CN101681427B - 对图像中的病毒粒子进行计数和分割的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明方法用于对图像中的病毒粒子进行细胞内计数和分割。提供其中具有多个项目的图像。确定病毒粒子的半径范围。识别图像中半径在预定半径范围内的圆形项目。确定可从预定半径范围形成的椭圆形项目。将所识别的圆形和椭圆形项目分类成组。识别圆形和椭圆形项目之中的病毒粒子。例如，本发明方法可用于对TEM图像中的siRNA处理的人巨细胞病毒粒子进行细胞内计数和分割。

Description

对图像中的病毒粒子进行计数和分割的方法
技术领域
本发明方法涉及计数、分割和识别图像如电子显微图中所示的对象如病毒粒子。
背景技术
在对包括病毒及其它组成的细胞结构进行分类和分析方面在过去已进行许多努力。已开发多种图像分析方法来通过使用可用图像技术描述、分割和分类病毒。例如，已使用低温电子显微镜，但并未很好地显示细胞和病毒粒子的结构。同样，很难客观地、重复地和可靠地描述细胞组成以准确地确定细胞组成的成熟阶段。
更具体地，病毒组装是一个错综复杂的过程和密集研究的主题。病毒利用宿主细胞经历复杂的成熟和细胞内运送过程产生其子代病毒粒子。该过程可通过使用电子显微镜(EM)在高放大率下进行监视，这使能直观识别不同细胞腔室中的不同类型的病毒粒子。有待解决的重要问题包括病毒组装过程中的每一步涉及到的病毒蛋白质的特性，以及在病毒成熟过程中不同类型的病毒粒子的细胞内易位和定位的机理。虽然可视化技术如断层摄影法和低温电子显微镜已经对病毒结构的海量信息作出巨大的贡献，但通常很难用于病毒成熟的结构方面。这些技术可用于提供稳态成熟病毒粒子的信息。基因工具可用于产生关键病毒蛋白质成分的突变体。电子显微镜可用于显现结构效果。但是，缺少合适的工具表征结构效果，尤其是中间和模糊粒子形式，及不能以客观的方法适当地对其量化。
这部分说明了为什么在前的分析方法尚非十分有效，及需要更有效的分析细胞和病毒粒子结构的方法。需要表征和量化病毒粒子成熟和细胞内运送的图像分析工具以有助于客观地研究不同的病毒组装。还需要对图像中所示的病毒粒子进行有效识别和量化的方法。
发明内容
本发明方法提供上述问题的解决方案。本发明方法可用于对图像如电子显微图中的病毒粒子进行细胞内计数和分割。提供其中具有多个对象/项目的图像。识别图像中的所有圆形和椭圆形对象。圆形和椭圆形对象被分类成组。确定圆形病毒粒子的径向密度轮廓。同样确定可由圆形病毒粒子的径向密度轮廓形成的椭圆形项目。通过分析所选组中的对象的径向密度轮廓从所分类的圆形和椭圆形对象的组中识别病毒粒子。例如，本发明方法可用于对TEM图像中的小分子干扰RNA(siRNA)处理的人巨细胞病毒粒子进行细胞内计数和分割。
附图说明
图1A为旋转不变图像A的示意图。
图1B为角不变图像B的示意图。
图2为五组图像的密度测量的图示。
图3为放在LVS中的所有组的图像的径向密度轮廓的示意图。
图4为在子组A的均值周围具有点划线所示的标准偏差的平均径向轮廓的示意图。
图5为在子组B的均值周围具有点划线所示的标准偏差的平均径向轮廓的示意图。
图6为图5的半径在30和40nm之间部分的示意特写图。
具体实施方式
本发明方法可用于搜索、分割和识别图像中的粒子/对象，如在透射电子显微镜(TEM)图像中图示的对象。图像中识别的对象可与病毒粒子及具有圆形和椭圆形形状的其它粒子有关。椭圆形形状可定义为具有最大半径和最小半径，而完全圆形形状中的每一圆形具有一个半径。优选地，本发明方法确定哪些椭圆形形状的项目可从要分析的病毒粒子的半径范围形成。例如，如果病毒粒子具有100单位的半径，则椭圆形形状的最大半径和最小半径例如可以是比病毒粒子圆形时的半径大20％(或120单位)和小20％(或80单位)。如果最大半径或最小半径在允许的半径范围之外，则该项目视为不可接受且将不被识别为病毒粒子。之后，对圆形和椭圆形形状进行分类和分组使得相似的半径范围分组在一起。之后，病毒粒子按项目的分组形状进行识别和量化。也可能识别在两个不同成熟阶段之间的病毒粒子，即处于两个不同成熟度组之间的成熟阶段。病毒粒子可具有预定的径向密度轮廓，及数学等式如傅立叶变换可用于基于预定的、病毒粒子的典型径向密度轮廓确定哪些椭圆形状的对象是病毒粒子。优选地，病毒粒子之后按分组进行识别和量化。优选地，不需要使用说明病毒粒子的径向密度轮廓处于某些成熟阶段的小册子，因为在小册子的两个不同成熟阶段之间的病毒粒子或受损病毒粒子使用小册子可能发现不了。
如图3中所示及下面详细描述的，可能按簇确定半径范围或径向密度轮廓的分布。同样如下所述，病毒粒子可暴露给化学物质，如药品，及本发明方法的步骤可基于修改的图像再次执行以确定粒子大小的分布或径向密度轮廓由于暴露给化学物质或医学处理而发生了怎样的变化。这样，可确定化学物质处理对病毒粒子的有效性。
也可能使用siRNA技术阻止某些结构单元，如通过以pp150蛋白质为目标并阻止在病毒粒子内生成cmv粒子。在这样的siRNA处理之后，可分析对病毒粒子的影响及病毒粒子的形态/结构变化。另外，也可研究受影响的病毒粒子的数量或数目。
也可通过分析径向密度轮廓以确定图像中图示了哪些病毒粒子而使用本发明方法识别病毒粒子。在发现图像中的所有圆形和椭圆形对象并基于半径特征将这些对象分类为组之后，下一步骤可以是识别特定病毒粒子的半径特征。因此，具有预定病毒粒子半径范围如80+/-3单位的半径范围内的半径特征的任何簇的对象可用于识别病毒粒子。通过使用半径特征的范围，也可能包括变形或椭圆形粒子。具有该可接受范围之外的半径范围的粒子被放弃并归类为非病毒粒子。如果在所希望的半径范围内有许多类型的病毒粒子，则可医学或化学处理病毒粒子然后再次执行本发明方法以确定病毒粒子对前述处理有怎样的反应。基于该反应，可识别是什么样的病毒粒子。例如，可使用PCR技术放大DNA，这产生可用于识别病毒粒子的参考小册子。因此，另外的测试可用于验证或确认所识别的病毒粒子。
因此，如下详细所述，本发明方法可用于搜索、分割和识别TEM图像中的病毒粒子。病毒粒子的衣壳为在距中心固定半径处具有相同蛋白质密度的近似圆形的对象，因而称为旋转不变对象，如图1A中所示。为产生旋转不变性的测量，需要对与旋转不变性“相反的”性质进行测量。角不变对象可用于该目的，因为其在距中心的固定角度具有相同的蛋白质密度，如图1B中所示。
其值由距中心的半径r(具有相应傅立叶频率wr)和从离开中心的任何固定方向取的角度t(具有相应傅立叶频率wt)确定的函数f的傅立叶频谱可用于说明旋转不变对象和角不变对象。理想的旋转不变对象其全部能量为wt＝0时的能量，理想的角不变对象其全部能量为wr＝0时的能量，及所有二者之间的对象具有两个频带中的能量。因此，适度好的测量是比较这些能量的差，给出测量阈值水平为唯一未知常数的先验测量，这可由负控制给出。
TEM图像中的病毒结构的密度测量在下面描述。比较不同图像中的病毒结构数量的密度测量提为图像中每面积单位A的一定对象数量n。
d = n A
不同病毒结构的分割在下面描述。每一发现的对象或项目/粒子的径向密度轮廓用作病毒结构的良好逼近。在线性矢量空间(LVS)中设定轮廓，基础设为轮廓的主轴，用单值分解(SVD)进行计算，给出不同病毒结构的簇性态的直观理解。使用该信息，可提取不同的簇并个别计数，及在应用药品时通过从每一组图像计算平均结构可区分结构差别。
如下表1中所示，由四个不同应用的siRNA感染的细胞的大约500MB的图像由电子显微镜以3.3nm/像素的分辨率获得。图像以旋转不变测量进行处理。旋转不变的控制半径设为15像素(约50nm)，及图像中的对象在15像素的局部半径最大值处获得，在那里半径不变测量超出15的水平。当获得径向密度轮廓时，每一轮廓的均值被去除以补偿不同图像中的不同亮度水平。均值在100像素、约330nm的半径上取得。
表1
  分组   图像数量 总面积μm2
  正控制   83   700.48
  MCP   119   1317.30
  GB   34   320.17
  MCP+gB+pp 150   28   241.71
  pp150   28   355.84
表2描述了所计算密度的均值的平均和标准偏差。将pp150和MCP图像的结果与正控制、与研究者t测试进行比较给出分别为7.21*10-13和2.19*10-11的p值，这否定了密度来自具有相等均值的分布的假设。
表2
  分组   发现的对象的数量(n)   预期密度n/μm2   预期密度的标准偏差n/μm2
  正控制   3982   5.65   0.40
  GB   2826   4.56   0.70
  MCP+gB+pp 150   1343   4.24   0.54
  MCP   1022   2.40   0.14
  pp150   652   1.66   0.28
图2为具有1标准偏差的五组图像(正控制、MCP、gB、MCP+gB+pp150和pp150)的密度测量的图示。MCP和pp150展现比正控制小很多的密度。
病毒结构的分割在下面描述。径向密度轮廓在LVS中绘出，如图3中所示，其中示出了来自两个最大主轴的信息。图3示出了放在LVS中的所有组的图像的径向密度轮廓。图像示出了两个充分分开的簇，记为A和B，在下面将对其进行更详细的描述。重要特征在于两个簇之间的粒子也被示出。例如，那些粒子可处于在这些簇表示的成熟阶段之间的成熟阶段。通常，当病毒粒子已被暴露给药品时，研究粒子簇或团之间的粒子特别重要，使得可确定药品的效果。
图4中示出了簇A的每一组(正控制、MCP、pp150、gB和MCP+gB+pp150)的平均径向密度轮廓。这揭示了普遍知道的A(空病毒壳)类HCMV成熟中间体。由于发现的该类型对象的数量小，这些对象具有小的径向和角能量，及在该组中存在许多其它非病毒结构，除了衣壳壁位于距中心约40nm处的信息之外，提取不到有意义的信息。
图5中示出了簇B的每一组(正控制、MCP、pp150、gB和MCP+gB+pp150)的平均径向密度轮廓。这揭示了普遍知道的B(具有半透明核的衣壳)和C(具有不透光核的成熟衣壳)类HCMV成熟中间体。正控制和gB组在30和40nm之间的半径及在中心处不同于MCP、pp150和MCP+gB+pp150组，如图6的特写图所示。
因此，可开发TEM图像中的病毒粒子的模型。使用角不变特征作为与旋转不变特征进行比较的度量可由旋转不变对象描述的函数能量与总能量的分数交换。然而，如果总能量非常小，则该分数变得数字上不稳定。
为解决该问题，可使用阈值水平。设定阈值水平的使用是主观性来源。然而，在该水平，非常少的假结构会被计数。尽管负控制组可用于设定阈值水平，及可用于了解siRNA分子的影响。
密度轮廓包括主轴的任何标准正交变换在L2-LVS中保持距离和内积。因此，不同子结构的聚类与基础的选择无关。
例子
下面描述可以使用的材料和方法的例子。人胚胎的肺成纤维细胞(HF)保存在具有汉克氏(Hank′s)盐(GIBCO BRL)的无碳酸氢盐的最低基础培养基中，汉克氏盐中添加有25mM的HEPES(4-(2羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸)、10％的热灭活小牛血清、L-谷氨酰胺(2mM)、青霉素(100U/ml)和链霉素(100mg/ml)(GIBCO BRL，美国纽约州格兰德岛市)。细胞在175cm2的组织培养瓶(Coming，New York，USA)中培养并使用直到17次继代为止。细胞采用感染复数(MOI)1感染HCMV。在感染后(pi)7或10天收集病毒上清液。之后，通过低速离心使上清液与细胞碎屑分离并冷冻在-70℃直到使用为止。在96孔板中或腔室玻片上生长的HF细胞单层采用感染复数(MOI)1感染HCMV AD169。
人肺动脉内皮细胞(HPAEC)从美国加利福尼亚州的Clonetics获得。这些细胞以37℃和5％CO2下的生长因子保存在EBM-2(Clonetics，CA，USA)中。在感染之前的一个小时，培养基变为具有5％小牛血清的EBM并在感染过程期间培养在该培养基中。细胞在涂覆0.2％明胶的175cm2组织培养瓶(Falcon)或8孔腔室玻片(NalgeNunc International)中进行培养和使用，直到实验中的8次继代为止。
人脐静脉内皮细胞(HUVEC)培养在EGM培养基(Clonetics，CA，USA)中。在感染之前的一个小时，培养基变为具有5％小牛血清的EBM并在感染过程期间培养在该培养基中。细胞在175cm2组织培养瓶(Falcon)或8孔腔室玻片(Nalge Nunc International)中进行培养并用于8次继代之前的实验。细胞以MOI 1感染适合内皮的菌株TB40。
平滑肌细胞与从经历通过嵌入主动脉移植物进行主动脉瘤手术的病人获得的主动脉移植物分离，或与来自移植供体的主动脉移植物或髂动脉移植物分离。细胞首先通过用锋利工具进行细胞刮削而去除内皮细胞。然后，脉管被分为两个不同的层，最内层(对应于脉管的内膜)和最外层(对应于脉管介质)，其中通过用一对镊子温和分离前述两层。主动脉移植物被切割为小的1mm块并在细胞培养皿上在SMGM 2培养基(Clonetics)中培养约2周，直到从外植体有SMC细胞迁移为止，其中培养基中添加SmGM-2Single Quotes(hEGF 0.5μg/ml，0.5ml；胰岛素5mg/ml，0.5ml；hFGF-b 1μg/ml，1ml；FBS 25ml；GA-1000，0.5ml)。细胞在175cm2孔培养瓶(Falcon)中进行培养。为确定SMC培养物的纯度，细胞在腔室玻片上生长并在4℃下在3％的甲醛中固定45分钟，及用0.3％的Triton X浸透5分钟。在固定之后，细胞用平滑肌细胞专用FITC共轭抗肌动蛋白(SIGMA)着色并使用荧光显微镜进行评价。细胞用甲醇∶丙酮(1∶1)在4℃下固定5分钟并用FITC共轭血管性血友病因子抗体(Anti-vWF)和内皮细胞专用血管性血友病因子着色，及用荧光显微镜进行评价。在实验中使用抗体的同形像控制。培养物对抗a肌动蛋白100％为阳性，及对血管性血友病因子100％为阴性。
为了用电子显微镜检查感染病毒的细胞，在3、5、7和10dpi收获未感染和已感染HCMV(MOI为1)的细胞，及将其在包含0.1M的蔗糖和3mM、PH值7.4的CaCl2的0.1M的二甲基胂酸钠缓冲剂的2％戊二醛中在室温下固定30分钟。然后用木棒刮掉细胞，转移到埃彭道夫管中继续在冰箱中固定一整夜。在固定之后，细胞在包含3mM、PH值为7.4的CaCl2的0.15M的二甲基胂酸钠缓冲剂中进行漂洗并离心分离。随后在溶解于包含1.5mM、PH值7.4的CaCl2的0.07M的二甲基胂酸钠缓冲剂中的2％的四氯化锇中以4℃后固定这些小球2小时，随后在乙醇和丙酮中脱水，并埋入LX-112(Ladd，美国佛蒙特州伯灵顿)中。使用跟随柠檬酸铅的醋酸盐铀酰进行截面对照，并在Tecnai 10透射电子显微镜(FEI，荷兰)中在80kV下进行检查。数字图像由Mega View II数字照相机(Soft Imaging System，GmbH，Munster，Germany)捕获。
电子显微镜处理在下面进行描述。使用跟随柠檬酸铅的醋酸盐铀酰进行截面对照，并在Tecnai 10透射电子显微镜(FEI，荷兰)中在80kV下进行检查。数字图像由Mega View II数字照相机(SoftImaging System，GmbH，Munster，Germany)捕获，或者电子显微照片被捕获、冲洗和扫描以进行数字化。显微照片在HP ScanJet 6200C平板扫描仪中数字化为8比特图像，其像素大小为2×2nm或3×3nm，在数字化显微照片中分别给出大约25或17像素的衣壳半径。每一数字图像具有大约1000×1000像素(1M字节)的大小。分辨率可令人满意地在这里研究的三种衣壳类别之间进行区分，但严重网纹背景使衣壳识别非常困难。运行Hp Tru64UNIX的DEC α个人工作站433用于开发和评价本发明方法。实施和测试使用Matlab 7.0.1(theMathWorks，Inc.，Natick，MA)进行。所产生的灰度级轮廓图在CorelDraw 10(Corel Corporation，Ottawa，Canada)和Photoshop CS(AdobeSystems Inc，San Jose，CAL，USA)中进行处理。
虽然本发明已经根据优选的组成和实施例进行了描述，但是应当理解，在不脱离本发明的精神和范围的情况下可进行某些替换和改动。

Claims (4)

1.用于对图像中的病毒粒子进行细胞内计数和分割的方法，包括：
提供其中具有多个对象的图像；
识别图像中的圆形对象；
将所识别的圆形对象分类成组；
确定所识别圆形对象的径向密度轮廓分布；
识别可从所述径向密度轮廓分布形成的椭圆形对象；
将所识别的椭圆形对象分类成组；及
基于所选组的圆形和椭圆形对象的对象径向密度轮廓分布在所分类的圆形和椭圆形对象之中识别病毒粒子；
将病毒粒子暴露给药品；
在暴露药品之后将病毒粒子分类成组；及
分析暴露给药品之前的病毒粒子径向密度轮廓分布和暴露给药品之后的病毒粒子径向密度轮廓分布之间的差别。
2.根据权利要求1的方法，其中所述方法还包括分析所述病毒粒子大小的分布由于所述暴露而发生的变化。
3.根据权利要求1的方法，其中所述方法还包括确定所述病毒粒子的数量在暴露给化学物质之前及之后的差别。
4.根据权利要求1的方法，其中所述方法还包括分析病毒粒子的形态结构。
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