KR101343749B1 - 이미지 내 바이러스 입자를 카운팅하고 분할하기 위한 방법 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 이미지 내 바이러스 입자의 세포내 카운팅 및 분할을 위한 것이다. 다수의 아이템이 포함된 이미지가 제공된다. 바이러스 입자의 반경 범위가 판단된다. 이미지 내, 지정된 반경 범위 내의 반경을 갖는 원형의 아이템이 식별된다. 지정된 반경 범위로부터 형성가능한 타원형 아이템이 판단된다. 그룹으로 식별된 상기 원형 및 타원형 아이템은 분류된다. 원형의 아이템과 타원형 아이템 간의 바이러스 입자가 식별된다. 예를 들어, 본 발명의 방법은 TEM 이미지에서의, siRNA 처리된 인간 거대세포바이러스 입자의 세포내 카운팅 및 분할을 위해 사용될 수 있다.

Description

이미지 내 바이러스 입자를 카운팅하고 분할하기 위한 방법{A METHOD FOR COUNTING AND SEGMENTING VIRAL PARTICLES IN AN IMAGE}
본 발명은 전자 현미경 이미지 등의 이미지에 나타난 바이러스 입자 등의 물체를 카운팅(counting)하고, 분할(segmenting)하며 식별하는 것에 관한 것이다.
과거에, 바이러스 및 그 밖의 다른 성분을 포함하는 세포 구조를 분류하고 분석하기 위한 많은 노력이 있어 왔다. 이용가능한 이미지 기술을 사용함으로써, 바이러스를 묘사하고, 분할하며, 분류하기 위해 다양한 이미지 분석 방법이 개발되어 왔다. 예를 들어, cryo-전자현미경법이 사용되어왔지만, 세포 및 바이러스 입자의 구조가 잘 나타나지는 않는다. 또한 세포 성분의 성숙 단계를 정확하게 판단하기 위해, 세포 성분을 객관적이고, 반복적이며, 신뢰할 만하게 묘사하는 것이 어려웠다.
더 구체적으로, 바이러스 조합(virus assembly)은 복잡한 프로세스이며, 집중적인 연구의 대상이다. 바이러스는 성숙과 세포내 전이(intracellular transport)의 복잡한 프로세스를 겪음으로써, 숙주 세포를 이용하여 자신의 후대 바이러스 입자를 생성할 수 있다. 이러한 프로세스는 전자 현미경(EM)을 이용함으로써, 높은 배율에서 모니터링될 수 있으며, 이로 인해서, 여러 다른 세포 구획(cellular compartment)에서의 여러 다른 타입의 바이러스 입자의 시각적 식별이 가능하다. 해결되어야 할 채로 남겨진 중요한 문제로는 이 바이러스 조합 프로세스의 각각의 단계에 관련된 바이러스 단백질의 식별뿐 아니라, 바이러스 성숙 동안 기저 세포내 전이 및 여러 다른 타입의 바이러스 입자의 이동 메커니즘이 있다. 예를 들면, 토모그래피 및 cry EM 등의 시각화 기법이 바이러스 구조에 대한 이용가능한 정보에 기여할지라도, 바이러스 성숙에 대한 구조적 형태는 일반적으로 해결하기 어렵다. 이들 기법은 안정적인 성숙된 바이러스 입자에 대한 정보를 제공하기 위해 사용될 수 있다. 핵심 바이러스 단백질 성분의 돌연변이를 생성하기 위해 유전공학적 툴(genetic tool)이 이용가능하다. 구조적 효과를 시각화하기 위해 EM이 사용될 수 있다. 그러나 구조적 효과, 특히, 중계 및 모호한 입자 형태를 특징짓고, 이들을 객관적인 방식으로 적절하게 정량화하기 위한 어떠한 적합한 툴도 존재하지 않는다.
이는 이전 분석 방법이 왜 그다지 효과적이지 않았으며, 세포 및 바이러스 입자 구조를 분석하기 위한 더 효과적인 방법에 대한 필요성이 존재함을 어느 정도는 설명한다. 바이러스 입자 성숙 및 세포내 전이를 특징짓고 정량화하여, 여러 다른 바이러스 조합에 대한 객관적인 연구를 촉진하기 위한 이미지 분석 툴이 요구된다. 또한 이미지에서 나타내는 바이러스 입자를 식별하고 정량화하기 위한 효과적 방법이 존재한다.
본 발명의 방법은 앞서 언급된 문제에 대한 해결책을 제공한다. 본 발명의 방법은 전자 현미경 이미지와 같은 이미지에서 바이러스 입자의 세포내 카운팅 및 분할을 위해 사용될 수 있다. 다수의 물체/아이템이 포함된 이미지가 제공된다. 이미지 내 모든 원형 및 타원형 물체가 식별된다. 원형 및 타원형 물체가 그룹으로 분류된다. 원형 바이러스 입자의 반경 밀도 프로필이 판단된다. 원형 바이러스 입자의 반경 밀도 프로필로부터 형성가능한 타원형 아이템이 또한 판단된다. 선택된 그룹 내 물체의 반경 밀도 프로필을 분석함으로써, 분류된 원형 및 타원형 물체 중에서 바이러스 입자가 식별된다. 예를 들어, 상기 방법은 TEM 이미지에서의 siRNA 처리된 인간 거대세포바이러스 입자의 세포내 카운팅 및 분할을 위해 사용될 수 있다.
도 1A는 회전 불변형 이미지(A)의 개략적 예시를 도시한다.
도 1B는 각도 불변형 이미지(A)의 개략적 예시를 도시한다.
도 2는 5개의 이미지 세트에 대한 밀도 측정치를 그래프로 도시한다.
도 3은 LVS에 위치하는 모든 이미지 세트로부터의 반경 밀도 프로필을 개략적으로 도시한다.
도 4는 서브셋 A에 대한 평균 주변에 점선으로 된 표준 편차가 포함된 평균 반경 프로필을 개략적으로 도시한다.
도 5는 서브셋 B에 대한 평균 주변에 점선으로 된 표준 편차가 포함된 평균 반경 프로필을 개략적으로 도시한다.
도 6은 30 내지 40㎚의 반경에 대해 도 5를 클로즈업으로 개략적으로 도시한다.
본 발명의 방법은 이미지 내의 입자/물체, 예를 들어, TEM(transmission electron microscopy) 이미지에 나타나는 물체의 검색, 분할 및 식별을 위한 사용될 수 있다. 이미지 내에서 식별되는 물체는 바이러스 입자와 원 및 타원 형태를 갖는 그 밖의 다른 입자와 관련될 수 있다. 완벽한 원형이 하나의 반경을 갖는 것에 반해, 타원 형태는 최대 반경과 최소 반경을 갖는 것으로 정의될 수 있다. 방법은 분석 대상인 바이러스 입자의 반경 범위에서 어느 타원 형태가 형성될 수 있는지를 판단한다. 예를 들어, 바이러스 입자가 100 단위(unit)의 반경을 갖는 경우, 타원 형태의 최대 반경 및 최소 반경은, 예를 들어, 바이러스 입자가 둥글 때의 바이러스 입자의 반경보다 20% 더 크거나(즉, 120단위), 20% 더 작을 수 있다(즉, 80단위). 최대 반경, 또는 최소 반경이 허용되는 반경 범위 외부에 있는 경우, 아이템은 허용될 수 없다고 간주되며, 바이러스 입자로서 식별되지 않을 것이다. 그 후, 원형 및 타원형이 분류되고 그룹-설정되어, 유사한 반경 범위들이 함께 그룹-설정될 수 있다. 그 후, 바이러스 입자가 그룹-설정된 아이템의 형태로 식별되고 정량화된다. 또한 2개의 서로 다른 성숙 단계 사이에 있는, 즉, 2개의 서로 다른 성숙 그룹 사이에 있는 성숙 단계에 있는 바이러스 입자를 식별하는 것이 가능하다. 바이러스 입자는 지정된 반경 밀도 프로필을 가질 수 있으며, 수학적 수식, 예를 들어, 푸리에 변환이 사용되어, 바이러스 입자에 대해 통상적인 지정된 반경 밀도 프로필을 기초로, 어느 타원형의 물체가 바이러스 입자인지를 판단할 수 있다. 특정 성숙 단계에서의 바이러스 입자의 반경 밀도 프로필을 보여주는 팜플렛을 이용할 필요성이 존재하지 않는다. 왜냐하면, 상기 팜플렛을 이용하여, 손상된 바이러스 입자, 또는 팜플렛의 2개의 서로 다른 성숙 단계 사이에 존재하는 바이러스 입자가 발견되지 않을 수 있기 때문이다.
반경 범위, 또는 반경 밀도 프로필의 분포를 클러스터(cluster)의 형태로 결정하는 것이 또한 가능할 수 있으며, 이는 도 3에서 나타나며, 이하에서 상세히 설명된다. 또한 이하에서 설명될 바와 같이, 바이러스 입자는 화학 물질, 예를 들어, 의약제에 노출될 수 있고, 본 발명의 방법의 단계들은 수정된 이미지를 기초로 다시 실행되어, 화학적 물질, 또는 의학적 치료에 대한 노출의 결과로서 입자 크기 또는 반경 밀도 프로필의 분포가 어떻게 변하는가를 판단할 수 있다. 이러한 방식으로, 바이러스 입자에 미치는 화학적 물질 치료의 효과를 판단하는 것이 가능할 수 있다.
또한 바이러스 입자 내에 특정 빌딩 블록(building block)을 차단하기 위해 siRNA 기법을 이용하는 것이, 예를 들어, pp150 단백질을 표적으로 정하고, cmv 입자 생산을 차단함으로써, 가능할 수 있다. 이러한 siRNA 처리 후, 바이러스 입자에 미치는 영향 및 상기 바이러스 입자의 형태적/구조적 변화가 분석될 수 있다. 덧붙이자면, 영향받는 바이러스 입자의 개수, 또는 양이 또한 연구될 수 있다.
또한 하나의 이미지 내에 나타나는 바이러스 입자가 어느 바이러스 입자인지를 판단하기 위해 반경 밀도 프로필을 분석함으로써 바이러스 입자를 식별하기 위해 본 발명의 방법을 이용하는 것이 가능할 수 있다. 하나의 이미지 내에서 모든 원형 및 타원형의 물체를 발견하고, 반경 특성을 기초로 물체들을 그룹으로 분류한 후, 다음 단계는 특정 바이러스 입자의 반경 특성을 식별하는 것일 수 있다. 따라서 바이러스 입자의 지정 반경 범위(가령, 80 +/- 3 단위(unit)의 반경 범위) 내의 반경 특성을 갖는 물체의 임의의 클러스터가 바이러스 입자를 식별하기 위해 사용될 수 있다. 반경 특성의 범위를 이용함으로써, 왜곡되거나 타원형의 입자도 또한 포함될 수 있다. 이러한 허용 가능한 범위 밖의 반경 범위를 갖는 입자는 폐기되고, 바이러스 입자가 아니라고 분류된다. 바람직한 반경 범위 내에 여러 가지 타입의 바이러스 입자가 존재하는 경우, 바이러스 입자를 의학적으로, 또는 화학적으로 처리하고, 그 후 바이러스 입자가 상기 처리에 대해 어떻게 반응하는지를 판단하기 위해 상기 방법을 다시 실행시키는 것이 가능하다. 이러한 반응을 기초로, 어떤 것이 바이러스 입자인지를 식별하는 것이 가능하다. 예를 들어, PCR 기법을 이용함으로써, 바이러스 입자를 식별하기 위해 사용될 수 있는 기준 팜플렛을 생성하는 DNA를 증폭시키는 것이 가능할 수 있다. 따라서 식별되는 바이러스 입자를 검증하거나 확인하기 위해, 추가적인 테스트가 사용될 수 있다.
따라서 본 발명의 방법은, 이하에서 상세히 설명될 바와 같이, TEM 이미지에 서 바이러스 입자를 검색하고, 분할하며, 식별하기 위해 사용될 수 있다. 바이러스 입자의 캡시드는, 중심으로부터의 고정 반경에서 동일한 단백질 밀도를 갖는 대략적으로 원형의 물체이며, 따라서 회전-불변형 물체(회전에 의해 변하지 않는 물체)라고 일컬어지며, 도 1A에서 가장 잘 나타난다. 회전 불변성의 측정치를 생성하기 위해, 회전 불변성 측정의 대상이 될 수 있는 “반대(opposite)” 속성에 대한 필요성이 존재한다. 도 1B에서 가장 잘 나타난 바와 같이, 이러한 목적을 위해 각도 불변형 물체(angular invariant object)가, 중심으로부터의 6개의 각에서 동일한 단백질 밀도를 갖기 때문에, 사용될 수 있다.
중심 및 각(t)(대응하는 푸리에 주파수(wt))에서부터의, 중심에서 멀어지는 임의의 고정된 방향으로 취해진 반경(r)(대응하는 푸리에 주파수(wr))에 의해 결정되는 값을 갖는 함수(f)의 푸리에 스펙트럼이 사용되어, 회전-불변형 물체와 각도 불변형 물체를 설명할 수 있다. 완벽한 회전-불변형 물체는, wt=0일 때 자신의 모든 에너지를 갖고, 완벽한 각도 불변형 물체는 wr=0일 때 자신의 모든 에너지를 가지며, 이 사이의 모든 물체는 두 주파수 대역 모두의 에너지를 갖는다. 따라서 합리적으로 올바른 측정은, 이들 에너지의 차이를 비교하는 것이며, 이는 음성 대조(negative control)에 의해서 제공될 수 있는 측정치의 임계 레벨을 갖는 선험적 측정을 유일한 미지의 상수로서 제공한다.
TEM 이미지 내 바이러스 구조의 밀도 측정이 지금부터 설명된다. 서로 다른 이미지 내의 바이러스 구조의 개수를 비교하기 위한 밀도 측정은 하나의 이미지 내 면적 단위(A) 당 물체의 특정 개수(n)로서 수행된다.
Figure 112009081435712-pct00001
서로 다른 바이러스 구조의 분할(segmentation)이 지금부터 설명된다. 각각의 발견된 물체 또는 아이템/입자의 반경 밀도 프로필은 바이러스 구조의 바람직한 근사치 역할을 한다. 프로필을, 특이값 분해(SVD: singular value decomposition)를 이용하여 계산된 상기 프로필의 주축(p)으로 설정된 기저 집합(basis set)을 갖는 선형 벡터 공간(LVS: linear vector space)으로 설정하는 것이 여러 다른 바이러스 구조의 클러스터 행태(cluster behavior)에 대한 시각적 이해를 제공한다. 이 정보를 이용하여, 서로 다른 클러스터를 추출하고, 개별적으로 카운팅하는 것이 가능하며, 이미지의 각각의 집합으로부터 평균 구조를 계산함으로써, 의료 약제를 투입할 때의 구조적 차이를 구별하는 것이 가능하다.
이하의 표 1에서 나타나는 바와 같이, 3.3 ㎚/픽셀의 분해능으로, 전자 현미경을 이용하여, 4개의 서로 다른 siRNA가 적용된, 감염된 세포에 대한 약 500MB의 이미지가 획득되었다. 회전 불변 측정을 이용하여 상기 이미지가 처리되었다. 회전 불변의 대조 반경(control radius)이 15픽셀(약 50㎚)로 설정되었고, 반경 불변성 측정이 15 레벨을 초과한 경우, 15픽셀의 로컬 반경 최대치에서 이미지 내 물체가 획득되었다. 반경 밀도 프로필을 획득할 때, 각각의 프로필의 평균이 제거되어, 서로 다른 이미지의 서로 다른 밝기 레벨에 대해 보상이 이뤄질 수 있다. 이러한 평균은 100픽셀, 즉 약 330㎚의 반경에 걸쳐 취해진 것이다.
그룹 이미지의 개수 총면적(㎛2)
양성 대조군 83 700.48
MCP 119 1317.30
GB 34 320.17
MCP+gB+pp150 28 241.71
pp150 28 355.84
표 2는 계산된 밀도의 평균 및 상기 평균의 표준 편차를 기재한다. 스튜던트 t-검증(student t-test)을 이용하여, pp150 및 MCP 이미지로부터의 결과를 양성 대조군(positive control)과 비교함으로써, 밀도는 동등 평균(equal mean)을 갖는 분포로부터 유래한다는 가설을 각각 기각하는 7.21*10-13 및 2.19*10-11의 p-값(p-value)이 제공된다.
그룹 발견된 물체의 개수(n) 예상 밀도(n/㎛2) 예상 밀도의 표준 편차(n/㎛2)
양성 대조군 3982 5.65 0.40
GB 2826 4.56 0.70
MCP+gB+pp150 1343 4.24 0.54
MCP 1022 2.40 0.14
pp150 652 1.66 0.28
도 2는 1의 표준 편차를 갖는 5개의 이미지 집합(양성 대조군, MCP, gB, MCP+gB+pp150 및 pp150)에 대한 밀도 측정에 대한 그래픽적 도시이다. MCP 및 pp150은 양성 대조군보다 상당히 더 작은 밀도를 보여준다.
바이러스 구조의 분할이 지금부터 설명된다. 도 3에서 가장 잘 나타나는 바와 같이, 반경 밀도 프로필이 LVS으로 그려졌으며, 여기서 2개의 가장 큰 주축으로부터 정보가 나타난다. 도 3은 LVS에 위치하는 모든 이미지 집합으로부터의 반경 밀도 프로필을 나타낸다. 이미지는 A 및 B로 표시된 2개의 잘 분리된 클러스터를 나타내며, 이들은 이하에서 더 상세히 설명된다. 중요한 특징은 또한 2개의 클러스터 사이에서 입자가 나타난다는 것이다. 예를 들어, 상기 입자는 클러스터에 의해 표현되는 성숙 단계들 사이의 성숙 단계에 있는 것일 수 있다. 종종, 바이러스 입자가 의약제에 노출될 때 상기 약제의 효과를 판단할 수 있도록, 클러스터, 즉 입자의 그룹 사이에 존재하는 입자를 연구하는 것이 특히 중요하다.
클러스터 A에 대하여, 각각의 집합(양성 대조군, MCP, pp150, gB 및 MCP+gB+pp150)에 대한 평균 반경 밀도 프로필이 도 4에서 나타난다. 이는 HCMV 성숙 중간 단계에 대한 일반적으로 알려진 A(빈 바이러스 껍질) 분류를 보여준다. 이러한 타입의 발견되는 물체의 개수는 적다는 사실 때문에, 물체는 작은 반경 및 각 에너지(angular energy)와, 세트에서의 그 밖의 다른 다수의 비-바이러스 구조의 존재여부를 모두 갖고, 캡시드 벽이 중심으로부터 약 40㎚에서 놓여있다는 정보에 추가로 어떠한 중요한 정보도 추출될 수 없다.
클러스터 B에 대하여, 각각의 세트(양성 대조군, MCP, pp150, gB 및 MCP+gB+pp150)에 대한 평균 반경 밀도 프로필이 도 5에서 도시된다. 이는 HCMV 성숙 중간 단계에 대한 일반적으로 알려진 B(반투명성 핵을 갖는 캡시드) 및 C(치밀한 핵(dense core)을 갖는 성숙형 캡시드) 분류를 보여준다. 양성 대조군 및 gB 세트는, 도 6의 클로즈-업에서 가장 잘 나타나는 바와 같이, 30 내지 40㎚의 반경에서, 그리고 중심에서, MCP, pp150 및 MCP+gB+pp150 세트와 차이를 갖는다.
따라서 TEM 이미지 내의 바이러스 입자의 모델이 형성될 수 있다. 각도 불변 특성을, 회전 불변 특성과 비교하기 위한 측정치로서 이용하는 것이, 회전 불변 물체와 총 에너지에 의해 설명될 수 있는 함수 에너지의 부분(fraction)에 의해, 대체될 수 있다. 그러나 총 에너지가 아주 작은 경우, 상기 부분은 계산하기에 숫자적으로 불안정해질 수 있다.
이를 해결하기 위해, 임계 레벨이 사용될 수 있다. 세트 임계 레벨의 사용은주관성(subjectivity)의 소스이다. 그러나 이 레벨에서, 잘못된 구조는 거의 카운트되지 않았다. 그렇지만 음성 대조군 그룹이 임계 레벨을 설정하고, 또한 siRNA 분자의 영향을 살피도록 기능할 수 있다.
주축을 포함하는 밀도 프로필의 임의의 정규 직교 변환이 L2-LVS에서의 거리 및 내적을 보존한다. 따라서 서로 다른 하위-구조(sub-structure)의 클러스터화는 기저(basis)의 선택에 대해 독립적이다.
실례
사용될 수 있는 물질 및 방법의 예가 지금부터 기재된다. 25mM의 HEPES [4-(2하이드록시에틸)-1-피페라진 에탄술포닉산], 10%의 열 비활성화 신생우아혈청(fetal calf serum), L-글루타민(2mM), 페니실린(100U/㎖) 및 스트렙토마이신(100㎎/㎖) (미국, 뉴욕, 그랜드 아일랜드에 소재지를 갖는 GIBCO BRL)으로 보충된 Hank's salt(GIBCO BRL)가 첨가된 무(無)-중탄산염(bicarbonate) MEM(minimal essential medium), 에 태아폐섬유아세포(human embryonic lung fibroblast)(HF)가 유지되었고, 17번의 계대배양까지 사용되었다. 세포가 1의 MOI(Multiplicity Of Infection)에서 HCMV에 의해 감염되었다. 7 또는 10dpi(day post infection)에서, 바이러스 상징액이 채집되었다. 그 후, 저속의 원심분리에 의해, 세포 잔유물(cell debris)로부터 상기 바이러스 상층액이 제거되고, 사용될 때까지 -70℃에서 냉각되었다. 96 웰 플레이트에서, 또는 챔버 슬라이드에서 성장된 HF 세포의 단층이, 1의 MOI(Multiplicity Of Infection)에서 HCMV AD169에 의해 감염되었다.
인간 폐동맥 내피세포(HPAEC: Human Pulmonary Artery Endothelial Cell)는 USA, CA에 소재지를 갖는 Clonetics로부터 얻어졌다. 상기 세포는 37℃에서의 성장 인자와 5%의 CO2가 포함된 EBM-2(Clonetics, CA, USA) 내에 유지되었다. 감염 1시간 전에, 매질이 5% 송아지 혈청(foetal calf serum)이 포함된 EBM으로 변경되었고, 감염 과정 동안 이 매질에서 배양되었다. 0.2%의 젤라틴 코팅된 175㎠ 조직 배양 플라스크(Falcon), 또는 8-웰 챔버(well chamber) 슬라이드(Nalge Nunc International)에서 세포가 배양되었고, 실험에서 계대배양 8까지 사용되었다.
인간 배꼽정맥 내피세포(HUVEC: Human Umbilical vein endothelial cell)가 EGM 매질(미국, 캘리포니아에 소재지를 갖는 Clonetics)에서 배양되었다. 감염 전 1시간 전에, 매질이 5%의 송아지 혈청이 포함된 EBM으로 변경되었고, 감정 과정 동안 이 매질에서 배양되었다. 175㎠의 조직 배양 플라스크(Falcon) 및 8-웰 챔버 슬라이드(Nalge Nunc international)에서 세포가 배양되었고, 계대배양 8 전까지 실험을 위해 사용되었다. 세포는 1의 MOI에서 내피세포에 적응된 스트레인(strain) TB에 의해 감염되었다.
평활근세포가, 대동맥 이식편을 삽입하는 대동맥류 수술을 한 환자의 대동맥 이식편, 또는 이식 기증자의 대동맥 이식편, 또는 장골 혈관의 이식편으로부터 얻어진 대동맥 혈관으로부터 분리되었다. 날카로운 기구를 이용한 세포 스크랩핑(cell scraping)에 의해 우선 내피세포를 제거함으로써, 세포가 분리되었다. 그 후, 핀셋을 이용한 2개의 층의 부드러운 분리에 의해, 혈관이 2개의 서로 다른 층, 즉 (혈관의 내막에 대응하는) 안쪽 층과 (혈관 매질에 대응하는) 바깥쪽 층으로 분할된다. 대동맥 이식편이 작은 1㎜ 조각으로 잘리고, 세포 배양 디쉬 상에서, SmGM-2 Single Quotes (hEGF 0.5㎍/㎖, 0.5㎖; 인슐린 5㎎/㎖, 0.5㎖, 0.5㎖; hFGF-b 1㎍/㎖, 1㎖; FBS 25㎖; GA-1000, 0.5㎖)가 첨가된 SMGM 2 매질(Clonetics)에서, 이식편으로부터 SMC 세포 이동이 존재할 때까지, 약 2주 동안 배양되었다. 세포는 175㎠의 세포-배양 플라스크(Falcon)에서 배양되었다. SMC 배양액의 순도를 판단하기 위해, 세포가 챔버 슬라이드 상에서 성장되었고, 4℃에서 45분간 3% 포름알데히드에서 고정되었고, 0.3%의 트리톤 X(Triton X)로 5분간 투과되었다. 고정 후, 세포는 평활근 세포 특정 FITC 켤레 항-액틴에 대해 착색되고, 형광 현미경법(fluorescence microscopy)을 이용하여 평가되었다. 세포가 4℃에서 5분 동안 메탄올:아세톤(1:1)에 의해 고정되었고, FITC 켤레 항-폰빌레브란트 인자(항-vWF) 및 내피세포 특정 폰빌레브란트 인자에 의해 착색되었으며, 형광 현미경법에 의해 평가되었다. 실험에서 항체에 대한 이소타입 대조군이 사용되었다. 배양액은 항 a-액틴에 대해 100% 양성이었으며, 폰빌레브란트 인자에 대해 음성이었다.
전자 현미경법으로 바이러스에 감염된 세포를 검사하기 위해, 미감염 세포와 HCMV-감염된(1의 MOI) 세포가 3, 5, 7 및 10dpi에서 수집되었고, 실온, pH7.4에서, 0.1M의 수크로오스 및 3mM의 CaCl2를 함유하는 0.1M의 소듐카코딜레이트 완충용액에서의 2% 글루탈알데히드에서 30분 동안 고정되었다. 그 후, 세포는 나무 막대로 긁어져서, 에펜도르프-튜브로 이동되었고, 냉장고에서 밤새도록 추가로 고정되었다. 고정 후, 세포는 pH7.4의 3mM의 CaCl2를 함유하는 0.15M의 소듐카코딜레이트 완충용액으로 헹궈지고, 원심분리되었다. 그 후, 펠릿(pellet)이, 4℃에서 2시간 동안, pH 7.4의 1.5mM CaCl2를 함유하는 0.07M의 소듐카코딜레이트 완충 용액에서의 2%의 오스뮴 테트록사이드에서 후-고정(post-fix)되었고, 에탄올, 그 후, 아세톤에서 탈수되었으며, LX-112(미국, 버몬트, 버링턴에 소재지를 갖는 Ladd)에 싸여졌다. 섹션이 우라닐 아세테이트 및 이에 뒤따르는 리드 시트레이트를 이용하여 조영(contrast)되었고, 80㎸에서 Tecnai 10 투과 전자 현미경(네덜란드에 소재지를 갖는 FEI)에서 검사되었다. Mega View II 디지털 카메라(독일, 뮌스터에 소재지를 갖는 Soft Imaging System, GmbH)에 의해 디지털 이미지가 캡처되었다.
지금부터 전자 현미경의 프로세싱이 기재된다. 우라닐 아세테이트 및 이에 뒤따르는 리드 시트레이트에 의해 섹션이 조영되었고, Tecnai 10 투과형 전자 현미경(네덜란드에 소재지를 갖는 FEI)에 의해 80㎸에서 검사되었다. Mega View II 디지털 카메라(독일, 뮌스터에 소재지를 갖는 Soft Imaging System GmbH)에 의해 디지털 이미지가 캡처되었고, 전자 현미경 상(electron micrograph)이 캡처되었고, 디지털화를 위해 현장되고 스캔되었다. 상기 전자 현미경 상은 HP ScanJet 6200C 플랫베드 스캐너에서 2x2㎚ 또는 3x3㎚를 나타내는 픽셀 크기까지의 8-비트 이미지로 디지털화되었는데, 이는 디지털화된 현미경 상에서, 각각 약 25 또는 17 픽셀의 캡시드 반경을 제공한다. 각각의 디지털 이미지는 약 1000x1000 픽셀(1Mbyte)의 크기를 갖는다. 분해능은 본원에서 검사되는 3개의 캡시드 클래스를 구별하기에 만족스러웠지만, 무겁게 질감-처리된 배경에 의해, 캡시드 식별이 매우 어렵게 수행되었다. 본 발명의 방법의 전개와 평가를 위해 사용되는 HP Tru64 UNIX가 실행 중인 DEC 알파 개인용 워크스테이션 433이 사용되었다. Matlab 7.0.1(미국, 마이애미, 나틱에 소재지를 갖는 MathWorks, Inc.)을 이용하여, 수행 및 테스트가 이뤄졌다. Corel Draw 10(캐나다, 오타와에 소재지를 갖는 Corel Corporation) 및 Photochop CS(미국, 캘리포니아, 산 호세에 소재지를 갖는 Adobe Systems Inc.)에서 생성된 회색 레벨 프로필 상이 프로세싱되었다.
본 발명이 바람직한 구성과 실시예에 따라 기술되었지만, 청구범위의 사상과 범위 내에서, 특정한 치환예 및 대안예가 만들어질 수 있다.

Claims (6)

  1. 이미지에서 바이러스 입자를 세포내(intracellular) 카운팅하고 분할하기 위한 방법에 있어서, 상기 방법은
    복수 개의 물체를 갖는 이미지를 제공하는 단계와,
    상기 이미지에서 원형의 물체를 식별하는 단계와,
    상기 식별된 원형의 물체를 그룹으로 분류하는 단계와,
    식별된 원형의 물체의 반경 밀도 프로필 분포를 판단하는 단계와,
    상기 반경 밀도 프로필 분포로부터 형성가능한 타원형의 물체를 식별하는 단계와,
    상기 식별된 타원형의 물체를 그룹으로 분류하는 단계와,
    원형 및 타원형의 물체의 선택된 그룹에서, 물체의 반경 밀도 프로필 분포를 기초로 하여, 분류된 원형 및 타원형의 물체들 중에서 바이러스 입자를 식별하는 단계와,
    바이러스 입자를 의약제(pharmaceutical drug)에 노출시키는 단계와,
    상기 의약제로의 노출 후에, 바이러스 입자를 그룹으로 분류하는 단계와,
    상기 의약제로의 노출 전의 바이러스 입자의 반경 밀도 프로필 분포와, 상기 의약제로의 노출 후의 바이러스 입자의 반경 밀도 프로필 분포 간의 차이를 분석하는 단계
    를 포함하는 것을 특징으로 하는 바이러스 입자를 세포내 카운팅하고 분할하기 위한 방법.
  2. 제 1 항에 있어서, 상기 방법은
    상기 노출의 결과로서 상기 이미지에서의 물체의 크기의 분포의 변화를 분석하는 단계
    를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 바이러스 입자를 세포내 카운팅하고 분할하기 위한 방법.
  3. 제 1 항에 있어서, 상기 방법은
    화학 물질로의 노출 전과 후의 그룹 내 물체의 수량의 차이를 판단하는 단계
    를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 바이러스 입자를 세포내 카운팅하고 분할하기 위한 방법.
  4. 제 1 항에 있어서, 상기 방법은
    바이러스 입자의 형태적 구조를 분석하는 단계
    를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 바이러스 입자를 세포내 카운팅하고 분할하기 위한 방법.
  5. 삭제
  6. 삭제
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