BR112017022551B1

BR112017022551B1 - Quantificação de alta precisão de partículas subvisíveis

Info

Publication number: BR112017022551B1
Application number: BR112017022551-4A
Authority: BR
Inventors: Rickard Nordstrom; Ida-Maria Sintorn; Lars Haag
Original assignee: Intelligent Virus Imaging Inc
Priority date: 2015-12-18
Filing date: 2016-10-21
Publication date: 2022-05-03
Also published as: IL252558A0; EP3389813A1; DK3389813T3; UA123318C2; US10345207B2; EA201792107A1; ES2784394T3; EP3389813B1; KR102150748B1; PT3389813T; CA2964777A1; MY188672A; US20180172566A1; NZ733989A; EP3389813A4; JP2019502093A; US20190178762A1; MA41074B1; HUE048446T2; SG11201706486QA

Abstract

QUANTIFICAÇÃO DE ALTA PRECISÃO DE PARTÍCULAS SUBVISÍVEIS. Método para quantificação de partículas subvisíveis. É fornecida uma membrana de filtro (116) que tem uma pluralidade de poros (138) definida através da mesma. A membrana de filtro (116) está em engate operacional com uma câmara de vácuo (104). Os poros são vedados com um vedante (140). Uma gotícula de amostra (126), que contém um líquido (144) e partículas subvisíveis (142), é aplicada sobre a membrana de filtro (116). O líquido (144) dissolve o vedante (140) em poros (138e a 138h) dispostos diretamente abaixo da gotícula de amostra (126). O líquido (144) flui através dos poros em que o vedante (140) foi dissolvido e as partículas subvisíveis (142) permanecem sobre a membrana de filtro (116). As partículas (142) são enumeradas em uma microscopia eletrônica.

Description

CAMPO DA TÉCNICA

[0001] A presente invenção refere-se a um método para quantificação de alta precisão de partículas subvisíveis, tais como micropartículas e/ou nanopartículas, usando-se microscopia tal como microscopia eletrônica de varredura (SEM). ANTECEDENTES E SUMÁRIO DA INVENÇÃO

[0002] Uma enumeração precisa do número de partículas subvisíveis, como partículas de vírus, partículas similares a vírus, microesferas inorgânicas e poliméricas e outras nanopartículas e micropartículas de amostras líquidas é importante em muitos processos. Por exemplo, os vetores de vírus modificados são comumente usados em aplicações de terapia genética. O número de vetores ativos por ml (o título infeccioso da amostra de vírus) pode ser determinado usando ensaios de infecciosidade padrão. No entanto, ao usar os métodos atualmente disponíveis, não é possível determinar com precisão o número total de partículas, incluindo partículas não infecciosas, na amostra. A razão de partículas infecciosas sobre não infecciosas fornece informações inestimáveis sobre a qualidade e eficácia do produto de terapia genética final e os processos de desenvolvimento a montante.

[0003] Uma das principais limitações das técnicas atualmente disponíveis, como a citometria de fluxo quantitativo (QFCM), é que as nanopartículas de interesse não são detectadas diretamente. Em vez disso, o número de sondas ligadas a uma população de nanopartículas é quantificado. Uma vez que o número de sondas que se liga por nanopartícula varia, a precisão das técnicas indiretas convencionais é tipicamente baixa e depende da afinidade entre o espécime e a sonda. Uma técnica em que a nanopartícula de interesse poderia ser detectada diretamente superaria essa limitação. Além disso, se a técnica pudesse visualizar as partículas com resolução suficiente, as partículas individuais poderiam ser identificadas com base em seu tamanho e morfologia e, portanto, ser enumeradas diretamente. Mesmo as partículas dentro dos grupos podem ser enumeradas e estimadas. Isso não é possível pelo uso dos métodos de afinidade disponíveis atualmente ou as técnicas baseadas em dispersão de luz.

[0004] O novo método de partículas diretas de alta precisão da presente invenção pode ser usado para enumerar partículas subvisíveis inorgânicas e orgânicas, tais como nanopartículas, a partir de amostras líquidas. Uma característica importante é que os espécimes são aplicados em uma marcação bem definida e mensurável. Outra característica importante é que os espécimes são distribuídos mais uniformemente do que o que foi possível antes e isso reduz a necessidade de amostragem e agora é possível realizar a análise em uma resolução em que as partículas individuais podem ser facilmente identificadas. As partículas subvisíveis são detectadas diretamente sem a necessidade de sondas de sinal e podem ser visualizadas em imagens bidimensionais normais. O método de quantificação de partículas SEM (pqSEM) da presente invenção é de preferência baseado em filtração de baixo vácuo, microscopia eletrônica de varredura (SEM) ou outras técnicas de microscopia eletrônica e análise de imagem. A presente invenção pode ser utilizada com ou sem padrões internos, dos quais um exemplo seria o Instituto Nacional de Padrões e Tecnologia (NIST) distinguido por microesferas de poliestireno.

[0005] A presente invenção fornece uma solução para os problemas descritos acima. Mais particularmente, o método é para a quantificação de partículas subvisíveis. É fornecida uma membrana de filtro que tem uma pluralidade de poros definida através da mesma. A membrana de filtro está em engate operacional com uma câmara de vácuo. Os poros são vedados com um vedante. Uma gotícula de amostra, que contém um líquido com partículas subvisíveis, é aplicada sobre a membrana de filtro. O líquido dissolve o vedante nos poros localizados diretamente abaixo da gotícula de amostra. O líquido flui através dos poros em que o vedante foi dissolvido e as partículas subvisíveis permanecem sobre a membrana de filtro. A membrana de filtro, com as partículas dispostas sobre a mesma, é movida para um microscópio eletrônico e enumerada em imagens adquiridas no microscópio.

[0006] O método compreende adicionalmente a etapa para pré-montar um conjunto de filtro que contém a membrana de filtro, em um suporte SEM.

[0007] O método compreende adicionalmente a etapa para colocar uma fita de montagem no suporte SEM.

[0008] O método compreende adicionalmente a etapa para fornecer o suporte SEM, que possui um canal alongado definido no mesmo, usando-se um injetor que contém a gotícula de amostra e alinhando-se o injetor em cima de um canal alongado antes de depositar a gotícula de amostra na membrana de filtro.

[0009] O método compreende adicionalmente a etapa para conectar o suporte SEM a uma câmara de vácuo conectada a uma fonte de vácuo e submeter a membrana de filtro a uma força de sucção através do canal alongado.

[0010] O método compreende adicionalmente a etapa para depositar a gotícula de amostra sobre a membrana de filtro sem a gotícula de amostra tocar qualquer borda externa da membrana de filtro.

[0011] O método compreende adicionalmente a etapa para o líquido apenas dissolver o vedante nos poros dispostos diretamente abaixo da gotícula de amostra enquanto os poros adjacentes no lado da gotícula permanecem vedados com o vedante porque o líquido não esteve em contato com o vedante disposto nesses poros.

[0012] O método compreende adicionalmente a etapa para as partículas subvisíveis formarem uma marcação definida e mensurável na membrana de filtro e adquirir de uma série de imagens das partículas a partir de uma periferia externa da marcação até o centro da marcação.

[0013] O método compreende adicionalmente a etapa para contar as partículas nas imagens de microscopia eletrônica adquiridas em uma resolução onde as partículas são claramente visíveis - usando-se, manualmente ou automaticamente, métodos de análise de imagem.

[0014] O método compreende adicionalmente a etapa para estimar a área total da marcação na membrana de filtro em imagens de microscopia que cobrem toda a marcação (ou uma imagem de baixa ampliação que cobre toda a marcação ou várias subimagens de ampliação superior da marcação costurada).

[0015] O método compreende adicionalmente a etapa para calcular o número total de partículas na amostra da área de toda a marcação e o número de partículas por unidade de área derivadas de imagens com uma resolução alta o suficiente para ver claramente partículas únicas.

[0016] O método compreende adicionalmente a etapa para compensar possivelmente a distribuição desigual de partículas radiais das partículas na marcação para a qual as informações são derivadas da aquisição de uma série de imagens da periferia da marcação através do centro com uma ampliação suficientemente alta para ver claramente partículas individuais.

[0017] O método compreende adicionalmente a etapa para calcular a concentração de partículas na solução usando-se a estimativa total de partículas da marcação; o volume aplicado e a diluição da amostra líquida.

[0018] O método compreende adicionalmente a etapa para utilizar um diluente do líquido para dissolver o vedante nos poros localizados diretamente abaixo da gotícula de amostra. O espécime deve estar na forma líquida e o diluente deve ser compatível com o diluente e ter a propriedade de dissolver efetivamente o vedante que foi usado.

[0019] O método compreende adicionalmente a etapa para utilizar glicina como o vedante. Outros vedantes que podem ser utilizados incluem, mas não estão limitados, as vedantes à base de trealose/sacarose.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

[0020] A Figura 1 é uma vista lateral em elevação esquemática de um dispositivo de vácuo da presente invenção;

[0021] A Figura 2 é uma vista lateral em corte transversal esquemática do conjunto de filtro;

[0022] A Figura 3A é uma imagem SEM de grande amplificação não processada de microesferas de poliestireno aderidas a um filtro de polietersulfona;

[0023] A Figura 3B é uma imagem SEM de detecção e enumeração de alta ampliação de microesferas de poliestireno aderidas a um filtro de polietersulfona;

[0024] A Figura 3C é uma vista em primeiro plano da imagem SEM da Figura 3B acima;

[0025] A Figura 4A é uma vista esquemática de uma borda da imagem da marcação de gotículas usando SEM (elétrons primários) com alta ampliação;

[0026] A Figura 4B é uma vista esquemática de uma borda da imagem da marcação de gotículas usando SEM (elétrons primários) com baixa ampliação;

[0027] A Figura 5A é uma vista lateral esquemática em corte transversal da membrana da presente invenção com poros abertos;

[0028] A Figura 5B é uma vista lateral esquemática em corte transversal da membrana mostrada na Figura 5A, mas com poros vedados;

[0029] A Figura 5C é uma vista lateral esquemática em corte transversal da membrana da presente invenção mostrada na Figura 5B que tem uma gotícula de amostra depositada sobre o mesmo;

[0030] A Figura 5D é uma vista lateral esquemática em corte transversal da membrana mostrada na Figura 5C que tem a gotícula sendo absorvida na membrana da presente invenção; e

[0031] A Figura 6 é uma vista ampliada da Figura 5D.

DESCRIÇÃO DETALHADA

[0032] O método da presente invenção é descrito com referência as Figuras 1 a 6. A Figura 1 é uma vista frontal esquemática de um conjunto de vácuo 100 que tem um dispositivo de vácuo 102 conectado a uma câmara de vácuo 104 através de uma tubulação 106 que se estende entre os mesmos. De preferência, a tubulação 106 tem uma válvula adequada tal como uma válvula luer 108. Um manômetro de vácuo 110 está em engate operativo com a câmara de vácuo 104 para medir uma pressão de vácuo na mesma. Um conjunto de filtro 112 é montado por um conjunto de filtro para montagem 114 no topo da câmara de vácuo 104. Uma membrana de filtro 116 é disposta no conjunto de filtro 112. Um injetor 118 está localizado acima da membrana de filtro 116.

[0033] A Figura 2 é uma vista em corte transversal esquemática do conjunto de filtro 112. Todo o processo de análise da presente invenção pode ser simplificado por pré-montar a membrana de filtro 116 sobre o suporte SEM (ponta de alumina) 120 em vez de fazê-lo manualmente quando a membrana de filtro 116 contém a amostra/espécime a ser analisada e enumerada. A montagem pode ser feita simplesmente perfurando um furo na ponta SEM 120. A utilização de tal dispositivo minimiza o risco de perda de espécime ou de danificar a membrana de filtro 116 durante a configuração anterior, na qual a membrana de filtro 116 que contém a amostra é manuseada manualmente durante a montagem sobre a ponta SEM 120. Os detalhes da preparação da membrana de filtro 116 são discutidos abaixo. Esse dispositivo de consumo analítico pqSEM é relativamente barato de fabricar.

[0034] Mais particularmente, o conjunto de filtro 112 preferencialmente tem uma ponta de alumina SEM modificada 120 sobre o qual é colocada uma fita de montagem de carbono de dupla face 122. Os poros vedados da membrana de filtro 116 são colocados no topo da fita de montagem de carbono 122. O processo de vedação da membrana de filtro 116 é descrito em detalhes abaixo, particularmente com referências às Figuras 5 a 6. O injetor 118, que contém um espécime ou uma amostra 124, para ser analisado, é disposto ou posicionado acima da membrana de filtro 116 e é usado para depositar uma gotícula de amostra 126 sobre a membrana de filtro 116. Porque a ponta 120 está ligada de forma vedante ao conjunto de montagem de filtro 114 que, por sua vez, está montado na câmara de vácuo 104, existe um vácuo dentro da ponta 120 de modo que o vácuo exerce uma força de sucção na membrana de filtro 116 de baixo do filtro de montagem 112. Isto é permitido porque uma cavidade ou canal alongado 128, definido dentro da ponta 120, está em comunicação de fluido com a membrana de filtro 116 e a câmara de vácuo 104. Como descrito abaixo, é importante que o injetor 118 seja posicionado corretamente acima da membrana de filtro 116 de modo que, quando a gotícula de amostra 126 é depositada sobre a membrana de filtro 116, a gotícula de amostra 126 não está em contato com as bordas da membrana de filtro 116 e colocada diretamente acima de uma porção de cavidade alargada 129 que é definida entre o canal 128 e o lado de baixo da fita de montagem 122. De preferência, a gotícula 126 é colocada no ou perto do centro da porção de cavidade 129 que está alinhada com o eixo geométrico longitudinal (L) que se estende através do canal 128.

[0035] As Figuras 3A a 3C são imagens SEM de grande amplificação de microesferas de poliestireno aderidas a um filtro de polietersulfona. A Figura 3A é uma imagem não processada 130 e a Figura 3B é uma imagem detectada e enumerada 132. A Figura 3C é uma vista em primeiro plano 133 da visa da Figura 3B e seção 131 da Figura 3A. Nestas imagens de exemplo, 77 partículas foram detectadas em um campo de visão de 131,47 yn. Isso corresponde a aproximadamente 0,59 partículas por pm2. A vista 133 mostra as partículas numeradas 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 28, 29, 30.

[0036] As Figuras 4A a 4B mostram a borda da imagem da marcação de gotícula que usa SEM (elétrons primários). A Figura 4A mostra uma imagem 134 em grande amplificação e a Figura 4B mostra uma marcação imagem 136 em baixa amplificação. A localização da imagem de grande amplificação 134, mostrada na Figura 4A, marcada com uma seta branca na Figura 4B de modo que a imagem 134 mostra uma porção de toda a imagem de marcação 136. A borda da gotícula é bem definida com um número insignificante de partículas fora da marcação. Em baixa ampliação, toda a marcação 136 da gotícula é visualizada e a área da marcação pode ser medida com precisão. Nesse exemplo, a área da marcação (ATctal) media 8,436 mm2.

[0037] As Figuras 5A a 5D são vistas de corte transversal lateral da membrana de filtro 116 e descreve o processo de vedação da membrana de filtro 116 e depois que dissolve o vedante. Na A Figura 5A, a membrana de filtro 116 tem poros abertos 138, definidos entre membros de grade alongados 139 da membrana de filtro 116, que se estende através da membrana de filtro 116. Na A Figura 5B, os poros 138 são preenchidos com um vedante 140. Na Figura 5C, a gotícula de amostra 126 da amostra 124, ou seja, um líquido 144 que contém partículas 142 a serem analisadas, é depositada na membrana de filtro 116. De preferência, a gotícula 126 é depositada na membrana de filtro 116 que utiliza o injetor 118 descrito acima. Após o contato com a gotícula 126 com vedante 140, o líquido 144 dissolve o vedante 140 que está disposto imediatamente abaixo da gotícula 126 de modo que o líquido 144 é absorvido e passado através dos poros 138 dispostos apenas abaixo da gotícula 126. Porque as partículas a serem enumeradas 142 têm um tamanho maior que os poros 138 da membrana, as partículas 142 são depositadas no topo da membrana de filtro 116 enquanto o líquido e quaisquer contaminantes menores 144 são absorvidos ou fluem para dentro dos poros 138 abaixo da gotícula 126 à medida que o vedante 140 nesses poros são dissolvidos e o líquido 144 está sujeito à sucção da câmara alongada 128 da câmara de vácuo 104 abaixo da membrana de filtro 116.

[0038] A Figura 6 é uma vista ampliada da membrana de filtro 116 da Figura 5D. As partículas subvisíveis 142 repousam sobre a membrana de filtro 116 e as partículas 142 são maiores que os poros 138a a138j, de modo que não passam pelos poros, mesmo que os poros estejam abertos e sujeitos a sucção da câmara de vácuo 104 (mostrado na Figura 1). Os poros 138a a d e 138i a j ainda são preenchidos com vedante 140, uma vez que não foram dissolvidos pelo líquido 144 porque não estiveram em contato com o líquido 144 da gotícula de amostra 126 (consultar a Figura 5C). Mais particularmente, o diluente, tal como um armazenamento temporário adequado, no líquido 144 dissolve o vedante 140. Conforme indicado acima, o diluente deve ser compatível com o espécime, isto é, ter influência mínima da morfologia da amostra e do estado de agregação. O diluente também deve ter a propriedade de dissolver o vedante. Isto é para se certificar de que o vácuo é mantido somente na marcação e para que a configuração não perca o vácuo "abrindo" os poros fora da área de interesse. À medida que o líquido 144 dissolve o vedante 140 disposto nos poros 138e a 13Sh, o líquido 144 enche os poros 138e a 138h para substituir o vedante 140. Isto torna mais fácil enumerar as partículas 142 porque as partículas 142 estão colocadas no topo do segmento de filtro 116 e estão bem distribuídas através da membrana de filtro 116.

EXEMPLO

[0039] Abaixo, um exemplo ilustrativo do método de preparação da membrana de filtro 116, de acordo com a presente invenção.

[0040] 1. Uma amostra, contendo partículas subvisíveis 142, como micropartículas e/ou nanopartículas, é preparada para enumeração, diluindo a amostra em série em um diluente apropriado (tipicamente água, fosfato tamponado, HEPES tamponado, TRIS tamponado ou solução salina tamponada com histidina) dependendo das condições de armazenamento temporário de cada amostra particular.

[0041] 2. Um agente de fixação (tipicamente glutaraldeído ou formaldeído) e/ou um agente estabilizador (tipicamente sacarose ou glicerol) pode ser introduzido na solução de amostra diluída 124, que também inclui as partículas subvisíveis 142, para estabilizar e preservar a estrutura das partículas e em algumas amostras evita agregação indesejável das partículas 142. Os agentes de fixação/estabilização e o diluente correspondem ao líquido 144 e em conjunto com as partículas 142 formam a amostra/o espécime 124 e a gotícula de amostra 126. Os agentes de fixação/estabilização são usados para evitar que as partículas 142 sejam destruídas ou danificadas durante o manuseio e aderindo de forma indesejável uma à outra, o que torna mais difícil enumerar as partículas 142 posteriormente.

[0042] 3. O conjunto de filtro 112 consiste na membrana de filtro porosa 116 (tipicamente produzida a partir de polietersulfona ou policarbonato) com poros 138 que têm um tamanho de poro definido (tipicamente de 0 a 15 nm) e um cassete de filtro que pode ser aberto, produzido a partir de plástico ou equivalente, usados para separar as partículas 142 do líquido. Um conjunto de filtro adequado 112 é mais bem mostrado na Figura 2. Em geral, os filtros são comprados em massa como filtros de uso único e, portanto, precisam ser montados em algo. Alguns fornecedores também vendem retentores de filtros e esses dispositivos são originalmente produzidos para serem conectados a uma seringa e empurrar o líquido e, portanto, não sugam o líquido através do vácuo. Portanto, é necessário montar o filtro em um conjunto de filtro para garantir a integridade do vácuo. Após alguma experimentação, surpreendentemente, percebeu-se que o filtro poderia ser montado diretamente no suporte SEM o que economiza tempo e evita as etapas críticas de manipulação manual dos espécimes contendo filtros. É concebível que tal conjunto possa ser feito de forma econômica e seja vendida como um consumível SEM.

[0043] 4. O conjunto de filtro 112 é montado no topo da câmara de vácuo de plástico 104 que por sua vez está conectada ao dispositivo de vácuo 102 através da tubulação 106.

[0044] 5. O vácuo na câmara de vácuo 104 é controlado pela válvula luer de 3 vias 108 e monitorizado usando-se o manômetro de vácuo 110. Um sistema automático que usa válvulas magnéticas controladas por um sistema eletrônico de monitoramento também pode ser implementado.

[0045] 6. Os poros 138 na membrana de filtro 116 são de preferência vedados com vedante 140 tal como glicina (ou equivalente) antes da aplicação da amostra da gotícula de amostra 126, como melhor mostrado nas Figuras 5B e 5C. Foi surpreendente e inesperadamente constatado que, utilizando o vedante 140 na membrana de filtro 116, as partículas 142 dentro da gotícula 126 foram distribuídas de forma mais uniforme (antes da remoção do líquido 144 da gotícula 126) e não havia necessidade de usar uma força de alto vácuo para reduzir o risco de a gotícula espalhar-se de forma desigual na membrana de filtro. Deve notar-se que a distribuição das partículas não tem que ser a mesma na periferia externa e como está no centro. O padrão da distribuição de partículas pode ser determinado pela varredura da marcação 134/136 (consultar as Figuras 4A a 4B) da amostra de partículas, disposta na membrana de filtro, a partir da periferia externa ou da borda externa 137 da marcação 136 para o centro 139 da marcação da amostra de partículas. Se a porção digitalizada da amostra de partículas mostrar certo padrão de distribuição de partículas, pode-se assumir de forma confiável que o mesmo padrão de distribuição de partículas se aplica ao redor de toda a marcação de amostra de partículas de formato circular 136, em parte porque as partículas tiveram tempo para se instalar antes do vedante 140 ser dissolvido pelo líquido na gotícula 126. Uma vez que a gotícula 126 é depositada pela primeira vez na membrana de filtro vedada 116, a borda externa 137 da marcação 136 da gotícula 126 torna-se relativamente distinta ou afiada, o que é importante para determinar onde iniciar a enumeração e a varredura em direção ao centro 139 de formato circular de amostra de partículas ou marcação 136 depositada na membrana de filtro dissolvida 116. Verificou-se de forma inesperada que as vantagens da distribuição relativamente uniforme das partículas na membrana de filtro superavam as desvantagens de remoção do vedante para permitir que o líquido na gotícula flua através da membrana de filtro antes de iniciar a enumeração das partículas. Qualquer periferia desigual ou não distinta da marcação da gotícula na membrana de filtro torna mais difícil determinar a sua marcação e saber qual área deve ser analisada para contar todas as partículas na gotícula. Ao aplicar a gotícula de amostra 126 na membrana de filtro 116, com todos os poros 138 que estão vedados pelo vedante 140, as partículas 142 estão uniformemente distribuídas dentro da gotícula 126 à medida que a gotícula 126 se espalha na superfície superior vedada da membrana de filtro 116. O requisito de dissolver o vedante 140 primeiro retarda o fluxo do líquido 144 através dos poros 138. Ao não utilizar o vedante 140, o líquido 144 da gotícula 126 começaria imediatamente a fluir através dos poros 138 e porque a gotícula 126 é mais grossa no centro e mais fina na sua periferia, mais partículas 142 tendem a estar localizadas no meio da gotícula. Isso geralmente resulta em uma distribuição desigual das partículas na membrana de filtro e a borda externa da marcação da amostra de partículas não é clara. Deve notar-se que mais partículas nem sempre estão localizadas no meio da gotícula porque alguns espécimes podem ter uma tendência a concentrar-se na interface ar-água. Em geral, é difícil prever exatamente como as diferentes amostras se comportam e distribuem.

[0046] Uma vez que a totalidade da marcação 136 da gotícula de amostra 126 é utilizada para calcular a concentração de partícula das partículas 142, a gotícula 126 não deve tocar a borda interna do retentor de filtro da membrana de filtro 116. Assim, é importante que apenas uma parte definida da membrana de filtro 116 seja coberta com a gotícula de amostra 126. Isto é para se certificar de que todas as partículas 142 na gotícula 126 são enumeradas ou contadas. Além disso, a posição da gotícula de amostra 126 deve ser alinhada com a cavidade 129 e o canal 128 definido dentro da ponta 120. Sem pré-tratamento da membrana de filtro 116 com vedante 140, os poros do filtro envolvente, isto é, os poros 138a a 138d e 138i a 138j na Figura 6, permanecem abertos e o ar flui ao redor da gotícula 126 e através da membrana de filtro 116 de modo que a gotícula de amostra 126 não absorve e se filtra rápido o suficiente para obter uma boa distribuição da amostra das partículas 142. Em outras palavras, a utilização do vedante 140 tem a vantagem de criar uma periferia externa mais distinta 137 da marcação 136 da gotícula 126 quando o líquido começa a dissolver o vedante 140 que é depositado abaixo da gotícula 126. Sem o uso do vedante 140, não há tempo suficiente para que as partículas 142 sejam distribuídas uniformemente dentro da gotícula 126, uma vez que o líquido 144 imediatamente começa a fluir através dos poros 138 sem dar às partículas 142 tempo para se acomodar e ser distribuído uniformemente dentro da gotícula 126. Uma característica muito importante do vedante 140 é, portanto, criar uma condição de vácuo de modo que uma marcação de espécime definido seja formada. Mais particularmente, sem o tratamento do vedante 140 de acordo com a presente invenção, a gotícula 126 seca de forma indesejável através da difusão e evaporação. Isso resulta em uma distribuição de partículas altamente desigual devido aos efeitos de secagem. Foi surpreendentemente constatado que a evaporação indesejável pode causar efeitos osmóticos potencialmente causando ruptura de partículas e formação de cristais devido ao aumento da concentração de sal na gotícula restante. Além disso, isso obscurece a detecção e enumeração de partículas causadas por partículas quebradas e partículas que estão escondidas por precipitados de sal. Na presente invenção, ao aplicar a gotícula de amostra 126 na membrana de filtro vedada 116, o líquido 144 na gotícula de amostra 126 dissolve lentamente o vedante 140 para abrir os poros 138e a 138h dispostos debaixo da gotícula 126. Consequentemente, o líquido 144 é rapidamente extraído através dos poros 138e a 138h da membrana de filtro 116 pelo vácuo, resultando em uma boa distribuição de amostra das partículas 142 no topo da superfície da membrana de filtro 116.

[0047] 7. Antes de aplicar a gotícula de amostra 126 na membrana de filtro 116, o dispositivo de vácuo 102 é ativado e a pressão na câmara de vácuo 104 é abaixada para criar sucção na membrana de filtro 116. O vácuo na câmara de vácuo 104 assegura que o líquido 144 da gotícula 126 seja absorvido uniformemente na membrana de filtro 116. A combinação do uso do vedante e do vácuo resulta em uma distribuição uniforme das partículas 142 através da marcação 136 na membrana de filtro 116.

[0048] 8. Um volume adequado (tipicamente 5 μl) da gotícula de amostra 126 é aplicado na membrana de filtro porosa e vedada 116. Como indicado acima, é importante que os diâmetros das partículas 142 sejam maiores do que o diâmetro dos poros 138 da membrana de filtro 116 e que a gotícula 126 não toque as bordas do filtro de montagem. Um volume superior a 5 μl pode ser aplicado usando um sistema de injeção em que são aplicadas múltiplas gotículas ou volumes maiores na mesma posição na membrana de filtro 116. Em geral, o uso de volumes maiores minimiza o erro de amostragem e permite a análise de amostras menos concentradas.

[0049] 9. A gotícula de amostra 126 é absorvida na membrana de filtro 116 para tipicamente 60 segundos sob pressão de vácuo fornecidos pela câmara de vácuo 104. Os valores de pressão exatos podem ter que ser ajustados em parte dependendo do tamanho do poro, tipo de amostra, volume, pureza e viscosidade.

[0050] 10. Após a absorção, a membrana de filtro 116 pode ser separada do conjunto de filtro 112 montado sobre a ponta de alumina SEM 120 (tipicamente com o uso de uma fita de carbono adesiva condutora 122).

[0051] 11. A membrana de filtro 116, com as partículas ligadas 142 colocadas sobre o mesmo, pode então ser revestida por dispersão, por exemplo, por uma fina película de carbono (tipicamente com 20 nm de espessura) com o uso de um evaporador de carbono a uma pressão de câmara adequada tipicamente IxlO-5 mbar. O revestimento por dispersão melhora a condutividade da membrana de filtro 116; aumenta a relação sinal-ruído da membrana de filtro 116 e reduz o dano do feixe de elétrons e os efeitos de carga. Esta técnica é muitas vezes necessária para usar a imagem de um material de filtro com o uso de uma SEM. Pode não ser convencional usar revestimento de carbono, mas fornece imageamento de SEM de maior resolução em comparação com o tamanho de granulação maior de dispersão de metal.

[0052] 12. A membrana de filtro 116 pode ser transferida para o SEM e o sinal de elétrons primários dispersos (com o uso de um detector na lente) ou elétrons secundários (como, por exemplo, com o uso um detector SE2) é gravado tanto para baixo quanto para cobrir toda a marcação e grande ampliação (normalmente 10.000 a 30.000) para enumeração. Se for utilizado um padrão de referência com uma assinatura de elétrons secundária diferente (embora não seja necessário determinar a concentração de partículas), as partículas de interesse podem ser distinguidas das partículas de referência pela combinação de informações de intensidade de diferentes detectores (como detectores de lente e SE2).

[0053] 13. As imagens de baixa ampliação 136 (consulte a Figura 4B) são usadas para definir o tamanho da marcação da gotícula e a distribuição geral da amostra enquanto as imagens de grande ampliação são usadas para determinar a enumeração de partículas.

[0054] 14. As imagens de grande ampliação, como a imagem 134, são adquiridas através da marcação da amostra a partir da borda 137, através do centro 139 e da borda oposta da gotícula, de modo a minimizar qualquer efeito das diferenças na distribuição de partículas através da marcação da gotícula.

[0055] 15. A partir das imagens de baixa amplificação, como a imagem 136, a área da marcação da amostra (Atotal) é calculada pelo rastreamento da borda da marcação. Os pixels circundados são contados e o número contado é multiplicado pelo tamanho do pixel.

[0056] 16. A partir das imagens de alta ampliação, as partículas 142 são detectadas e contadas. Este procedimento pode ser executado através de marcação manual ou marcação automática com o uso de um software adequado, como o software proprietário Analyser da Vironova ou qualquer outro software de análise de imagem apropriado. O número médio de partículas por unidade de área (n AFOV) é calculado a partir do conjunto de dados da imagem.

[0057] 17. O número de partículas por ml na amostra de partículas é, de preferência, calculado usando a seguinte fórmula:

[0058] Onde C é a concentração de partículas, df é o fator de diluição e V é o volume de amostra aplicado. Também pode ser possível usar uma fórmula que tenha em conta que a distribuição de partículas pode variar da periferia da amostra de partículas à medida que a amostra é submetida à varredura para o centro da mesma.

[0059] Em resumo, a técnica de microscopia eletrônica de varredura quantitativa de partículas (pqSEM) da presente invenção é uma técnica de detecção e enumeração de partículas diretas de alta precisão. Uma característica importante da presente invenção é que a detecção direta não depende da afinidade entre uma sonda e o espécime que muitas técnicas convencionais existentes fazem. Todos os parâmetros, como o fator de diluição, o volume aplicado, a marcação da gotícula, podem ser controlados e o número de partículas por unidade de área pode ser medido diretamente, minimizando o erro de aproximações e premissas. Além disso, o poder de resolução do pqSEM permite a detecção de partículas individuais subvisíveis no interior de grupos e duas populações de partículas de diferentes tamanhos ou outras características morfológicas podem ser enumeradas a partir da mesma amostra. As partículas e a marcação das imagens de alto contraste geradas pela técnica pqSEM da presente invenção podem ser facilmente detectadas usando a análise automatizada de imagens. Isso fornece os meios para coletar rapidamente grandes conjuntos de dados e produzir resultados estatísticos robustos.

[0060] Embora a presente invenção tenha sido descrita de acordo com composições e modalidades preferenciais, deve-se compreender que certas substituições e alterações podem ser realizadas à mesma sem se afastar do espírito e escopo das reivindicações a seguir.

Claims

1. Método para quantificação de partículas subvisíveis caracterizado pelo fato de que compreende: fornecer uma membrana de filtro (116) que tem uma pluralidade de poros (138) definida através das mesmas, sendo que a membrana de filtro (116) está em engate operacional com uma câmara de vácuo (104); vedar os poros com um vedante (140); aplicar uma gotícula de amostra (126), que contém um líquido (144) e partículas subvisíveis (142) na membrana de filtro (116) sem a gotícula de amostra (126) tocar qualquer part para fora da extremidade da membrana de filtro (116), o líquido (144) dissolver o vedante (140) em poros (138e a138h) dispostos abaixo da gotícula de amostra (126); o líquido (144) flui através dos poros em que o vedante (140) foi dissolvido e as partículas subvisíveis (142) permanecerem sobre a membrana de filtro (116); e as partículas subvisíveis (142) serem enumeradas em um microscópio eletrônico.

2. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o método compreende adicionalmente a etapa para pré-montar um conjunto de filtro (112), que contém a membrana de filtro (116), em um suporte SEM (120).

3. Método, de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que o método compreende adicionalmente a etapa para colocar uma fita de montagem (122) no suporte SEM (120).

4. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o método compreende adicionalmente a etapa para fornecer o suporte SEM (120) que possui um canal alongado (128) definido no mesmo, usando-se um injetor (118) que contém a gotícula de amostra (126) e alinhar o injetor (118) em cima de um canal alongado (128) antes de depositar a gotícula de amostra (126) na membrana de filtro (116).

5. Método, de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que o método compreende adicionalmente a etapa para conectar o suporte SEM (120) a uma câmara de vácuo (104) conectada a uma fonte de vácuo (102) e submeter a membrana de filtro (116) a uma força de sucção através do canal alongado (128).

6. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o método compreende adicionalmente a etapa de o líquido (144) apenas dissolver o vedante (140) nos poros (138e a 138h) dispostos imediatamente abaixo da gotícula de amostra (126) enquanto os poros adjacentes (138a a 138d, 138i a 138j) permanecem vedados com o vedante (140).

7. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o método compreende adicionalmente a etapa de as partículas subvisíveis (142) formarem uma marcação (136) na membrana de filtro (116) e realizar varredura das subpartículas (142) a partir de uma periferia externa (137) da marcação (136) em direção a um centro (139) da marcação (136).

8. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o método compreende adicionalmente a etapa de utilizar um diluente do líquido (144) para dissolver o vedante (140) nos poros localizados diretamente abaixo da gotícula de amostra (126).

9. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o método compreende adicionalmente a etapa de utilizar uma glicina como vedante (140).