CN107106926A - 显微可见的颗粒的高精度定量 - Google Patents
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Abstract
该方法用于显微可见的颗粒的定量。提供过滤膜(116)，所述过滤膜(116)具有穿过该过滤膜(116)而限定的多个孔(138)。所述过滤膜(116)与真空室(104)操作接合。利用密封剂(140)密封所述孔。包含液体(144)和显微可见的颗粒(142)的样本液滴(126)被施加到所述过滤膜(116)上。所述液体(144)使设置在所述样本液滴(126)直接下方的孔(138e‑138h)中的密封剂(140)溶解。所述液体(144)流过其中密封剂(140)已被溶解的孔，并且所述显微可见的颗粒(142)留在所述过滤膜(116)的顶部。所述颗粒(142)在电子显微术中被计数。
Description
技术领域
本发明涉及用于使用显微术(诸如扫描电子显微术(SEM))的显微可见(sub-visible)的颗粒(诸如微颗粒和/或纳米颗粒)的高精度定量的方法。
背景技术
从液体样本精确计数显微可见的颗粒(诸如病毒颗粒、类病毒颗粒、无机和聚合物珠、以及其它纳米颗粒和微颗粒)的数量在许多处理中是重要的。例如，经修改的病毒载体常用于基因治疗应用中。每mL的活性载体的数量(病毒样本的感染滴度)可以使用标准的感染性测定来确定。然而，通过使用当前可用的方法，不可能精确地确定样本中的颗粒(包括非感染颗粒)的总数量。感染颗粒与非感染颗粒的比率提供关于最终的基因治疗产品和上游发展过程的质量和疗效的无价信息。
当前可用技术(诸如定量流式细胞术(QFCM))的一个主要限制是感兴趣的纳米颗粒不被直接检测。相反，结合到一群纳米颗粒的探针的数量被定量。由于每个纳米颗粒结合的探针的数量变动，所以传统的间接技术的精度通常低，并且依赖于标本和探针之间的亲合性。感兴趣的纳米颗粒可以被直接检测的技术将克服该限制。而且，如果该技术将能够以足够的分辨率使颗粒可视化，则单个的颗粒可以基于它们的大小和形态被识别，因此被直接计数。甚至集群内的颗粒也可以被计数和估计。通过使用当前可用的亲合性方法或基于光散射的技术，这是不可能的。
发明内容
本发明的新颖的高精度直接颗粒方法可以被用于从液体样本对无机和有机显微可见的颗粒(诸如纳米颗粒)两者计数。另一个重要的特征是，标本的分布比以前可能的分布更均匀，并且这使对于取样的需要减少，并且现在可以以单个的颗粒可以被容易地识别的分辨率进行分析。显微可见的颗粒在不需要信号探针的情况下被直接检测，并且可以在正常的二维图像中被可视化。本发明的颗粒定量SEM(pqSEM)方法优选地基于低真空过滤、扫描电子显微术(SEM)或其它电子显微术技术和图像分析。本发明可以与内部标准一起或不与内部标准一起使用，内部标准的示例将是国家标准和技术协会(NIST)表征的聚苯乙烯珠。
本发明提供上述问题的解决方案。更特别地，该方法用于显微可见的颗粒的定量。提供过滤膜，所述过滤膜具有穿过该过滤膜而限定的多个孔。过滤膜与真空室操作接合。利用密封剂密封孔。包含液体与显微可见的颗粒的样本液滴被施加到过滤膜上。液体使位于样本液滴直接下方的孔中的密封剂溶解。液体流过其中密封剂已被溶解的孔，并且显微可见的颗粒留在过滤膜的顶部。颗粒设置在其上的过滤膜被移动到电子显微镜，并且在显微镜中获取的图像中被计数。
所述方法进一步包括将包含过滤膜的过滤器组件预先安装到SEM支撑体上的步骤。
所述方法进一步包括将安装带放置在SEM支撑体上的步骤。
所述方法进一步包括在使样本液滴沉积在过滤膜上之前提供具有限定在其中的细长通道的SEM支撑体、使用包含样本液滴的注入器以及使注入器在细长通道的顶部对齐的步骤。
所述方法进一步包括将SEM支撑体连接到与真空源连接的真空室和经由细长通道使过滤膜经受抽吸力的步骤。
所述方法进一步包括在样本液滴不触及过滤膜的任何外边缘的情况下使样本液滴沉积到过滤膜上的步骤。
所述方法进一步包括以下步骤：液体仅使设置在样本液滴直接下方的孔中的密封剂溶解，而液滴侧的相邻的孔保持被密封剂密封，因为液体尚未与设置在这些孔中的密封剂接触。
所述方法进一步包括显微可见的颗粒在过滤膜上形成限定的且可测量的足迹和从该足迹的外周边到该足迹的中心获取一系列的颗粒的图像的步骤。
所述方法进一步包括对以颗粒清晰可见的分辨率获取的电子显微术图像中的颗粒数数—手动地或使用图像分析方法自动地数数的步骤。
所述方法进一步包括估计覆盖整个足迹的显微术图像(覆盖整个足迹的一个低倍率图像或联结在一起的足迹的几个较高倍率子图像)中的过滤膜上的足迹的总面积的步骤。
所述方法进一步包括从整个足迹的面积和从高得足以清晰地看见单一颗粒的分辨率的图像导出的每面积单位的颗粒的数量来计算样本中的颗粒的总数量的步骤。
所述方法进一步包括可能地补偿其信息从以高得足以清晰地看见单个颗粒的倍率从足迹的周边通过中心获取一系列图像导出的足迹中的颗粒的非均匀径向颗粒分布的步骤。
所述方法进一步包括使用来自足迹的总颗粒估计、液体样本的施加的体积和稀释度来计算溶液中的颗粒的浓度的步骤。
所述方法进一步包括使用液体的稀释剂来使位于样本液滴直接下方的孔中的密封剂溶解的步骤。标本应当为液体形式，并且稀释剂应当与稀释剂相容并具有有效地溶解正被使用的密封剂的性质。
所述方法进一步包括使用甘氨酸作为密封剂的步骤。可以使用的其它密封剂包括但不限于基于海藻糖/蔗糖的密封剂。
附图说明
图1是本发明的真空设备的示意性正面侧视图；
图2是过滤器组件的示意性截面侧视图；
图3A是粘附到聚醚砜过滤器的聚苯乙烯珠的未经处理的高倍率SEM图像；
图3B是粘附到聚醚砜过滤器的聚苯乙烯珠的检测和计数的高倍率SEM图像；
图3C是上面的图3B的SEM图像的近摄图；
图4A是高倍率的使用SEM(一次电子)的液滴足迹图像的边缘的示意图；
图4B是低倍率的使用SEM(一次电子)的液滴足迹图像的边缘的示意图；
图5A是本发明的其中孔敞开的膜的截面示意性侧视图；
图5B是图5A中所示的、但是其中孔被密封的膜的截面示意性侧视图；
图5C是图5B中所示的本发明的膜的截面示意性侧视图，该膜具有沉积在其上的样本液滴；
图5D是本发明的图5C中所示的膜的截面示意性侧视图，该膜具有被吸收到该膜中的液滴；以及
图6是图5D的放大图。
具体实施方式
参照图1-6来描述本发明的方法。图1是真空组件100的示意性前视图，真空组件100具有真空设备102，真空设备102经由在真空设备102和真空室104之间延伸的管106连接到真空室104。优选地，管106具有合适的阀，诸如鲁尔(Luer)阀108。真空压力计110与真空室104操作接合以测量其中的真空压力。过滤器组件112通过过滤器组件底座114安装在真空室104的顶部。过滤膜116被设置在过滤器组件112上。注入器118位于过滤膜116上方。
图2是过滤器组件112的示意性截面图。本发明的整个分析过程可以通过将过滤膜116预先安装到SEM支撑体(氧化铝桩体)上、而不是当过滤膜16包含待分析和计数的样本/标本时手动地这样做来简化。该安装可以通过在SEM桩体120中简单地钻孔来进行。这样的设备的使用使在先前的设置期间丢失标本或损坏过滤膜116的风险最小化，在先前的设置中，包含标本的过滤膜116在安装到SEM桩体120上期间被手动地操纵。下面讨论过滤膜116的准备的细节。这样的pqSEM分析消耗品设备的制造相对便宜。
更特别地，过滤器组件112优选地具有经修改的SEM氧化铝桩体120，双面碳安装带122被放置到经修改的SEM氧化铝桩体120上。密封的多孔过滤膜116被放置在碳安装带122的顶部。下面特别地参照图5-6来详细描述密封过滤膜116的过程。包含待分析的标本或样本124的注入器118被设置或定位在过滤膜116上方，并且被用于使样本液滴126沉积到过滤膜116上。因为桩体120被密封地连接到过滤器组件底座114、过滤器组件底座114又被安装在真空室104上，所以在桩体120内部存在真空使得该真空从过滤器组件112下方对过滤膜116施加抽吸力。这被使得成为可能，因为限定在桩体120内部的细长腔体或通道128与过滤膜116和真空室104流体连通。如下所述，重要的是注入器118被正确地定位在过滤膜116上方，使得当样本液滴126沉积到过滤膜116上时，样本液滴126与过滤膜116的边缘不接触并且被放置在扩大的腔体部分129正上方，该扩大的腔体部分129被限定在通道128和安装带122的底侧之间。优选地，液滴126被放置在与延伸通过通道128的纵轴(L)对齐的腔体部分129的中心处或附近。
图3A-3C是粘附到聚醚砜过滤器的聚苯乙烯珠的高倍率SEM图像。图3A是未处理的图像130，图3B是检测和计数的图像132。图3C是图3B的视图和图3A的部分131的近摄图133。在这些示例图像中，在131.47μm2的视场中检测到77个颗粒。这对应于每μm2大约0.59个颗粒。视图133示出了被编号的颗粒1、2、3、4、5、6、7、28、29、30。
图4A-4B示出了使用SEM(一次电子)成像的液滴足迹的边缘。图4A示出了高倍率的图像134，图4B示出了低倍率的足迹图像136。图4A中所示的高倍率图像134的位置在图4B中用白色箭头标记，使得图像134示出整个足迹图像136的一部分。在足迹外部颗粒的数量可忽略的情况下，液滴的边缘被很好地限定。在低倍率处，液滴的整个足迹136被可视化，并且足迹的面积可被精确地测量。在该示例中，足迹的面积(Atotal)被测量为8.436mm2。
图5A-5D是过滤膜116的截面侧视图，并且描述密封过滤膜116并然后使密封剂溶解的过程。在图5A中，过滤膜116具有敞开的孔138，该敞开的孔138被限定在过滤膜116的细长网格构件139之间，延伸通过过滤膜116。在图5B中，孔138被密封剂140填充。在图5C中，作为包含待分析的颗粒142的液体144的样本124的样本液滴126沉积到过滤膜116上。优选地，通过使用上述注入器118使液滴126沉积到过滤膜116上。当液滴126与密封剂140接触时，液体144使设置在液滴126正下方的密封剂140溶解，使得液体144被吸收并且通过仅设置在液滴126下方的孔138。因为待计数的颗粒142具有大于膜的孔138的大小，所以当液滴126下方的孔138中的密封剂140被溶解并且液体144经受来自过滤膜116下方的真空室104的细长室128的抽吸时，颗粒142在液体和任何较小的污染物144被吸收或流到这些孔中的同时被沉积在过滤膜116的顶部。
图6是图5D的过滤膜116的放大图。显微可见的颗粒142停留在过滤膜116上，并且颗粒142大于孔138a-138j，所以它们不通过孔，即使孔敞开并且经受来自真空室104(在图1中示出)的抽吸。孔138a-d和138i-j仍然被密封剂140填充，因为由于它们尚未与样本液滴126的液体144接触(参见图5C)，所以它们尚未被液体144溶解。更特别地，液体144中的稀释剂(诸如合适的缓冲剂)使密封剂140溶解。如以上所指出的，稀释剂应当与标本相容，即，具有标本形态和聚集状态的最小影响。稀释剂还应当具有使密封剂溶解的性质。这是要确保真空仅在足迹处被维持，并且通过“打开”感兴趣区域外部的孔使得设置不使真空损失。当液体144使设置在孔138e-138h中的密封剂140溶解时，液体144填充孔138e-138h以替换密封剂140。这使得对颗粒142计数更容易，因为颗粒142躺在过滤段116的顶部，并且在整个过滤膜116上很好地分布。
示例
下面是根据本发明的准备过滤膜116的方法的说明性示例。
1.通过将样本连续地稀释在依赖于每个特定样本的缓冲剂状况的适当的稀释剂(通常为水、磷酸盐缓冲的、HEPES缓冲的、TRIS缓冲的或组氨酸缓冲的盐水)中来准备包含显微可见的颗粒142(诸如微颗粒和/或纳米颗粒)的样本以用于计数。
2.可以将固定剂(通常为戊二醛或甲醛)和/或稳定剂(通常为蔗糖或甘油)引入到被稀释的、还包括显微可见的颗粒142的样本溶液124中，以稳定和保持颗粒的结构，并且在一些样本中防止颗粒142不期望的聚集。固定剂/稳定剂和稀释剂对应于液体144，并且与颗粒142一起形成样本/标本124和样本液滴126。固定剂/稳定剂被用于防止颗粒142在操纵期间被毁坏或损坏以及防止颗粒142不期望地彼此粘附(其使得更难以在以后对颗粒142计数)。
3.过滤器组件112由多孔过滤膜116(通常由聚醚砜或聚碳酸酯制成)和由塑料或等同物制成的可打开的过滤盒(cassette)组成，多孔过滤膜116具有孔138，该孔138具有限定的孔大小(通常为0至15nm)，可打开的过滤盒用于使颗粒142与液体分离。合适的过滤器组件112在图2中被最佳地示出。一般来说，过滤器是作为一次性使用的过滤器大批购买的，因此需要被安装在某物上。一些供应商还销售过滤器保持器，并且这些设备最初被制成连接到注射器并且推送液体通过，因此不使用真空来抽吸液体通过。因此有必要将过滤器安装到过滤器组件以确保真空完整性。在一些实验之后，令人惊讶地意识到过滤器可以被直接安装在SEM支撑体上，这节省了时间并且避免了手动操纵包含过滤器的标本的关键步骤。可想象的是，这样的组件可以便宜地制造，并且作为SEM消耗品销售。
4.过滤器组件112被安装到塑料真空室104的顶部上，该塑料真空室104又经由管106连接到真空设备102。
5.真空室104中的真空由3路鲁尔阀108控制，并且通过使用真空压力计110监视。使用由电子监视系统控制的电磁阀的自动化系统也可以被实现。
6.如图5B和5C中最佳地示出的，过滤膜116中的孔138优选地在样本液滴126点样之前被用密封剂140(诸如甘氨酸(或等同物))密封。令人惊讶地且出乎意料地发现，通过在过滤膜116中使用密封剂140，液滴126内部的颗粒142更均匀地分布(在移除液滴126的液体144之前)，并且不需要使用高真空力来降低液滴在过滤膜上非均匀地散开的风险。应当注意，颗粒的分布在外周边处不必与中心处相同。可以通过从足迹136的外周边或外边缘137朝着颗粒样本的足迹的中心139扫描设置在过滤膜上的颗粒样本的足迹134/136(参见图4A-4B)来确定颗粒分布图样。如果颗粒样本的被扫描部分示出某个颗粒分布图样，则可以可靠地假设相同的颗粒分布图样应用于整个圆形颗粒样本足迹136的周围，部分是因为颗粒在密封剂140被液滴126中的液体溶解之前被给予时间稳定下来。因为液滴126首先沉积到密封的过滤膜116上，所以液滴126的足迹136的外边缘137变得相对明显或清楚，为了确定在哪里开始朝着沉积在溶解的过滤膜116上的圆形颗粒样本或足迹136的中心139扫描和计数，这是重要的。出乎意料地发现，颗粒在过滤膜上的相对均匀的分布的优点胜过在开始颗粒的计数之前必须移除密封剂以允许液滴中的液体流过过滤膜的缺点。液滴在过滤膜上的足迹的任何非均匀的或不明显的周边使得确定其足迹以及知道哪个区域将被分析以便对液滴中的所有颗粒数数更加困难。通过在所有孔138都被密封剂140密封的情况下将样本液滴126施加到过滤膜116上，当液滴126在过滤膜116的密封的顶表面上散开时，颗粒142均匀地分布在液滴126内部。首先必须使密封剂140溶解的要求使液体144通过孔138流过放慢。通过不使用密封剂140，液滴126的液体144将立即开始流过孔138，并且因为液滴126在中心处最厚且在其周边处较薄，所以更多颗粒142趋于位于液滴的中间。这通常导致颗粒非均匀地分布到过滤膜上并且颗粒样本的足迹的外边缘不清晰。应当注意，因为一些标本可能具有朝着空气-水界面集中的趋势，所以更多颗粒并不总是位于液滴的中间。一般难以准确地预见不同的样本如何表现和分布。
由于样本液滴126的整个足迹136被用于计算颗粒142的颗粒浓度，所以液滴126不应当触及过滤膜116的过滤器保持器的内边缘。因此，重要的是仅过滤膜116的限定部分被样本液滴126覆盖。这是要确保液滴126中的所有颗粒142都被计数或数数。此外，样本液滴126的位置应当与桩体120内部限定的腔体129和通道128对齐。在不用密封剂140对过滤膜116进行预处理的情况下，周围的过滤孔(即，图6中的孔138a-138d和138i-138j)保持敞开，并且空气围绕液滴126流动并且流过过滤膜116，使得样本液滴126不吸收并且变得足够快地被过滤以得到颗粒142的良好的样本分布。换句话说，密封剂140的使用具有当液体开始使设置在液滴126下方的密封剂140溶解时产生液滴126的足迹136的更明显的外周边137。在不使用密封剂140的情况下，没有足够的时间让颗粒142均匀地分布在液滴126内部，因为液体144立即开始流过孔138而没有给予颗粒142时间稳定下来和均匀地分布在液滴126内部。因此密封剂140的一个非常重要的特征是产生真空条件使得形成限定的标本足迹。更特别地，在没有根据本发明的密封剂140的处理的情况下，液滴126不期望地通过扩散和蒸发变干。由于干燥效应，这导致高度非均匀的颗粒分布。令人惊讶地发现，不期望的蒸发可能引起渗透效应，由于剩余的液滴中的盐浓度增加，这些渗透效应潜在地引起颗粒破裂和晶体形成。另外，这使由破坏的颗粒和被盐析出物隐藏的颗粒引起的颗粒检测和计数模糊不清。在本发明中，当将样本液滴126施加到密封的过滤膜116上时，样本液滴126中的液体144使密封剂140缓慢地溶解以使设置在液体126下面的孔138e-138h敞开。因此，液体144被真空迅速地抽拉通过过滤膜116的孔138e-138h，这导致颗粒142在过滤膜116的顶表面上的良好的样本分布。
7.在将样本液滴126施加到过滤膜116上之前，真空设备102被启动，并且真空室104中的压力被降低以在过滤膜116上产生抽吸。真空室104中的真空确保液滴126的液体144被均匀地吸收在过滤膜116上。密封剂和真空的使用的组合导致颗粒142在过滤膜116上的整个足迹136上的均匀分布。
8.样本液滴126的合适的体积(通常为5μl)被施加在多孔的且密封的过滤膜116上。如以上所指出的，重要的是颗粒142的直径大于过滤膜116的孔138的直径并且液滴126不触及过滤器底座的边缘。可以通过使用注入系统来施加比5μl高的体积，在该注入系统中，多滴或者较大体积被施加在过滤膜116上的同一个位置上。一般来说，较大体积的使用使取样误差最小化，并且允许对不太集中的样本进行分析。
9.样本液滴126在由真空室104提供的真空压力下在过滤膜116上被吸收达通常60秒。准确的压力值可能必须部分地根据孔大小、样本类型、体积、纯度和粘度被调整。
10.在吸收之后，可以从安装到SEM氧化铝桩体120上(通常通过使用粘合剂和导电碳带122)的过滤器组件112拆卸过滤膜116。
11.然后可以例如在合适的室压力(通常为1×10-5mbar)下使用碳蒸发器用碳薄膜(通常为20nm厚)溅射涂布其上放置有结合的颗粒142的过滤膜116。溅射涂布提高过滤膜116的传导性；增加过滤膜116的信噪比并且减小电子束损坏和带电效应。为了使用SEM对过滤材料成像，该技术通常是有必要使用的。使用碳涂布可能是非传统的，但是与较大晶粒大小的金属溅射相比它提供较高分辨率的SEM成像。
12.过滤膜116可以被转移到SEM，并且来自散射的一次电子(使用in-lens检测器)或二次电子(诸如通过使用SE2检测器)的信号既被以低倍率记录以覆盖整个足迹，又被以高倍率(通常为10000至30000)记录以用于计数。如果使用具有不同的二次电子签名的参考标准(尽管没有必要确定颗粒浓度)，则可以通过组合来自不同检测器(诸如in-lens检测器和SE2检测器)的强度信息来使感兴趣的颗粒与参考颗粒区分开。
13.低倍率图像136(参见图4B)被用于限定液滴的足迹的大小和总体标本分布，而高倍率图像被用于确定颗粒计数。
14.高倍率图像(诸如图像134)是在整个样本足迹上从边缘137开始、通过中心139、再到液滴的相对边缘获取的，以便使液体的整个足迹上的颗粒分布的差异的任何影响最小化。
15.从低倍率图像(诸如图像136)，通过追踪足迹的边缘来计算样本足迹的面积(Atotal)。对被包围的像素数数，并且将数得的数量乘以像素大小。
16.从高倍率图像，检测颗粒142并且对颗粒142数数。该过程可以通过手动标记或通过使用合适的软件(诸如Vironova专有的软件Analyzer或任何其它适当的图像分析软件)的自动标记来执行。每面积单位的颗粒的平均数量(n/AFOV)从图像数据集计算。
17.颗粒样本中的每mL的颗粒的数量优选通过使用以下公式计算：
其中，C是颗粒的浓度，df是稀释因子，V是样本的施加的体积。还可以使用考虑当样本被朝着其中心扫描时颗粒分布可能不同于颗粒样本的周边的公式。
总的来说，本发明的颗粒定量扫描电子显微术(pqSEM)技术是高精度直接颗粒检测和计数技术。本发明的重要特征是，直接检测不依赖于探针和标本之间的亲合性，而许多现有的传统技术依赖于探针和标本之间的亲合性。所有参数(诸如液滴的稀释因子、施加的体积、足迹)可以被控制，并且每面积单位的颗粒的数量可以在使来自于近似和假设的误差最小化的同时被直接测量。而且，pqSEM的分辨能力允许检测集群内的单个的显微可见的颗粒，并且不同大小或其它形态特征的两群颗粒可以从同一个样本计数。来自通过本发明的pqSEM技术产生的高对比度图像的颗粒和足迹可以通过使用自动图像分析被容易地检测。这提供了用于迅速地收集大的数据集并且生成鲁棒的统计结果的手段。
虽然已根据优选的组成和实施例描述了本发明，但是要理解，在不脱离随附的权利要求的精神和范围的情况下，可以对其进行某些替换和更改。
权利要求书(按照条约第19条的修改)
1.一种用于显微可见的颗粒的定量的方法，包括：
提供过滤膜(116)，所述过滤膜(116)具有穿过该过滤膜(116)而限定的多个孔(138)，所述过滤膜(116)与真空室(104)操作接合；
利用密封剂(140)密封所述孔；
在包含液体(144)和显微可见的颗粒(142)的样本液滴(126)不触及所述过滤膜(116)的任何外边缘的情况下将所述样本液滴(126)施加到所述过滤膜(116)上；
所述液体(144)使设置在所述样本液滴(126)下方的孔(138e-138h)中的密封剂(140)溶解；
所述液体(144)流过其中密封剂(140)已被溶解的孔，并且所述显微可见的颗粒(142)留在所述过滤膜(116)的顶部；以及
所述显微可见的颗粒(142)在电子显微术中被计数。
2.根据权利要求1所述的方法，其中，所述方法进一步包括将包含所述过滤膜(116)的过滤器组件(112)预先安装到SEM支撑体(120)上的步骤。
3.根据权利要求2所述的方法，其中，所述方法进一步包括将安装带(122)放置在所述SEM支撑体(120)上的步骤。
4.根据权利要求1所述的方法，其中，所述方法进一步包括在使所述样本液滴(126)沉积在所述过滤膜(116)上之前提供具有限定在其中的细长通道(128)的SEM支撑体(120)、使用包含所述样本液滴(126)的注入器(118)以及使所述注入器(118)在细长通道(128)的顶部对齐的步骤。
5.根据权利要求2所述的方法，其中，所述方法进一步包括将所述SEM支撑体(120)连接到与真空源(102)连接的真空室(104)和经由细长通道(128)使所述过滤膜(116)经受抽吸力的步骤。
6.根据权利要求1所述的方法，其中，所述方法进一步包括所述液体(144)仅使设置在样本液滴(126)正下方的孔(138e-138h)中的密封剂(140)溶解、而相邻的孔(138a-138d，138i-138j)保持被密封剂(140)密封的步骤。
7.根据权利要求1所述的方法，其中，所述方法进一步包括所述显微可见的颗粒(142)在所述过滤膜(116)上形成足迹(136)和从所述足迹(136)的外周边(137)朝着所述足迹(136)的中心(139)对显微颗粒(142)进行扫描的步骤。
8.根据权利要求1所述的方法，其中，所述方法进一步包括使用所述液体(144)的稀释剂来使位于所述样本液滴(126)直接下方的孔中的密封剂(140)溶解的步骤。
9.根据权利要求1所述的方法，其中，所述方法进一步包括使用甘氨酸作为密封剂(140)的步骤。
Claims (10)
1.一种用于显微可见的颗粒的定量的方法，包括：
提供过滤膜(116)，所述过滤膜(116)具有穿过该过滤膜(116)而限定的多个孔(138)，所述过滤膜(116)与真空室(104)操作接合；
利用密封剂(140)密封所述孔；
将包含液体(144)和显微可见的颗粒(142)的样本液滴(126)施加到所述过滤膜(116)上；
所述液体(144)使设置在所述样本液滴(126)下方的孔(138e-138h)中的密封剂(140)溶解；
所述液体(144)流过其中密封剂(140)已被溶解的孔，并且所述显微可见的颗粒(142)留在所述过滤膜(116)的顶部；以及
所述显微可见的颗粒(142)在电子显微术中被计数。
2.根据权利要求1所述的方法，其中，所述方法进一步包括将包含所述过滤膜(116)的过滤器组件(112)预先安装到SEM支撑体(120)上的步骤。
3.根据权利要求2所述的方法，其中，所述方法进一步包括将安装带(122)放置在所述SEM支撑体(120)上的步骤。
4.根据权利要求1所述的方法，其中，所述方法进一步包括在使所述样本液滴(126)沉积在所述过滤膜(116)上之前提供具有限定在其中的细长通道(128)的SEM支撑体(120)、使用包含所述样本液滴(126)的注入器(118)以及使所述注入器(118)在细长通道(128)的顶部对齐的步骤。
5.根据权利要求2所述的方法，其中，所述方法进一步包括将所述SEM支撑体(120)连接到与真空源(102)连接的真空室(104)和经由细长通道(128)使所述过滤膜(116)经受抽吸力的步骤。
6.根据权利要求1所述的方法，其中，所述方法进一步包括在样本液滴(126)不触及过滤膜(116)的任何外边缘的情况下使所述样本液滴(126)沉积到所述过滤膜(116)上的步骤。
7.根据权利要求1所述的方法，其中，所述方法进一步包括所述液体(144)仅使设置在样本液滴(126)正下方的孔(138e-138h)中的密封剂(140)溶解、而相邻的孔(138a-138d，138i-138j)保持被密封剂(140)密封的步骤。
8.根据权利要求1所述的方法，其中，所述方法进一步包括所述显微可见的颗粒(142)在所述过滤膜(116)上形成足迹(136)和从所述足迹(136)的外周边(137)朝着所述足迹(136)的中心(139)对显微颗粒(142)进行扫描的步骤。
9.根据权利要求1所述的方法，其中，所述方法进一步包括使用所述液体(144)的稀释剂来使位于所述样本液滴(126)直接下方的孔中的密封剂(140)溶解的步骤。
10.根据权利要求1所述的方法，其中，所述方法进一步包括使用甘氨酸作为密封剂(140)的步骤。
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