UA123318C2 - Високоточна квантифікація невидимих неозброєним оком частинок - Google Patents
Високоточна квантифікація невидимих неозброєним оком частинок Download PDFInfo
- Publication number
- UA123318C2 UA123318C2 UAA201807032A UAA201807032A UA123318C2 UA 123318 C2 UA123318 C2 UA 123318C2 UA A201807032 A UAA201807032 A UA A201807032A UA A201807032 A UAA201807032 A UA A201807032A UA 123318 C2 UA123318 C2 UA 123318C2
- Authority
- UA
- Ukraine
- Prior art keywords
- filter membrane
- particles
- sample
- pores
- sealant
- Prior art date
Links
- 238000011002 quantification Methods 0.000 title claims abstract description 6
- 239000012906 subvisible particle Substances 0.000 title abstract 4
- 239000002245 particle Substances 0.000 claims abstract description 105
- 239000012528 membrane Substances 0.000 claims abstract description 93
- 239000011148 porous material Substances 0.000 claims abstract description 46
- 239000000565 sealant Substances 0.000 claims abstract description 46
- 239000007788 liquid Substances 0.000 claims abstract description 39
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 38
- 238000001493 electron microscopy Methods 0.000 claims abstract description 4
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 claims description 3
- 230000009471 action Effects 0.000 claims description 2
- 244000005894 Albizia lebbeck Species 0.000 claims 2
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 67
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 13
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 11
- 239000002105 nanoparticle Substances 0.000 description 8
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 6
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 5
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 5
- 230000008569 process Effects 0.000 description 5
- 239000004695 Polyether sulfone Substances 0.000 description 4
- 239000004793 Polystyrene Substances 0.000 description 4
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 4
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 4
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 description 4
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 4
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 4
- 230000002458 infectious effect Effects 0.000 description 4
- 229920006393 polyether sulfone Polymers 0.000 description 4
- 229920002223 polystyrene Polymers 0.000 description 4
- 238000004626 scanning electron microscopy Methods 0.000 description 4
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 4
- WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N Formaldehyde Chemical compound O=C WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 3
- 239000011230 binding agent Substances 0.000 description 3
- 239000011859 microparticle Substances 0.000 description 3
- TWNQGVIAIRXVLR-UHFFFAOYSA-N oxo(oxoalumanyloxy)alumane Chemical compound O=[Al]O[Al]=O TWNQGVIAIRXVLR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 3
- 239000003381 stabilizer Substances 0.000 description 3
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 2
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 2
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 2
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 description 2
- 238000000576 coating method Methods 0.000 description 2
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 2
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 2
- 238000001704 evaporation Methods 0.000 description 2
- 230000008020 evaporation Effects 0.000 description 2
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 2
- 238000001415 gene therapy Methods 0.000 description 2
- 238000010191 image analysis Methods 0.000 description 2
- 238000003384 imaging method Methods 0.000 description 2
- 238000009434 installation Methods 0.000 description 2
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 2
- 239000004033 plastic Substances 0.000 description 2
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 2
- 238000005070 sampling Methods 0.000 description 2
- 238000007789 sealing Methods 0.000 description 2
- 238000004544 sputter deposition Methods 0.000 description 2
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 2
- 238000009827 uniform distribution Methods 0.000 description 2
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- HDTRYLNUVZCQOY-UHFFFAOYSA-N α-D-glucopyranosyl-α-D-glucopyranoside Natural products OC1C(O)C(O)C(CO)OC1OC1C(O)C(O)C(O)C(CO)O1 HDTRYLNUVZCQOY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- SXRSQZLOMIGNAQ-UHFFFAOYSA-N Glutaraldehyde Chemical compound O=CCCCC=O SXRSQZLOMIGNAQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- HDTRYLNUVZCQOY-WSWWMNSNSA-N Trehalose Natural products O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O1 HDTRYLNUVZCQOY-WSWWMNSNSA-N 0.000 description 1
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 1
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 1
- 239000000853 adhesive Substances 0.000 description 1
- 230000001070 adhesive effect Effects 0.000 description 1
- 238000004220 aggregation Methods 0.000 description 1
- 230000002776 aggregation Effects 0.000 description 1
- HDTRYLNUVZCQOY-LIZSDCNHSA-N alpha,alpha-trehalose Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 HDTRYLNUVZCQOY-LIZSDCNHSA-N 0.000 description 1
- 238000000149 argon plasma sintering Methods 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 1
- 239000012141 concentrate Substances 0.000 description 1
- 239000000356 contaminant Substances 0.000 description 1
- 239000013078 crystal Substances 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 238000009792 diffusion process Methods 0.000 description 1
- 239000012470 diluted sample Substances 0.000 description 1
- 238000007865 diluting Methods 0.000 description 1
- 238000005553 drilling Methods 0.000 description 1
- 238000001035 drying Methods 0.000 description 1
- 238000010894 electron beam technology Methods 0.000 description 1
- 238000000635 electron micrograph Methods 0.000 description 1
- 238000000684 flow cytometry Methods 0.000 description 1
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 1
- 238000003703 image analysis method Methods 0.000 description 1
- 239000010954 inorganic particle Substances 0.000 description 1
- 239000012469 less concentrated sample Substances 0.000 description 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 1
- 229910052751 metal Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000002184 metal Substances 0.000 description 1
- 238000001000 micrograph Methods 0.000 description 1
- 238000000386 microscopy Methods 0.000 description 1
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 1
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 1
- 230000000877 morphologic effect Effects 0.000 description 1
- 238000009828 non-uniform distribution Methods 0.000 description 1
- 239000011146 organic particle Substances 0.000 description 1
- 230000003204 osmotic effect Effects 0.000 description 1
- 239000004417 polycarbonate Substances 0.000 description 1
- 229920000515 polycarbonate Polymers 0.000 description 1
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 238000004445 quantitative analysis Methods 0.000 description 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 1
- 238000003892 spreading Methods 0.000 description 1
- 230000007480 spreading Effects 0.000 description 1
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- -1 that is Substances 0.000 description 1
- 239000010409 thin film Substances 0.000 description 1
- 238000003828 vacuum filtration Methods 0.000 description 1
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 1
- 239000013603 viral vector Substances 0.000 description 1
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 1
Classifications
-
- B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
- B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
- B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
- B01L3/00—Containers or dishes for laboratory use, e.g. laboratory glassware; Droppers
- B01L3/50—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes
- B01L3/502—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes with fluid transport, e.g. in multi-compartment structures
- B01L3/5021—Test tubes specially adapted for centrifugation purposes
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N1/00—Sampling; Preparing specimens for investigation
- G01N1/28—Preparing specimens for investigation including physical details of (bio-)chemical methods covered elsewhere, e.g. G01N33/50, C12Q
- G01N1/40—Concentrating samples
- G01N1/4077—Concentrating samples by other techniques involving separation of suspended solids
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N15/00—Investigating characteristics of particles; Investigating permeability, pore-volume or surface-area of porous materials
- G01N15/06—Investigating concentration of particle suspensions
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N15/00—Investigating characteristics of particles; Investigating permeability, pore-volume or surface-area of porous materials
- G01N15/06—Investigating concentration of particle suspensions
- G01N15/0606—Investigating concentration of particle suspensions by collecting particles on a support
- G01N15/0618—Investigating concentration of particle suspensions by collecting particles on a support of the filter type
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N15/00—Investigating characteristics of particles; Investigating permeability, pore-volume or surface-area of porous materials
- G01N15/10—Investigating individual particles
- G01N15/14—Optical investigation techniques, e.g. flow cytometry
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N15/00—Investigating characteristics of particles; Investigating permeability, pore-volume or surface-area of porous materials
- G01N15/10—Investigating individual particles
- G01N15/14—Optical investigation techniques, e.g. flow cytometry
- G01N15/1468—Optical investigation techniques, e.g. flow cytometry with spatial resolution of the texture or inner structure of the particle
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N15/00—Investigating characteristics of particles; Investigating permeability, pore-volume or surface-area of porous materials
- G01N15/06—Investigating concentration of particle suspensions
- G01N15/0606—Investigating concentration of particle suspensions by collecting particles on a support
- G01N15/0618—Investigating concentration of particle suspensions by collecting particles on a support of the filter type
- G01N15/0625—Optical scan of the deposits
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N1/00—Sampling; Preparing specimens for investigation
- G01N1/28—Preparing specimens for investigation including physical details of (bio-)chemical methods covered elsewhere, e.g. G01N33/50, C12Q
- G01N1/40—Concentrating samples
- G01N1/4077—Concentrating samples by other techniques involving separation of suspended solids
- G01N2001/4088—Concentrating samples by other techniques involving separation of suspended solids filtration
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N15/00—Investigating characteristics of particles; Investigating permeability, pore-volume or surface-area of porous materials
- G01N2015/0038—Investigating nanoparticles
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N15/00—Investigating characteristics of particles; Investigating permeability, pore-volume or surface-area of porous materials
- G01N15/10—Investigating individual particles
- G01N15/14—Optical investigation techniques, e.g. flow cytometry
- G01N2015/1486—Counting the particles
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Immunology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Pathology (AREA)
- Dispersion Chemistry (AREA)
- Hematology (AREA)
- Clinical Laboratory Science (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Sampling And Sample Adjustment (AREA)
- Analysing Materials By The Use Of Radiation (AREA)
- Separation Using Semi-Permeable Membranes (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Physical Or Chemical Processes And Apparatus (AREA)
Abstract
Спосіб призначений для квантифікації невидимих неозброєним оком частинок. Використовують фільтрувальну мембрану (116), яка має сформовані в ній пори (138). Фільтрувальна мембрана (116) функціонально з'єднана з вакуумною камерою (104). Пори герметизуються герметиком (140). Краплю (126) зразка, яка містить рідину (144) і невидимі неозброєним оком частинки (142), наносять на фільтрувальну мембрану (116). Рідина (144) розчиняє герметик (140) в порах (138e-138h), розташованих безпосередньо під краплею (126) зразка. Рідина (144) протікає крізь пори, у яких був розчинений герметик (140), а невидимі неозброєним оком частинки (142) залишаються на верхній поверхні фільтрувальної мембрани (116). Частинки (142) нумерують в електронній мікроскопії.
Description
Галузь Техніки
Представлений винахід відноситься до способу високоточної квантифікації невидимих неозброєним оком частинок, таких як мікрочастинки і/або наночастинки, з використанням мікроскопії, такої як сканувальна електронна мікроскопія (ЕМ).
Рівень техніки і Короткий Опис Винаходу
В багатьох процесах важливим є точний підрахунок кількості невидимих неозброєним оком частинок, таких як вірусні частинки, вірусоподібні частинки, неорганічні і полімерні кульки, та інших наночастинок і мікрочастинок з рідких зразків. Наприклад, модифіковані вірусні вектори зазвичай використовуються в застосуваннях генної терапії. Кількість активних векторів на мл (інфекційний титр вірусного зразка) може визначатися з використанням стандартних тестувань на інфективність. Однак, використовуючи на даний момент доступні способи, неможливо точно визначити загальну кількість частинок у зразку, включаючи неінфекційні частинки. Відношення кількості інфекційних частинок до кількості неінфекційних частинок надає безцінну інформацію про якість і ефективність кінцевого продукту генної терапії і попередні процеси розвитку.
Одним значним обмеженням на даний момент доступних технологій, таких як квантифікуюча проточна цитометрія (ОБСМ), є те, що наночастинки, які представляють цікавість, безпосередньо не виявляються. Замість цього, для популяції наночастинок проводять кількісний аналіз зв'язаних проб. Оскільки кількість проб, які зв'язуються, на наночастинку змінюється, то точність традиційних опосередкованих технологій є типово низькою і залежить від родової спорідненості між зразком і пробою. Технологія, де наночастинка, яка представляє цікавість, може безпосередньо виявлятися, повинна долати це обмеження. Більше того, якщо технологія повинна мати можливість візуалізувати частинки з достатньою роздільною здатністю, то окремі частинки можуть ідентифікуватися на основі їх розміру і морфології, і, таким чином, безпосередньо підраховуватися. Навіть можуть підраховуватися і оцінюватися частинки в кластерах. Це неможливо шляхом використання на даний момент доступних способів розділення сумішей або технологій на основі розсіяння світла.
Може використовуватися новий спосіб високоточного безпосереднього підрахунку частинок представленого винаходу для підрахунку неорганічних і органічних невидимих неозброєним оком частинок з рідких зразків, таких як наночастинки. Однією важливою ознакою є те, що зразки наносять з одержанням чіткого здатного до вимірювання сліду. ІНШОЮ важливою ознакою є те, що зразки однорідніше розподіляються ніж, як це було можливо до цього, і це послаблює потребу у відборі зразків, і тепер можна проводити аналіз за роздільної здатності, де окремі частинки можуть легко ідентифікуватися. Невидимі неозброєним оком частинки виявляються безпосередньо без потреби у сигнальних пробах і можуть візуалізуватися в нормальних двовимірних зображеннях. Спосіб квантифікації частинок з використанням сканувального електронного мікроскопа (ЗЕМ) (ра5ЕМ) представленого винаходу переважно базується на низьковакуумному фільтруванні, сканувальній електронній мікроскопії (ЗЕМ) або інших технологіях електронної мікроскопії і аналізу зображень. Представлений винахід може використовуватися з або без внутрішніх стандартів, прикладом яких повинні бути полістиролові кульки, описані Національним Інститутом Стандартів і Технологій (МІ5Т).
Представлений винахід надає рішення для вищеописаних проблем. Точніше, спосіб передбачений для квантифікації невидимих неозброєним оком частинок. Надається мембрана фільтра, яка має сформовані в ній пори. Фільтрувальна мембрана функціонально з'єднується з вакуумною камерою. Пори герметизуються герметиком. Крапля зразка, яка містить рідину з невидимими неозброєним оком частинками, наноситься на фільтрувальну мембрану. Рідина розчиняє герметик в порах, розташованих безпосередньо під краплею зразка. Рідина протікає крізь пори, у яких розчинився герметик, а невидимі неозброєним оком частинки залишаються на верхній поверхні фільтрувальної мембрани. Фільтрувальну мембрану з розміщеними на ній частинками подають до електронного мікроскопу і підраховують частинки в зображеннях, отриманих в мікроскопі.
У способі додатково попередньо встановлюють фільтрувальний блок, який містить фільтрувальну мембрану, на предметному столику сканувального електронного мікроскопа (ЗЕМ).
У способі додатково на предметний столик сканувального електронного мікроскопа (ЗЕМ) поміщають монтажну стрічку.
У способі додатково передбачають предметний столик сканувального електронного мікроскопа (ЗЕМ), який має сформований в ньому продовгуватий канал, використовують ін'єктор, який містить краплю зразка, і орієнтують ін'єктор на верхній частині продовгуватого каналу перед поміщенням краплі зразка на фільтрувальну мембрану.
У способі додатково з'єднують предметний столик сканувального електронного мікроскопа (ЗЕМ) з вакуумною камерою, з'єднаною з джерелом вакууму, і піддають фільтрувальну мембрану дії підсмоктувальної сили за допомогою продовгуватого каналу.
У способі додатково поміщають краплю зразка на фільтрувальну мембрану без торкання краплею зразка якогось зовнішнього краю фільтрувальної мембрани.
У способі додатково рідина розчиняє герметик тільки в порах, розташованих безпосередньо під краплею зразка, тоді як сусідні пори на стороні краплі залишаються загерметизовані герметиком, оскільки рідина не контактувала з герметиком, розташованим у таких порах.
У способі додатково невидимі неозброєним оком частинки формують на фільтрувальній мембрані чіткий і вимірюваний слід, і отримують ряд зображень частинок від зовнішньої периферії сліду до центру сліду.
У способі додатково або вручну або автоматично з використанням способів аналізу зображень підраховують частинки в зображеннях електронної мікроскопії, отриманих з роздільною здатністю, де частинки чітко видимі.
У способі додатково оцінюють загальну площу сліду на фільтрувальній мембрані в зображеннях мікроскопії які покривають увесь слід (або одне зображення з малим збільшенням, яке покриває увесь слід, або декілька зшитих фрагментів зображень сліду з більшим збільшенням).
У способі додатково підраховують загальну кількість частинок в зразку з площі усього сліду і кількість частинок на одиницю площі, отриману із зображень з досить високою роздільною здатністю для чіткого розглядування окремих частинок.
У способі додатково по можливості компенсують неоднорідний радіальний розподіл частинок в сліді, для чого інформацію одержують з ряду зображень, які одержуються від периферії сліду з проходженням центру, з досить великим збільшенням для чіткого розглядання окремих частинок.
У способі додатково обраховують концентрацію частинок в розчині з використанням загальної оцінки частинок зі сліду, нанесеного об'єму і розрідження рідкого зразка.
У способі додатково використовують розріджувач рідини для розчинення герметика в порах, розташованих безпосередньо під краплею зразка. Зразок повинен бути у рідкій формі і повинен
Зо бути сумісним з розріджувачем та мати властивість ефективного розчинення герметика, який використовується.
У способі додатково як герметик використовують гліцин. Інші герметики, які можуть використовуватися, включають, але не обмежуються герметиками на основі трегалози/цукрози.
Короткий Опис Креслень
Фіг. 1 зображає схематичний вигляд збоку вакуумного пристрою представленого винаходу;
Фіг. 2 зображає схематичний вигляд збоку поперечного перерізу фільтрувального блока;
Фі. ЗА зображає необроблене зображення полістиролових кульок зі сканувального електронного мікроскопу (ЗЕМ) з великим збільшенням, які прилипли до поліетерсульфонного фільтра;
Фі. ЗВ показує зображення виявлених і пронумерованих полістиролових кульок зі сканувального електронного мікроскопу (ЗЕМ) з великим збільшенням, які прилипли до поліетерсульфонного фільтра;
Фіг. ЗС зображає вигляд зблизька і зверху зображення зі сканувального електронного мікроскопа (ЗЕМ) з Фіг. ЗВ;
Фіг 4А зображає схематичний вигляд краю зображення сліду краплі з використанням сканувального електронного мікроскопа (5ЕМ) (первинні електрони) з великим збільшенням;
Фіг. 4В зображає схематичний вигляд краю зображення сліду краплі з використанням сканувального електронного мікроскопа (5ЕМ) (первинні електрони) з малим збільшенням;
Фіг. БА зображає схематичний вигляд збоку поперечного перерізу мембрани представленого винаходу з відкритими порами;
Фіг. 58 зображає схематичний вигляд збоку поперечного перерізу мембрани, зображеної на
Фіг. 5А, але із загерметизованими порами;
Фі. 5С зображає схематичний вигляд збоку поперечного перерізу мембрани представленого винаходу, зображеної на Фіг. 5В, яка має розташовану на ній краплю зразка;
Фіг. 50 зображає схематичний вигляд збоку поперечного перерізу мембрани, зображеної на
Фіг. 5С, яка має краплю, яка поглинута мембраною представленого винаходу; і
Фіг. 6 зображає збільшений вигляд з Фіг. 50.
Детальний Опис
Спосіб представленого винаходу описується з посиланням на Фіг. 1-6. Фіг. 1 зображає бо схематичний вигляд спереду вакуумного блока 100, який має вакуумний пристрій 102, з'єднаний з вакуумною камерою 104 за допомогою гнучкого трубопроводу 106, який проходить між ними.
Переважно, гнучкий трубопровід 106 має відповідний клапан, такий як клапан Люера 108.
Вакуумний манометр 110 функціонально з'єднаний з вакуумною камерою 104 для вимірювання в ній вакуумного тиску. Фільтрувальний блок 112 встановлюють за допомогою його тримача 114 на верхній частині вакуумної камери 104. Фільтрувальну мембрану 116 розташовують на фільтрувальному блоці 112. Ін'єктор 118 розташовують над фільтрувальною мембраною 116.
Фіг. 2 зображає схематичний вигляд поперечного перерізу фільтрувального блока 112.
Увесь процес аналізу представленого винаходу може спрощуватися шляхом попереднього встановлення фільтрувальної мембрани 116 на предметний столик сканувального електронного мікроскопа (ЗЕМ) (коротка стійка з оксиду алюмінію) 120 замість виконання цього вручну, коли фільтрувальна мембрана 116 містить пробу/зразок, який аналізується і обраховується.
Встановлення може виконуватися шляхом простого свердління отвору у короткій стійці 120 сканувального електронного мікроскопа (ЗЕМ). Застосування такого пристрою мінімізує ризик втрати зразка або ушкодження фільтрувальної мембрани 116 під час попереднього етапу, на якому фільтрувальною мембраною 116, яка містить зразок, маніпулюють вручну під час встановлення на коротку стійку 120 сканувального електронного мікроскопа (ЗЕМ). Деталі підготовки фільтрувальної мембрани 116 описуються нижче. Такий аналітичний пристрій, який витрачається, на основі сканувальної електронної мікроскопії (рд5ЕМ) є відносно недорогим для виготовлення.
Точніше, фільтрувальний блок 112 переважно має модифіковану коротку стійку 120 з оксиду алюмінію сканувального електронного мікроскопа (ЗЕМ), на якій поміщена двостороння вуглецева монтажна стрічка 122. Загерметизовану пористу фільтрувальну мембрану 116 поміщають на верхню поверхню вуглецевої монтажної стрічки 122. Процес герметизації фільтрувальної мембрани 116 описується в деталях нижче, зокрема, з посиланням на Фіг. 5-6.
Ін'єктор 118, який містить зразок або пробу 124, що аналізується, розташовують або поміщають над фільтрувальною мембраною 116 і використовують для поміщення краплі 126 зразка на фільтрувальну мембрану 116. Оскільки коротка стійка 120 герметично з'єднується з тримачем 114 фільтрувального блока, який, своєю чергою, встановлюється на вакуумній камері 104, всередині короткої стійки 120 присутній вакуум таким чином, що вакуум прикладає
Зо підсмоктувальну силу до фільтрувальної мембрани 116 знизу фільтрувального блока 112. Це можливо, оскільки продовгувата порожнина або канал 128, сформований всередині короткої стійки, гідравлічно сполучений з фільтрувальною мембраною 116 і вакуумною камерою 104. Як описується нижче, важливо, щоб ін'єктор 118 вірно розташовували над фільтрувальною мембраною 116 таким чином, щоб, коли крапля 126 зразка поміщалася на фільтрувальну мембрану 116, вона не контактувала з краями фільтрувальної мембрани 116 і розташовувалась безпосередньо над продовгуватою частиною 129 порожнини, яка сформована між каналом 128 і нижньою стороною монтажної стрічки 122. Переважно, крапля 126 поміщається в або біля центру частини 129 порожнини, який лежить на поздовжній осі (1), яка проходить крізь канал 128.
Фіг. ЗА-3С показують зображення з великим збільшенням полістиролових кульок, які прилипли до поліетерсульфонного фільтра, зі сканувального електронного мікроскопа (ЗЕМ).
Фіг. ЗА показує необроблене зображення 130, а Фіг. ЗВ показує виявлене зображення 132 з пронумерованими частинками. Фіг. ЗС зображає вигляд зблизька 133 вигляду з Фіг. ЗВ і частини 131 з Фіг. ЗА. У цих ілюстративних зображеннях в області огляду розміром 131,47 мкме виявляли 77 частинок. Це відповідає приблизно 0,59 частинок на мкм. Вигляд 133 показує пронумеровані частинки 1, 2, З, 4, 5, 6, 7, 28, 29, 30.
Фіг 4А-48 зображають край сліду краплі, зображеного з використанням сканувального електронного мікроскопа (ЗЕМ) (первинні електрони). Фіг. 4А показує зображення 134 з великим збільшенням, а Фіг. 4В показує зображення 136 сліду з малим збільшенням. Місцезнаходження
БО зображення 134 з великим збільшенням, показане на Фіг. 4А, позначене білою стрілкою на
Фіг. 4В таким чином, що зображення 134 показує частину зображення 136 усього сліду. Край краплі чітко визначається нехтуваною кількістю частинок зовні сліду. При малому збільшенні увесь слід 136 краплі візуалізується і може точно визначатися площа сліду. У цьому прикладі, площа сліду (Аюа) становила 8,436 мм".
Фіг. БА-50 зображають вигляди збоку поперечного перерізу фільтрувальної мембрани 116 та описують процес герметизації фільтрувальної мембрани 116 і потім розчинення герметика.
На Фіг. БА фільтрувальна мембрана 116 має відкриті пори 138, сформовані між продовгуватими гратчастими елементами 139 фільтрувальної мембрани 116, які проходять крізь фільтрувальну мембрану 116. На Фіг. 5В пори 138 заповнені герметиком 140. На фіг. 5С крапля 126 зразка 124, бо який є рідиною 144, яка містить частинки 142, які аналізуються, поміщена на фільтрувальній мембрані 116. Переважно, крапля 126 поміщається на фільтрувальну мембрану 116 шляхом використання вищеописаного ін'єктора 118. При контактуванні краплі 126 з герметиком 140, рідина 144 розчиняє герметик 140, який знаходиться безпосередньо під краплею 126, таким чином, що рідина 144 поглинається і проходить крізь пори 138, розташовані тільки під краплею 126. Оскільки частинки 142, які нумеруються, мають розмір, який перевищує розмір пор 138 мембрани, вони поміщаються на верхню поверхню фільтрувальної мембрани 116, тоді як рідина і будь-які забруднюючі речовини 144 з меншим розміром частинок поглинаються або протікають в пори 138 під краплею 126, оскільки герметик 140 в таких порах розчиняється і рідина 144 піддається дії підсмоктувальної сили від продовгуватого каналу 128 вакуумної камери 104 під фільтрувальною мембраною 116.
Фіг. б показує збільшений вигляд фільтрувальної мембрани 116 з Фіг. 50. Невидимі неозброєним оком частинки 142 лежать на фільтрувальній мембрані 116 і вони більші за пори 13ва-138) таким чином, що вони не проходять крізь пори навіть, коли пори відкриті і піддаються дії підсмоктувальної сили з вакуумної камери 104 (показана на Фіг. 1). Пори 138а-а4 і 1381-| все ще заповнені герметиком 140, оскільки він ще не був розчинений рідиною 144, оскільки він не контактував з рідиною 144 краплі 126 зразка (дивіться Фіг. 5С). Точніше, розріджувач, такий як відповідний буферний розчин, в рідині 144 розчиняє герметик 140. Як вказано вище, розріджувач повинен бути сумісним із зразком, тобто, мати мінімальний вплив на морфологію зразка і агрегатний стан. Розріджувач повинен також мати властивість розчиняти герметик. Це гарантує те, що вакуум підтримується тільки в сліді і, таким чином, що прилад не втрачає вакуум шляхом "відкривання" пор зовні ділянки, яка представляє цікавість. Коли рідина 144 розчиняє герметик 140, розташований в порах 138е-138Пп, вона заповнює пори 138е-1381 для заміщення герметика 140. Це полегшує нумерацію частинок 142, оскільки вони лежать на верхній поверхні фільтрувальної мембрани 116 і гарно розподілені по фільтрувальній мембрані 116.
Приклад
Нижче наведений ілюстративний приклад способу підготовки фільтрувальної мембрани 116 згідно з представленим винаходом. 1. Зразок, який містить невидимі неозброєним оком частинки 142, такі як мікрочастинки і/або
Зо наночастинки, готують для нумерації шляхом послідовного розрідження його у відповідному розріджувачі (типово вода, фосфат-сольовий буфер, НЕРЕБ(М-2-гідроксиетилпіперазин-М'-2- етансульфонова кислота)-сольовий буфер, ТКІЗ-сольовий буфер або гістидин-сольовий буфер) в залежності від буферних умов кожного конкретного зразка. 2. Зв'язуючий агент (типово глутаральдегід або формальдегід) і/або стабілізуючий агент (типово цукроза або гліцерин) може вводитися в розчин 124 розрідженого зразка, що також містить невидимі неозброєним оком частинки 142, для стабілізації і збереження структури частинок і, в деяких зразках, для запобігання небажаній агрегації частинок 142.
Зв'язуючі/стабілізуючі агенти і розріджувач відповідають рідині 144 і разом з частинками 142 формують пробу/зразок 124 і краплю 126 зразка. Зв'язуючі/стабілізуючі агенти використовуються для запобігання руйнування або пошкодження частинок 142 під час маніпуляції ними і небажаному злипанню їх між собою, що утруднює подальшу нумерацію їх. 3. Фільтрувальний блок 112 складається з пористої фільтрувальної мембрани 116 (типово виготовленої з поліетерсульфону або полікарбонату) з порами 138, які мають визначений розмір (типово 0 - 15 нм), і здатної до відкривання фільтрувальної касети, виготовленої з пластику або еквівалентного матеріалу, використовуваних для відділення частинок 142 від рідини. Відповідний фільтрувальний блок 112 найкраще показаний на фіг. 2. Загалом, фільтри беруться великими партіями як одноразові фільтри і, таким чином, їх потрібно на щось встановлювати. Деякі постачальники також продають тримачі фільтрів і ці пристрої первинно виготовляються для з'єднання зі шприцом і подачі рідини крізь нього, і, таким чином, не засмоктуючи рідину крізь нього з використанням вакууму. Тому, потрібно кріпити фільтр на фільтрувальному блоці для забезпечення цілісності вакууму. Після деякого експериментування, на подив було виявлено, що фільтр можна встановлювати безпосередньо на предметному столику сканувального електронного мікроскопа (ЗЕМ), що економить час і усуває критичні етапи ручної маніпуляції фільтрами, які містять зразок. Ймовірно, що такий блок може недорого виготовлятися і продаватися як такий, що витрачається сканувальним електронним мікроскопом (ЗЕМ). 4. Фільтрувальний блок 112 встановлюють на верхню частину пластикової вакуумної камери 104, яка, своєю чергою, з'єднується з вакуумним пристроєм 102 за допомогою гнучкого трубопроводу 106.
5. Вакуум у вакуумній камері 104 контролюється З3З-ходовим клапаном Люера 108 і відслідковується з використанням вакуумного манометра 110. Може також втілюватися автоматична система, яка використовує магнітні клапани, керовані електронною відслідковувальної системою. 6. Пори 138 у фільтрувальній мембрані 116 переважно герметизується герметиком 140, таким як гліцин (або еквівалентом), перед нанесенням краплі 126 зразка, як найкраще показано на Фіг. 58 і 5С. На подив і неочікувано було виявлено, що шляхом використання герметика 140 у фільтрувальній мембрані 116, частинки 142 всередині краплі 126 розподілялись однорідніше (перед видаленням рідини 144 краплі 126) і не було потреби використовувати велику вакуумну силу для зниження ризику неоднорідного розтікання краплі на фільтрувальній мембрані. Слід відзначити, що розподіл частинок не повинен бути однаковим на зовнішній периферії і в центрі.
Схема розподілу частинок може визначатися шляхом сканування сліду 134/136 (дивіться Фіг. 4А-4В) зразка з частинками, поміщеного на фільтрувальній мембрані, від зовнішньої периферії або зовнішнього краю 137 сліду 136 в напрямі до центру 139 сліду зразка з частинками. Якщо просканована частина зразка з частинками має певну схему розподілу частинок, можна впевнено припустити, що однакова схема розподілу частинок застосовується навколо усього круглого сліду 136 зразка з частинками частково через те, що частинкам надали годинний період для осідання перед розчиненням герметика 140 рідиною в краплі 126. Оскільки крапля 126 спершу поміщається на загерметизовану фільтрувальну мембрану 116, зовнішній край 137 сліду 136 краплі 126 стає відносно чітким або гострим, що важливо для визначення того, де починати нумерацію і сканування в напрямі до центру 139 круглого зразка з частинками або сліду 136, поміщеного на розчинену фільтрувальну мембрану 116. Неочікувано було виявлено, що переваги відносно однорідного розподілу частинок на фільтрувальній мембрані переважують недоліки, пов'язані з необхідністю видалення герметика для надання можливості рідині в краплі протікати крізь фільтрувальну мембрану до початку нумерації частинок. Будь-яка неоднорідна або нечітка периферія сліду краплі на фільтрувальній мембрані утруднює визначення її сліду і знання того, яку ділянку потрібно аналізувати для підрахунку усіх частинок в краплі. Наносячи краплю 126 зразка на фільтрувальну мембрану 116, усі пори 138 якої загерметизовані герметиком 140, частинки 142 однорідно розподіляються всередині краплі 126,
Зо оскільки крапля 126 розтікається по загерметизованій верхній поверхні фільтрувальної мембрани 116. Необхідність розчинення герметика 140 спершу уповільнює протікання рідини 144 крізь пори 138. Не використовуючи герметик 140, рідина 144 краплі 126 повинна негайно починати протікати крізь пори 138 і, оскільки крапля 126 найтовща в центрі і тонша на своїй периферії, то більше частинок 142 мають тенденцію розміщуватися в середині краплі. Це часто приводить до неоднорідного розподілу частинок на фільтрувальній мембрані і зовнішній край сліду зразка з частинками не чіткий. Слід відмітити, що більше частинок не завжди розташовуються в середині краплі, оскільки деякий зразок може мати тенденцію концентруватися в напрямі до межі розділу між повітрям і водою. Загалом важко точно передбачити як поводять себе і розподіляються різні зразки.
Оскільки увесь слід 136 краплі 126 зразка використовується для обрахунку концентрації частинок 142, крапля 126 не повинна торкатися внутрішнього краю тримача фільтрувальної мембрани 116. Таким чином, важливо, щоб тільки визначена частина фільтрувальної мембрани 116 покривалась краплею 126 зразка. Це гарантує те, що нумеруються або підраховуються усі частинки 142 в краплі 126. Також, крапля 126 зразка повинна знаходитися на одній осі з порожниною 129 і каналом 128, сформованим всередині короткої стійки 120. Без попередньої обробки фільтрувальної мембрани 116 герметиком 140, оточуючі пори фільтра, тобто, пори 13в8а-1384 і 138і-138) на Фіг. 6, залишаються відкритими і повітря протікає навколо краплі 126 та крізь фільтрувальну мембрану 116 таким чином, що крапля 126 зразка не поглинається і досить швидко фільтрується з досяганням гарного розподілу зразка з частинками 142. Іншими словами, застосування герметика 140 має перевагу, яка полягає у створенні чіткішої зовнішньої периферії 137 сліду 136 краплі 126, коли рідина починає розчиняти герметик 140, який розташований під краплею 126. Без застосування герметика 140 частинки 142 не будуть мати достатньо часу для однорідного розподілу всередині краплі 126, оскільки рідина 144 негайно починає протікати крізь пори 138 без надання частинкам 142 годинного періоду для осідання і однорідного розподілу всередині краплі 126. Однією дуже важливою ознакою герметика 140 є, таким чином, створення вакуумного стану таким чином, що формується визначений слід зразка. Точніше, без обробки герметиком 140, згідно з представленим винаходом, крапля 126 небажано сохне завдяки дифузії і випаровуванню. Це приводить до сильно неоднорідного розподілу частинок внаслідок ефектів сушіння. На подив бо було виявлено, що небажане випаровування може спричиняти осмотичні ефекти, які потенційно спричиняють руйнування частинок і формування кристалів внаслідок підвищеної концентрації солі в решті краплі. Окрім того, це заважає виявленню і нумерації частинок, причиною чого є зруйновані частинки і частинки, які приховуються сольовими осадами. В представленому винаході, при нанесенні краплі 126 зразка на загерметизовану фільтрувальну мембрану 116, рідина 144 в краплі 126 зразка повільно розчиняє герметик 140 для відкривання пор 138е-138П1, розташованих під краплею 126. Тому, рідина 144 швидко всмоктується крізь пори 138е-1381 фільтрувальної мембрани 116 завдяки вакууму, приводячи до гарного розподілу зразка з частинками 142 на верхній поверхні фільтрувальної мембрани 116. 7. Перед нанесенням краплі 126 зразка на фільтрувальну мембрану 116, активують вакуумний пристрій 102 і тиск у вакуумній камері 104 знижують для створення на фільтрувальній мембрані 116 підсмоктувальної сили. Вакуум у вакуумній камері 104 гарантує те, що рідина 144 краплі 126 однорідно поглинається фільтрувальною мембраною 116.
Комбінація застосування герметика і вакууму приводить до однорідного розподілу частинок 142 по сліду 136 на фільтрувальній мембрані 116. 8. Відповідний об'єм (типово 5 мкл) краплі 126 зразка наносять на пористу і загерметизовану фільтрувальну мембрану 116. Як вказано вище, важливо, що діаметри частинок 142 перевищують діаметр пор 138 фільтрувальної мембрани 116, і що крапля 126 не торкається країв тримача фільтра. Об'єм, більший за 5 мкл, може наноситися шляхом використання ін'єкторної системи, де або багато крапель або більші об'єми наносяться в одне і те ж місце на фільтрувальній мембрані 116. Загалом, застосування більших об'ємів мінімізує похибку відбору зразків і дозволяє аналіз менш концентрованих зразків. 9. Крапля 126 зразка поглинається фільтрувальною мембраною 116 протягом типово 60 секунд під дією вакуумного тиску, забезпечуваного вакуумною камерою 104. Точні величини тиску можуть частково регулюватися в залежності від розміру пор, типу зразка, об'єму зразка, чистоти і в'язкості. 10. Після поглинання, фільтрувальна мембрана 116 може від'єднуватися від фільтрувального блока 112, встановленого на короткій стійці 120 з оксиду алюмінію сканувального електронного мікроскопа (ЗЕМ) (типово шляхом застосування адгезиву і провідної карбонової стрічки 122).
Зо 11. Фільтрувальна мембрана 116 з нанесеними на неї зв'язаними частинками 142 може потім покриватися напиленням, наприклад, тонкою плівкою вуглецю (типово 20 нм в товщину) з використанням вуглецевого випарника при відповідному тиску камери типово 1х105 мбар.
Напилюване покриття покращує провідність фільтрувальної мембрани 116; збільшує відношення "сигнал-шум" фільтрувальної мембрани 116 і послаблює ушкодження від електронного променю і впливи заряджання. Ця технологія часто необхідна у застосуванні для відображення фільтрувального матеріалу з використанням сканувального електронного мікроскопа (ЗЕМ). Може бути нетрадиційним застосування вуглецевого покриття, але воно забезпечує формування зображення від сканувального електронного мікроскопа (ЗЕМ) з більшою роздільною здатністю порівняно з більшим розміром частинок металевого напилення. 12. Фільтрувальна мембрана 116 може переноситися до сканувального електронного мікроскопа (ЗЕМ) і сигнал від розсіяних первинних електронів (3 використанням внутрішньолінзового детектора) або вторинних електронів (як, наприклад, шляхом застосування детектора 5Е2) реєструється при малому збільшенні для покривання усього сліду і при великому збільшенні (типово 10000 - 30000 разів) для нумерації. Якщо використовується еталон з різною сигнатурою вторинних електронів (хоча необов'язково для визначення концентрації частинок), то частинки, які представляють цікавість, можуть розрізнятися серед еталонних частинок шляхом поєднання інформації про яскравість від різних детекторів (таких як внутрішньолінзові детектори і детектори ЗЕ). 13. Зображення 136 з малим збільшенням (дивіться Фіг. 48) використовуються для визначення розміру сліду краплі і розподілу усього зразка, тоді як зображення з великим збільшенням використовуються для нумерації частинок. 14. Зображення з великим збільшенням, такі як зображення 134, отримуються у сліді зразка, починаючи від краю 137, з проходженням через центр 139 і до протилежного краю краплі, для мінімізації будь-якого впливу відмінностей в розподілі частинок у сліді краплі. 15. Із зображень з малим збільшенням, таких як зображення 136, площа сліду зразка (Аюіа) обраховується шляхом проходження краю сліду. Взяті в коло пікселі підраховуються і підрахована кількість множиться на розмір пікселів. 16. Із зображень з великим збільшенням виявляють і підраховують частинки 142. Ця процедура може виконуватися шляхом ручного маркування або автоматизованого маркування бо шляхом використання відповідного програмного забезпечення, такого як Мігопома"5 ргоргієїагу зоймаге Апаїуег, або будь-якого іншого відповідного програмного забезпечення для аналізу зображень. Середня кількість частинок на одиницю площі (п/Агоу) обраховується з набору даних зображення. 17. Кількість частинок на мл в зразку з частинками переважно обраховують з використанням наступної формули:
С-А х їй харх ові
Боба! Акоу у щі де С є концентрацією частинок, аї є коефіцієнтом розрідження, а М є нанесеним об'ємом зразка. Також може бути можливим використовувати формулу, в якій взято до уваги той факт, що розподіл частинок може змінюватися від периферії зразка з частинками, коли зразок сканується, в напрямі до його центру.
Таким чином, технологія квантифікаційної сканувальної електронної мікроскопії частинок (ра5ЕМ) представленого винаходу є технологією високоточної безпосередньої детекції і нумерації частинок. Важливою ознакою представленого винаходу є те, що пряма детекція не залежить від спорідненості між пробою і зразком, що можуть робити багато існуючих традиційних технологій. Усі параметри, такі як коефіцієнт розрідження, нанесений об'єм, слід краплі, можуть контролюватися і кількість частинок на одиницю площі може безпосередньо визначатися з одночасною мінімізацією похибки з наближень і припущень. Більше того, роздільна здатність РО2ЕМ дозволяє детекцію окремих невидимих неозброєним оком частинок в кластерах і з однакового зразка можуть нумеруватися дві популяції частинок різних розмірів або інші морфологічні ознаки. Частинки і слід з висококонтрастних зображень, одержаних технологією рда5ЕМ представленого винаходу, можуть легко виявлятися шляхом використання автоматизованого аналізу зображень. Це надає засіб для швидкого збору великих наборів даних і одержання стійких статистичних результатів.
Хоча представлений винахід був описаний у відповідності з переважними прикладами і варіантами виконання, слід розуміти, що в нього можуть вноситися певні заміни і зміни без виходу за рамки наступної формули винаходу.
Claims (9)
- ФОРМУЛА ВИНАХОДУ Зо 1. Спосіб квантифікації невидимих неозброєним оком частинок, у якому: використовують фільтрувальну мембрану (116), яка має сформовані в ній пори (138), функціонально з'єднують її з вакуумною камерою (104); герметизують пори герметиком (140); наносять краплю (126) зразка, яка містить рідину (144) і невидимі неозброєним оком частинки (142), на фільтрувальну мембрану (116) без торкання краплею (126) зразка жодного зовнішнього краю фільтрувальної мембрани (116); рідина (144) розчиняє герметик (140) в порах (138е-138П), розташованих під краплею (126) зразка; рідина (144) протікає крізь пори, у яких був розчинений герметик (140), а невидимі неозброєним оком частинки (142) залишаються на верхній поверхні фільтрувальної мембрани (116); і невидимі неозброєним оком частинки (142) нумерують в електронній мікроскопії.
- 2. Спосіб за п. 1, який відрізняється тим, що у ньому додатково попередньо встановлюють фільтрувальний блок (112), який містить фільтрувальну мембрану (116), на предметний столик (120) сканувального електронного мікроскопа (ЗЕМ).
- 3. Спосіб за п. 2, який відрізняється тим, що у ньому додатково на предметний столик (120) сканувального електронного мікроскопа (5ЕМ) поміщають монтажну стрічку (122).
- 4. Спосіб за п. 1, який відрізняється тим, що у ньому додатково використовують предметний столик (120) сканувального електронного мікроскопа (ЕМ), який має сформований в ньому продовгуватий канал (128), використовують ін'єктор (118), який містить краплю (126) зразка, і орієнтують ін'єктор (118) на верхній частині продовгуватого каналу (128) перед поміщенням краплі (126) зразка на фільтрувальній мембрані (116).
- 5. Спосіб за п. 2, який відрізняється тим, що у ньому додатково з'єднують предметний столик (120) сканувального електронного мікроскопа (ЗЕМ) з вакуумною камерою (104), з'єднаною з вакуумним пристроєм (102), і піддають фільтрувальну мембрану (116) дії підсмоктувальної сили за допомогою продовгуватого каналу (128).
- 6. Спосіб за п. 1, який відрізняється тим, що у ньому додатково рідина (144) розчиняє герметик (140) тільки в порах (1386-1381), розташованих безпосередньо під краплею (126) зразка, тоді як сусідні пори (138а-1384, 138і-138)) залишаються загерметизованими герметиком (140).
- 7. Спосіб за п. 1, який відрізняється тим, що у ньому додатково невидимі неозброєним оком частинки (142) формують слід (136) на фільтрувальній мембрані (116), і сканують невидимі неозброєним оком частинки (142) від зовнішньої периферії (137) сліду (136) в напрямі до центра (139) сліду (136).
- 8. Спосіб за п. 1, який відрізняється тим, що у ньому додатково використовують розріджувач рідини (144) для розчинення герметика (140) в порах, розташованих безпосередньо під краплею (126) зразка.
- 9. Спосіб за п. 1, який відрізняється тим, що у ньому додатково як герметик (140) використовують гліцин. и 160 пе шов Ваши ПРИСТРІЙ с З Я Пд ма мо ха У р і 4-14 мо 7 М вакуумна ве рай Ф ; це камера (С с-- ЗОФіг. 1 и 112 кт а фі- ім ше До/126 16 й а по тини З ї. що 120 ще гу ХУ хх 328 МІХ і ф-т ї іФіг. 2«31 -е що со в й Б 3 КешенттнйФіг. ЗА зи 1Фіг. ЗВ7 133 ОН і М В В а ОО В наяС я. ВД ННВвооов ов ко о ЗЕ ТНК вкв оо Вико ово и о ВВ С и в я нан її ПО А и МЕ и с 6 М и в но нн у с В ДН В я МФіг. 3С , ї34 її; ЕК и в Енн в В а в а и у і ; о в в пн и г нн. с п ен и БО НЕ МЕ ВЕ Я с Й и нн с ОО в и 3 НН і МН В В п ПНЯФіг. 4АЕ ши ще я ГЛ й лов Ки Х пит ПДК КОХ АХА КК КК КК я Зі Пон в ОКХ КК Ж ЗО ВОя сс с ше я ПК КОКО ех ОК У КИ СЕЛО ОК ОК Ко КО о и А 0 - НЕ ВЕ с ОО А КОХ ЗХ З ІМ ква ОО с 5 ПЕН КК УК НИ ММ ОО Кс п оо о о ОВ роко с КК ВИ с г Ті ше м БО п ня УМ, 1 ЕХ 3. Б МЛ ОО МОЯ дик ШИ ш ДО БО Пи не се в А ЯК ячЕ Й в 0 МЕ СЕН ОО ОО ВОК и не я шо. С ДЕКО и .: ШКТ ЕВ ВО 5 ші пошти Б. Ох о оо п КА 3 ще0. с ве Я КОКО ОО ши ни МІ МОКО КОКО и ПИСК о КК ви ПК и СКК ши ОО а ши 5 щАВ с - о пох ОІД Ко НН ДИКУ с ОО ЕВ ще ОО ом г п КК ОКО оо я ее ОХ ОК Я о ПАХ КОКО КК ни Тл с с ТЕО с ОО ПЕ с 5 с МЕ ПКЕЕ 0 ден ПИШИ Ж ОВК КО МКК КК ше і ОБ Ве : Пи ши шІш ит 00000 виде КК Й 139Фіг. 48 138 ха 4 Й і х ра 116 ; Н Х гр х їй ) й У Ей и 4 133Фіг. 5А
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US201562269465P | 2015-12-18 | 2015-12-18 | |
| PCT/US2016/058011 WO2017105625A1 (en) | 2015-12-18 | 2016-10-21 | High precision quantification of sub-visible particles |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| UA123318C2 true UA123318C2 (uk) | 2021-03-17 |
Family
ID=59057225
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| UAA201807032A UA123318C2 (uk) | 2015-12-18 | 2016-10-21 | Високоточна квантифікація невидимих неозброєним оком частинок |
Country Status (23)
| Country | Link |
|---|---|
| US (3) | US10247648B2 (uk) |
| EP (1) | EP3389813B1 (uk) |
| JP (1) | JP6621825B2 (uk) |
| KR (1) | KR102150748B1 (uk) |
| CN (1) | CN107106926B (uk) |
| AU (1) | AU2016372660B2 (uk) |
| BR (1) | BR112017022551B1 (uk) |
| CA (1) | CA2964777C (uk) |
| CL (1) | CL2017001694A1 (uk) |
| DK (1) | DK3389813T3 (uk) |
| EA (1) | EA035524B1 (uk) |
| ES (1) | ES2784394T3 (uk) |
| HU (1) | HUE048446T2 (uk) |
| IL (1) | IL252558A0 (uk) |
| MA (1) | MA41074B1 (uk) |
| MX (1) | MX368558B (uk) |
| MY (1) | MY188672A (uk) |
| NZ (1) | NZ733989A (uk) |
| PL (1) | PL3389813T3 (uk) |
| PT (1) | PT3389813T (uk) |
| SG (1) | SG11201706486QA (uk) |
| UA (1) | UA123318C2 (uk) |
| WO (1) | WO2017105625A1 (uk) |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2020041283A1 (en) * | 2018-08-21 | 2020-02-27 | Battelle Memorial Institute A Non-Profit Corporation Of The State Of Ohio | Particle sample preparation with filtration |
Family Cites Families (14)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5385672A (en) | 1993-10-13 | 1995-01-31 | Eg&G Idaho, Inc. | Method for preparing membranes with adjustable separation performance |
| US6699665B1 (en) * | 2000-11-08 | 2004-03-02 | Surface Logix, Inc. | Multiple array system for integrating bioarrays |
| WO2002055673A1 (en) * | 2001-01-10 | 2002-07-18 | Biopore, Inc. | Cell concentrator and washer |
| US6884341B2 (en) * | 2002-10-02 | 2005-04-26 | G6 Science Corp. | Filter device to capture a desired amount of material |
| JP2005152849A (ja) | 2003-11-27 | 2005-06-16 | Kitakyushu Foundation For The Advancement Of Industry Science & Technology | 浮遊微粒子捕集用フィルタ及びそれを用いた浮遊微粒子捕集方法、浮遊微粒子分析方法、並びに浮遊微粒子捕集装置 |
| KR20070097434A (ko) * | 2004-11-12 | 2007-10-04 | 루미넥스 코포레이션 | 이미지화를 위해 마이크로스피어를 배치하는 방법 및시스템 |
| US8029744B2 (en) * | 2005-11-16 | 2011-10-04 | Hitachi, Ltd. | Method of liquid droplet formation and transport apparatus therefor and particle manipulating apparatus |
| IL173536A0 (en) | 2006-02-05 | 2006-07-05 | Ilan Avichai | Method of reversibly sealing the pores of a netting and its application to agricultural protection |
| KR101343749B1 (ko) | 2007-05-30 | 2013-12-19 | 인텔리전트 바이러스 이미징 아이엔씨. | 이미지 내 바이러스 입자를 카운팅하고 분할하기 위한 방법 |
| SE532499C2 (sv) * | 2008-01-18 | 2010-02-09 | Hemocue Ab | Metod och apparat för analys av partiklar i ett vätskeformigt prov |
| EP2260300B1 (en) * | 2008-03-07 | 2013-09-25 | Advanced Microdevices Pvt Ltd | Method and device for particle removal and droplet preparation for qualitative and quantitative bioanalysis |
| EP2335825A1 (en) * | 2009-12-21 | 2011-06-22 | F. Hoffmann-La Roche AG | Unit and device for the preparation of cells and/or particles in a liquid and method for microscopic analysis |
| US8969827B2 (en) * | 2012-07-09 | 2015-03-03 | Materials Analysis Technology (Us) Corp. | Specimen preparation for transmission electron microscopy |
| KR101371663B1 (ko) | 2012-09-03 | 2014-03-12 | 창원대학교 산학협력단 | 입자의 정량적 측정방법 및 그 장치 |
-
2016
- 2016-10-21 JP JP2017533216A patent/JP6621825B2/ja active Active
- 2016-10-21 HU HUE16876228A patent/HUE048446T2/hu unknown
- 2016-10-21 MY MYPI2018700118A patent/MY188672A/en unknown
- 2016-10-21 CA CA2964777A patent/CA2964777C/en active Active
- 2016-10-21 AU AU2016372660A patent/AU2016372660B2/en active Active
- 2016-10-21 PL PL16876228T patent/PL3389813T3/pl unknown
- 2016-10-21 MX MX2017010161A patent/MX368558B/es active IP Right Grant
- 2016-10-21 EA EA201792107A patent/EA035524B1/ru not_active IP Right Cessation
- 2016-10-21 NZ NZ733989A patent/NZ733989A/en not_active IP Right Cessation
- 2016-10-21 BR BR112017022551-4A patent/BR112017022551B1/pt not_active IP Right Cessation
- 2016-10-21 SG SG11201706486QA patent/SG11201706486QA/en unknown
- 2016-10-21 MA MA41074A patent/MA41074B1/fr unknown
- 2016-10-21 PT PT168762284T patent/PT3389813T/pt unknown
- 2016-10-21 KR KR1020177023965A patent/KR102150748B1/ko active IP Right Grant
- 2016-10-21 ES ES16876228T patent/ES2784394T3/es active Active
- 2016-10-21 DK DK16876228.4T patent/DK3389813T3/da active
- 2016-10-21 CN CN201680004052.3A patent/CN107106926B/zh active Active
- 2016-10-21 UA UAA201807032A patent/UA123318C2/uk unknown
- 2016-10-21 WO PCT/US2016/058011 patent/WO2017105625A1/en active Application Filing
- 2016-10-21 US US15/736,621 patent/US10247648B2/en active Active
- 2016-10-21 EP EP16876228.4A patent/EP3389813B1/en active Active
-
2017
- 2017-05-28 IL IL252558A patent/IL252558A0/en active IP Right Grant
- 2017-06-23 CL CL2017001694A patent/CL2017001694A1/es unknown
-
2019
- 2019-02-15 US US16/277,393 patent/US10345207B2/en active Active
- 2019-05-18 US US16/416,186 patent/US10571375B2/en active Active
Also Published As
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JP5961889B2 (ja) | 末梢循環腫瘍細胞分離用デバイス、希少細胞分離用デバイス、末梢循環腫瘍細胞分離方法及び希少細胞分離方法 | |
| AU2006304717B2 (en) | Apparatus and method for performing counts within a biologic fluid sample | |
| KR101858056B1 (ko) | 다수의 세포 현탁액 제조 및 분석용 자동 방법 및 자동화 디바이스 | |
| JP7074148B2 (ja) | 有核細胞の濾過用フィルターおよびそれを用いた濾過方法 | |
| CN108795723B (zh) | 用于过滤有核细胞的过滤器和使用了其的过滤方法 | |
| JP2013537469A5 (uk) | ||
| JP2011521262A (ja) | 免疫磁気濃縮された希少細胞の改良されたイメージング | |
| JP2011521262A5 (uk) | ||
| UA123318C2 (uk) | Високоточна квантифікація невидимих неозброєним оком частинок | |
| JP2009544030A (ja) | フロースルーセルおよび使用方法 | |
| EP2244083A1 (en) | Method, apparatus, vessel and cytocentrifuge for liquid based cell preparation | |
| JP2016174578A (ja) | 微小粒子選別装置および前記装置を備えた微小粒子回収装置 | |
| US20230279324A1 (en) | Autonomous microfluidic device for sample preparation | |
| JP2020153960A (ja) | 微量液滴に含まれる微粒子の光学・電子顕微鏡による定量方法 | |
| US11484882B2 (en) | Autonomous microfluidic device for sample preparation | |
| JP2009139109A (ja) | 溶液中の異物の検査方法、及び溶液中の異物検査用ろ過膜 |