆盖。
图13用根据本发明的装置和方法制备的非贴壁细胞的示例性图像，和
图14使用根据本发明的装置和方法进行的微核测试的分析结果的实例。
图1显示用于制备根据本发明的在液体中含有的细胞和/或颗粒的制备物的独立制备单元10的实施方案的横截面图。
制备单元10包括用于储存细胞悬浮液的储藏室20。储藏室20包括圆顶形或漏斗形部分25，以及与圆顶形部分25邻接的圆柱形部分26。贮藏室20可设定用于含有预定体积的细胞悬浮液，其通常为1μl至1000μl之间，特别地10μl至100μl之间，和特别地50μl。在圆顶形部分25的远端处，贮藏室20包括出口22。贮藏室20还包括通往圆顶形部分25的通风口24。
圆柱形通道30与贮藏室20的出口22邻近排列。通道30具有比出口22的横截面更大的横截面。具体而言，通道30与贮藏室20的出口22同轴排列。在出口22至通道30的过渡处，壁形成了边缘32。在该实施方案中，边缘32包括90度的角度α。
在远离贮藏室20的出口22的侧面，具体为滤纸40的吸收装置40与通道30邻近排列。滤纸40可以是坐标纸或者层析纸，特别地获自公司Whatman Ltd，Brentford，伦敦，英国的Grade 17Chr纸。滤纸40具有孔42。孔42与圆柱形通道30同轴排列。
具体为载玻片50的观察构件与滤纸40邻近排列，使得滤纸40在通道30与载玻片50之间排列。此外，塑造制备单元10的通道以形成另外的边缘34，其与滤纸40邻近排列。边缘34将滤纸40挤压向载玻片50，以防止滤纸40与载玻片50之间的间隙。
部分25和26形成了贮藏室20的内部空腔，用于储存包括液体和在液体中包含的细胞的细胞悬浮液，只要除重力外没有应用其他外力。在这方面，边缘32连同粘附力和/或表面张力帮助将细胞悬浮液抵抗重力保留在贮藏室20中。然而，当应用预定离心力时，细胞悬浮液从贮藏室经出口22释放。然后，空气可以流经通风口24进入贮藏室20，从而填充由于释放的细胞悬浮液留下的空白空间。还可以通过将移液器的末端放于通风口24周围的壁、对移液器中细胞悬浮液应用预定的压力(例如通过挤压移液器)，从而细胞悬浮液通过通风口24被吸入贮藏室20的加宽的圆顶形部分，并然后进入圆柱形部分26。
通道30和孔42允许细胞悬浮液(其已经从贮藏室20中释放)从贮藏室20移动到载玻片50。载玻片50用于接收经孔42释放的细胞悬浮液。滤纸40的孔42设定用于接触接收的细胞悬浮液，以便除去来自细胞悬浮液的液体，并留下沉积在载玻片50上的细胞。可以通过孔42周围的滤纸40部分的高度控制液体的吸收速度。一旦吸收了液体并且细胞沉积在了载玻片50上，就可以将载玻片50转移至成像装置，例如显微镜或者平板读数器。
图2显示根据本发明的制备装置的实施方案的立体透视图。该制备装置包括一套不同的平板和薄层，即从底部到顶部以以下顺序：基板700、弹簧板600、中间板602、观察板500(例如玻璃板)、第一吸收层400(例如第一滤层)、第二吸收层402(例如第二滤层)、孔板200(例如漏斗板)和盖板702。
制备装置包括96个单独的单元10(参见图1)。孔板200包括贮藏室20和通道30，第一吸收层400包括吸收装置40，并且观察板500包括观察构件50。
中间板602用于补偿由独立制备单元10上弹簧板600的各个弹簧施加的不同压力。此外，中间板602防止观察板500受到弹簧板600的弹簧604的刮划(还参见图7中的细节VII)。
基板700包括多个钉706，其在组装期间帮助平板组套正确地排列。这些钉706与弹簧板600和孔板200中的对应孔啮合。此外，显示了夹子704，其适合于将装配的且压缩的组套维持在一起作为紧凑的制备装置。为此，夹子704是U形的，其中配置的两个弯曲边缘啮合到在基板700和盖板702的侧壁中存在的槽中。
图3显示了图2的制备装置的侧视图，并且图4显示了沿图3的线IV-IV的横截面图，参考相同的参考编号。在图5中放大显示了显示孔板200的一部分的细节V，并且在图6中放大显示了显示第一吸收层400的一部分的细节VI。这些部分在下文进行了更详细的描述。
图5显示了图3的孔板200的细节V的放大图。细节V显示了孔板200的96个独立制备单元中的两个的部分。各个单元的每一部分都包括用于独立地储存和释放各个细胞悬浮液的贮藏室20和通道30。
图6显示了图3的第一吸收层400的细节VI的放大图。该细节显示吸收层400的96个独立单元的一个完整单元，所述吸收层400包括被吸收层400围绕的孔42。吸收层400在围绕孔42的区域中具有台阶形横截面，所述孔具有围绕孔42且具有更小厚度的内部区域44，并且具有围绕内部区域44且具有比内部区域44的厚度更大的厚度的外部区域45。通过压缩吸收层400可以获得内部区域44的更小厚度。通过该压缩，可以将液体的吸收速度调整到期望的速度。外部区域45保持未压缩，以对待除去的液体显示出高的吸收能力。
图7显示了具有两个螺旋形弹簧604的图2的弹簧板600的细节的放大图。螺旋形弹簧604排列在弹簧板600和中间板602之间。每一螺旋形弹簧604作用于一个独立单元10(参见图1)。因此，每一弹簧604的力将各个压力应用于中间板602的对应区域，所述中间板602的对应区域反过来将压力应用于观察板500的对应区域，所述观察板500的对应区域挤压向包含各个贮藏室20的孔板200。
螺旋形弹簧604可以是圆锥状，其中与弹簧板600邻近排列的弹簧绕线具有大的直径，并且绕线的直径朝中间板602的方向减少。
图8显示了在组装状态中图2的制备装置的侧视图，并且图9显示了沿图8的线IX-IX的横截面图。两个夹子704(仅显示了一个)将组装的且压缩的平板和薄层组套维持在一起作为紧凑的制备装置。这借助于每一夹子704的两个弯曲边缘实现，所述两个弯曲边缘啮合到在基板700和盖板702的侧壁中存在的槽中。制备装置的细节X显示于图10中，并在下文进行了更详细的进一步描述。
图10显示了图9的制备装置的细节X的放大图，并且特别地该细节显示了两个完全组装的制备单元10。在远离观察板500的侧面，第二吸收层402与第一吸收层400邻近排列并与第一吸收层400接触。第二吸收层402具有比第一吸收层400的吸收能力更高的吸收能力。这增加了可以由吸收层吸收的液体的总量，并帮助改进了独立制备单元的相互分离，从而降低了交叉污染的风险。
图11显示了在组装状态中根据图2的制备装置的透视图，用两个夹子704(仅显示了一个夹子)将包括基板700和盖板702的组套夹在一起。在组装状态中，制备装置是非常紧凑且牢固的，并且可以容易地放置到离心机中。在该实施方案中，制备装置具有标准的足迹(footprint)。因此，可以在没有任何修饰的情况下将其放置在常规离心机，例如“Shandon Cytospin 4细胞离心机”中。
根据图2至11的制备装置包括多个独立的单元10，其是相互分离的，避免了交叉污染，并因此适合于平行进行的多个制备。孔板200提供了紧凑的方式的独立单元10的贮藏室20和通道30，具有孔间标准化距离且具有标准化足迹。观察板500提供了独立单元10的观察构件50，使得可以共同处理观察构件50，以提供通过自动化图像分析的高效观察。第一吸收层400用作为从观察板500中除去液体的主要工具，然而，其具有可控制的吸收速度以防止在吸收期间细胞与液体一起被吸走。第二吸收层402用于在除去液体中辅助吸收层400，并用于改进独立制备单元的相互分离。
中间板602用于均匀分布通过弹簧板600的弹簧604施加的各个压缩力，并防止观察板500受到弹簧604的刮划。弹簧板600用于将压缩力施加给平板和薄层的组套，所述平板和薄层的组套借助于基板700、盖板702和夹子704以紧凑且牢固方式维持在一起。钉706用于在组装期间正确地排列平板组套。如果期望增加压缩力，可以在剩余的组套保持不变的情况下插入额外的间隔板(从而增加弹簧板600的弹簧的压缩)。可以将完整组装的制备装置放置到标准离心机中，以使可以同时进行多个细胞制备。
如上所述，有利的是将含一种或多种染料的水凝胶分别应用于观察构件上或者观察板上沉积的细胞。水凝胶可以含有至少一种染料，所述至少一种染料能与细胞的专门组分结合。例如，水凝胶是琼脂糖水凝胶并含有两种染料，一种染料适合于与细胞的专门组分或者结构，例如与细胞核或者微核结合，并且其他染料适合于与细胞边界结合。当分别与专门的组分或者结构，或者与细胞边界结合时，当用各个预定波长的光激发，各个染料是发荧光的，而只要其没有与该专门的细胞组分、结构或者边界结合，其是不发荧光的。
琼脂糖水凝胶使沉积在观察构件上的细胞保持在湿润状态，其对于维持沉积在观察构件上或者观察板上的细胞的形态学是有利的。在室温，水凝胶如前述琼脂糖水凝胶以类似于明胶的状态存在，即其基本上为固体。其使细胞免于干透以及免于受到污染。然而，小分子如染料的分子基本上可以在水凝胶中自由移动，并扩散通过水凝胶进入到细胞中，在那里它们与专门的细胞组分，例如如细胞核、微核、细胞的其他专门组分，或者与细胞界限结合。
具有其上沉积了细胞501并用含染料的水凝胶502覆盖的观察板500的细节图解显示于图12中。可以将如此制备的观察板500储存预定的时间，以允许染料扩散进入细胞501并分别与细胞核和可能的微核以及与细胞边界结合。随后，将细胞进行显微镜分析，产生了细胞和细胞结构的高反差显微镜图像。
本方法的更详细实例描述于下文中：
细胞培养
在T-175烧瓶中，在含10％马灭活血清、2mM L-谷氨酰胺和1％青霉素/链霉素抗生素的RPMI 1640中，将“L5178Ytk+/-”型的小鼠淋巴瘤细胞悬浮培养至75％汇合以及95％存活(全部培养基都可从LifeTechnologies Corporation，Carlsbad，California，美国得到)。
化合物温育
在37℃，5％ CO2，用60μl生长培养基中的8000个细胞在获自BecktonDickinson，New Jersey，美国的型号为“Falcon 353077”的96孔板中进行化合物温育24小时。将化合物以1％的最终DMSO浓度溶解于二甲亚砜DMSO中(偶尔也溶解于水中)。对于阳性对照，使用15μg/ml的甲磺酸甲酯(methylmethanesulfonate)(MMS)。
细胞离心&固定
在用250μl移液器头混合5次后，使用获自公司CyBio AG，Jena，德国的型号为“CyBi-well”的96头自动化移液器，将50μl细胞悬浮液从温育板中转移到倒置的漏斗板中(参见图4和图5显示的孔板200的小室20)。
基本上如图2中所示来组装细胞制备装置。将包含等强度的96个螺旋弹簧的弹簧板600放置在框架(frame)的基板700的上部并用薄的柔性的金属中间板602覆盖用于保护。其次，在堆积式组装中，将专门的玻璃板500用作为观察板以接受细胞。这种平板可以是获自Schott Technical GlassSolutions GmbH，Jena，德国的“Nexterion”玻璃板。使用两个有孔的滤纸板400和402，每一滤纸板都在SBS-标准间隔处具有96个孔(SBS=生物分子科学协会(Society for Biomolecular Science))。与玻璃板500接触的第一滤层400将形成每一个96样品点的边界，并除去离心期间来自悬浮液的培养基(3.5mm直径的孔)。为了以限定的速度实现均匀的且各向同性的液体去除，将过滤材料按围绕每一孔的环的形状压成0.5mm的厚度。
以疏松接触位于第一滤板400的上部的第二滤板402将增加第一滤板400的保留能力，并包括更大孔(7.0mm直径)用于更好地安装在倒置漏斗板200的边缘32。
将装满了细胞悬浮液的漏斗板200小心放置在第一滤板400的上部，并装入第二滤板402的孔中。通过制备装置的盖板完成组装。通过人工杠杆式压力机预压缩，使用两个金属托架704从基本上不占空间的侧面固定制备装置，使得将整个装置安装入，例如获自公司Heraeus，德国的型号为“Multifuge 1S”的市售离心机的微量滴定板桶中。这种特定的离心机可以立即加速到1000RPM的设定离心速度，维持5分钟。拆卸制备装置后，在环境空气中干燥平板1分钟，然后浸没在70％乙醇/水中固定过夜，并且保存长达一周。
染色和封片
固定后，在甩掉过量液体的情况下干燥玻璃板1分钟，并浸没在磷酸缓冲盐水(PBS)中5分钟作为预处理。用双蒸水(ddH2O)快速漂洗与平板的沉积了细胞的表面相反的底面，并然后将平板准备用于封片。
为了使细胞保持湿润状态，并且为了防止细胞形态的不期望改变和染色假象，证明用琼脂糖水凝胶覆盖细胞是有利的。为此，将获自Sigma-Aldrich Corporation，Missouri，美国的“低熔点低凝胶化温度琼脂糖型VII”在850W在微波炉中在PBS中溶解成最终2％重量/体积溶液。在粉末完全溶解前，其需要几分钟以及几次煮沸和混合循环。
可以在琼脂糖凝胶中进行用获自Sigma AldrichCorporation(Missouri，美国)的型号为“Hoechst”(1μM(H2O))的染料染色细胞的细胞核，和用获自Life Technologies Corporation(Carlsbad，California，美国)的型号为“cell mask red”(1μg/ml(PBS))的染料染色细胞的细胞核，不需要任意额外的洗涤步骤。这是因为以下事实，染料Hoechst在溶液中实际上是不发荧光的，并且只有当与DNA结合时才发荧光，以及图像获取是通过共焦激发和检测进行的，从而极大地降低了离焦背景。在50℃保持含染料的液体琼脂糖溶液，并使用25ml一次性移液器倒在平板上。该溶液会留在平板上，并且由于表面张力不会溢出边缘。20-30分钟后凝胶变硬，并且可以将平板封固在用于玻璃″Nexterion″的专门的有盖框中(可以与该玻璃相同的公司获得)。
成像
在获自公司PerkinElmer Cellular Technologies(Hamburg，德国)的高通量自动化成像系统“Opera QEHS”上进行携带了96个部件的玻璃板的旋转式圆盘共焦荧光显微术。通过固态激光，分别在405nm和635nm处激发胞核染料(Hoechst)和胞质染料(cell mask red)。
在每一实验中调整照明源的激发强度和持续时间，以解决标记效率的差异、优化亮度和反差，以及最小化漂白(通常为50mW激光输出、200-2000ms积分时间)。
在每一点，通常通过2个独立的高量子效率12位CCD照相机(130万像素单色)经LCPLF 20×NA 0.4空气物镜(获自公司Olympus，日本)和优化的滤色片套装记录25对扫描图像。通过使用来自校准样品的独立获取的图像修正任一剩余的照明不均一性、图像偏移或扭曲。
图像分析
使用PerkinElmer的“Opera”成像系统的专有软件环境“Acapella 2.0”(二者都获自PerkinElmer Cellular Technologies，Hamburg，德国)分析共焦显微照片。首先，通过胞核染色图像的分割，鉴定每一细胞的位置。一旦定位了胞核，并测量了它们的轮廓和面积，就可以通过胞质染色的分割测定细胞的轮廓。
此外，通过可获自公司Definiens AG(Munich，德国)的图像分析软件“eCognition”分析含微核的样品的图像。
图13显示了用所述装置和方法制备的非贴壁细胞的示例性图像。在上排图像中，已经用上述染料“Hoechst”染色了细胞，而在下排中，已经用同样上述的染料“cell mask red”染色了细胞。在左列中，没有处理细胞，而在右列中，已经用基因毒性化合物处理了细胞。可以看出，用所述装置和方法制备的细胞良好地粘附在未处理的玻璃表面，并且铺展扁平，从而胞内结构很好地分离。
图14显示了使用所述的装置和方法进行的微核测试的分析结果的实例。如在图上的图例所示，该实验已经在4个不同的天一式两份进行。如在图中所示，将含微核的细胞占全部细胞的比例相对于物质浓度作图。上排含有已知没有基因毒性的物质，而下排含有已知有基因毒性的物质。从图中可以看出，全部三种物质都已经正确的分类。将平板#13和#14仅用不具有任何毒性物质的DMSO(二甲亚砜)处理，作为阴性对照，并且其可以在下排中显示的图中详细看出。已经将细胞稀释成指定物质的12个稀释度。通过最大浓度(硝基喹啉氧化物和丝裂霉素C为10μM、全部其他物质为100μM)、稀释因子1.5和稀释数目定义浓度范围id。使用定制的图像处理算法计数不含微核的细胞和含一个至三个微核的细胞。在图中，纯粹处于展示目的，将硝基喹啉氧化物和丝裂霉素C的数据向右移动了10倍。
Claims (17)
1.用于制备在液体中含有的细胞和/或颗粒的单元(10)，其包括
-贮藏室(20)，其配置用于储存含细胞和/或颗粒的液体，以及当应用预定的外力，特别是离心力时，通过出口(22)释放所储存的含细胞和/或颗粒的液体，
-通道(30)，其与贮藏室(20)的出口(22)邻近排列，贮藏室(20)的出口(22)通往通道，
其中通道(30)具有比出口(22)的横截面更大的横截面，并且其中出口(22)至通道(30)的过渡处的壁形成了边缘(32)，
-观察构件(50)，用于接收释放的含细胞和/或颗粒的液体，和
-吸收装置(40)，其与观察构件(50)邻近排列，处于通道(30)和观察构件(50)之间，
所述吸收装置(40)具有孔(42)，所述孔(42)允许含细胞和/或颗粒的液体经该孔(42)移动到观察构件(50)上，
所述吸收装置(40)还除去来自观察构件(50)上含细胞和/或颗粒的液体中的液体，以使细胞和/或颗粒留在观察构件(50)上用于观察。
2.权利要求1的单元(10)，其中所述出口(22)和通道(30)之间的过渡处的边缘(32)的壁包括90度的角度(α)。
3.权利要求1或2的单元(10)，其中所述贮藏室(20)包括圆顶形或者漏斗形部分(25)以及与圆顶形或者漏斗形部分邻接的圆柱形部分(26)。
4.前述权利要求中任一项的单元(10)，其中所述贮藏室(20)设定成含有预定体积的含细胞和/或颗粒的液体，其中所述预定体积为1μl至1000μl之间，特别地10μl至100μl之间，以及特别地50μl。
5.前述权利要求中任一项的单元(10)，其中所述贮藏室(20)包括通风口(24)，其排列在贮藏室(20)的与出口(22)相对的末端处。
6.前述权利要求中任一项的单元(10)，其中所述观察构件(50)是用于光学观察的载片。
7.前述权利要求中任一项的单元(10)，其中所述孔(42)周围的吸收装置(40)部分具有预定的厚度，以实现对液体的预定吸收速度。
8.权利要求7的单元(10)，其中围绕所述孔(42)的吸收装置(40)的壁部分是朝向观察构件(50)预弯曲的，以使在单元(10)的组装时，该预弯曲部分与观察构件(10)紧密连接。
9.制备装置，其包含权利要求1-8中任一项的多个独立单元(10)，其中所述独立单元(10)是对于交叉污染相互隔离的。
10.权利要求9的制备装置，其包括96孔板(200)或者384孔板，其中所述多个独立单元(10)的贮藏室(20)分别通过96孔板或者384孔板的孔形成。
11.权利要求9或者10的制备装置，其进一步包括观察板(500)，所述观察板(500)形成了独立单元(10)的观察构件(50)。
12.权利要求11的制备装置，其进一步包括第一(400)和第二(402)吸收层，所述第一(400)和第二(402)吸收层形成了独立单元(10)的吸收装置(40)，所述第一吸收层(400)与所述观察板(500)直接邻近排列并与所述观察板(500)接触，并且所述第二吸收层(402)在远离所述观察板(500)的侧面上与所述第一吸收层(400)邻近排列并与所述第一吸收层(400)接触，所述第二吸收层(402)具有的吸收能力增加了所述第一吸收层(400)的吸收能力。
13.权利要求9-12中任一项的制备装置，其进一步包括弹簧板(600)，用于将各个压缩力应用于独立单元(10)，以实现所述各个吸收装置(40)与所述各个观察构件(50)的紧密连接。
14.权利要求13的制备装置，其中所述弹簧板(600)包括多个螺旋形弹簧(604)，所述多个螺旋形弹簧(604)与独立单元(10)的数目对应，其中每一螺旋形弹簧(604)作用于一个独立单元(10)。
15.用于制备在液体中含有的细胞的方法，包括步骤：
-将含非贴壁细胞的液体分配到贮藏室(20)中；
-仅通过粘附力和/或表面张力将含非贴壁细胞的液体抵抗其重力维持在贮藏室(20)中；
-将额外的预定外力，特别是离心力应用于含非贴壁细胞的液体，以便将液体从贮藏室(20)中释放到观察构件(50)上；
-从观察构件(50)除去液体，将非贴壁细胞留在观察构件(50)上用于观察。
16.权利要求15的方法，其进一步包括将包含水凝胶的涂层应用在其上具有沉积的细胞的观察构件(50)上的步骤，所述水凝胶含有至少一种染料，所述染料能够与细胞的专门组分结合，并且当用预定波长的光激发时，所述染料是发荧光的。
17.用于细胞的显微镜分析的方法，其包括步骤
-使用权利要求15或者权利要求16的方法制备细胞，
-将制备的细胞放置在显微镜下和
-分析显微图像。
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