EA035524B1 - Высокоточное определение количества неразличимых невооруженным глазом частиц - Google Patents
Высокоточное определение количества неразличимых невооруженным глазом частиц Download PDFInfo
- Publication number
- EA035524B1 EA035524B1 EA201792107A EA201792107A EA035524B1 EA 035524 B1 EA035524 B1 EA 035524B1 EA 201792107 A EA201792107 A EA 201792107A EA 201792107 A EA201792107 A EA 201792107A EA 035524 B1 EA035524 B1 EA 035524B1
- Authority
- EA
- Eurasian Patent Office
- Prior art keywords
- filter membrane
- particles
- sample
- pores
- liquid
- Prior art date
Links
- 239000012906 subvisible particle Substances 0.000 title abstract 4
- 238000011002 quantification Methods 0.000 title abstract 2
- 239000002245 particle Substances 0.000 claims abstract description 103
- 239000012528 membrane Substances 0.000 claims abstract description 93
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 43
- 239000011148 porous material Substances 0.000 claims abstract description 43
- 239000007788 liquid Substances 0.000 claims abstract description 42
- 238000001493 electron microscopy Methods 0.000 claims abstract description 3
- 239000003566 sealing material Substances 0.000 claims description 36
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 claims description 3
- 238000007789 sealing Methods 0.000 claims description 3
- 230000003993 interaction Effects 0.000 claims description 2
- 239000000565 sealant Substances 0.000 abstract description 5
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 60
- 238000004626 scanning electron microscopy Methods 0.000 description 20
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 15
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 description 8
- 239000002105 nanoparticle Substances 0.000 description 8
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 7
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 6
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 5
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 5
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 5
- 230000008569 process Effects 0.000 description 5
- 238000001878 scanning electron micrograph Methods 0.000 description 5
- 239000004695 Polyether sulfone Substances 0.000 description 4
- 239000004793 Polystyrene Substances 0.000 description 4
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 4
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 4
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 4
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 4
- 230000002458 infectious effect Effects 0.000 description 4
- 238000009434 installation Methods 0.000 description 4
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 4
- 229920006393 polyether sulfone Polymers 0.000 description 4
- 229920002223 polystyrene Polymers 0.000 description 4
- WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N Formaldehyde Chemical compound O=C WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- PNEYBMLMFCGWSK-UHFFFAOYSA-N aluminium oxide Inorganic materials [O-2].[O-2].[O-2].[Al+3].[Al+3] PNEYBMLMFCGWSK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 3
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 3
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 3
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 3
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 3
- 239000011859 microparticle Substances 0.000 description 3
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 3
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 2
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 2
- 238000004220 aggregation Methods 0.000 description 2
- 230000002776 aggregation Effects 0.000 description 2
- 239000012491 analyte Substances 0.000 description 2
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 2
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 2
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 description 2
- 238000000576 coating method Methods 0.000 description 2
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 2
- 238000001704 evaporation Methods 0.000 description 2
- 230000008020 evaporation Effects 0.000 description 2
- 238000001415 gene therapy Methods 0.000 description 2
- 238000010191 image analysis Methods 0.000 description 2
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 2
- 239000004033 plastic Substances 0.000 description 2
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 2
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 2
- 238000005070 sampling Methods 0.000 description 2
- 239000003381 stabilizer Substances 0.000 description 2
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 2
- 239000012905 visible particle Substances 0.000 description 2
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- HDTRYLNUVZCQOY-UHFFFAOYSA-N α-D-glucopyranosyl-α-D-glucopyranoside Natural products OC1C(O)C(O)C(CO)OC1OC1C(O)C(O)C(O)C(CO)O1 HDTRYLNUVZCQOY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic acid Chemical compound OCC[NH+]1CCN(CCS([O-])(=O)=O)CC1 JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- SXRSQZLOMIGNAQ-UHFFFAOYSA-N Glutaraldehyde Chemical compound O=CCCCC=O SXRSQZLOMIGNAQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000007995 HEPES buffer Substances 0.000 description 1
- HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N L-histidine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- HDTRYLNUVZCQOY-WSWWMNSNSA-N Trehalose Natural products O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O1 HDTRYLNUVZCQOY-WSWWMNSNSA-N 0.000 description 1
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 1
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 1
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 1
- 239000000853 adhesive Substances 0.000 description 1
- 230000001070 adhesive effect Effects 0.000 description 1
- HDTRYLNUVZCQOY-LIZSDCNHSA-N alpha,alpha-trehalose Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 HDTRYLNUVZCQOY-LIZSDCNHSA-N 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- 238000000149 argon plasma sintering Methods 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 1
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 238000004891 communication Methods 0.000 description 1
- 239000012141 concentrate Substances 0.000 description 1
- 239000000356 contaminant Substances 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- 239000013078 crystal Substances 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 238000009792 diffusion process Methods 0.000 description 1
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 1
- 238000005553 drilling Methods 0.000 description 1
- 238000009513 drug distribution Methods 0.000 description 1
- 238000001035 drying Methods 0.000 description 1
- 238000010894 electron beam technology Methods 0.000 description 1
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 1
- 238000000684 flow cytometry Methods 0.000 description 1
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 1
- 235000011187 glycerol Nutrition 0.000 description 1
- 239000008187 granular material Substances 0.000 description 1
- HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N histidine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000003703 image analysis method Methods 0.000 description 1
- 238000003384 imaging method Methods 0.000 description 1
- 238000007373 indentation Methods 0.000 description 1
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 1
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 1
- 239000012469 less concentrated sample Substances 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 239000002184 metal Substances 0.000 description 1
- 238000000386 microscopy Methods 0.000 description 1
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 1
- 230000000877 morphologic effect Effects 0.000 description 1
- 230000003204 osmotic effect Effects 0.000 description 1
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 1
- 239000004417 polycarbonate Substances 0.000 description 1
- 229920000515 polycarbonate Polymers 0.000 description 1
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 1
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 1
- 238000013207 serial dilution Methods 0.000 description 1
- 239000007921 spray Substances 0.000 description 1
- 238000005507 spraying Methods 0.000 description 1
- 230000000087 stabilizing effect Effects 0.000 description 1
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 1
- 239000010409 thin film Substances 0.000 description 1
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 1
- 239000013603 viral vector Substances 0.000 description 1
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 1
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N15/00—Investigating characteristics of particles; Investigating permeability, pore-volume or surface-area of porous materials
- G01N15/10—Investigating individual particles
- G01N15/14—Optical investigation techniques, e.g. flow cytometry
- G01N15/1468—Optical investigation techniques, e.g. flow cytometry with spatial resolution of the texture or inner structure of the particle
-
- B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
- B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
- B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
- B01L3/00—Containers or dishes for laboratory use, e.g. laboratory glassware; Droppers
- B01L3/50—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes
- B01L3/502—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes with fluid transport, e.g. in multi-compartment structures
- B01L3/5021—Test tubes specially adapted for centrifugation purposes
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N1/00—Sampling; Preparing specimens for investigation
- G01N1/28—Preparing specimens for investigation including physical details of (bio-)chemical methods covered elsewhere, e.g. G01N33/50, C12Q
- G01N1/40—Concentrating samples
- G01N1/4077—Concentrating samples by other techniques involving separation of suspended solids
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N15/00—Investigating characteristics of particles; Investigating permeability, pore-volume or surface-area of porous materials
- G01N15/06—Investigating concentration of particle suspensions
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N15/00—Investigating characteristics of particles; Investigating permeability, pore-volume or surface-area of porous materials
- G01N15/06—Investigating concentration of particle suspensions
- G01N15/0606—Investigating concentration of particle suspensions by collecting particles on a support
- G01N15/0618—Investigating concentration of particle suspensions by collecting particles on a support of the filter type
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N15/00—Investigating characteristics of particles; Investigating permeability, pore-volume or surface-area of porous materials
- G01N15/10—Investigating individual particles
- G01N15/14—Optical investigation techniques, e.g. flow cytometry
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N15/00—Investigating characteristics of particles; Investigating permeability, pore-volume or surface-area of porous materials
- G01N15/06—Investigating concentration of particle suspensions
- G01N15/0606—Investigating concentration of particle suspensions by collecting particles on a support
- G01N15/0618—Investigating concentration of particle suspensions by collecting particles on a support of the filter type
- G01N15/0625—Optical scan of the deposits
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N1/00—Sampling; Preparing specimens for investigation
- G01N1/28—Preparing specimens for investigation including physical details of (bio-)chemical methods covered elsewhere, e.g. G01N33/50, C12Q
- G01N1/40—Concentrating samples
- G01N1/4077—Concentrating samples by other techniques involving separation of suspended solids
- G01N2001/4088—Concentrating samples by other techniques involving separation of suspended solids filtration
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N15/00—Investigating characteristics of particles; Investigating permeability, pore-volume or surface-area of porous materials
- G01N2015/0038—Investigating nanoparticles
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N15/00—Investigating characteristics of particles; Investigating permeability, pore-volume or surface-area of porous materials
- G01N15/10—Investigating individual particles
- G01N15/14—Optical investigation techniques, e.g. flow cytometry
- G01N2015/1486—Counting the particles
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Immunology (AREA)
- Pathology (AREA)
- Dispersion Chemistry (AREA)
- Hematology (AREA)
- Clinical Laboratory Science (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Sampling And Sample Adjustment (AREA)
- Analysing Materials By The Use Of Radiation (AREA)
- Separation Using Semi-Permeable Membranes (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Physical Or Chemical Processes And Apparatus (AREA)
Abstract
Данный способ предназначен для количественной оценки неразличимых невооруженным глазом частиц. Предложена фильтрующая мембрана (116), имеющая множество пор (138), определенных в ней. Фильтрующая мембрана (116) находится в функциональном взаимодействии с вакуумной камерой (104). Поры загерметизированы герметизирующим материалом (140). Каплю образца (126), содержащего жидкость (144) и неразличимые невооруженным глазом частицы (142), наносят на фильтрующую мембрану (116). Жидкость (144) растворяет герметизирующий материал (140) в порах (138e-138h), расположенных непосредственно под каплей образца (126). Жидкость (144) течет сквозь поры (140), в которых герметизирующий материал был растворен, а неразличимые невооруженным глазом частицы (142) остаются на верху фильтрующей мембраны (116). Частицы (142) подсчитывают посредством электронной микроскопии.
Description
Область техники
Настоящее изобретение относится к способу высокоточного определения количества неразличимых невооруженным глазом частиц, например микрочастиц и/или наночастиц, с помощью микроскопии, например сканирующей электронной микроскопии (SEM).
Уровень техники и сущность изобретения
Точный подсчет количества неразличимых невооруженным глазом частиц, например вирусных частиц, вирусоподобных частиц, неорганических и полимерных гранул и других наночастиц и микрочастиц в жидких образцах, имеет важное значение во множестве процессов. Например, модифицированные вирусные векторы обычно используются в генно-терапевтических применениях. Количество активных векторов на мл (инфекционный титр образца вируса) можно определять с помощью стандартных оценок инфицированности. Однако с помощью имеющихся в настоящее время способов невозможно точно определить общее количество частиц в образце, включая неинфекционные частицы. Отношение инфекционных к неинфекционным частицам предоставляет ценную информацию о качестве и эффективности конечного генно-терапевтического продукта и предшествующих процессов разработки.
Одним из основных ограничений доступных в настоящее время способов, например количественной проточной цитометрии (QFCM), является то, что интересующие наночастицы обнаруживаются не напрямую. Вместо этого количественно оценивают число связанных зондов к популяции наночастиц. Поскольку число зондов, связывающихся с одной наночастицей, меняется, точность обычных непрямых способов обычно является низкой и зависит от сродства между образцом и зондом. Способ, в котором интересуемые наночастицы могут быть обнаружены непосредственно, должен преодолеть это ограничение. Кроме того, если бы указанный способ позволял визуализировать частицы с достаточным разрешением, можно было бы идентифицировать и, таким образом непосредственно подсчитать отдельные частицы на основании их размера и морфологии. Даже частицы внутри кластеров могут быть подсчитаны и оценены. Это невозможно с помощью доступных в настоящее время способов на основе сродства или светорассеяния.
Новый высокоточный прямой способ для частиц согласно настоящему изобретению можно применять для подсчета неорганических и органических неразличимых невооруженным глазом частиц, например наночастиц, в жидких образцах. Одной важной особенностью является то, что образцы наносят на четко определенный и измеримый отпечаток. Еще одной важной особенностью является то, что образцы распределены более равномерно, чем это было возможно ранее, что снижает необходимость пробоотбора и теперь можно проводить анализ с таким разрешением, при котором отдельные частицы могут быть легко идентифицированы. Неразличимые невооруженным глазом частицы непосредственно обнаруживают без необходимости использования сигнальных зондов и их можно визуализировать на обычных двумерных изображениях. Способ определения количества частиц SEM (pqSEM) согласно настоящему изобретению предпочтительно основан на фильтрации в условиях низкого вакуума, сканирующей электронной микроскопии (SEM) или других методиках электронной микроскопии и анализа изображений. Настоящее изобретение можно использовать с или без внутренними стандартами, примером которых являются, охарактеризованные Национальным институтом стандартов и технологий (NIST), характеризующий полистироловые гранулы.
Настоящее изобретение обеспечивает решение для вышеописанных проблем. Конкретнее, данный способ предназначен для определения количества неразличимых невооруженным глазом частиц. Обеспечена фильтрующая мембрана, имеющая множество пор, определенных в ней. Фильтрующая мембрана находится в функциональном взаимодействии с вакуумной камерой. Поры загерметизированы герметизирующим материалом. Каплю образца, содержащего жидкость с неразличимыми невооруженным глазом частицами, наносят на фильтрующую мембрану. Жидкость растворяет герметизирующий материал в порах, расположенных непосредственно под каплей образца. Жидкость течет сквозь поры, в которых герметизирующий материал был растворен, а неразличимые невооруженным глазом частицы остаются на верху фильтрующей мембраны. Фильтрующую мембрану с частицами, расположенными на ней, переносят под электронный микроскоп и подсчитывают на изображениях, полученных на микроскопе.
Данный способ также включает этап предварительной установки узла фильтра, содержащего фильтрующую мембрану, на опору SEM.
Данный способ также включает этап размещения монтажной ленты на опоре SEM.
Данный способ также включает этап обеспечения опоры SEM, содержащей удлиненный канал, определенный в ней, использования инжектора, содержащего каплю образца, и выравнивания инжектора на верху удлиненного канала до нанесения капли образца на фильтрующую мембрану.
Данный способ также включает этап присоединения опоры SEM к вакуумной камере, подключенной к источнику вакуума, и подвергания фильтрующей мембраны воздействию всасывающей силы через удлиненный канал.
Данный способ также включает этап размещения капли образца на фильтрующей мембране без касания каплей образца любого внешнего края фильтрующей мембраны.
Данный способ также включает этап растворения жидкостью герметизирующего материала только в порах, находящихся непосредственно под каплей образца, в то время как соседние поры по сторонам от
- 1 035524 капли остаются загерметизированными, поскольку жидкость не контактировала с герметизирующим материалом, расположенным в этих порах.
Данный способ также включает этап образования неразличимыми невооруженным глазом частицами определенного и измеримого отпечатка на фильтрующей мембране и получения серии изображений частиц от внешней периферии отпечатка к центру отпечатка.
Данный способ также включает этап подсчета частиц на электронно-микроскопических изображениях, полученных с разрешением, при котором частицы отчетливо видны, вручную или автоматически с использованием способов анализа изображения.
Данный способ также включает этап оценки общей площади отпечатка на фильтрующей мембране на микроскопических изображениях, охватывающих весь отпечаток (одном изображении с малым увеличением, охватывающем весь отпечаток, или нескольких частичных изображениях отпечатка с более высоким увеличением, соединенных друг с другом).
Данный способ также включает этап вычисления общего количества частиц в образце на основе площади всего отпечатка и количества частиц на единицу площади, полученных из изображения с достаточно высоким разрешением, позволяющим отчетливо видеть одиночные частицы.
Данный способ также включает этап возможной компенсации неравномерного радиального распределения частиц на отпечатке, информацию о котором получают путем получения серии изображений от периферии отпечатка через центр отпечатка при достаточно большом увеличении, позволяющем отчетливо видеть отдельные частицы.
Данный способ также включает этап вычисления концентрации частиц в растворе, используя оценку общего количества частиц на отпечатке, нанесенного объема и разбавления жидкого образца.
Данный способ также включает этап использования разбавителя жидкости для растворения герметизирующего материала в порах, расположенных непосредственно под каплей образца. Препарат должен быть в жидкой форме, а разбавитель должен быть совместим с разбавителем и обладать свойством эффективного растворения используемого герметизирующего материала.
Данный способ также включает этап использования глицина в качестве герметизирующего материала. Другие герметизирующие материалы, которые можно использовать, включают герметизирующие материалы на основе трегалозы/сахарозы, но не ограничиваются ими.
Краткое описание чертежей
Фиг. 1 представляет собой схематический вид вакуумного устройства согласно настоящему изобретению сбоку в вертикальной проекции.
Фиг. 2 представляет собой схематический вид узла фильтра сбоку в разрезе.
Фиг. 3А представляет собой необработанное SEM-изображение полистироловых гранул, прилипших к полиэфирсульфоновому фильтру, с большим увеличением.
Фиг. 3В представляет собой SEM-изображение обнаруженных и подсчитанных полистироловых гранул, прилипших к полиэфирсульфоновому фильтру, с большим увеличением.
Фиг. 3С представляет собой увеличенное SEM-изображение, приведенное выше на фиг. 3В.
Фиг. 4А представляет собой схематический вид изображения края отпечатка капли, полученного с помощью SEM (первичные электроны) с большим увеличением.
Фиг. 4В представляет собой схематический вид изображения края отпечатка капли, полученного с помощью SEM (первичные электроны) с малым увеличением.
Фиг. 5А представляет собой схематический вид сбоку в разрезе мембраны согласно настоящему изобретению с открытыми порами.
Фиг. 5В представляет собой схематический вид сбоку в разрезе мембраны согласно настоящему изобретению, показанной на фиг. 5А, но с загерметизированными порами.
Фиг. 5С представляет собой схематический вид сбоку в разрезе мембраны согласно настоящему изобретению, показанной на фиг. 5В, с нанесенной на нее каплей образца.
Фиг. 5D представляет собой схематический вид сбоку в разрезе мембраны, показанной на фиг. 5С, с каплей, абсорбированной в мембрану согласно настоящему изобретению; и
Фиг. 6 представляет собой увеличенное изображение фиг. 5D.
Подробное описание
Способ согласно настоящему изобретению описан со ссылками на фиг. 1-6.
Фиг. 1 представляет собой схематический вид спереди вакуумного узла 100, содержащего вакуумное устройство 102, подсоединенное к вакуумной камере 104 посредством трубопровода 106, расположенного между ними. Трубопровод 106 предпочтительно содержит подходящий клапан, например клапан Люэра 108. Вакуумный манометр 110 находится в функциональном взаимодействии с вакуумной камерой 104 для измерения давления вакуума в ней. Узел фильтра 112 смонтирован посредством монтажного элемента узла фильтра 114 на верху вакуумной камеры 104. Фильтрующая мембрана 116 расположена на узле фильтра 112. Инжектор 118 расположен над фильтрующей мембраной 116.
Фиг. 2 представляет собой схематический вид узла фильтра 112 в разрезе. Весь процесс анализа согласно настоящему изобретению можно упростить путем предварительной установки фильтрующей мембраны 116 на опору SEM (подложку (stub) из оксида алюминия) 120 вместо осуществления этого
- 2 035524 вручную, когда фильтрующая мембрана 116 содержит образец/препарат для анализа и подсчета. Установку можно выполнить путем простого сверления отверстия в подложке для SEM 120. Использование такого устройства минимизирует риск потери препарата или повреждения фильтрующей мембраны 116 во время предыдущей установки, при которой с фильтрующей мембраной 116, содержащей препарат, обращаются вручную во время установки на подложку для SEM 120. Подробности о подготовке фильтрующей мембраны 116 обсуждается ниже. Такие аналитические расходные устройства для pqSEM относительно недороги в производстве.
Более конкретно, узел фильтра 112 предпочтительно содержит модифицированную подложку для SEM 120 из оксида алюминия, на которой размещена двусторонняя углеродная монтажная лента 122.
Фильтрующая мембрана 116 с герметизированными порами размещена поверх углеродной монтажной ленты 122. Процесс герметизации фильтрующей мембраны 116 подробно описан ниже, в частности, со ссылкой на фиг. 5-6. Инжектор 118, содержащий анализируемый препарат или образец 124, размещен или спозиционирован над фильтрующей мембраной 116 и используются для нанесения капли образца 126 на фильтрующую мембрану 116. Поскольку подложка 120 герметично присоединена к монтажному элементу узла фильтра 114, который, в свою очередь, смонтирован на вакуумной камере 104, внутри подложки 120 имеет место вакуум, так что вакуум оказывает всасывающую силу на фильтрующую мембрану 116 снизу узла фильтра 112. Это обеспечивается тем, что удлиненная полость или канал 128, определенный внутри подложки 120, находится в сообщении по текучей среде с фильтрующей мембраной 116 и вакуумной камерой 104. Как описано ниже, важно, чтобы инжектор 118 был правильно расположен над фильтрующей мембраной 116, так чтобы, когда капля образца 126 нанесена на фильтрующую мембрану 116, капля образца 126 не соприкасалась с краями фильтрующей мембраны 116 и располагалась непосредственно над расширенной частью полости 129, определенной между каналом 128 и нижней стороной монтажной ленты 122. Каплю 126 предпочтительно помещают на центр или вблизи от центра части полости 129, который совмещен с продольной осью (L), проходящей через канал 128.
Фиг. 3А-3С представляют собой SEM-изображения с большим увеличением полистироловых гранул, прилипших к полиэфирсульфоновому фильтру. Фиг. 3А представляет собой необработанное изображение 130, а фиг. 3В представляет собой изображение 132 после обнаружения и подсчета. Фиг. 3С представляет собой вид крупным планом 133 изображения из фиг. 3В и участка 131 на фиг. 3А. На этих типичных изображениях обнаружено 77 частиц в поле зрения размером 131,47 мкм2. Это соответствует приблизительно 0,59 частиц на мкм2. Вид 133 показывает пронумерованные частицы 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 28, 29, 30.
На фиг. 4А, 4В показан край отпечатка капли, изображение которого получено с помощью SEM (первичные электроны). На фиг. 4А показано изображение 134 при большом увеличении, а на фиг. 4В показано изображение отпечатка 136 при малом увеличении. Местоположение изображения 134 с большим увеличением, показанного на фиг. 4А, отмечено белой стрелкой на фиг. 4В, т.е. на изображении 134 показана часть всего изображения отпечатка 136. Край капли четко определен пренебрежимо малым количеством частиц вне отпечатка. При малом увеличении весь отпечаток 136 капли визуализирован, и можно точно измерить площадь отпечатка. В данном примере измеренная площадь отпечатка (Atota) составила 8,436 мм2.
Фиг. 5A-5D представляют собой виды фильтрующей мембраны 116 в разрезе сбоку и описывают процесс герметизации фильтрующей мембраны 116 и последующего растворения герметизирующего материала. На фиг. 5А фильтрующая мембрана 116 содержит открытые поры 138, определенные между удлиненными элементами решетки 139 фильтрующей мембраны 116 и проходящие через фильтрующую мембрану 116. На фиг. 5В поры 138 заполнены герметизирующим материалом 140. На фиг. 5С каплю 126 образца 124, который является жидкостью 144, содержащей анализируемые частицы 142, нанесена на фильтрующую мембрану 116. Капля 126 предпочтительно нанесена на фильтрующую мембрану 116 с помощью инжектора 118, описанного выше. При контакте капли 126 с герметизирующим материалом 140 жидкость 144 растворяет герметизирующий материал 140, располагающийся непосредственно под каплей 126 так, что жидкость 144 абсорбируется и проходит сквозь поры 138 только под каплей 126. Поскольку размер подсчитываемых частиц 142 имеет размер, больший, чем поры 138 мембраны, частицы 142 оседают на верху фильтрующей мембраны 116, в то время как жидкость и любые загрязнители 144 меньшего размера абсорбируются или втекают в поры 138 под каплей 126 по мере растворения герметизирующего материала 140 в указанных порах и подвергания жидкости 144 всасыванию со стороны удлиненной камеры 128 вакуумной камеры 104 под фильтрующей мембраной 116.
Фиг. 6 представляет собой увеличенный вид фильтрующей мембраны 116 с фиг. 5D. Неразличимые невооруженным глазом частицы 142 остаются на фильтрующей мембране 116; размер частиц 142 превышает размер пор 138a-138j, поэтому они не проходят сквозь поры, даже если поры открыты и подвержены всасыванию из вакуумной камеры 104 (показано на фиг. 1). Поры 138a-d и 138i-j по-прежнему заполнены герметизирующим материалом 140, так как они не были растворены жидкостью 144, поскольку они не контактировали с жидкостью 144 капли образца 126 (см. фиг. 5С). Более конкретно, разбавитель, например, подходящий буфер, в жидкости 144, растворяет герметизирующий материал 140. Как указывалось выше, разбавитель должен быть совместим с препаратом, т.е. оказывать минимальное влияние на
- 3 035524 морфологию и состояние агрегации препарата. Разбавитель также должен быть способен растворять герметизирующий материал. Это позволяет гарантировать, что вакуум поддерживается только в области отпечатка, и что таким образом установка не теряет вакуум за счет открытия пор вне интересуемой области. По мере растворения жидкостью 144 герметизирующего материала 140, расположенного в порах 138e-138h, жидкость 144 заполняет поры 138e-138h, замещая герметизирующий материал 140. Это облегчает подсчет частиц 142, поскольку частицы 142 лежат на верху сегмента фильтра 116 и равномерно распределены по фильтрующей мембране 116.
Пример.
Ниже приведен пояснительный пример способа подготовки фильтрующей мембраны 116 согласно настоящему изобретению.
1. Образец, содержащий неразличимые невооруженным глазом частицы 142, например микрочастицы и/или наночастицы, получен с целью подсчета путем последовательного разбавления образца подходящим разбавителем (обычно водой, физиологическим раствором с фосфатным буфером, HEPESбуфером, трис-буфером или гистидиновым буфером) в зависимости от буферных условий в каждом конкретном образце.
2. Для стабилизации и сохранения структуры частиц, а в некоторых образцах - для предотвращения нежелательной агрегации частиц 142, в разбавленный раствор образца 124, также содержащий неразличимые невооруженным глазом частицы 142, могут быть введены фиксирующий реагент (обычно глутаральдегид или формальдегид) и/или стабилизирующий агент (обычно сахароза или глицерин). Фиксирующие/стабилизирующие реагенты и разбавитель соответствуют жидкости 144 и вместе с частицами 142 образуют образец/препарат 124 и каплю образца 126. Фиксирующие/стабилизирующие агенты используют для предотвращения разрушения или повреждения частиц 142 при манипулировании и от нежелательного слипания друг с другом, что затрудняет последующий подсчет частиц 142.
3. Узел фильтра 112, состоящий из пористой фильтрующей мембраны 116 (обычно изготовленной из полиэфирсульфона или поликарбоната) с порами 138, имеющими определенный размер (обычно от 0 до 15 нм) и открывающейся кассеты фильтра, изготовленной из пластика или эквивалентного материала, используется для отделения частиц 142 от жидкости. Подходящий узел фильтра 112 лучше всего показан на фиг. 2. В общем случае фильтры покупают общей массой как одноразовые фильтры, и поэтому должны быть установлены на что-то. Некоторые поставщики также продают держатели фильтра, и эти устройства исходно выполнены для присоединения к шприцу и продавливания жидкости и, таким образом, не всасывают жидкость с использованием вакуума. Поэтому необходимо установить фильтр в узел фильтра, чтобы гарантировать сохранность вакуума. После некоторых экспериментов неожиданно выяснилось, что фильтр можно установить непосредственно на опору SEM, что экономит время и позволяет избежать критических этапов ручного манипулирования фильтрами, содержащими образец. Понятно, что такой узел может быть недорог при изготовлении и продаваться в качестве расходного материала для SEM.
4. Узел фильтра 112 установлен на верху пластиковой вакуумной камеры 104, которая в свою очередь присоединена к вакуумному устройству 102 через трубопровод 106.
5. Вакуум в вакуумной камере 104 контролируется с помощью трехходового клапана Люэра 108 и отслеживается с использованием вакуумного манометра 110. Также можно ввести автоматическую систему с использованием магнитных клапанов, управляемых электронной системой мониторинга.
6. Поры 138 в фильтрующей мембране 116 предпочтительно загерметизированы герметизирующим материалом 140, например глицином (или эквивалентным), до нанесения образца капли образца 126, как наилучшим образом показано на фиг. 5В и 5С. Удивительно и неожиданно было обнаружено, что за счет применения герметизирующего материала 140 в фильтрующей мембране 116 частицы 142 внутри капли 126 были распределены более равномерно (до удаления жидкости 144 капли 126), а необходимость в использовании вакуума большой силы для снижения риска неравномерного распределения капли на фильтрующей мембране отсутствовала. Следует отметить, что распределение частиц не обязательно должно быть одинаковым на внешней периферии и в центре. Картину распределения частиц можно определить путем сканирования отпечатка 134/136 (см. фиг. 4А, 4В) образца частиц, помещенного на фильтрующую мембрану, от внешней периферии или внешнего края 137 отпечатка 136 к центру 139 отпечатка образца частиц. Если отсканированная часть образца частиц демонстрирует определенную картину распределения частиц, можно достоверно предположить, что эта же картина распределения частиц имеет место на всем отпечатке образца частиц 136 круглой формы, отчасти потому, что частицам давалось время осесть до растворения герметизирующего материала 140 жидкостью капли 126. Поскольку вначале, капля 126 нанесена на загерметизированную фильтрующую мембрану 116, внешний край 137 отпечатка 136 капли 126 становится относительно различимым или резким, что важно для определения места, где начать подсчет и сканирование к центру 139 образца частиц круглой формы или отпечатка 136, нанесенного на растворенную фильтрующую мембрану 116. Неожиданно выяснилось, что преимущества относительно равномерного распределения частиц на фильтрующей мембране перевешивают недостатки необходимости удаления герметизирующего материала для обеспечения протекания жидкости капли через фильтрующую мембрану перед началом подсчета частиц. Любая неравномерная или нечеткая периферия отпечат
- 4 035524 ка капли на фильтрующей мембране затрудняет определение ее отпечатка и областей, подлежащих анализу с целью подсчета всех частиц в капле. Посредством нанесения капли образца 126 на фильтрующую мембрану 116 со всеми порами 138, загерметизированными герметизирующим материалом 140, частицы 142 равномерно распределяются внутри капли 126 по мере растекания капли 126 по герметизированной верхней поверхности фильтрующей мембраны 116. Требование растворения герметизирующего материала 140 вначале замедляет поток жидкости 144 через поры 138. Без использования герметизирующего материала 140 жидкость 144 капли 126 немедленно бы начинала течь через поры 138 и, поскольку капля 126 является наиболее толстой в центре и более тонкой на периферии, большее количество частиц 142 стремится разместиться в центре капли. Это часто приводит к неравномерному распределению частиц по фильтрующей мембране и внешний край отпечатка образца частиц не является четким. Следует отметить, что в центре капли не всегда находится большее количество частиц, поскольку некоторые препараты могут характеризоваться тенденцией концентрироваться в направлении границы раздела воздух-вода. Как правило, трудно точно предвидеть поведение и распределение различных образцов.
Поскольку весь отпечаток 136 капли образца 126 используется для расчета концентрации частиц 142, капля 126 не должна касаться внутреннего края держателя фильтра фильтрующей мембраны 116. Таким образом важно, чтобы только определенная часть фильтрующей мембраны 116 была покрыта каплей образца 126. Это необходимо, чтобы гарантировать, что все частицы 142 в капле 126 пронумерованы или подсчитаны. Также положение капли образца 126 следует совместить с полостью 129 и каналом 128, определенным внутри подложки 120. Без предобработки фильтрующей мембраны 116 герметизирующим материалом 140 окружающие поры фильтра, т.е. поры 138a-138d и 138i-138j на фиг. 6, остаются открытыми, и вокруг капли 126 и через фильтрующую мембрану 116 течет воздух, так что капля образца 126 не абсорбируется и не фильтруется достаточно быстро для получения хорошего распределения образца частиц 142. Другими словами, использование герметизирующего материала 140 имеет преимущество, заключающееся в создании более различимой внешней периферии 137 отпечатка 136 капли 126, когда жидкость начинает растворять герметизирующий материал 140, расположенный под каплей 126. Без использования герметизирующего материала 140 частицам 142 не хватает времени для равномерного распределения внутри капли 126, поскольку жидкость 144 немедленно начинает течь через поры 138, не давая частицам 142 времени осесть и равномерно распределиться внутри капли 126. Таким образом, одним очень важным свойством герметизирующего материала 140 является создание состояния вакуума, так что формируется определенный отпечаток препарата. Более конкретно, без обработки герметизирующим материалом 140 согласно настоящему изобретению капля 126 нежелательно высыхает за счет диффузии и испарения. Это приводит к весьма неравномерному распределению частиц из-за эффектов высыхания. Было неожиданно обнаружено, что нежелательное испарение может вызывать осмотические эффекты, потенциально вызывающие разрушение частиц и образование кристаллов из-за увеличения концентрации соли в оставшейся капле. Дополнительно это затрудняет обнаружение и подсчет частиц из-за разрушенных частиц и частиц, скрытых осадками солей. В настоящем изобретении при нанесении капли образца 126 на загерметизированную фильтрующую мембрану 116 жидкость 144 в капле образца 126 медленно растворяет герметизирующий материал 140 для открытия пор 138e-138h, расположенных под каплей 126. Затем жидкость 144 быстро всасывается через поры 138e-138h фильтрующей мембраны 116 за счет вакуума, приводя к хорошему распределению частиц образца 142 по верхней поверхности фильтрующей мембраны 116.
7. Перед нанесением капли образца 126 на фильтрующую мембрану 116 активируется вакуумное устройство 102 и снижается давление в вакуумной камере 104, чтобы создать всасывание на фильтрующей мембране 116. Вакуум в вакуумной камере 104 гарантирует, что жидкость 144 капли 126 абсорбируется равномерно на фильтрующей мембране 116. Сочетание использования герметизирующего материала и вакуума приводит к равномерному распределению частиц 142 по отпечатку 136 на фильтрующей мембране 116.
8. Капля образца 126 подходящего объема (обычно 5 мкл) наносится на пористую герметизированную фильтрующую мембрану 116. Как указывалось выше, важно, чтобы диаметр частиц 142 был больше диаметра пор 138 фильтрующей мембраны 116 и чтобы капля 126 не касалась краев монтажного элемента фильтра. Можно нанести объем более 5 мкл с помощью инжекционной системы, где любое из нескольких капель или больших объемом наносятся в то же положение на фильтрующей мембране 116. В общем случае использование больших объемов минимизирует ошибку пробоотбора и позволяет анализировать менее концентрированные образцы.
9. Капля образца 126 обычно абсорбируется фильтрующей мембраной 116 обычно в течение 60 с под вакуумным давлением, обеспечиваемым вакуумной камерой 104. Точные значения давления можно корректировать частично в зависимости от размера пор, типа, объема, чистоты и вязкости образца.
10. После абсорбции фильтрующую мембрану 116 можно снять с узла фильтра 112, установленного на подложке для SEM 120 из оксида алюминия (обычно с использованием адгезива и проводящей углеродной ленты 122).
11. Затем фильтрующая мембрана 116 с помещенными на нее связанными частицами 142 может быть покрыта напылением, например, тонкой пленкой из углерода (обычно толщиной 20 нм) с помощью
- 5 035524 испарителя углерода при подходящим давлении в камере, обычно 1х10-5 мбар. Напыленное покрытие улучшает проводимость фильтрующей мембраны 116, повышает отношение сигнал-шум фильтрующей мембраны 116 и снижает повреждение пучком электронов и зарядовые эффекты. Эту методику часто необходимо использовать для получения изображения фильтрующего материала с использованием SEM. Использование углеродного покрытия может быть нетрадиционно, однако оно обеспечивает повышенное разрешение SEM-изображения по сравнению с металлическим напылением с более крупным размером зерна.
12. Фильтрующую мембрану 116 можно перенести на SEM и сигнал от рассеянных первичных электронов (с использованием внутрилинзового детектора) или вторичных электронов (например, с помощью SE2-детектора) записывают как при малом (для охвата всего отпечатка), так и при большом увеличении (обычно от 10000 до 30000) для подсчета. Если используется эталонный стандарт с отличающейся сигнатурой вторичных электронов (хотя это не является обязательным для определения концентрации частиц), интересующие частицы можно отличить от эталонных частиц путем объединения информации об интенсивности с различных детекторов (например, внутрилинзового и SE2-детектора).
13. Изображения с малым увеличением 136 (см. фиг. 4В) используют для определения размера отпечатка капли и общего распределения препарата, в то время как изображения с большим увеличением используют для подсчета частиц.
14. Изображения с большим увеличением, например, изображение 134, получают по всему отпечатку образца, начиная от края 137 через центр 139 и к противоположному краю капли для минимизации любых влияний различия в распределении частиц по отпечатку капли.
15. На основании изображений с малым увеличением, например, изображения 136, рассчитывают площадь отпечатка образца (Atotal) путем очерчивания края отпечатка. Охваченные пиксели подсчитывают и подсчитанное количество умножают на размер пикселя.
16. На изображениях с большим увеличением обнаруживают и подсчитывают частицы 142. Эту процедуру можно выполнить посредством ручной маркировки или автоматической маркировки с помощью подходящего программного обеспечения, например, проприетарного программного обеспечения Analyzer компании Vironova или любого другого подходящего программного обеспечения для анализа изображений. На основании набора данных изображений рассчитывают среднее количество частиц на единицу площади (n/AFOV).
17. Количество частиц на мл в образце частиц предпочтительно рассчитывают с использованием следующей формулы:
C = Atotalx-^-xdf к l^OMKH afov V мкл где С - концентрация частиц, df - коэффициент разбавления, а V - нанесенный объем образца.
Кроме того, можно использовать формулу, учитывающую, что распределение частиц может меняться при сканировании образца частиц от периферии к центру.
Резюмируя, подход количественной сканирующей электронной микроскопии частиц (pqSEM) согласно настоящему изобретению представляет собой высокоточную методику прямого обнаружения и подсчета частиц. Важной особенностью настоящего изобретения является то, что прямое обнаружение не зависит от сродства между зондом и препаратом, как происходит во многих существующих общепринятых способах. Можно контролировать все параметры, например, коэффициент разбавления, наносимый объем, отпечаток капли и непосредственно измерять количество частиц на единицу площади при минимизации ошибок, вызванных аппроксимациями и допущениями. Кроме того, разрешающая способность pqSEM позволяет обнаруживать отдельные неразличимые невооруженным глазом частицы в кластерах и две популяции частиц с различными размерами или другими морфологическими особенностями могут быть подсчитаны в одном и том же образце. Частицы и отпечаток на высококонтрастных изображениях, полученных с помощью методики pqSEM согласно настоящему изобретению, могут быть легко обнаружены с помощью автоматизированного анализа изображений. Это обеспечивает средства для быстрого сбора больших наборов данных и получения надежных статистических результатов.
Хотя настоящее изобретение описано в соответствии с предпочтительными композициями и вариантами воплощения, следует понимать, что в нем могут быть сделаны некоторые замены и изменения без отхода от сущности и объема следующих пунктов формулы изобретения.
Claims (7)
- ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ1. Способ определения количества неразличимых невооруженным глазом частиц в жидком образце с использованием фильтрующей мембраны (116), содержащей множество пор (138), определенных в ней, поры имеют размер, меньший размера неразличимых невооруженным глазом частиц (142), причем фильтрующая мембрана (116) находится в функциональном взаимодействии с вакуумной камерой (104), включающий герметизацию пор фильтрующей мембраны (116) герметизирующим материалом (140), растворимым жидкостью (144) капли образца (126);- 6 035524 нанесение капли образца (126), содержащего жидкость (144) и неразличимые невооруженным глазом частицы (142), на фильтрующую мембрану (116) без касания каплей образца (126) любого внешнего края фильтрующей мембраны (116); и подсчет неразличимых невооруженным глазом частиц (142) с использованием электронной микроскопии после растворения жидкостью (144) герметизирующего материала в порах (138е-13811), расположенных под каплей образца (126), и истечения жидкости с поверхности фильтрующей мембраны (116).
- 2. Способ по п.1, отличающийся тем, что дополнительно включает этап предварительной установки узла фильтра (112), содержащего фильтрующую мембрану (116), на опору сканирующего электронного микроскопа (120).
- 3. Способ по п.2, отличающийся тем, что дополнительно включает этап размещения монтажной ленты (122) на опоре сканирующего электронного микроскопа (120).
- 4. Способ по п.1, отличающийся тем, что опора сканирующего электронного микроскопа (120) содержит удлиненный канал (128) и инжектор (118), расположенный над фильтрующей мембраной и содержащий каплю образца (126), причем инжектор (118) установлен над удлинённым каналом (128).
- 5. Способ по п.2, отличающийся тем, что опора сканирующего электронного микроскопа (120) содержит удлиненный канал (128), присоединенный к вакуумной камере (104), соединенной с источником вакуума (102), и что дополнительно включает этап воздействия всасывающей силы на фильтрующую мембрану (116) посредством удлиненного канала (128).
- 6. Способ по п.1, отличающийся тем, что дополнительно включает этап образования неразличимыми невооруженным глазом частицами (142) отпечатка (136) на фильтрующей мембране (116) и сканирования неразличимых невооруженным глазом частиц (142) от внешней периферии (137) отпечатка (136) к центру (139) отпечатка (136).
- 7. Способ по п.1, отличающийся тем, что в качестве герметизирующего материала (140) используется глицин.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US201562269465P | 2015-12-18 | 2015-12-18 | |
| PCT/US2016/058011 WO2017105625A1 (en) | 2015-12-18 | 2016-10-21 | High precision quantification of sub-visible particles |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| EA201792107A1 EA201792107A1 (ru) | 2018-12-28 |
| EA035524B1 true EA035524B1 (ru) | 2020-06-30 |
Family
ID=59057225
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| EA201792107A EA035524B1 (ru) | 2015-12-18 | 2016-10-21 | Высокоточное определение количества неразличимых невооруженным глазом частиц |
Country Status (23)
| Country | Link |
|---|---|
| US (3) | US10247648B2 (ru) |
| EP (1) | EP3389813B1 (ru) |
| JP (1) | JP6621825B2 (ru) |
| KR (1) | KR102150748B1 (ru) |
| CN (1) | CN107106926B (ru) |
| AU (1) | AU2016372660B2 (ru) |
| BR (1) | BR112017022551B1 (ru) |
| CA (1) | CA2964777C (ru) |
| CL (1) | CL2017001694A1 (ru) |
| DK (1) | DK3389813T3 (ru) |
| EA (1) | EA035524B1 (ru) |
| ES (1) | ES2784394T3 (ru) |
| HU (1) | HUE048446T2 (ru) |
| IL (1) | IL252558A0 (ru) |
| MA (1) | MA41074B1 (ru) |
| MX (1) | MX368558B (ru) |
| MY (1) | MY188672A (ru) |
| NZ (1) | NZ733989A (ru) |
| PL (1) | PL3389813T3 (ru) |
| PT (1) | PT3389813T (ru) |
| SG (1) | SG11201706486QA (ru) |
| UA (1) | UA123318C2 (ru) |
| WO (1) | WO2017105625A1 (ru) |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US10598576B2 (en) | 2018-08-21 | 2020-03-24 | Battelle Memorial Institute | Particle sample preparation with filtration |
Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5385672A (en) * | 1993-10-13 | 1995-01-31 | Eg&G Idaho, Inc. | Method for preparing membranes with adjustable separation performance |
| US20030024877A1 (en) * | 2001-01-10 | 2003-02-06 | Amann Rupert P. | Cell concentrator and washer |
| US20090049742A1 (en) * | 2006-02-05 | 2009-02-26 | Ecoseal Ltd | Reversibly Sealing the Pores of Nets and Its Application to Agricultural Protection |
| US20100151446A1 (en) * | 2007-05-30 | 2010-06-17 | Mohammed Homman | Method for counting and segmenting viral particles in an image |
Family Cites Families (10)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6699665B1 (en) * | 2000-11-08 | 2004-03-02 | Surface Logix, Inc. | Multiple array system for integrating bioarrays |
| US6884341B2 (en) * | 2002-10-02 | 2005-04-26 | G6 Science Corp. | Filter device to capture a desired amount of material |
| JP2005152849A (ja) * | 2003-11-27 | 2005-06-16 | Kitakyushu Foundation For The Advancement Of Industry Science & Technology | 浮遊微粒子捕集用フィルタ及びそれを用いた浮遊微粒子捕集方法、浮遊微粒子分析方法、並びに浮遊微粒子捕集装置 |
| JP2008520205A (ja) * | 2004-11-12 | 2008-06-19 | ルミネックス・コーポレーション | ミクロスフェアを撮影するために位置決めする方法およびシステム |
| JP4571193B2 (ja) * | 2005-11-16 | 2010-10-27 | 株式会社日立製作所 | 液滴生成搬送方法及び装置、並びに粒子操作装置 |
| SE532499C2 (sv) * | 2008-01-18 | 2010-02-09 | Hemocue Ab | Metod och apparat för analys av partiklar i ett vätskeformigt prov |
| WO2009109997A1 (en) * | 2008-03-07 | 2009-09-11 | Advanced Microdevices Pvt Ltd | Method and device for particle removal and droplet preparation for qualitative and quantitative bioanalysis |
| EP2335825A1 (en) * | 2009-12-21 | 2011-06-22 | F. Hoffmann-La Roche AG | Unit and device for the preparation of cells and/or particles in a liquid and method for microscopic analysis |
| US8969827B2 (en) * | 2012-07-09 | 2015-03-03 | Materials Analysis Technology (Us) Corp. | Specimen preparation for transmission electron microscopy |
| KR101371663B1 (ko) * | 2012-09-03 | 2014-03-12 | 창원대학교 산학협력단 | 입자의 정량적 측정방법 및 그 장치 |
-
2016
- 2016-10-21 AU AU2016372660A patent/AU2016372660B2/en active Active
- 2016-10-21 UA UAA201807032A patent/UA123318C2/uk unknown
- 2016-10-21 CA CA2964777A patent/CA2964777C/en active Active
- 2016-10-21 JP JP2017533216A patent/JP6621825B2/ja active Active
- 2016-10-21 BR BR112017022551-4A patent/BR112017022551B1/pt active IP Right Grant
- 2016-10-21 KR KR1020177023965A patent/KR102150748B1/ko active IP Right Grant
- 2016-10-21 WO PCT/US2016/058011 patent/WO2017105625A1/en active Application Filing
- 2016-10-21 MA MA41074A patent/MA41074B1/fr unknown
- 2016-10-21 NZ NZ733989A patent/NZ733989A/en unknown
- 2016-10-21 EA EA201792107A patent/EA035524B1/ru not_active IP Right Cessation
- 2016-10-21 US US15/736,621 patent/US10247648B2/en active Active
- 2016-10-21 SG SG11201706486QA patent/SG11201706486QA/en unknown
- 2016-10-21 MX MX2017010161A patent/MX368558B/es active IP Right Grant
- 2016-10-21 CN CN201680004052.3A patent/CN107106926B/zh active Active
- 2016-10-21 ES ES16876228T patent/ES2784394T3/es active Active
- 2016-10-21 MY MYPI2018700118A patent/MY188672A/en unknown
- 2016-10-21 DK DK16876228.4T patent/DK3389813T3/da active
- 2016-10-21 PT PT168762284T patent/PT3389813T/pt unknown
- 2016-10-21 EP EP16876228.4A patent/EP3389813B1/en active Active
- 2016-10-21 PL PL16876228T patent/PL3389813T3/pl unknown
- 2016-10-21 HU HUE16876228A patent/HUE048446T2/hu unknown
-
2017
- 2017-05-28 IL IL252558A patent/IL252558A0/en active IP Right Grant
- 2017-06-23 CL CL2017001694A patent/CL2017001694A1/es unknown
-
2019
- 2019-02-15 US US16/277,393 patent/US10345207B2/en active Active
- 2019-05-18 US US16/416,186 patent/US10571375B2/en active Active
Patent Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5385672A (en) * | 1993-10-13 | 1995-01-31 | Eg&G Idaho, Inc. | Method for preparing membranes with adjustable separation performance |
| US20030024877A1 (en) * | 2001-01-10 | 2003-02-06 | Amann Rupert P. | Cell concentrator and washer |
| US20090049742A1 (en) * | 2006-02-05 | 2009-02-26 | Ecoseal Ltd | Reversibly Sealing the Pores of Nets and Its Application to Agricultural Protection |
| US20100151446A1 (en) * | 2007-05-30 | 2010-06-17 | Mohammed Homman | Method for counting and segmenting viral particles in an image |
Also Published As
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US7731901B2 (en) | Apparatus and method for performing counts within a biologic fluid sample | |
| EP2668509A1 (en) | Systems, devices, and methods for ultra-sensitive detection of molecules or particles | |
| JP2009544030A (ja) | フロースルーセルおよび使用方法 | |
| US10345207B2 (en) | High precision quantification of sub-visible particles | |
| US20230279324A1 (en) | Autonomous microfluidic device for sample preparation | |
| US11484882B2 (en) | Autonomous microfluidic device for sample preparation |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MM4A | Lapse of a eurasian patent due to non-payment of renewal fees within the time limit in the following designated state(s) |
Designated state(s): AM AZ BY KZ KG TJ TM |