KR20180095441A - 서브-비져블의 고정밀 정량화 - Google Patents
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Abstract
본 방법은 서브-비져블 입자의 정량화를 위한 것이다. 복수의 구멍(138)이 형성된 필터 멤브레인(116)이 제공된다. 필터 멤브레인(116)은 진공 챔버(104)와 작동 연결된다. 구멍들은 밀봉제(140)로 밀봉된다. 액체(144)와 서브-비져블 입자(142)를 포함하는 샘플 액적(126)은 필터 멤브레인(116) 상에 도포된다. 액체(144)는 샘플 액적(126) 바로 아래 배치된 구멍(138e-138h) 내의 밀봉제(140)를 용해시킨다. 액체(144)는 구멍을 통해 흐르고, 밀봉제(140)가 용해되어서, 서브-비져블 입자(142)는 필터 멤브레인(116)의 상단에 남는다. 입자(142)는 전자 현미경으로 열거된다.
Description
본 발명은 전자 주사 현미경법(scanning electron microscopy, SEM)과 같은 현미경법을 사용하여, 마이크로-입자 및/또는 나노입자와 같은 서브-비져블 입자의 고정밀 정량화를 위한 방법에 관한 것이다.
바이러스 입자, 바이러스-유사 입자 및 무기 및 고분자 비드와 같은 서브-비져블 입자(sub-visible particle) 및 다른 나노입자 및 액체 샘플로부터의 마이크로-입자의 갯수의 정확한 열거는 많은 프로세스에서 중요하다. 가령, 수정된 바이러스 벡터는 유전자 치료 응용 분야에서 흔히 사용된다. mL 당 활성 벡터의 수(바이러스 샘플의 전염 역가(infectious titer))는 표준 전염 분석(standard infectivity assay)을 사용하여 결정될 수 있다. 그러나, 현재 가능한 방법을 사용함에 의해, 비-전염성 입자를 포함하여, 샘플 내의 전체 입자의 수를 정확하게 결정하는 것이 불가능하다. 비-전염성 입자에 대한 전염성의 비율은 최종 유전자 치료 제품과 업스트림 전개 프로세스의 품질과 효율성에 있어서 매우 귀한 정보를 제공한다.
정량적인 흐름 세포계산법(quantitative flow cytometry, QFCM)과 같은 현재 사용가능한 기술의 한 가지 중요한 한계점은, 관심 있는 나노입자가 직접 검출되지 않는다는 것이다. 대신에, 나노입자의 개체수에 대해 결합된 프로브(bound probe)의 수가 정량화된다. 나노입자당 결합된 프로브의 수가 변하기 때문에, 종래의 간접적인 기술의 정확성은 전형적으로 낮고, 표본과 프로브 간의 친화도에 의존한다. 관심 있는 나노입자가 직접적으로 검출되는 기술은 이러한 한계를 극복할 것이다. 게다가, 그 기술이 충분한 분해능으로 입자를 시각화할 수 있다면, 개개의 입자들은 그들의 크기와 형태에 기초하여 식별되어서, 직접적으로 열거될 수 있다. 심지어 클러스터 내의 입자가 열거되고 평가될 수 있다. 이는 현재 사용가능한 친화도 방법이나 광 산란-기반의 기술을 사용하여서는 가능하지 않다.
본 발명의 신규한 고정밀 직접 입자 방법이 사용되어서, 액체 샘플로부터, 나노입자와 같은 무기 및 유기 서브-비져블(sub-visible) 입자 모두를 열거하는데 사용될 수 있다. 하나의 중요한 특징은, 표본이 잘-형성되고 측정가능한 풋프린트(footprint)에 도포된다는 것이다. 또 다른 중요한 특징은, 표본이 이전에 가능했던 것보다 더 균일하게 분산되고 이는 샘플링에 대한 필요성을 감소시킨다는 것이고, 이제는 개개의 입자가 용이하게 식별될 수 있는 분해능으로 분석을 시행할 수 있다. 서브-비져블 입자는 신호 프로브에 대한 필요없이 직접 검출되고, 일반적인 이차원 이미지에서 가시화될 수 있다. 본 발명의 입자 정량화 SEM(pqSEM) 방법은 낮은-진공 필터링, 전자 주사 현미경법(SEM)이나 다른 전자 현미경 기술과 이미지 분석법에 기초하는 것이 바람직하다. 본 발명은, 이러한 예는 특징짓는 미국표준기술연구소(National Institute of Standards and Technology)가 폴리스티렌 비드를 특징짓는 내부 표준으로, 또는 내부 표준 없이 사용될 수 있다.
본 발명은 상기 기술된 문제점에 대한 해결책을 제공한다. 좀 더 구체적으로, 본 방법은 서브-비져블 입자의 정량화를 위한 것이다. 복수의 구멍이 형성된 필터 멤브레인이 제공된다. 필터 멤브레인은 진공 챔버와 작동 연결된다. 구멍들은 밀봉제로 밀봉된다. 액체와 서브-비져블 입자를 포함하는 샘플 액적은 필터 멤브레인 상에 도포된다. 액체는 샘플 액적 바로 아래 배치된 구멍 내의 밀봉제를 용해시킨다. 액체는 구멍을 통해 흐르고, 밀봉제가 용해되어서, 서브-비져블 입자는 필터 멤브레인의 상단에 남는다. 입자가 배치된 필터 멤브레인은 전자 현미경으로 이동되어서 현미경으로 얻은 이미지에서 열거된다.
본 방법은, 필터 멤브레인을 포함하는 필터 조립체를 SEM 지지부 상에 사전-장착하는 단계를 더 포함한다.
본 방법은, SEM 지지부 상에 장착 테이프를 위치시키는 단계를 더 포함한다.
본 방법은, 샘플 액적을 필터 멤브레인 상에 증착하는 단계 이전에, 기다란 채널이 형성된 SEM 지지부를 준비하고, 샘플 액적을 포함하는 주입기를 사용하여 주입기를 기다란 채널의 상단에 정렬하는 단계를 더 포함한다.
본 방법은, SEM 지지부를 진공 소스와 연결된 진공 챔버에 연결시켜서, 필터 멤브레인이 기다란 채널을 통해 흡입력의 대상이되도록 하는 단계를 더 포함한다.
본 방법은 샘플 액적이 필터 멤브레인의 임의의 외부 모서리에 접촉하지 않으면서, 샘플 액적이 필터 멤브레인 상으로 증착시키는 단계를 더 포함한다.
본 방법은, 액체가 구멍 내에 배치된 밀봉제와 접촉하지 않기 때문에, 액적의 측면 상의 인접한 구멍은 밀봉제로 밀봉된 채로 남겨지는 반면, 샘플 액적 바로 아래에 배치된 구멍 내의 밀봉제만 액체가 용해시키는 단계를 더 포함한다.
본 방법은, 서브-비져블 입자가 필터 멤브레인 상에 형성되고 측정가능한 풋프린트를 형성하고, 풋프린트의 외부 주변부로부터 풋프린트의 중심까지, 일련의 입자의 이미지를 얻는 단계를 더 포함한다.
본 방법은, 입자가 명확하게 가시화되는 분해능에서 얻어진 전자 현미경으로, 이미지 분석 방법을 사용하여 수동이거나 자동으로, 입자를 카운팅하는 단계를 더 포함한다.
본 방법은, 전체 풋프린트를 커버하는 현미경 이미지(전체 풋프린트를 커버하는 하나의 저배율 이미지 또는 함께 봉합된 풋프린트의 여러개의 고배율 서브-이미지)에서 필터 멤브레인 상의 풋프린트의 전체 면적을 평가하는 단계를 더 포함한다.
본 방법은, 전체 풋프린트의 면적과 단일 입자를 명확하게 보는데 충분히 높은 분해능에서, 이미지로부터 파생된 단위 면적당 입자의 수로부터 샘플 내의 전체 입자의 수를 계산하는 단계를 더 포함한다.
본 방법은, 풋프린트 내의 입자의 불균형한 반경 입자 분포에 대해 보상하는 단계를 더 포함하되, 정보는 개개의 입자를 명확하게 보기 위해 충분히 높은 배율로, 풋프린트의 주변부에서 중심을 통한, 일련의 이미지를 얻는 것에서 파생된다.
본 방법은, 풋프린트, 액체 샘플의 도포된 부피와 희석도로부터 전체 입자 추정치를 사용하여, 용액 내의 입자의 농도를 계산하는 단계를 더 포함한다.
본 방법은, 샘플 액적 바로 아래에 위치된 구멍 내의 밀봉제를 용해시키기 위해, 액체의 희석제를 사용하는 단계를 더 포함한다. 표본은 액체 형태이어야 하고, 희석제는 희석제와 호환가능해야 하며, 사용될 밀봉제를 효과적으로 용해시키는 속성을 가져야 한다.
본 방법은, 밀봉제로서 글라이신을 사용하는 단계를 더 포함한다. 사용될 수 있는 다른 밀봉제는 트레할로오스/수크로오스계 밀봉제를 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
도 1은 본 발명의 진공 장치의 개략적인 측면도이다.
도 2는 필터 조립체의 개략적인 측단면도이다.
도 3a는 폴리-에테르 설폰 필터에 부착된 폴리스티렌 비드의 처리되지 않은 고확대 SEM 이미지이다.
도 3b는 폴리-에테르 설폰 필터에 부착된 폴리스티렌 비드의 검출되고 열거된 고확대 SEM 이미지이다.
도 3c는 상기 도 3b의 SEM 이미지의 클로즈업도이다.
도 4a는 고배율에서 SEM(1차 전자)을 사용한 액적 풋프린트 이미지의 모서리의 개략도이다.
도 4b는 저배율에서 SEM(1차 전자)을 사용한 액적 풋프린트 이미지의 모서리의 개략도이다.
도 5a는 개방된 구멍이 있는 본 발명의 멤브레인의 개략적인 측단면도이다.
도 5b는 도 5a에 도시된, 그러나 밀봉된 구멍을 가진 멤브레인의 개략적인 측단면도이다.
도 5c는 도 5b에 도시된, 샘플 액적이 증착된 본 발명의 멤브레인의 측단면도이다.
도 5d는 도 5c에 도시된, 본 발명의 멤브레인내로 흡수되는 액적을 가진 멤브레인의 개략적인 측단면도이다.
도 6은 도 5d의 확대도이다.
도 2는 필터 조립체의 개략적인 측단면도이다.
도 3a는 폴리-에테르 설폰 필터에 부착된 폴리스티렌 비드의 처리되지 않은 고확대 SEM 이미지이다.
도 3b는 폴리-에테르 설폰 필터에 부착된 폴리스티렌 비드의 검출되고 열거된 고확대 SEM 이미지이다.
도 3c는 상기 도 3b의 SEM 이미지의 클로즈업도이다.
도 4a는 고배율에서 SEM(1차 전자)을 사용한 액적 풋프린트 이미지의 모서리의 개략도이다.
도 4b는 저배율에서 SEM(1차 전자)을 사용한 액적 풋프린트 이미지의 모서리의 개략도이다.
도 5a는 개방된 구멍이 있는 본 발명의 멤브레인의 개략적인 측단면도이다.
도 5b는 도 5a에 도시된, 그러나 밀봉된 구멍을 가진 멤브레인의 개략적인 측단면도이다.
도 5c는 도 5b에 도시된, 샘플 액적이 증착된 본 발명의 멤브레인의 측단면도이다.
도 5d는 도 5c에 도시된, 본 발명의 멤브레인내로 흡수되는 액적을 가진 멤브레인의 개략적인 측단면도이다.
도 6은 도 5d의 확대도이다.
본 발명의 방법은 도 1-6을 참조하여 기술된다. 도 1은 진공 장치와 진공 챔버 사이에서 연장된 튜빙(106)을 통해 진공 챔버(104)에 연결된 진공 장치(102)를 가진 진공 조립체(100)의 개략적인 전면도이다. 바람직하게는, 튜빙(106)은 루어 밸브(luer valve, 108)와 같은 적절한 밸브를 가진다. 진공 검압계(110)는 진공 챔버(104)와 작동 연결되어서, 그 안의 진공 압력을 측정한다. 필터 조립체(112)는 필터 조립체 장착부(114)에 의해 진공 챔버(104)의 상단에 장착된다. 필터 멤브레인(116)은 필터 조립체(112) 상에 배치된다. 주입기(118)는 필터 멤브레인(116) 위에 위치된다.
도 2는 필터 조립체(112)의 개략적인 단면도이다. 본 발명의 전체적인 분석 프로세스는, 필터 멤브레인(116)이 분석되거나 열거될 샘플/표본을 포함할 때, 이를 수동으로 하기보다는, 필터 멤브레인(116)을 SEM 지지부(알루미나 스터브(alumina stub)) 상에 사전-장착함에 의해 간단화될 수 있다. 장착은 SEM 스터브(120) 내에 홀을 간단하게 드릴링함에 의해 행해질 수 있다. 이러한 장치의 사용에 의해, 표본을 포함하는 필터 멤브레인(116)이 수동으로 SEM 스터브(120) 상으로 장착하는 동안에 다루어지는 이전 단계 동안에, 표본을 잃어버리거나 필터 멤브레인(116)을 손상시킬 위험을 최소화시킨다. 필터 멤브레인(116)의 준비의 세부사항은 이하에서 기술된다. 이러한 pqSEM 분석 소비 장치는 제조하기에 비교적 비싸지 않다.
좀 더 구체적으로, 필터 조립체(112)는, 양면 탄소 장착 테이프(122)가 위치된 수정된 SEM 알루미나 스터브(120)를 가진다. 밀봉된 다공성 필터 멤브레인(116)은 탄소 장착 테이프(122)의 상단에 위치된다. 필터 멤브레인(116)을 밀봉하는 프로세스는 도 5-6을 참조하여 특히 아래에 상세하게 기술된다. 분석될 표면이나 샘플(124)을 포함하는 주입기(118)는 필터 멤브레인(116)의 위에 배치되거나 위치되고, 샘플 액적(126)을 필터 멤브레인(116) 상에 증착하는데 사용된다. 스터브(120)가 필터 조립체 장착부(114)에 밀봉적으로 연결되고, 이는 결국 진공 챔버(104) 상에 장착되기 때문에, 스터브(120) 내부에 진공이 있어서 진공은 필터 조립체(112) 아래로부터 필터 멤브레인(116)에 흡입력을 가한다. 이는 스터브(120) 내부에 형성된 기다란 캐비티나 채널(128)이 필터 멤브레인(116) 및 진공 챔버와 유체 연동되기 때문에 활성화된다. 이하에 기술된 바와 같이, 주입기(118)가 필터 멤브레인(116) 위에 정확하게 위치되어서, 샘플 액적(126)이 필터 멤브레인(116) 상에 증착되고, 샘플 액적(126)이 필터 멤브레인(116)의 모서리와 접촉하지 않고 채널(128)과 장착 테이프(122)의 아랫면 사이에 형성된 확대된 캐비티 부분(129) 위에 직접 위치되는 것이 중요하다. 바람직하게는, 액적(126)은, 채널(128)을 통해 연장되는 종방향 축(L)과 정렬된 캐비티 부분(129)의 중심이나 그 근처에 위치된다.
도 3a-3c는 폴리-에테르 설폰 필터에 부착된 폴리스티렌 비드의 고배율 SEM 이미지이다. 도 3a는 처리되지 않은 이미지(130)이고, 도 3b는 검출되고 열거된 이미지(132)이다. 도 3c는 도 3b의 도면과 도 3a의 섹션(131)의 클로즈업도(133)이다. 이들 예시적인 이미지에서, 77개의 입자가 131.47 ㎛2의 시야에서 검출되었다. 이는 대략 ㎛2 당 0.59개의 입자에 해당한다. 도면(133)은 넘버링된 입자 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 28, 29, 30를 나타낸다.
도 4a-4b는 SEM 이미지(1차 전자)를 사용하여 이미지화된 액적 풋프린트의 모서리를 나타낸다. 도 4a는 고배율에서의 이미지(134)이고, 도 4b는 저배율에서의 풋프린트 이미지(136)를 나타낸다. 도 4a에 도시된 고배율 이미지(134)의 위치는 도 4b에 흰색 화살표로 마킹되어서, 이미지(134)는 전체 풋프린트 이미지(136)의 일부를 나타낸다. 액적의 모서리는 풋프린트의 외부에 무시할만한 수의 입자로 잘 형성된다. 저배율에서, 액적의 전체 풋프린트(136)가 가시화되고, 풋프린트의 면적이 정확하게 측정될 수 있다. 이러한 예시에서, 풋프린트의 면적(Atotal)은 8.436 mm2으로 측정되었다.
도 5a-5d는 필터 멤브레인(116)의 단면도이고, 필터 멤브레인(116)을 밀봉하고, 밀봉제를 용해시키는 프로세스를 기술한다. 도 5a에서, 필터 멤브레인(116)은 필터 멤브레인(116)의 기다란 격자 부재들(139) 사이에 형성되고, 필터 멤브레인(116)을 통하여 연장되는 개방된 구멍(138)을 가진다. 도 5b에서, 구멍(138)은 밀봉제(140)로 채워진다. 도 5c에서, 분석될 입자(142)를 포함하는 액체(144)가 있는 샘플(124)의 샘플 액적(126)이 필터 멤브레인(116) 상에 증착된다. 바람직하게는, 액적(126)은 상기 기술된 주입기(118)를 사용하여 필터 멤브레인(116) 상에 증착된다. 액적(126)에 의해 밀봉제(140)와 접촉하면, 액체(144)는 액적(126) 아래에 바로 배치된 밀봉제(140)를 용해시켜서, 액체(144)는 액적(126) 아래에만 배치된 구멍(138)을 통과하여 흡수된다. 열거될 입자(142)가 멤브레인의 포어(138)보다 크기 때문에, 이들 구멍 내의 밀봉제가 용해되고, 액체(144)가 필터 멤브레인(116) 아래의 진공 챔버(104)의 기다란 챔버(128)로부터 흡입됨에 따라, 액체 및 임의의 작은 오염물(144)은 액적(126) 아래의 구멍(138) 내로 흡수되거나 흐르는 반면, 증착된 입자(142)는 필터 멤브레인(116) 상단에 증착된다.
도 6은 도 5d의 필터 멤브레인(116)의 확대도이다. 서브-비져블 입자(142)가 필터 멤브레인(116) 상에 안착되고, 입자(142)가 구멍(138a-138j)보다 커서, 구멍이 개방되고 진공 챔버(104)(도 1에 도시)로부터 흡입되어도, 입자들은 구멍을 통과하지 못한다. 구멍(138a-d 및 138i-j)은 밀봉제(140)로 여전히 채워져 있는데, 왜냐하면, 이들은 샘플 액적(126)(도 5c 참조)과 접촉하지 않아서 액체(144)에 의해 용해되지 않았기 때문이다. 좀 더 구체적으로, 액체(144) 내의 적절한 완충제와 같은 희석제는 밀봉제(140)를 용해시킨다. 상기 지적된 바와 같이, 희석제는 표본과 호환가능해야 하는데, 즉, 표면 형태와 응집 상태의 최소의 영향을 가진다. 또한, 희석제는 밀봉제를 용해시키는 속성을 가져야 한다. 이는, 진공이 풋프린트에서 유지시켜서, 관심 있는 영역 외부의 "개통" 구멍에 의해 설정한 것이 진공을 잃지 않도록 보장한다. 액체(144)가 구멍(138e-138h) 내에 배치된 밀봉제(140)를 용해시킴에 따라, 액체(144)가 밀봉제(140)를 대신하여 구멍(138e-138h)을 채운다. 이는 입자(142)를 열거하는데 더 용이해지는데, 왜냐하면, 입자(142)는 필터 세그먼트(116)의 상단에 놓여있고, 필터 멤브레인(116)에 걸쳐 잘 분산되기 때문이다.
예시
이하 본 발명에 따른 필터 멤브레인(116)을 준비하는 방법의 설명적인 예시가 있다.
1. 마이크로-입자 및/또는 나노입자와 같은 서브-비져블 입자(142)를 포함하는 샘플이, 각각의 특정 샘플의 완충 조건에 의존하는 일련의 적절한 희석제(전통적으로 물, 인산-완충된, HEPES- 완충된, TRIS-완충된 또는 Histidine-완충된 식염수) 내에 샘플을 희석하여, 열거되기 위해 준비된다.
2. 고정제(전통적으로 글루타르알데히드나 포름알데히드) 및/또는 안정제(전통적으로 수크로오스나 글리세롤)는 서브-비져블 입자(142)를 포함하는 희석된 샘플 용액(124) 내로 도입될 수 있어서, 입자의 구조를 안정화하고 보존하며, 일부 샘플에서는 원하지 않는 입자(142)의 응딥을 막는다. 입자(142)와 함께 액체(144)에 해당하는 고정/안정제 및 희석제는 샘플/표면(124) 및 샘플 액적(126)을 형성한다. 고정/안정제는, 입자(142)들이 파괴되거나 다루는 동안 손상되거나 원하지 않게 서로 부착되는 것을 방지하는데, 이는 나중에 입자(142)를 열거하는데 더욱 어렵게 한다.
3. 필터 조립체(112)는, 구멍 크기(전통적으로 0 내지 15 nm)로 형성된 구멍(138)이 있는 다공성 필터 멤브레인(116)(전통적으로, 폴리-에테르 설폰이나 폴리카보네이트로 제조됨)으로 구성되고, 플라스틱이나 등가물로 제조된 개방가능한 필터 카세트가 액체로부터 입자(142)를 분리시키는데 사용된다. 적절한 필터 조립체(112)다 도 2에 가장 잘 도시된다. 일반적으로, 필터는 일회용 필터로서 대량으로 구입되어서, 어떤 것에 장착될 필요가 있다. 일부 판매원은 소유자에게 필터를 판하고, 이들 장치는 원래 주사기에 연결되도록 제조되어서, 이를 통해 액체를 푸쉬하고, 진공을 사용하는 것을 통해 액체를 흡입하지 않는다. 그러므로, 필터를 필터 조립체에 장착하여, 진공 온전성을 보장할 필요가 있다. 일부 실험 이후에, 필터는 SEM 지지부 상에 직접 장착될 수 있고, 이는 시간을 단축시키며 필터를 포함아는 표면을 수동으로 다루는 중요한 단계를 회피하는 것이 놀랍게도 실현되었다. 이러한 조립체는 비싸지 않게 제조될 수 있고, 소비가능한 SEM으로 판매되는 것이 고려가능하다.
4. 필터 조립체(112)는 플라스틱 진공 챔버(104)의 상단에 장착되고, 이는 결국 튜빙(106)을 통해 진공 장치(102)에 연결된다.
5. 진공 챔버(104) 내의 진공은 3-웨이 루어 밸브(108)에 의해 제어되고, 진공 검압계(110)를 사용하여 모니터링된다. 전자 모니터링에 의해 제어되는 자기 밸브를 사용하는 자동화 시스템도 실행될 수 있다.
6. 도 5b와 5c에 가장 잘 도시된 바와 같이, 샘플 액적(126)의 샘플 도포 이전에, 필터 멤브레인(116) 내의 구멍(138)은, 글라이신(또는 등가예)과 같은 밀봉제(140)로 밀봉되는 것이 바람직하다. 필터 멤브레인(116) 내의 밀봉제의 사용에 의해, 액적(126) 내의 입자(142)는 좀 더 균일하게 분포되었고(액적(126)의 액체(144)를 제거하기 이전에), 높은 진공력을 사용할 필요가 없어서, 필터 멤브레인 상에 불균일하게 퍼져있는 액적의 위험을 감소시키는 것을 놀랍고, 예상하지 못하게 발견되었다. 입자의 분포는 외부 주변부와 중심에서 동일할 필요는 없다는 것에 주목해야 한다. 입자 분포의 패턴은, 풋프린트(136)의 외부 주변부나 외부 모서리(137)로부터 입자 샘플의 풋프린트의 중심(139)을 향해, 필터 멤브레인 상에 배치된, 입자 샘플의 풋프린트(134/136)(도 4a-4b 참조)를 스캐닝함에 의해 결정될 수 있다. 입자 샘플의 스캐닝된 부분이 입자 분포의 특정한 패턴을 나타내면, 동일한 입자 분포 패턴이 전체 워형 입자 샘플 풋프린트(136) 주위에 도포된다는 것이 신뢰성있게 가정될 수 있는데, 왜냐하면, 밀봉제(140)가 액적(126) 내의 액체에 의해 용해되기 전에, 정착하기 위한 시간이 입자에게 주어졌기 때문이다. 우선, 액적(126)이 밀봉된 필터 멤브레인(116) 상에 증착되기 때문에, 액적(126)의 풋프린트(136)의 외부 모서리(137)가 비교적 구분되거나 선명하게 되는데, 이는 용해된 필터 멤브레인(116) 상에 증착된 원형 입자 샘플이나 풋프린트(136)의 중심을 향하여 열거와 스캐닝을 어디서부터 시작할지를 결정하는데 중요하다. 필터 멤브레인 상의 입자의 비교적 균일한 분포의 이점은, 입자의 열거를 시작하기 이전에 필터 멤브레인을 통해 액적 내의 액체가 흐를 수 있도록 밀봉제를 제거해야 하는 단점보다 더 크다. 필터 멤브레인 상의 액적의 풋프린트의 임의의 불균일하거나 불명확한 주변부는 액적의 풋프린트를 결정하고, 액적 내의 모든 입자를 카운트하기 위해 분석될 면적을 아는 것을 더욱 어렵게 한다. 샘플 액적(126)을 필터 멤브레인(116) 상에 도포함에 의해, 모든 구멍(138)이 밀봉제(140)에 의해 밀봉되면서, 액적(126)이 필터 멤브레인(116)의 밀봉된 상면에 퍼져 있듯이, 입자(142)는 액적(126) 내부에서 균일하게 분포된다. 밀봉제(140)를 용해시키는 요구사항은 우선 구멍(138)을 통한 액체(144)의 통과액을 늦추는 것이다. 밀봉제(140)를 사용하지 않는다면, 액적(126)의 액체(144)는 구멍(138)을 통해 바로 흐르기 시작할 것이고, 액적(126)은 중심에서 가장 두껍고, 그 주변부에서 더 얇으므로, 입자(142)는 액적의 중간에 위치되는 경향이 있다. 이는 종종 필터 멤브레인 상에 입자의 불균형한 분포를 초래하고, 입자 샘플의 풋프린트의 외부 모서리가 명확하지 않게 되는 것을 초래한다. 어떤 표본은 공기-물 인터페이스를 향해 집중하는 경향을 가질 수 있기 때문에, 더 많은 입자가 액적의 중간에 위치되지 않는다는 것을 주목해야 한다. 서로 다른 샘플이 어떻게 행동하고 분포되는지를 정확하게 예측하기는 일반적으로 어렵다.
샘플 액적(126)의 전체 풋프린트(136)가 입자(142)의 입자 농도를 계산하는데 사용되기 때문에, 액적(126)은 필터 멤브레인(116)의 필터 홀더의 내부 모서리에 접촉하지 않아야 한다. 그러므로, 필터 멤브레인(116)의 정의된 부분만 샘플 액적(126)으로 커버된다는 것이 중요하다. 이는, 액적(126) 내의 모든 입자(142)가 열거되거나 카운트되도록 하는 것을 보장한다. 또한, 샘플 액적(126)의 위치는 스터브(120) 내부에 형성된 캐비티(129)와 채널(128)과 정렬되어야 한다. 밀봉제(140)로 필터 멤브레인(116)의 사전처리 없으면, 도 6에서의 필터 구멍 주위, 즉, 구멍(138a-138d 및 138i-138j)은 개방되고, 공기가 액적(126) 주위에, 그리고 필터 멤브레인(116)을 통해 흘러서, 샘플 액적(126)은 흡수되지 않아서, 입자(142)의 우수한 샘플 분포를 얻기에 충분히 빠르게 필터링된다. 다시 말해, 밀봉제(140)의 사용은, 액체가 액적(126) 아래에 배치된 밀봉제(140)를 용해시키기 시작할 때, 액적(126)의 풋프린트(136)의 좀 더 명확한 외부 주변부(137)를 생성하는 이점을 가진다. 밀봉제(140)의 사용이 없으면, 입자(142)가 정착하고, 액적(126) 내부에 균일하게 분포될 시간을 주지 않고, 액체(144)가 바로 구멍(138)을 통과하기 시작하기 때문에, 입자(142)가 액적(126) 내부에 균일하게 분포될 충분한 시간이 없다. 그러므로, 밀봉제(140)의 하나의 매우 중요한 특징은 진공 조건을 생성하여서, 형성된 표본 풋프린트가 형성된다는 것이다. 좀 더 구체적으로, 본 발명에 따른 밀봉제(140)의 처리 없다면, 액적(126)은 원하지 않게 확산과 증발을 통해 건조된다. 이는 건조 효과 때문에, 매우 불균일한 입자 분포를 초래한다. 원하지 않는 증발은, 나머지 액적 내의 증가된 염 농도 때문에 잠재적으로 입자 파괴와 결정 형성을 야기하는 삼투압 효과를 발생할 수도 있다는 것이 놀랍게 발견되었다. 또한, 이는, 깨진 입자, 그리고 염 침전물에 의해 가려진 입자에 의해 야기되는 입자 검출과 열거를 모호하게 한다. 본 발명에서, 샘플 액적(126)을 밀봉된 필터 멤브레인(116) 상에 도포할 때, 샘플 액적(126) 내의 액체(144)는 밀봉제(140)를 천천히 용해시켜서, 액적(126) 아래에 배치된 구멍(138e-138h)을 개방시킨다. 결과적으로, 액체(144)는 진공에 의해, 필터 멤브레인(116)의 구멍(138e-138h)을 통해 빠르게 빠져나와서, 필터 멤브레인(!16)의 상면에 입자(142)의 우수한 샘플 분포를 초래한다.
7. 샘플 액적(126)을 필터 멤브레인(116) 상에 도포하기 이전에, 진공 장치(102)가 활성화되고, 진공 챔버(104) 내의 압력이 낮아져서, 필터 멤브레인(116) 상에 흡입력을 생성한다. 진공 챔버(104) 내의 진공은 액적(126)의 액체(144)가 필터 멤브레인(116) 상에서 균일하게 흡수되도록 보장한다. 밀봉제와 진공의 사용의 조합은 필터 멤브레인(116) 상의 풋프린트(136)에 걸쳐 입자(142)의 균일한 분포를 초래한다.
8. 샘플 액적(126)의 적절한 부피(전통적으로 5 ㎕)가 다공성이고 밀봉된 필터 멤브레인(116) 상에 도포된다. 상기에 나타난 바와 같이, 입자(142)의 지름이 필터 멤브레인(116)의 구멍(138)의 지름보다 크고, 액적(126)이 필터 장착부의 모서리와 접촉하지 않는 것이 중요하다. 5 ㎕보다 더 많은 부피는, 주입 시스템의 사용에 의해, 복수의 방울(drop)이나 더 큰 부피가 필터 멤브레인(116) 상의 동일한 위치에 도포되는 곳에 도포될 수 있다. 일반적으로, 더 큰 부피의 사용은 샘플링 오차를 최소로하고, 더 적은 농도의 샘플의 분석을 가능하게 한다.
9. 샘플 액적(126)은 진공 챔버(104)에 의해 제공된 진공 압력하에서, 전형적으로 60초 동안 필터 멤브레인(116) 상에서 흡수된다. 정확한 압력값은 구멍 크기, 샘플 타입, 부피, 순도 및 점도에 부분적으로 의존하여 조절될 수 있다.
10. 흡수한 이후에, 필터 멤브레인(116)은 (전형적으로, 접착 및 전도성 탄소 테이프(122)를 사용하여) SEM 알루미나 스터브(120) 상에 장착된 필터 조립체(112)로부터 분리될 수 있다.
11. 그리고 나서, 결합된 입자(142)가 위치된 필터 멤브레인(116)은 전통적으로 1x10-5 mbar인 적절한 챔버 압력에서 탄소 증발기를 사용하여, 가령 탄소의 박막(전통적으로 20 nm 두께)에 의해 코팅된 스퍼터일 수 있다. 스퍼터 코팅은 필터 멤브레인(116)의 전도성을 개선시키고, 필터 멤브레인(116)의 신호 대 노이즈 비율을 증가시켜서, 전자 빔 손상과 전하 효과를 감소시킨다. 이러한 기술은, SEM을 사용하여 필터 재료를 이미지화하기 위해 종종 필수적으로 사용된다. 탄소 코팅물을 사용하는 것이 새로울 수 있으나, 이는 금속 스퍼터링의 더 큰 그레인 크기에 비해 더 높은 분해능의 SEM 이미징을 제공한다.
12. 필터 멤브레인(116)은 SEM으로 이송되어서, 산란된 1차 전자(인-렌즈 검출기(in-lens detector)를 사용하여) 또는 2차 전자(SE2 검출기를 사용하는 것과 같이)로부터의 신호는, 전체 풋프린트를 커버하기 위해 낮은 배율, 그리고 열거를 위해 높은 배율(전통적으로 10000 내지 30000)에서 기록된다. 서로 다른 2차 전자 시그니쳐를 가진 기준 표준이 사용된다면(비록 입자 농도를 결정하는데 필수적이지 않더라도), 관심 있는 입자는, 서로 다른 검출기(가령, 인-렌즈 및 SE2 검출기와 같은)로부터의 세기 정보를 결합함에 의해 기준 입자와 구별될 수 있다.
13. 저배율 이미지(136)(도 4b 참조)는 액적의 풋프린트의 크기와 전반적인 표본 분포를 정의하는데 사용되는 반면, 고배율은 입자 열거를 결정하는데 사용된다.
14. 이미지(134)와 같은 고배율 이미지는, 액적의 풋프린트에 걸친 입자 분포에서의 차이의 어떤 효과를 최소화하기 위해, 액적의 모서리(137)에서 시작하여, 중심(139)을 통하여 반대편 모서리까지의 샘플 풋프린트에 걸쳐서 얻게된다.
15. 이미지(136)와 같은 저배율 이미지로부터, 샘플 풋프린트의 면적(Atotal)이 풋프린트의 모서리를 추적함에 의해 계산된다. 둘러싸인 픽셀이 카운트되고, 카운트된 수는 픽셀 크기와 곱해진다.
16. 고배율 이미지로부터, 입자(142)가 검출되고 카운트 된다. 이러한 절차는 Vironova의 소유의 소프트웨어 분석기나 임의의 적절한 이미지 분석 소프트웨어와 같은 적절한 소프트웨어를 사용함에 의한, 수동 마킹이나 자동 마킹을 통해 수행될 수 있다. 단위 면적당 입자의 평균 수(n/AFOV)는 이미지 데이터세트로부터 계산된다.
17.입자 샘플 내의 mL 당 입자의 수는, 바람직하게는, 다음 공식을 사용하여 계산된다.
여기서, C는 입자의 농도이고, df는 희석 인자이며, V는 샘플의 도포된 부피이다. 입자 분포가 입자 샘플의 주변부로부터 샘플이 입자의 중심을 향하여 스캐닝되어, 가변할 수 있다는 것을 고려한 공식을 사용할 수 있다.
요약하면, 본 발명의 입자 정량적 전자 주사 현미경법(pqSEM) 기술은 고정밀 직접 입자 검출과 열거 기술이다. 본 발명의 중요한 특징은, 많은 기존의 종래 기술이 행하는 프로브와 표본 간의 친화도에 의존하지 않는 직접적인 검출이라는 것이다. 희석 인자, 도포된 부피, 액적의 풋프린트와 같은 모든 파라미터는 제어될 수 있고, 근사치와 가정치로부터의 오차를 최소로하면서, 단위 면적당 입자의 수가 직접 측정될 수 있다. 게다가, pqSEM의 분해능은 클러스터 내의 개개의 서브-비져블 입자의 검출도 허여하고, 서로 다른 크기의 입자의 두 개체수나 다른 형태학적 특징도 동일한 샘플로부터 열거될 수 있다. 본 발명의 pqSEM 기술에 의해 생성된 높은-명암의 이미지로부터의 입자 및 풋프린트는 자동화된 이미지 분석을 사용함에 의해 용이하게 검출될 수 있다. 이는 대량 데이터세트를 용이하게 수집하고, 강건한 통계적 결과를 생성하기 위한 수단을 제공한다.
본 발명이 바람직한 구성과 실시예에 따라 기술되었지만, 어떤 치환예와 대안예가 이하의 청구항의 사상과 범위에서 벗어나지 않고 이루어질 수 있다는 것이 이해되어야 한다.
Claims (9)
- 복수의 구멍(138)이 형성된 필터 멤브레인(116)을 제공하는 단계 - 필터 멤브레인(116)은 진공 챔버(104)와 작동 연결됨 - 와,
밀봉제(140)로 구멍을 밀봉하는 단계와,
샘플 액적이 필터 멤브레인(116)의 임의의 외부 모서리에 접촉하지 않도록 하면서, 필터 멤브레인(116) 상에 액체(144)와 서브-비져블 입자(142)를 포함하는 샘플 액적(126)을 도포하는 단계와,
액체(144)에 의해, 샘플 액적(126) 아래에 배치된 구멍(138e-138h) 내의 밀봉제(140)를 용해시키는 단계와,
밀봉제(140)가 용해된 구멍을 통해 액체(144)가 흐르고, 서브-비져블 입자(142)가 필터 멤브레인(116)의 상단에 남도록 하는 단계와,
서브-비져블 입자(142)가 전자 현미경으로 열거되는 단계를 포함하는, 서브-비져블 입자의 정량화를 위한 방법. - 제 1 항에 있어서, 필터 멤브레인(116)을 포함하는 필터 조립체(112)를 SEM 지지부(120) 상에 사전-장착하는 단계를 더 포함하는, 서브-비져블 입자의 정량화를 위한 방법.
- 제 2 항에 있어서, SEM 지지부(120) 상에 장착 테이프(122)를 위치시키는 단계를 더 포함하는, 서브-비져블 입자의 정량화를 위한 방법.
- 제 1 항에 있어서,
샘플 액적(126)을 필터 멤브레인(116) 상에 증착하는 단계 이전에,
기다란 채널(128)이 형성된 SEM 지지부(120)를 준비하고, 샘플 액적(126)을 포함하는 주입기(118)를 사용하여 주입기(118)를 기다란 채널(128)의 상단에 정렬하는 단계를 더 포함하는, 서브-비져블 입자의 정량화를 위한 방법. - 제 2 항에 있어서, SEM 지지부(120)를 진공 소스(102)와 연결된 진공 챔버(104)에 연결시켜서, 필터 멤브레인(116)이 기다란 채널(128)을 통해 흡입력의 대상이되도록 하는 단계를 더 포함하는, 서브-비져블 입자의 정량화를 위한 방법.
- 제 1 항에 있어서, 인접한 구멍(138a-138d, 138i-138j)은 밀봉제(140)로 밀봉된 채로 남겨지는 반면, 샘플 액적(126) 바로 아래에 배치된 구멍(138e-138h) 내의 밀봉제(140)만 액체(144)가 용해시키는 단계를 더 포함하는, 서브-비져블 입자의 정량화를 위한 방법.
- 제 1 항에 있어서, 서브-비져블 입자(142)가 필터 멤브레인(116) 상의 풋프린트(136)를 형성하고, 풋프린트(136)의 외부 주변부(137)로부터 풋프린트(136)의 중심(139)을 향해 서브-입자(142)를 스캐닝하는 단계를 더 포함하는, 서브-비져블 입자의 정량화를 위한 방법.
- 제 1 항에 있어서, 샘플 액적(126) 바로 아래에 위치된 구멍 내의 밀봉제(140)를 용해시키기 위해, 액체(144)의 희석제를 사용하는 단계를 더 포함하는, 서브-비져블 입자의 정량화를 위한 방법.
- 제 1 항에 있어서, 밀봉제(140)로서 글라이신을 사용하는 단계를 더 포함하는, 서브-비져블 입자의 정량화를 위한 방법.
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