WO2024106092A1 - ウェルアレイフィルター、粒子整列デバイスおよび粒子捕獲方法 - Google Patents

ウェルアレイフィルター、粒子整列デバイスおよび粒子捕獲方法 Download PDF

Info

Publication number
WO2024106092A1
WO2024106092A1 PCT/JP2023/037086 JP2023037086W WO2024106092A1 WO 2024106092 A1 WO2024106092 A1 WO 2024106092A1 JP 2023037086 W JP2023037086 W JP 2023037086W WO 2024106092 A1 WO2024106092 A1 WO 2024106092A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
well
wells
array filter
partition
opening
Prior art date
Application number
PCT/JP2023/037086
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
享史 大坂
杏奈 高橋
佳歩 森田
敦史 室田
亮正 仲村
Original Assignee
東京応化工業株式会社
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 東京応化工業株式会社 filed Critical 東京応化工業株式会社
Publication of WO2024106092A1 publication Critical patent/WO2024106092A1/ja

Links

Images

Classifications

    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01D—SEPARATION
    • B01D29/00—Filters with filtering elements stationary during filtration, e.g. pressure or suction filters, not covered by groups B01D24/00 - B01D27/00; Filtering elements therefor
    • B01D29/01—Filters with filtering elements stationary during filtration, e.g. pressure or suction filters, not covered by groups B01D24/00 - B01D27/00; Filtering elements therefor with flat filtering elements
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M1/00—Apparatus for enzymology or microbiology
    • C12M1/26—Inoculator or sampler
    • C12M1/28—Inoculator or sampler being part of container
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor

Definitions

  • the present invention relates to a well array filter for capturing particles such as cells and beads, a particle alignment device, and a particle capturing method.
  • a cell screening device particle alignment device
  • One method of screening cells is, for example, to contact cells captured in many wells with a liquid in which a reagent such as a catcher that binds to a specific antibody is dispersed, and cells that have secreted a secretion that has bound to the catcher are found and collected from the well.
  • the particle alignment device disclosed in Patent Document 1 includes a well array filter made of resist, in which a large number of wells with through-holes at the bottom are arranged.
  • the opening shape of each well is circular or elliptical to resemble a cell.
  • a well array filter is disclosed in which the well opening diameter is 100 ⁇ m, the well depth is 30-100 ⁇ m, and the through-hole opening diameter is 2-5 ⁇ m.
  • the particle alignment device disclosed in Patent Document 2 is equipped with a well array filter made of a silicon wafer, in which a large number of wells are formed by etching and a SiNx film with through-holes is provided at the bottom of each well.
  • the opening shape of each well is circular. Since this well array filter is made from a silicon wafer, in the example of Patent Document 2, the thickness of the filter body is 380 ⁇ m, the opening diameter of the wells is approximately 100 ⁇ m, and the distance between the centers of the wells is approximately 150 ⁇ m.
  • the particle alignment device disclosed in Patent Document 3 is equipped with a well array filter for secretion assays, which consists of two layers: a well substrate with a through hole at the bottom for storing cells, and a substrate for storing cells to detect secretions from those cells.
  • the well substrate is made of resist.
  • the wells are circular and have an opening diameter of 12 ⁇ m, which is close to the size of a cell, but the distance between the centers of the wells is about 100 ⁇ m.
  • the distance between wells is large in all cases, so there is a high frequency that cells, beads, and other particles do not enter the wells and end up remaining on the partitions between the wells.
  • the distance between the wells is large, the wells cannot be arranged at high density, and the well arrangement density is insufficient for screening a large number of cells, etc. at once.
  • the well arrangement density is low, if the through-holes at the bottom of the wells are sized to reliably capture cells, i.e., to prevent cells from passing through, the ratio of the total opening area of the through-holes to the area of the well array filter is small, and there is a problem that it is difficult to pass a sufficient amount of sample through the well array filter using pipette operation alone.
  • the opening shape of the wells is circular or elliptical, there is a problem that when performing automatic image analysis of cells captured in the wells, the shapes of the cells and the wells are similar, making image analysis difficult.
  • the well partitions in all of Patent Documents 1 to 3 are thick, and in Patent Document 2 they are made of hard silicon, which results in poor flexibility of the filter.
  • cells or the like are collected from the wells using a thin glass capillary, there is a possibility that the tip of the capillary will hit the well partition and be damaged, making the work difficult.
  • the present invention was made in consideration of the above circumstances, and aims to provide a well array filter, particle alignment device, and particle capture method that can easily capture particles such as cells one by one in a well, facilitate screening of a large number of particles, and facilitate automated image analysis.
  • a well array filter has a flat filter body, the filter body has a plurality of wells formed therein that open into a well formation region on the upper surface of the filter body, adjacent wells are separated by well partitions, well bottoms are formed at the lower ends of the wells, the openings of the wells are polygonal or polygonal with rounded corners, the circle equivalent diameter of the openings of the wells is 5 ⁇ m or more and 200 ⁇ m or less, at least one through hole is formed in the well bottom that reaches the lower surface of the filter body, the maximum horizontal thickness of the well partition is 1 ⁇ m or more and 20 ⁇ m or less, the ratio of the total opening area of the wells to the area of the well formation region is 40% or more, and the depth of the wells is at least twice the maximum horizontal thickness of the well partition.
  • the well partitions between wells are sufficiently thin that particles such as cells and beads are unlikely to remain on the well partitions, and the rate at which multiple particles enter one well can be reduced by appropriately setting the aperture diameter, allowing particles to be stably captured in wells that are sufficiently deep compared to the aperture diameter.
  • the wells are polygonal, it is easy to distinguish between particles and wells during automatic image analysis, and the wells can be arranged at high density, which has the advantage of allowing a large number of particles to be screened at once.
  • the through hole may have a maximum inscribed circle diameter of 4 ⁇ m or less. In this case, it is possible to effectively prevent particles such as cells or beads from passing through the through-holes.
  • the ratio of the total opening area of the through holes to the area of the well formation region may be 0.5% or more and 3.5% or less. In this case, since the total opening area of the through-holes is appropriate, it is easy to pass a liquid through the well array filter by pipetting.
  • the polygonal shape may be any one of a triangular shape, a rectangular shape, and a hexagonal shape.
  • the wells may be triangular, rectangular, or hexagonal in shape, allowing the wells to be closely packed on the filter body.
  • the well partition and the well bottom may be formed from different materials, and the well bottom may be formed from a material having greater strength than the well partition.
  • the well bottom is formed from a material stronger than the well partition, thereby increasing the strength of the entire well array filter while mitigating shrinkage during molding of the well wall, thereby reducing warping and distortion of the well array filter.
  • the well partition and the well bottom may be formed from different materials, the well bottom may be divided into tile shapes corresponding to the shapes of the openings of the wells, gaps may be formed between adjacent well bottoms, and the material forming the well partition may penetrate into these gaps and solidify.
  • the well bottom is divided into tile shapes with gaps formed between them, and then the well partitions are formed and the material that forms the well partitions is inserted into the gaps and solidified. This reduces warping and distortion in the well array filter due to solidification shrinkage compared to when the well bottom is formed from a single plate.
  • At least the inner surface of the well may be coated with a polymer that inhibits cell adhesion.
  • the polymer may be, for example, an MPC polymer, PEG, PVA, PMEA, or a mixture thereof.
  • the polymer applied to the inner surface of the well suppresses cell adhesion, making it easier to remove cells or particles from the well.
  • the polymer may be applied not only to the inner surface of the well, but also to the upper surface of the well partition, the inner surface of the through-hole, and the lower surface of the filter body. In this case, problems such as cells adhering to the upper surface of the well partition or the lower surface of the filter body can be suppressed.
  • the well bottom may have a thickness of 1 nm or more and 2 ⁇ m or less.
  • the well bottom since the well bottom is thin, the captured object in the well can be easily observed through the well bottom with an inverted microscope, and since the thin well bottom generates less autofluorescence, the adverse effect of autofluorescence on observation can be reduced.
  • a particle alignment device comprises a well array filter according to any one of aspects 1 to 8, and a device body which supports the well array filter and has a sample flow path extending from the opening side of the well of the well array filter through the through hole to the bottom side of the well.
  • the particle alignment device of the above-mentioned aspect 9 since the well partition between the wells is thin, particles such as cells and beads are unlikely to remain on the well partition, and since the wells are polygonal, it is easy to distinguish between the particles and the wells during automatic image analysis, and the particles can be stably trapped one by one in the wells that are deep enough compared to the opening diameter. Furthermore, since the wells can be arranged at high density, it has the advantage that a large number of particles can be screened at once.
  • a particle capturing method includes the steps of passing a liquid containing an organic solvent that does not dissolve or degrade the well array filter and the device body through the sample flow path of the particle alignment device of aspect 9, passing an aqueous solution through the sample flow path to replace the liquid containing the organic solvent with the aqueous solution, and passing an aqueous solution containing particles to be captured in the well through the sample flow path replaced with the aqueous solution to capture the particles in the well.
  • the liquid containing the organic solvent is not limited, but for example, a liquid such as an aqueous solution containing ethyl alcohol or an organic solvent such as 30 to 80% ethyl alcohol, preferably a 70% aqueous ethyl alcohol solution, can be used.
  • a liquid containing the organic solvent is passed through the sample flow path, and then the inside of the sample flow path is replaced with an aqueous solution. After that, an aqueous solution containing particles such as cells, beads having cell components or secretions attached thereto, or beads for attaching cell components or secretions is passed through the sample flow path. This reduces the resistance to liquid flow through the well array filter, makes it difficult for air bubbles to remain in the wells, and makes it easy to capture the cells or particles one by one in each well.
  • the well partitions between wells are sufficiently thin that particles such as cells and beads are unlikely to remain on the well partitions, and by appropriately setting the opening diameter, the rate at which excess particles enter one well can be reduced, and particles can be stably captured in wells that are sufficiently deep compared to the opening diameter.
  • the wells are polygonal, it is easy to distinguish between particles and wells during automatic image analysis, and the wells can be arranged at high density, providing the excellent effect of allowing a large number of particles to be screened at once.
  • FIG. 2 is an enlarged plan view of the well array filter of the first embodiment of the present invention.
  • FIG. 2 is an enlarged cross-sectional view of the well array filter of the same embodiment.
  • FIG. 4 is an enlarged plan view of a well of the well array filter of the same embodiment.
  • FIG. 11 is an enlarged plan view of a well of a well array filter of a second embodiment.
  • FIG. 13 is an enlarged plan view of a well of a well array filter of a third embodiment.
  • FIG. 13 is an enlarged plan view of a well of a well array filter of a fourth embodiment.
  • FIG. 13 is an enlarged plan view of a well of a well array filter according to a fifth embodiment.
  • FIG. 13 is an enlarged plan view of a well of a well array filter of a sixth embodiment.
  • FIG. 13 is an enlarged plan view of a well array filter according to a seventh embodiment.
  • FIG. 23 is an enlarged plan view of a well array filter according to an eighth embodiment.
  • 1(a) to 1(f) are enlarged cross-sectional views illustrating a method for producing a well array filter according to an embodiment of the present invention.
  • FIG. 1 is a plan view showing a particle alignment device according to an embodiment of the present invention.
  • FIG. 2 is a vertical cross-sectional view showing the particle alignment device of the embodiment.
  • 1 is a graph showing the effect of an embodiment of the present invention.
  • 1 is a graph showing the effect of an embodiment of the present invention.
  • 1 is a graph showing the effect of an embodiment of the present invention.
  • 6 is a photograph showing the effect of an embodiment of the present invention.
  • FIGS. 1 and 2 are an enlarged plan view and an enlarged cross-sectional view showing a first embodiment of a well array filter.
  • This well array filter 1 has a flat filter body 2 of a constant thickness, and the filter body 2 has a large number of wells 3 formed therein, which open into a well-forming region on the upper surface of the filter body 2.
  • the well-forming region refers to the region of the filter body 2 that is used as a filter, and the filter body 2 may have a support region, in which no wells are formed, for supporting a filter, around the well-forming region.
  • the wells 3 adjacent to each other are separated by well partitions 6.
  • a flat well bottom 4 is formed as shown in FIG. 2, which closes the lower end of the well 3.
  • the opening of the well 3 is polygonal or polygonal with rounded corners.
  • the wells 3 are regular hexagonal, and the wells 3 and well partitions 6 are arranged in a honeycomb pattern.
  • At least the well bottom 4 is made of a transparent material so that particles such as cells C in the wells 3 can be observed through the well bottom 4 with an inverted microscope.
  • the well partitions 6 may also be made of a transparent material, but they can also be made of an opaque material.
  • the equivalent circle diameter of the opening of well 3 is set to 5 ⁇ m or more and 200 ⁇ m or less.
  • the equivalent circle diameter refers to the diameter of a circle with the same area as the opening of well 3. If the equivalent circle diameter of the opening of well 3 is 5 ⁇ m or more, it becomes possible to capture particles such as cells or beads, and if it is 200 ⁇ m or less, it becomes easy to capture one or an appropriate fixed number of cells or particles such as beads in each well 3.
  • the equivalent circle diameter of the opening of well 3 may more preferably be 10 ⁇ m or more and 100 ⁇ m or less, and even more preferably be 15 ⁇ m or more and 60 ⁇ m or less, so that cells can be captured one by one in well 3.
  • Beads are particles made of resin or the like to which cellular components and secretions are attached for analysis; cellular components are released outside the well 3 and attached to the beads, and the beads with the cellular components and secretions attached are captured in the well 3 for analysis; alternatively, cells and beads may be placed in the well 3, the cells may be broken down, and the cellular components and secretions may be attached to the beads in the well 3. Magnetic beads may also be used, and the beads may be attracted by a magnet placed below the well array filter 1 and captured in the well 3.
  • Each well bottom 4 has at least one through hole 8 that reaches the bottom surface of the filter body 2.
  • the number of through holes 8 is not limited, and may be one, three, or four or more. However, when only one through hole 8 is formed in the center, if the diameter D of the through hole 8 is made large to a certain extent in order to ensure a sufficient flow rate, there is a possibility that the cell C will deform and pass through the through hole 8.
  • the maximum horizontal thickness B of the well partition 6 (see FIG. 1) is 1 ⁇ m or more and 20 ⁇ m or less.
  • the maximum thickness B 1 ⁇ m or more the strength of the well partition 6 can be appropriately ensured, and the well partition 6 can be prevented from collapsing, for example, when a pipette P is applied to the top surface of the well partition 6 to suck up cells C.
  • the maximum thickness B 20 ⁇ m or less particles to be captured, such as cells or beads, can be prevented from remaining on the well partition 6, and the density of the well 3 can be increased.
  • the well partition 6 can be provided with appropriate flexibility when the pipette P is applied, and damage to the tip of the pipette P can be suppressed.
  • the maximum thickness B of the well partition 6 may be preferably 2 ⁇ m or more and 20 ⁇ m or less, and more preferably 2 ⁇ m or more and 12 ⁇ m or less.
  • the ratio of the total opening area of the wells 3 to the area of the well formation region is set to 40% or more. When this ratio is 40% or more, the proportion of particles captured in the wells 3 among particles such as cells supplied to the well array filter 1, i.e., the particle capture rate, can be sufficiently increased.
  • the ratio of the total opening area of the wells 3 to the area of the well formation region may preferably be 40% or more and 95% or less, and more preferably 40% or more and 75% or less. A high ratio leads to a thin well partition 6.
  • the depth of the well 3 is set to be at least twice the maximum horizontal thickness B of the well partition 6.
  • the depth of the well 3 is at least twice the thickness B of the well partition 6, particles such as cells C captured in the well 3 can be prevented from escaping to the outside of the well 3 due to disturbances in the flow of the liquid, etc., so that particles once captured can be stably held in the well 3.
  • the depth of the well 3 may be at least twice but not more than 40 times the thickness B of the well partition 6, and even more preferably at least twice but not more than 15 times.
  • the planar shape of the through hole 8 is a circle, but the present invention is not limited to a circle, and the shape may be any shape, such as an ellipse, a triangle, a square, a pentagon, a hexagon, or another polygon, a polygon with rounded corners, a rectangle, a star, a slit, a dumbbell shape, an H-shape, or any other irregular shape.
  • the maximum inscribed circle diameter of the through-hole 8 is not limited in the present invention, but is preferably 4 ⁇ m or less.
  • the maximum inscribed circle diameter refers to the diameter of the maximum inscribed circle when it is drawn within one through-hole 8. If the maximum inscribed circle diameter exceeds 4 ⁇ m, there is a possibility that particles such as cells or beads to be captured may slip through.
  • the maximum inscribed circle diameter may be preferably 0.1 ⁇ m or more and 4 ⁇ m or less, and more preferably 0.5 ⁇ m or more and 3.5 ⁇ m or less.
  • the ratio of the total opening area of the through holes 8 to the area of the well formation region is not limited in the present invention, but is preferably 0.5% or more and 3.5% or less.
  • the ratio of the total opening area of the through holes 8 is 0.5% or more, the flow resistance through the through holes 8 is appropriately small, so that it is easy to pass the liquid through the well array filter 1 by operating the pipette P.
  • the ratio of the total opening area of the through holes 8 is 3.5% or less, the liquid sample does not flow too much when passing the liquid through the well array filter 1 by operating the pipette P, and operability is excellent.
  • the ratio of the total opening area of the through holes 8 may be preferably 0.5% or more and 3.5% or less, and more preferably 0.75% or more and 3.2% or less.
  • the planar shape of the wells 3 is a polygon or a polygon with rounded corners, it is easy to distinguish between the particles and the wells 3 during automatic image analysis, but among the polygonal shapes, it is preferable that the shape is either a triangle, a square, or a hexagon as shown in the figure. With a triangle, square, or hexagon, it is possible to arrange wells 3 of the same shape in a regular pattern, thereby increasing the array density of the wells 3. Among these, an equilateral triangle, regular square, or regular hexagon is preferable, since it is possible to increase the array density of the wells 3 with a geometrically simple array.
  • the well partition 6 and the well bottom 4 may be made of the same material, but preferably they are made of different materials, with the well bottom 4 being made of a material stronger than the well partition 6.
  • the strength of the well array filter 1 as a whole can be increased while mitigating shrinkage during molding of the well bottom 4, thereby reducing warping and distortion of the well array filter 1.
  • the lack of warping in the well array filter 1 is important in order to focus the entire observation area when observing particles trapped in the wells 3 with an inverted microscope.
  • the material of the well partition 6 and the well bottom 4 is not limited, but may be formed of various photoresists to realize the fine structure. It is preferable to form the well bottom 4 from a material stronger than the well partition 6 by changing the type and composition of the photoresist and/or changing the exposure conditions.
  • the partition resist 6A (see FIG. 11) forming the well partition 6 is formed from a photoresist with a relatively small amount of polyfunctional epoxy, and the bottom resist 4A (see FIG.
  • the well bottom 4 is formed from a photoresist with a relatively large amount of polyfunctional epoxy, so that the strength of the material of the well bottom 4 can be made higher than the strength of the material of the well partition 6.
  • the autofluorescence of the material of the well partition 6 is relatively weak and the autofluorescence of the material of the well bottom 4 is relatively strong, but since the thickness of the well bottom 4 is small, there is no adverse effect on observation with an inverted microscope.
  • the method of forming the well bottom 4 and the well partition 6 is not limited, but in order to relieve stress in the well array filter 1, preferably, the well partition 6 and the well bottom 4 are formed separately from each other, the well bottom 4 is divided into tile shapes corresponding to the shape of the opening of each well 3, gaps are formed between adjacent well bottoms 4, and the material forming the well partition 6 penetrates into these gaps and solidifies.
  • An example of a specific manufacturing method will be described later.
  • a polymer that inhibits cell adhesion may be applied in advance to at least a portion of the inner surface of the well 3.
  • the polymer applied to the inner surface of the well 3 inhibits adhesion of the cells C, making it easier to remove the cells C or particles from the well 3.
  • MPC polymer (2-methacryloyloxyethyl phosphorylcholine polymer
  • PEG polyethylene glycol
  • PVA polyvinyl alcohol
  • PMEA poly(2-methoxyethyl acrylate
  • the polymer may be applied not only to the inner surface of the well 3, but also to the upper surface of the well partition 6, the inner surface of the through-hole 8, and the lower surface of the filter body 2. In this case, problems such as cells adhering to the upper surface of the well partition 6 or the lower surface of the filter body 2 can be suppressed.
  • the thickness of the well bottom 4 may be 1 nm or more and 2 ⁇ m or less. In this case, since the well bottom 4 is sufficiently thin, captured objects such as cells C in the well 3 can be easily observed through the well bottom 4 with an inverted microscope, and since the well bottom 4 is thin, the autofluorescence of the well bottom 4 is kept small, and the adverse effects of autofluorescence on observation can also be reduced.
  • the thickness of the well bottom 4 may more preferably be 100 nm or more and 2 ⁇ m or less, and even more preferably be 500 nm or more and 1.5 ⁇ m or less.
  • the well partitions 6 between the wells 3 are sufficiently thin that particles such as cells and beads are unlikely to remain on the well partitions 6, and the rate at which multiple particles enter one well 3 can be reduced by appropriately setting the opening diameter, allowing particles to be stably captured in wells 3 that are sufficiently deep compared to the opening diameter.
  • the wells 3 are polygonal, it is easy to distinguish between particles and wells 3 during automatic image analysis, and the wells 3 can be arranged at high density, which has the advantage of allowing a large number of particles to be screened at once.
  • FIG. 4 shows a second embodiment of the well array filter 1, and in this example, a total of three through holes 8 are formed in the center of the well bottom 4.
  • the through holes 8 may be formed at the vertices of an equilateral triangle, or may be formed at the vertices of an isosceles triangle, a right triangle, or a scalene triangle other than an equilateral triangle.
  • the center of the well bottom 4 is located inside the triangle, preferably at the center of gravity.
  • Three through holes 8 may be formed at equal or unequal intervals on a single line segment. In that case, it is preferable that the center of the well bottom 4 is located on the line segment.
  • Other configurations of the second embodiment may be similar to those of the first embodiment, and the above description is incorporated herein. In this second embodiment, the same effects as those of the first embodiment can be obtained.
  • FIG. 5 shows a third embodiment of the well array filter 1, and in this example, a total of four through holes 8 are formed in the center of the well bottom 4.
  • the through holes 8 may be formed at the vertices of a square, or may be formed at the vertices of a rectangle, trapezoid, or scalene rectangle other than a square.
  • the center of the well bottom 4 is located inside the quadrangle, preferably at the center of gravity.
  • three through holes 8 may be arranged at the vertices of a triangle, and a fourth through hole 8 may be arranged inside the triangle or on one of the three sides.
  • the triangle may be an equilateral triangle, or may be an isosceles triangle, right triangle, or scalene triangle other than an equilateral triangle.
  • the center of the well bottom 4 is located inside the triangle, preferably at the center of gravity.
  • four through holes 8 may be formed at equal or unequal intervals on a single line segment. In that case, it is preferable that the center of the well bottom 4 is located on the line segment.
  • the other configurations of the third embodiment may be similar to those of the first embodiment, and the above description is used. In the third embodiment, the same effects as in the first and second embodiments can be obtained.
  • FIG. 6 shows a fourth embodiment of the well array filter 1, and in this example, a total of seven through holes 8 are formed in the center of the well bottom 4.
  • six through holes 8 are formed at the vertices of a regular hexagon, and the seventh through hole 8 is formed in the center of the regular hexagon.
  • N through holes 8 N ⁇ 1 may be formed at the vertices of an M-gon (M ⁇ 3) and on the inside or one or more sides of the M-gon.
  • the other configurations of the fourth embodiment may be similar to those of the first embodiment, and the above description is incorporated herein. In this fourth embodiment, the same effects as those of the first to third embodiments can be obtained.
  • FIG. 7 shows a fifth embodiment of the well array filter 1.
  • a through hole 8A is formed in the center of the well bottom 4 in a planar shape (iron array shape) in which two circles are connected by a slit.
  • the through hole 8A may be a simple long hole.
  • the through hole 8A may be a curved or bent line shape.
  • the opening area (flow path cross-sectional area) of the through hole 8A can be secured to be large, and the flow rate of the through hole 8A can be increased while preventing particles such as cells and beads from passing through the through hole 8A.
  • the center of the well bottom 4 is located on the through hole 8A.
  • the other configurations of the fifth embodiment may be the same as those of the first embodiment, and the above description is incorporated herein. In this fifth embodiment, the same effects as those of the first to fourth embodiments can be obtained.
  • FIG. 8 shows a sixth embodiment of the well array filter 1.
  • a through hole 8B having a planar shape (radial shape) is formed in the center of the well bottom 4, which includes three or more slits extending radially from the center and a circular hole formed at the end of the slit.
  • Each slit of the through hole 8B may be a simple long hole.
  • the opening area (flow path cross-sectional area) of the through hole 8B can be secured to be large, and the flow rate of the through hole 8B can be increased while preventing particles such as cells and beads from passing through the through hole 8B.
  • the center of the well bottom 4 is located at the center of the through hole 8B.
  • FIG. 9 shows a seventh embodiment 20 of a well array filter, which is characterized in that the well partitions 6 are formed in a square grid shape, and each of the well bottoms 4 is formed in a square shape.
  • the well partitions 6 are not limited to a square grid shape, and may be in a diagonal grid shape or a rectangular grid shape, but it is preferable that the shapes of the individual wells 3 are the same as each other.
  • the wells 3 may be arranged in a staggered manner every other row.
  • the through holes 8 may be the same as any of the first to sixth embodiments.
  • the other configurations of the seventh embodiment may be the same as those of the first embodiment, and the above description is incorporated herein.
  • the seventh embodiment also provides the same effects as the first to sixth embodiments.
  • [Eighth embodiment of well array filter] 10 shows an eighth embodiment 30 of a well array filter, which is characterized in that the well partitions 6 are formed in a so-called truss shape, in which equilateral triangles are alternately arranged in reverse orientation, and each well bottom 4 is formed in an equilateral triangle.
  • the well partitions 6 are not limited to an equilateral triangle shape, and may be an isosceles triangle shape, a right-angled triangle shape, or a scalene triangle shape, but it is preferable that the shapes of the individual wells 3 are the same as each other.
  • the through-holes 8 may be the same as those of any of the first to sixth embodiments.
  • the other configurations of the eighth embodiment may be the same as those of the first embodiment, and the above description is incorporated herein.
  • the eighth embodiment also provides the same effects as those of the first to seventh embodiments.
  • FIG. 11(a) to (f) are cross-sectional views showing an example of a manufacturing method for the well array filters 1, 20, and 30.
  • a sacrificial film 12 that is insoluble in resist solvents and developing solutions is formed on a substrate 10 made of a Si wafer or the like.
  • the sacrificial film 12 can be formed from, for example, a styrene-based elastomer, dextrin, or dextran.
  • a negative bottom resist 4A is formed on the sacrificial film 12 to a constant thickness required for the well bottom 4.
  • the bottom resist 4A is exposed to a predetermined pattern by photolithography and then developed, so that the well bottoms 4 having through-holes 8 are arranged in a polygonal tile shape with gaps 14 between them, as shown in FIG. 11(c).
  • the width of the gaps 14 is slightly smaller than the thickness of the well partition 6.
  • the gaps 14 between the well bottoms 4 may be partially bridged by thin bridges. In this case, the well bottoms 4 can be positioned so that the arrangement is not disturbed by the bridges.
  • the partition resist 6A covering the well bottom 4 is formed to a thickness required for the well partition 6.
  • the autofluorescence of the material of the well partition 6 is relatively weak and the autofluorescence of the material of the well bottom 4 is relatively strong, but since the thickness of the well bottom 4 is small, there is no adverse effect on observation with an inverted microscope.
  • the partition resist 6A is exposed to light in a predetermined pattern by photolithography, and then developed to form the well partition 6 as shown in FIG. 11(e). As a result, the partition resist 6A penetrates into the inside of the gap 14, is insolubilized in the gap 14 by exposure, and connects the well bottoms 4 together.
  • the well bottom 4 and the well partition 6 are heated to, for example, 180°C to further heat-set the resist, and then the sacrificial film 12 is dissolved with a solvent that does not alter the resist, and the substrate 10 is peeled off from the well bottom 4, completing the well array filters 1, 20, and 30 as shown in the first to eighth embodiments.
  • the above manufacturing method allows for efficient manufacturing of well array filters 1, 20, 30 having wells 3 with high shape accuracy.
  • this manufacturing method allows for the well bottoms 4 to be divided into tile shapes to form gaps 14 between them, and then the well partitions 6 are formed and the material that forms the well partitions 6 penetrates into the gaps 14 and solidifies, reducing warping and distortion that occurs in the well array filters 1, 20, 30 due to solidification and shrinkage of the well bottoms 4.
  • FIGS. 12 and 13 are a plan view and a longitudinal sectional view showing an embodiment 40 of a particle alignment device according to the present invention.
  • the particle alignment device 40 has a rectangular bottom plate 42 and a wall 44 formed in the center of the bottom plate 42.
  • the wall 44 has a square frame-shaped peripheral wall rising from the bottom plate 42 and two partition walls rising from the inside of the peripheral wall and formed parallel to each other, and the inside of the peripheral wall is divided into a first chamber 46, a second chamber 48, and a third chamber 50 by the partition walls.
  • a cylindrical opening 52 is formed at the bottom of the first chamber 46, and a cylindrical opening 54 is also formed at the bottom of the third chamber 50.
  • the bottom of the second chamber 48 is open, and as shown in FIG. 13, the well array filters 1, 20, and 30 are fixed to the lower end of the wall portion 44 with a small flow path 56 from the bottom plate portion 42.
  • a certain gap is also provided between the bottom of the first chamber 46 and the bottom plate portion 42, and between the bottom of the third chamber 50 and the bottom plate portion 42, forming the flow path 56.
  • This makes it possible to capture particles such as cells C and beads in the well 3 of the well array filter 1 by putting a liquid sample containing particles such as cells C and beads into the second chamber 48 and letting the liquid flow out from the opening 52 or opening 54. That is, a sample flow path is formed that leads to the second chamber 48, the well array filter 1, and the flow path 56. It is also possible to put a reagent into the opening 52 or opening 54 and react with the particles such as cells C and beads in the second chamber 48.
  • One embodiment of the particle capture method of the present invention includes the steps of passing a liquid containing an organic solvent that does not dissolve or alter well array filter 1 and device body 40 through a sample flow path that passes through well array filters 1, 20, and 30 of particle alignment device 40, i.e., a sample flow path that passes from the opening side of well 3 through through hole 8 to the bottom side of well 3, passing an aqueous solution through the sample flow path to replace the liquid containing the organic solvent with the aqueous solution, and passing an aqueous solution containing particles to be captured in well 3 through the sample flow path to capture the particles in well 3.
  • a liquid such as a water-soluble, low-interfacial tension organic solvent such as ethyl alcohol, or an aqueous solution containing about 30-80% of an organic solvent such as ethyl alcohol
  • a 70% aqueous solution of ethyl alcohol can be suitably used. This causes the through-hole 8 to be filled with the organic solvent.
  • an aqueous solution of a buffer solution such as phosphate buffer solution (PBS) is added to the second chamber 48, and the liquid containing the organic solvent is aspirated from the opening 52 and/or the opening 54. This is repeated several times to replace the liquid containing the organic solvent in the second chamber 48, the through-hole 8, and inside the flow channel 56 with the aqueous solution of the phosphate buffer solution.
  • PBS phosphate buffer solution
  • a sample liquid in which cells C and/or particles such as beads are dispersed in a phosphate buffer solution or the like is supplied to the second chamber 48, and the phosphate buffer solution is aspirated from the opening 52 and/or the opening 54, whereby the cells C and/or beads are captured one by one or in approximately equal numbers in each well 3.
  • a reagent that binds to the target cells C or beads with cell secretions attached is added through the second chamber 48 or the openings 52, 54, and after marking the target, the target is identified using an inverted microscope, and the target cells C or beads are collected from the well 3 using a pipette P, capillary, etc.
  • a liquid containing an organic solvent is passed through the sample flow path through the well array filter 1, which is then replaced with an aqueous solution, and then an aqueous solution containing particles such as cells, beads to which cell components or secretions are attached, or beads for attaching cell components or secretions is passed through.
  • FIG. 14 is a graph showing the aperture ratio of the well 3 when the well array filter 1, in which the opening of the well 3 is a regular hexagon, and the opening width of the well 3 and the horizontal thickness of the well partition 6 are variously changed as shown in FIG. 1 and FIG. 2.
  • "Hex10” indicates that the well 3 is a regular hexagon with an opening width of 10 ⁇ m between two parallel sides
  • “Hex20” indicates that the opening width is 20 ⁇ m
  • “Hex50” indicates that the opening width is 50 ⁇ m
  • “Hex100” indicates that the opening width is 100 ⁇ m.
  • the partition width ( ⁇ m) on the horizontal axis indicates the horizontal thickness ( ⁇ m) of the partition of the well partition 6.
  • the circle equivalent diameter of the well 3 is 1.050075 ⁇ A.
  • FIG. 15 is a graph showing the total aperture ratio (%) of the through-holes 8 when the well array filter 1 in which the opening of the well 3 is a regular hexagon as shown in FIG. 1 and FIG. 2 is produced by changing the opening width of the well 3, the thickness of the well partition 6, and the dimensions, shapes, and number of the through-holes 8.
  • “Hex10” to “Hex100” are the same as FIG. 14, and “Hex125” indicates that the opening width between the two parallel sides of the well 3 is 125 ⁇ m.
  • the horizontal axis "well opening diameter + wall thickness” indicates the opening width ( ⁇ m) between the two parallel sides of the well 3 + the horizontal thickness ( ⁇ m) of the well partition 6.
  • the vertical axis "through-hole aperture ratio (%)” indicates the ratio (%) of the total opening area of the through-holes 8 to the area of the well formation region.
  • "2.5 ⁇ m ⁇ 4" indicates that four through-holes 8 with a circular diameter of 2.5 ⁇ m are formed for each well 3.
  • "2.8 ⁇ m ⁇ 4.6 ⁇ m ⁇ 4" indicates that four rectangular through-holes 8 of 2.8 ⁇ m ⁇ 4.6 ⁇ m were formed for each well 3.
  • the opening width of the well 3 is 5 ⁇ m or more
  • the thickness of the well partition 6 is 1 ⁇ m or more
  • the through-hole opening ratio is 0.5 to 3.5%.
  • Table 1 shows the parameters of the well array filters manufactured in Examples 1 to 8 and Comparative Example, with "Hex10-20" indicating that the well 3 is a regular hexagon, the target opening width between two parallel sides is 10 ⁇ m, and the target depth of the well 3 is 20 ⁇ m. The same is true for the others.
  • opening diameter ( ⁇ m) indicates the opening diameter between two parallel sides of the regular hexagon
  • partition width ( ⁇ m) indicates the horizontal thickness of the well partition 6
  • depth ( ⁇ m) indicates the depth of the well 3
  • opening ratio indicates the ratio (%) of the total opening area of the well 3 to the area of the well formation region
  • density (cm -2 ) indicates the number of wells 3 formed per cm 2 of the well formation region.
  • the "number of through holes” is the number of through holes 8 per well 3
  • "opening shape” is the opening shape of each through hole 8
  • "2.8” in “opening dimensions” indicates the diameter of a circle
  • "3.15/5.19” indicates a rectangle of 3.15 ⁇ m x 5.19 ⁇ m with rounded chamfered corners
  • "opening rate” indicates the total opening rate (%) of the through holes 8 relative to the area of the well formation region.
  • the total opening rate of the through holes 8 was 0.50% or more, but in the comparative example, it was less than 0.50%, at 0.38%.
  • Example 4 Using the well array filters of Examples 2, 6, 7, 8 and Comparative Example, the liquid passage time of ethyl alcohol was measured. Each well array filter was attached to a particle alignment device 40 as shown in Figures 12 and 13. The well formation area of the well array filter was a square of 17 mm x 17 mm. 0.5 ml of ethyl alcohol was injected into the second chamber 48, and the liquid passage time (seconds) until the entire amount of ethyl alcohol passed through the well array filter and flowed into the flow path 56 was measured. The results are shown in Table 2.
  • Example 5 The well array filter of Example 2 (well formation area: 17 mm x 17 mm) was attached to the particle alignment device 40, and after passing ethyl alcohol, phosphate buffer solution (PBS) was passed three times. Next, 1 ml of phosphate buffer solution in which various cells were dispersed in a predetermined number of seeded cells was placed in the second chamber 48 and passed through the well array filter.
  • PBS phosphate buffer solution
  • the cells in the wells 3 were stained with an aqueous calcein solution, and the cells in the wells 3 were observed through the bottom plate 42 with an inverted fluorescent microscope, and the single cell rate (%) was measured by dividing the number of wells 3 in which only one cell C was captured in the wells 3 within the field of view of the microscope by the total number of wells 3.
  • the cells used were PBMC (peripheral blood mononuclear cells), PC3 (prostate cancer cells), HL60 (leukemia cells), MCF7 (breast cancer cells), and A549 (human alveolar basal epithelial adenocarcinoma cells).
  • the number of cells seeded on the well array filter was 10,000, 100,000, and 200,000. The results are shown in Table 3.
  • the "Poisson distribution" values in Table 3 indicate the single cell rate (%) calculated statistically from the ratio of the number of seeded cells to the number of wells. As shown in Table 3, for all five types of cells, a higher single cell rate was obtained than the single cell rate of the Poisson distribution obtained by statistical probability calculation. This shows that after the first cell is captured in well 3, it becomes difficult for the second cell to enter, and indicates that the shape of well 3 and the setting of through-hole 8 are appropriate.
  • Figure 17 shows a fluorescence micrograph (magnification: 10x) of the cells stored in well 3 of the well array filter after calcein staining when 200,000 A549 cells were seeded. As shown in Figure 17, all the A549 cells were stored in an orderly fashion in well 3, and no A549 cells were found remaining on the well partition 6.
  • the well partitions between wells are sufficiently thin that particles such as cells and beads are unlikely to remain on the well partitions, and the rate at which excess particles enter one well can be reduced by appropriately setting the opening diameter, allowing particles to be stably captured in wells that are deep enough compared to the opening diameter.
  • the wells are polygonal, it is easy to distinguish between particles and wells during automatic image analysis, and the wells can be arranged at high density, providing the excellent effect of allowing a large number of particles to be screened at once. Therefore, industrial applications are possible.

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Sustainable Development (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Apparatus Associated With Microorganisms And Enzymes (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

このウェルアレイフィルター（１）は、フィルタ本体（２）に複数のウェル（３）が形成され、ウェル（３）の開口部は多角形状もしくは角が丸められた多角形状をなす。ウェル（３）の開口部の円相当径は５μｍ以上２００μｍ以下であり、ウェル底部（４）には貫通孔（８）が少なくとも一つ形成されている。ウェル隔壁（６）の最大厚さは１μｍ以上２０μｍ以下であり、ウェル形成領域の面積に対するウェル（３）の合計開口面積の比率は４０％以上であり、ウェル（３）の深さはウェル隔壁（６）の厚さの２倍以上である。

Description

ウェルアレイフィルター、粒子整列デバイスおよび粒子捕獲方法
　本発明は、細胞やビーズ等の粒子を捕捉するためのウェルアレイフィルター、粒子整列デバイス、および粒子捕獲方法に関する。
　本願は、２０２２年１１月１４日に、日本に出願された特願２０２２－１８１８０１号に基づき優先権を主張し、その内容をここに援用する。
　近年、特に創薬分野において、細胞解析のターゲッ卜が細胞群レベルから単一細胞レベルへと細分化され、細胞スクリーニングデバイス（粒子整列デバイス）を用いて、ウェルアレイフィルターの微細かつ多数のウェル内に細胞を１つ１つ捕捉したうえ、多数の細胞に対し一斉にスクリーニングテストを行い、目的の特性を有する細胞を選別する手法が使用されている。細胞をスクリーニングする方法としては、例えば、多数のウェル内に捕捉した細胞を、特定の抗体と結合するキャッチャーなどの試薬を分散させた液と接触させ、キャッチャーと結合した分泌物を分泌した細胞を探し出し、ウェルから回収する方法などが採用されている。
　特許文献１に開示された粒子整列デバイスは、レジストで作製されたウェルアレイフィルターを備え、このウェルアレイフィルターには、底部に貫通孔を有するウェルが多数配列されて形成されている。各ウェルの開口形状は、細胞に類似させて、円形または楕円形とされている。特許文献１の実施例では、ウェルの開口径は１００μｍ、ウェルの深さは３０～１００μｍ、貫通孔の開口径は２～５μｍとされたウェルアレイフィルターが開示されている。
　特許文献２に開示された粒子整列デバイスは、シリコンウェハで作製されたウェルアレイフィルターを備え、このウェルアレイフィルターには、エッチングにより多数のウェルが配列されて形成され、各ウェルの底部には、貫通孔を形成したＳｉＮｘ膜が設けられている。各ウェルの開口形状は円形とされている。このウェルアレイフィルターは、シリコンウェハから作製されているので、特許文献２の実施例は、フィルタ本体の厚さが３８０μｍ、ウェルの開口径は１００μｍ程度で、ウェル中心間距離は１５０μｍ程度とされている。
　特許文献３に開示された粒子整列デバイスは、細胞を格納するための底部に貫通孔を有するウェル基板と、その細胞からの分泌物を検出するための細胞を格納するための基板の２層からなる分泌アッセイ用のウェルアレイフィルターを備えている。前記ウェル基板は、レジストで作製されている。特許文献３の実施例では、ウェルは円形で開口径は１２μｍと細胞に近いサイズであるが、ウェル中心間の距離は１００μｍ程度とされている。
米国特許第１０３７０６３０号明細書 米国特許第９６３８６３６号明細書 特開２０１９－２１３５６６号公報
　特許文献１～３に記載されたウェルアレイフィルターでは、いずれもウェル間の距離が大きくされているため、ウェルに細胞やビーズ等の粒子が入らずに、ウェル間の隔壁上に残ってしまう頻度が大きかった。また、ウェル間の距離が大きいため、ウェルを高密度に配列できず、多数の細胞等を一度にスクリーニングするにはウェル配列密度が不十分であった。
　また、ウェルの配列密度が低いため、ウェル底部の貫通孔を細胞等が確実に捕獲できる、すなわち細胞等が通り抜けない大きさにすると、ウェルアレイフィルターの面積に占める貫通孔の合計開口面積の比率が小さく、ピペット操作だけでは、ウェルアレイフィルターに十分な量のサンプルを通液しにくいという問題があった。
　また、ウェルの開口形状が円形または楕円形にされているため、ウェル内に捕獲された細胞等を自動で画像解析する場合に、細胞とウェルの形状が似ており、画像解析がしにくいという問題もあった。
　また、特許文献１～３のいずれもウェル隔壁が厚く、さらに特許文献２では硬いシリコンで形成されているため、フィルターの可撓性が乏しく、細いガラスキャピラリーを用いてウェルから細胞等を回収する際に、キャピラリーの先端がウェル隔壁に当たって破損する可能性があり、作業がしにくいという問題も有していた。
　本発明は前記事情に鑑みてなされたものであり、ウェル内に一つずつ細胞等の粒子を捕捉しやすく、多数の粒子のスクリーニングが容易で、自動での画像解析も行いやすいウェルアレイフィルター、粒子整列デバイスおよび粒子捕獲方法を提供することを課題としている。
［態様１］本発明に係る一態様のウェルアレイフィルターは、平板状のフィルタ本体を有し、前記フィルタ本体には前記フィルタ本体の上面のウェル形成領域に開口する複数のウェルが形成され、互いに隣接する前記ウェル同士の間はウェル隔壁によりそれぞれ仕切られ、前記ウェルの下端にはウェル底部がそれぞれ形成され、前記ウェルの開口部は多角形状もしくは角が丸められた多角形状をなし、前記ウェルの開口部の円相当径は５μｍ以上２００μｍ以下であり、前記ウェル底部には前記フィルタ本体の下面に達する貫通孔が少なくとも一つ形成され、前記ウェル隔壁の水平方向の最大厚さは１μｍ以上２０μｍ以下であり、前記ウェル形成領域の面積に対する前記ウェルの合計開口面積の比率は４０％以上であり、前記ウェルの深さは、前記ウェル隔壁の水平方向の最大厚さの２倍以上であることを特徴としている。
　前記態様１のウェルアレイフィルターによれば、ウェル間のウェル隔壁が十分に薄いため、ウェル隔壁上に細胞やビーズ等の粒子が残留しにくいうえ、開口径の適切な設定により複数の粒子が一つのウェルの中に進入する率も減らすことができ、開口径に比して十分に深さのあるウェルで粒子を安定的に捕捉できる。また、ウェルが多角形状であるから自動画像解析の際に粒子とウェルとを識別することが容易であり、さらに高密度にウェルを配置できるため多数の粒子を一度にスクリーニングできる利点を有する。
［態様２］前記態様１において、前記貫通孔の最大内接円直径は４μｍ以下であってもよい。
　この場合、前記貫通孔を細胞またはビーズ等の粒子が通り抜けてしまうことを効果的に抑制することができる。
［態様３］前記態様１または２において、前記ウェル形成領域の面積に対する前記貫通孔の合計開口面積の比率は０．５％以上３．５％以下であってもよい。
　この場合、前記貫通孔の合計開口面積が適切であるためピペット操作でウェルアレイフィルターに通液することが容易である。
［態様４］前記態様１～３のいずれか１つにおいて、前記多角形状は、三角形状、四角形状、または六角形状のいずれかであってもよい。
　この場合、ウェル形状が三角形状、四角形状、または六角形状のいずれかであることにより、フィルタ本体上にウェルを最密配列することが可能である。
［態様５］前記態様１～４のいずれか１つにおいて、前記ウェル隔壁と前記ウェル底部は互いに異なる材質で形成され、前記ウェル底部は前記ウェル隔壁よりも強度の高い材質で形成されていてもよい。
　この場合、前記ウェル底部は前記ウェル隔壁よりも強度の高い材質で形成されているから、ウェルアレイフィルター全体の強度を高めつつ、前記ウェル壁部の成形時の収縮を緩和してウェルアレイフィルターの反りや歪を低減できる。
［態様６］前記態様１～５のいずれか１つにおいて、前記ウェル隔壁と前記ウェル底部は互いに異なる材質で形成され、前記ウェル底部はそれぞれ前記ウェルの開口部の形状に対応したタイル形状に分割されて隣接する前記ウェル底部の間には間隙が形成され、これら間隙内に前記ウェル隔壁を形成する材料が侵入して固化していてもよい。
　この構造によれば、前記ウェル底部がタイル形状に分割されて相互に間隙が形成された状態としたのち、前記ウェル隔壁を形成して前記間隙内に前記ウェル隔壁を形成する材料を侵入固化させることができるため、ウェル底部が一枚板で形成されている場合に比して、固化収縮のためにウェルアレイフィルターに生じる反りや歪を低減できる。
［態様７］前記態様１～６のいずれか１つにおいて、少なくとも前記ウェルの内面に細胞接着を抑制するポリマーが塗布されていてもよい。前記ポリマーは例えば、ＭＰＣポリマー、ＰＥＧ、ＰＶＡ、ＰＭＥＡ、およびこれらの混合物であってもよい。
　この場合、前記ウェルの内面に塗布されたポリマーが細胞接着を抑制するから、ウェルからの細胞または粒子の取り出しが容易になる。前記ポリマーを塗布するのは、前記ウェルの内面だけでなく、前記ウェル隔壁の上面、前記貫通孔の内面、および前記フィルタ本体の下面にも前記ポリマーを塗布してもよい。その場合、前記ウェル隔壁の上面に細胞等が付着したり、前記フィルタ本体の下面に細胞等が付着したりする問題を抑制できる。
［態様８］前記態様１～７のいずれか１つにおいて、前記ウェル底部の厚さは、１ｎｍ以上２μｍ以下であってもよい。
　この場合、前記ウェル底部が薄いために、倒立顕微鏡でウェル内の捕捉物をウェル底部を通して観察しやすい上に、薄い分自家蛍光が小さいために自家蛍光による観察への悪影響も低減できる。
［態様９］本発明の態様９に係る粒子整列デバイスは、前記態様１～８のいずれか１つに記載のウェルアレイフィルターと、前記ウェルアレイフィルターを支持するとともに前記ウェルアレイフィルターの前記ウェルの開口部側から前記貫通孔を通じて前記ウェルの底面側へ向けてサンプル流路を有するデバイス本体を備えたものである。
　前記態様９に係る粒子整列デバイスによれば、ウェル間のウェル隔壁が薄いためウェル隔壁上に細胞やビーズ等の粒子が残留しにくいうえ、ウェルが多角形状であるから自動画像解析の際に粒子とウェルとを識別することが容易であり、開口径に比して十分に深さのあるウェルで粒子を一つずつ安定的にトラップできる。さらに、高密度にウェルを配置できるため多数の粒子を一度にスクリーニングできるメリットを有する。
［態様１０］本発明の態様１０に係る粒子捕獲方法は、前記態様９の粒子整列デバイスの前記サンプル流路に前記ウェルアレイフィルターおよび前記デバイス本体を溶解または変質させない有機溶媒を含む液体を通液させる工程と、前記サンプル流路に水溶液を通液させて前記有機溶媒を含む液を前記水溶液で置換する工程と、前記水溶液で置換された前記サンプル流路に、前記ウェルで捕捉すべき粒子を含む水溶液を通液させ前記ウェル内に前記粒子を捕獲する工程を有する。前記有機溶媒を含む液体は限定されないが、例えば、エチルアルコールや、３０～８０％程度のエチルアルコール等の有機溶媒を含む水溶液等の液体、好ましくは７０％エチルアルコール水溶液などが使用できる。
　態様１０に係る粒子捕獲方法によれば、前記有機溶媒を含む液体を前記サンプル流路に通液させ、次いで前記サンプル流路内を水溶液に置換した後に、細胞、細胞の成分や分泌物を付着させたビーズ、または、細胞の成分や分泌物を付着させるためのビーズ等の粒子を含む水溶液を通液させることにより、ウェルアレイフィルターの通液抵抗が低減されるとともに、ウェルに気泡が残留しにくく、各ウェル内に一つずつ前記細胞または前記粒子を捕獲することが容易である。
　以上説明したように、本発明のウェルアレイフィルターによれば、ウェル間のウェル隔壁が十分に薄いため、ウェル隔壁上に細胞やビーズ等の粒子が残留しにくいうえ、開口径の適切な設定により過剰の粒子が一つのウェルの中に進入する率も減らすことができ、開口径に比して十分に深さのあるウェルで粒子を安定的に捕捉できる。また、ウェルが多角形状であるから自動画像解析の際に粒子とウェルとを識別することが容易であり、さらに高密度にウェルを配置できるため多数の粒子を一度にスクリーニングできるという優れた効果を奏する。
本発明の第１実施形態のウェルアレイフィルターの平面拡大図である。 同実施形態のウェルアレイフィルターの断面拡大図である。 同実施形態のウェルアレイフィルターのウェルの平面拡大図である。 第２実施形態のウェルアレイフィルターのウェルの平面拡大図である。 第３実施形態のウェルアレイフィルターのウェルの平面拡大図である。 第４実施形態のウェルアレイフィルターのウェルの平面拡大図である。 第５実施形態のウェルアレイフィルターのウェルの平面拡大図である。 第６実施形態のウェルアレイフィルターのウェルの平面拡大図である。 第７実施形態のウェルアレイフィルターの平面拡大図である。 第８実施形態のウェルアレイフィルターの平面拡大図である。 （ａ）～（ｆ）はそれぞれ本発明の実施形態のウェルアレイフィルターの製造方法を示す断面拡大図である。 本発明の一実施形態の粒子整列デバイスを示す平面図である。 同実施形態の粒子整列デバイスを示す縦断面図である。 本発明の実施例の効果を示すグラフである。 本発明の実施例の効果を示すグラフである。 本発明の実施例の効果を示すグラフである。 本発明の実施例の効果を示す写真である。
　以下、本発明の実施形態を図面を用いて説明する。
［第１実施形態］
　図１および図２は、ウェルアレイフィルターの第１実施形態を示す平面拡大図および断面拡大図である。このウェルアレイフィルター１は、一定の厚さで平板状のフィルタ本体２を有し、フィルタ本体２には、フィルタ本体２の上面のウェル形成領域に、開口する多数のウェル３が形成されている。ウェル形成領域とは、フィルタ本体２のフィルタとして使用される領域を示し、フィルタ本体２はウェル形成領域の周囲に、フィルタを支持するための、ウェルが形成されていない支持領域等を有していてもよい。
　互いに隣接するウェル３同士の間は、ウェル隔壁６によりそれぞれ仕切られている。個々のウェル３の下端には、図２に示すように平板状のウェル底部４がそれぞれ形成され、ウェル３の下端を塞いでいる。ウェル３の開口部は多角形状もしくは角が丸められた多角形状をなしている。この実施形態では、ウェル３は正六角形状をなし、各ウェル３およびウェル隔壁６は、ハニカム状に配列されている。倒立顕微鏡でウェル３内の細胞Ｃ等の粒子をウェル底部４を通して観察できるように、少なくともウェル底部４は透明な材質で形成されている。ウェル隔壁６も透明な材質で形成されていてもよいが、不透明な材質で形成することも可能である。
　ウェル３の開口部の円相当径は５μｍ以上２００μｍ以下にされている。円相当径とは、ウェル３の開口部と面積が等しい円の直径を示す。ウェル３の開口部の円相当径が５μｍ以上であると、細胞またはビーズ等の粒子を捕捉することが可能となり、２００μｍ以下であると、細胞またはビーズ等の粒子を各ウェル３に一つまたは適切な一定数ずつ、捕捉することが容易になる。ウェル３の開口部の円相当径は、ウェル３で細胞を一つずつ捕捉できるように、より好ましくは１０μｍ以上１００μｍ以下であってもよく、さらに好ましくは１５μｍ以上６０μｍ以下であってもよい。
　なお、ビーズとは、細胞の成分や分泌物を付着させて分析に供するための、樹脂などからなる粒子であり、ウェル３の外で細胞の成分を放出させてビーズに付着させ、前記細胞の成分や分泌物が付着したビーズをウェル３に捕捉して分析に供したり、あるいは、ウェル３内に細胞とビーズを入れ、細胞を壊して細胞の成分や分泌物をウェル３内でビーズに付着させる場合もある。また、磁気を帯びたビーズを使用して、ウェルアレイフィルター１の下方に配置された磁石でビーズを吸い寄せて、ウェル３に捕捉する場合もある。
　ウェル底部４のそれぞれには、フィルタ本体２の下面に達する貫通孔８が少なくとも一つずつ形成されている。この実施形態では、貫通孔８の数はウェル３毎に２つであり、図３に示すように、ウェル底部４の中央に互いに間隔Ｗを開けて、ウェル底部４を垂直に貫通して形成されている。本発明では貫通孔８の数は限定されず、１個でも、３個でも、４個以上であってもよいが、１個だけ中央に貫通孔８を形成する場合には、十分な流量を確保しようとして貫通孔８の径Ｄをある程度大きくすると、細胞Ｃが変形しつつ貫通孔８を通り抜ける可能性が生じる。ウェル底部４に貫通孔８を複数形成した場合は、十分な流量を確保した場合にも細胞Ｃが貫通孔８を通り抜けにくい利点があるとともに、ウェル底部４の中心から外れた位置に少なくとも一部の貫通孔８が形成されるため、細胞Ｃによって全ての貫通孔８が閉塞されることが少なく、細胞Ｃが捕捉された後も貫通孔８を通じてウェル３内の液体を適度に流通させることが容易である。
　ウェル隔壁６の水平方向の最大厚さＢ（図１参照）は、１μｍ以上２０μｍ以下とされている。最大厚さＢが１μｍ以上であることにより、ウェル隔壁６の強度を適切にすることができ、例えばピペットＰをウェル隔壁６の上面に当てて細胞Ｃを吸う場合などに、ウェル隔壁６が崩れてしまうことを防止できる。また、最大厚さＢが２０μｍ以下であることにより、ウェル隔壁６の上に細胞やビーズ等の捕捉すべき粒子が留まってしまうことが抑制でき、ウェル３の密度も高めることができる。また、ピペットＰを当てたときにウェル隔壁６に適度な可撓性をもたらすことができ、ピペットＰの先端の破損を抑制することができる。ウェル隔壁６の最大厚さＢは、好ましくは２μｍ以上２０μｍ以下であってもよく、さらに好ましくは２μｍ以上１２μｍ以下であってもよい。
　ウェル形成領域の面積に対する、ウェル３の合計開口面積の比率は４０％以上とされている。この比率は４０％以上であると、ウェルアレイフィルター１に供給される細胞等の粒子のうち、ウェル３内に捕捉される粒子の割合、すなわち粒子捕捉率を十分に高めることができる。ウェル形成領域の面積に対するウェル３の合計開口面積の比率は、好ましくは４０％以上９５％以下であってもよく、さらに好ましくは４０％以上７５％以下であってもよい。前記比率が高いということは、ウェル隔壁６が薄いということに繋がる。
　ウェル３の深さは、ウェル隔壁６の水平方向の最大厚さＢの２倍以上とされている。ウェル３の深さがウェル隔壁６の厚さＢの２倍以上であると、ウェル３内に捕捉された細胞Ｃ等の粒子が、液体の流れの乱れ等によりウェル３外に抜け出てしまうことが抑制できるから、いったん捕捉された粒子は安定的にウェル３内に保持することができる。より好ましくはウェル３の深さがウェル隔壁６の厚さＢの２倍以上４０倍以下であってもよく、さらに好ましくは２倍以上１５倍以下であってもよい。
　貫通孔８の平面視形状は、この実施形態では円であるが、本発明は円に限定されず、楕円形、三角形、四角形、五角形、六角形などの多角形、角の丸められた多角形、長方形、星形、スリット、鉄アレイ形状、Ｈ型、その他不定形などいかなる形状であってもよい。
　貫通孔８の最大内接円直径は本発明では限定はされないが、４μｍ以下であることが好ましい。最大内接円直径とは、一つの貫通孔８の中に最大の内接円を描いた時の内接円の直径を示す。最大内接円直径が４μｍを越えると、捕捉すべき細胞やビーズなどの粒子がすり抜ける可能性が生じる。好ましくは最大内接円直径は０．１μｍ以上４μｍ以下であってもよく、さらに好ましくは０．５μｍ以上３．５μｍ以下であってもよい。
　ウェル形成領域の面積に対する貫通孔８の合計開口面積の比率は、本発明では限定されないが、０．５％以上３．５％以下であることが好ましい。貫通孔８の合計開口面積とは、ウェル形成領域内に形成されている全ての貫通孔８の開口面積（＝流路断面積）の合計値である。貫通孔８の合計開口面積の比率が０．５％以上であると、貫通孔８を通過する流液抵抗が適度に小さくなるため、ピペットＰの操作でウェルアレイフィルター１に通液することが容易である。貫通孔８の合計開口面積の比率が３．５％以下であると、ピペットＰの操作でウェルアレイフィルター１に通液する際に、液体サンプルが流れすぎることがなく、操作性に優れる。前記貫通孔８の合計開口面積の比率は、好ましくは０．５％以上３．５％以下であってもよく、より好ましくは０．７５％以上３．２％以下であってもよい。
　ウェル３の平面視形状は、多角形状または角を丸められた多角形状であれば、自動画像解析の際に粒子とウェル３とを識別することが容易であるが、多角形状の中でも、三角形状、四角形状、または図示のように六角形状のいずれかであることが好ましい。三角形状、四角形状、または六角形状であると、同一形状のウェル３を規則的に配列してウェル３の配列密度を高めることが可能である。中でも、正三角形状、正四角形状、または正六角形状であると、幾何学的に単純な配列で、ウェル３の配列密度を高めることが可能であるから好ましい。
　ウェル隔壁６とウェル底部４は、互いに同じ材質で形成されていてもよいが、好ましくは、互いに異なる材質で形成され、ウェル底部４はウェル隔壁６よりも強度の高い材質で形成されていてもよい。この場合、ウェルアレイフィルター１全体の強度を高めつつ、ウェル底部４の成形時の収縮を緩和してウェルアレイフィルター１の反りや歪を低減できる。ウェルアレイフィルター１に反りが無いことは、ウェル３に捕捉された粒子を倒立顕微鏡で観察する際に観察範囲全面に焦点を合わせるために重要である。
　ウェル隔壁６とウェル底部４の材質は限定されないが、その微細構造を実現するために各種フォトレジストで形成されていてもよく、フォトレジストの種類や組成を変える、および／または露光条件を変えることにより、ウェル底部４はウェル隔壁６よりも強度の高い材質で形成することが好ましい。ウェル隔壁６とウェル底部４をフォトレジストで形成する場合、例えば、ウェル隔壁６を形成する隔壁レジスト６Ａ（図１１参照）を多官能エポキシ量が相対的に少ないフォトレジストで形成し、ウェル底部４を形成する底部レジスト４Ａ（図１１参照）を多官能エポキシ量が相対的に多いフォトレジストで形成し、ウェル底部４の材質の強度をウェル隔壁６の材質の強度よりも高めることが可能である。この場合、ウェル隔壁６の材質の自家蛍光が相対的に弱く、ウェル底部４の材質の自家蛍光が相対的に強くなりはするが、ウェル底部４の厚さは小さいため、倒立顕微鏡による観察に悪影響を与えることはない。
　本発明ではウェル底部４とウェル隔壁６の形成方法は限定されないが、ウェルアレイフィルター１の応力を緩和するために、好ましくは、ウェル隔壁６とウェル底部４は互いに別々に形成され、ウェル底部４はそれぞれウェル３の開口部の形状に対応したタイル形状に分割され、隣接するウェル底部４の間には間隙が形成され、これら間隙内にウェル隔壁６を形成する材料が侵入して固化している構造とされてもよい。具体的な製造方法の一例を後述する。このようなタイル状にウェル底部４が分割されて、ウェル隔壁６がウェル底部４の間隙に侵入する構造でウェルアレイフィルター１を形成することにより、ウェル底部４の固化収縮のためにウェルアレイフィルター１に反りや歪が生じることを一層抑制できる。
　本発明では必須ではないが、ウェル３の内面の少なくとも一部に、細胞接着を抑制するポリマーが予め塗布されていてもよい。この場合、ウェル３の内面に塗布されたポリマーが細胞Ｃの接着を抑制するから、ウェル３からの細胞Ｃまたは粒子の取り出しが容易になる。この種のポリマーとしては、例えば、ＭＰＣポリマー（２－メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリンポリマー）、ＰＥＧ（ポリエチレングリコール）、ＰＶＡ（ポリビニルアルコール）、ＰＭＥＡ（ポリ（２－メトキシエチルアクリレート））、およびこれらの混合物が採用できる。ポリマーの塗布位置はウェル３の内面だけでなく、ウェル隔壁６の上面、貫通孔８の内面、フィルタ本体２の下面にも前記ポリマーを塗布してもよい。その場合、ウェル隔壁６の上面に細胞等が付着したり、フィルタ本体２の下面に細胞等が付着したりする問題を抑制できる。
　本発明では限定されないが、ウェル底部４の厚さは１ｎｍ以上２μｍ以下であってもよい。この場合、ウェル底部４が十分に薄いために、倒立顕微鏡でウェル３内の細胞Ｃ等の捕捉物をウェル底部４を通して観察しやすい上に、ウェル底部４が薄い分、ウェル底部４の自家蛍光が小さく抑えられ、自家蛍光による観察への悪影響も低減できる。ウェル底部４の厚さはより好ましくは１００ｎｍ以上２μｍ以下であってもよく、さらに好ましくは５００ｎｍ以上１．５μｍ以下であってもよい。
　前記構成からなるウェルアレイフィルター１によれば、ウェル３間のウェル隔壁６が十分に薄いため、ウェル隔壁６上に細胞やビーズ等の粒子が残留しにくいうえ、開口径の適切な設定により複数の粒子が一つのウェル３の中に進入する率も減らすことができ、開口径に比して十分に深さのあるウェル３で粒子を安定的に捕捉できる。また、ウェル３が多角形状であるから自動画像解析の際に粒子とウェル３とを識別することが容易であり、さらに高密度にウェル３を配置できるため多数の粒子を一度にスクリーニングできる利点を有する。
［ウェルアレイフィルターの第２実施形態］
　図４は、ウェルアレイフィルター１の第２実施形態を示し、この例では、ウェル底部４の中央に合計３つの貫通孔８が形成されている。貫通孔８は正三角形の頂点位置にそれぞれ形成されていてもよいが、正三角形以外の二等辺三角形、直角三角形、不等辺三角形の頂点にそれぞれ形成されていてもよい。三角形に配列した場合は、三角形の内側、好ましくは重心位置にウェル底部４の中心が位置することが好ましい。一本の線分上に等間隔または不等間隔で３つの貫通孔８を形成してもよい。その場合、線分上にウェル底部４の中心が位置することが好ましい。第２実施形態の他の構成は、第１実施形態と同様でよく、前述の説明を援用する。この第２実施形態においても、第１実施形態と同様の効果が得られる。
［ウェルアレイフィルターの第３実施形態］
　図５は、ウェルアレイフィルター１の第３実施形態を示し、この例では、ウェル底部４の中央に合計４つの貫通孔８が形成されている。貫通孔８は正方形の頂点位置にそれぞれ形成されていてもよいが、正方形以外の長方形、台形、不等辺四角形の頂点にそれぞれ形成されていてもよい。四角形に配列した場合は、四角形の内側、好ましくは重心位置にウェル底部４の中心が位置することが好ましい。また、３つの貫通孔８を三角形の頂点位置に配列し、三角形の内側もしくは３辺のいずれかの上に、４つ目の貫通孔８を配置してもよい。この場合、三角形は正三角形でもよいが、正三角形以外の二等辺三角形、直角三角形、不等辺三角形であってもよい。三角形に配列した場合は、三角形の内側、好ましくは重心位置にウェル底部４の中心が位置することが好ましい。さらに一本の線分上に等間隔または不等間隔で４つの貫通孔８を形成してもよい。その場合、ウェル底部４の中心が線分上に位置することが好ましい。第３実施形態の他の構成は、第１実施形態と同様でよく、前述の説明を援用する。この第３実施形態においても、第１実施形態および第２実施形態と同様の効果が得られる。
［ウェルアレイフィルターの第４実施形態］
　図６は、ウェルアレイフィルター１の第４実施形態を示し、この例では、ウェル底部４の中央に合計７つの貫通孔８が形成されている。図６の例では、６つの貫通孔８が正六角形の頂点位置にそれぞれ形成され、７つ目の貫通孔８が正六角形の中央に形成されている。図示の配列に限らず、本発明では、Ｍ角形（Ｍ≧３）の頂点位置と、前記Ｍ角形の内側または１以上の辺上にＮ個（Ｎ≧１）の貫通孔８を形成してもよい。第４実施形態の他の構成は、第１実施形態と同様でよく、前述の説明を援用する。この第４実施形態においても、第１～３実施形態と同様の効果が得られる。
［ウェルアレイフィルターの第５実施形態］
　図７は、ウェルアレイフィルター１の第５実施形態を示し、この例では、ウェル底部４の中央に、二つの円をスリットでつないだ平面形状（鉄アレイ形状）の貫通孔８Ａが形成されている。貫通孔８Ａは単純な長穴であってもよい。貫通孔８Ａは曲線状、屈曲線状であってもよい。このような形状を有する貫通孔８Ａの場合、貫通孔８Ａの最大内接円直径が４μｍ以下である場合にも、貫通孔８Ａの開口面積（流路断面積）を大きく確保することができ、細胞やビーズ等の粒子が貫通孔８Ａを通り抜けることを阻止しつつ、貫通孔８Ａの流量を大きくすることができる。この場合、ウェル底部４の中心が貫通孔８Ａ上に位置することが好ましい。第５実施形態の他の構成は、第１実施形態と同様でよく、前述の説明を援用する。この第５実施形態においても、第１～第４実施形態と同様の効果が得られる。
［ウェルアレイフィルターの第６実施形態］
　図８は、ウェルアレイフィルター１の第６実施形態を示し、この例では、ウェル底部４の中央に、中心から放射状に延びる３本以上のスリットと、スリットの末端に形成された円孔からなる平面形状（放射形状）の貫通孔８Ｂが形成されている。貫通孔８Ｂの各スリットは単純な長穴であってもよい。このような形状を有する貫通孔８Ｂの場合にも、貫通孔８Ａの最大内接円直径が４μｍ以下であっても、貫通孔８Ｂの開口面積（流路断面積）を大きく確保することができ、細胞やビーズ等の粒子が貫通孔８Ｂを通り抜けることを阻止しつつ、貫通孔８Ｂの流量を大きくすることができる。この場合、ウェル底部４の中心が貫通孔８Ｂの中心に位置することが好ましい。第６実施形態の他の構成は、第１実施形態と同様でよく、前述の説明を援用する。この第６実施形態においても、第１～第５実施形態と同様の効果が得られる。
［ウェルアレイフィルターの第７実施形態］
　図９は、ウェルアレイフィルターの第７実施形態２０を示し、この例では、ウェル隔壁６が正方眼形状に形成され、ウェル底部４はそれぞれ正方形に形成されていることを特徴とする。ウェル隔壁６は正方眼形状に限定されず、斜方眼形状であっても、直方眼形状であってもよいが、個々のウェル３の形状は互いに同一であることが好ましい。ウェル３を一列ごとに互い違いに配列してもよい。貫通孔８は、第１～第６実施形態のいずれかと同様でよい。第７実施形態の他の構成は、第１実施形態と同様でよく、前述の説明を援用する。この第７実施形態においても、第１～第６実施形態と同様の効果が得られる。
［ウェルアレイフィルターの第８実施形態］
　図１０は、ウェルアレイフィルターの第８実施形態３０を示し、この例では、ウェル隔壁６が正三角形を交互に逆向きに並べた、いわゆるトラス形状に形成され、ウェル底部４はそれぞれ正三角形に形成されていることを特徴とする。ウェル隔壁６は正三角形状に限定されず、二等辺三角形状であっても、直角三角形形状であっても、不等辺三角形状であってもよいが、個々のウェル３の形状は互いに同一であることが好ましい。貫通孔８は、第１～第６実施形態のいずれかと同様でよい。第８実施形態の他の構成は、第１実施形態と同様でよく、前述の説明を援用する。この第８実施形態においても、第１～第７実施形態と同様の効果が得られる。
［ウェルアレイフィルターの製造方法の一実施形態］
　図１１（ａ）～（ｆ）は、ウェルアレイフィルター１，２０，３０の製造方法の一例を示す断面図である。まず、図１１（ａ）に示すように、Ｓｉウェーハ等からなる基板１０上に、レジスト溶媒および現像液に溶解しない犠牲膜１２を形成する。犠牲膜１２は例えばスチレン系エラストマー、デキストリン、またはデキストラン等から形成することができる。
　次に、図１１（ｂ）に示すように、犠牲膜１２上に、ネガ型の底部レジスト４Ａを、ウェル底部４として必要な一定の厚さに形成する。底部レジスト４Ａを所定のパターンで光リソグラフィーにより露光し、さらに現像を行って、図１１（ｃ）に示すように、貫通孔８を有するウェル底部４が、多角形のタイル状をなして、互いに間隙１４を空けて配列された状態とする。間隙１４の幅はウェル隔壁６の厚さよりも若干小さい程度とされる。また、ウェル底部４同士の間隙１４は、部分的に細いブリッジで架橋された状態としてもよい。その場合、ブリッジによりウェル底部４同士の配列が乱れないように位置決めできる。
　次に、図１１（ｄ）に示すように、ウェル底部４を覆う隔壁レジスト６Ａをウェル隔壁６として必要な厚さに形成する。この時、例えば、隔壁レジスト６Ａを多官能エポキシ量が相対的に少ないフォトレジストで形成し、底部レジスト４Ａを多官能エポキシ量が相対的に多いフォトレジストで形成し、ウェル底部４の材質の強度をウェル隔壁６の材質の強度よりも相対的に高めることが好ましい。この場合、副次効果として、ウェル隔壁６の材質の自家蛍光が相対的に弱く、ウェル底部４の材質の自家蛍光が相対的に強くなりはするが、ウェル底部４の厚さは小さいため、倒立顕微鏡による観察に悪影響を与えることはない。隔壁レジスト６Ａに所定のパターンで光リソグラフィーにより露光し、さらに現像を行って、図１１（ｅ）に示すように、ウェル隔壁６を形成する。これにより、間隙１４の内部には隔壁レジスト６Ａが侵入し、露光により間隙１４内で不溶化され、ウェル底部４同士を連結する。
　次に、ウェル底部４およびウェル隔壁６の全体を例えば１８０℃に加熱し、レジストをさらに熱硬化させたのち、レジストを変質させない溶媒で犠牲膜１２を溶解し、基板１０をウェル底部４から剥離して、前記第１～第８実施形態に示すようなウェルアレイフィルター１，２０，３０が完成する。
　前記製造方法によれば、形状精度の高いウェル３を有するウェルアレイフィルター１，２０，３０が効率よく製造できる。また、この製造方法によれば、ウェル底部４がタイル形状に分割されて相互に間隙１４が形成された状態としたのち、ウェル隔壁６を形成して間隙１４内にウェル隔壁６を形成する材料を侵入固化させるため、ウェル底部４の固化収縮のためにウェルアレイフィルター１，２０，３０に生じる反りや歪を低減できる。
［粒子整列デバイスの実施形態］
　図１２および図１３は、本発明に係る粒子整列デバイスの一実施形態４０を示す平面図および縦断面図である。この粒子整列デバイス４０は、長方形状の底板部４２と、底板部４２の中央部に形成された壁部４４とを有する。壁部４４は、底板部４２から起立する四角い枠状の周壁部と、この周壁部の内側に起立して互いに平行に形成された２枚の隔壁を有し、周壁部の内側が隔壁により、第１室４６、第２室４８、および第３室５０に区画されている。第１室４６の底部には円筒状の開口部５２が形成され、第３室５０の底部にも円筒状の開口部５４が形成されている。
　第２室４８の底は開いており、図１３に示すように、ウェルアレイフィルター１，２０，３０が底板部４２から僅かな流路５６を空けて壁部４４の下端に固定されている。第１室４６の底部と底板部４２の間、第３室５０の底部と底板部４２の間もそれぞれ一定の間隙が空けられ、流路５６を形成している。これにより、第２室４８内に細胞Ｃやビーズ等の粒子を含む液体サンプルを入れ、開口部５２または開口部５４から液体を流出させることにより、ウェルアレイフィルター１のウェル３内に細胞Ｃやビーズ等の粒子を捕捉することが可能である。すなわち、第２室４８、ウェルアレイフィルター１、流路５６へと到るサンプル流路が形成される。また、開口部５２または開口部５４から試薬を入れて第２室４８内の細胞Ｃやビーズ等の粒子と反応させることもできる。
［粒子捕獲方法の実施形態］
　本発明に係る粒子捕獲方法の一実施形態は、粒子整列デバイス４０のウェルアレイフィルター１，２０，３０を通じるサンプル流路、すなわち、ウェル３の開口部側から貫通孔８を通じてウェル３の底面側へ通じるサンプル流路に、ウェルアレイフィルター１およびデバイス本体４０を溶解または変質させない有機溶媒を含む液体を通液させる工程と、前記サンプル流路に水溶液を通液させて前記有機溶媒を含む液体を前記水溶液で置換する工程と、前記サンプル流路に、ウェル３で捕捉すべき粒子を含む水溶液を通液させ、ウェル３内に粒子を捕獲する工程とを有する。
　具体的には、粒子整列デバイス４０の第２室４８にエチルアルコール等の水溶性かつ低界面張力の有機溶媒、あるいは、３０～８０％程度のエチルアルコール等の有機溶媒を含む水溶液等の液体を供給し、ウェルアレイフィルター１，２０，３０に有機溶媒を含む液体を通液させる。前記液体としては、例えば７０％エチルアルコール水溶液なども好適に使用できる。これにより、貫通孔８にも有機溶媒が満たされる。次に、リン酸緩衝液 (ＰＢＳ)などの緩衝液等の水溶液を第２室４８に加え、開口部５２および／または開口部５４から有機溶媒を含む液体を吸引する。これを数回繰り返して、第２室４８、貫通孔８、および流路５６の内部の有機溶媒を含む液体をリン酸緩衝液の水溶液で置換する。
　次に、リン酸緩衝液等に細胞Ｃおよび／またはビーズ等の粒子を分散させたサンプル液体を第２室４８に供給し、開口部５２および／または開口部５４からリン酸緩衝液を吸引することにより、細胞Ｃおよび／またはビーズは各ウェル３に一つずつもしくはほぼ一定の個数ずつ捕捉される。
　次に、ターゲットとする細胞Ｃまたは細胞分泌物が付着したビーズと結合する試薬を第２室４８または開口部５２，５４から加え、ターゲットをマーキングした後、倒立顕微鏡でターゲットを特定し、ピペットＰやキャピラリー等でウェル３からターゲットとなる細胞Ｃまたはビーズを補集する。
　以上の粒子捕獲方法によれば、ウェルアレイフィルター１を通じるサンプル流路に有機溶媒を含む液体を通液させ、さらに水溶液で置換した後に、細胞、細胞の成分や分泌物を付着させたビーズ、または、細胞の成分や分泌物を付着させるためのビーズ等の粒子を含む水溶液を通液させることにより、通液抵抗が減少するとともに、ウェル３に気泡が残留しにくくなり、各ウェル３内に一つずつもしくは所定数ずつ細胞Ｃまたはビーズ等の粒子を捕獲することが容易となる。したがって、多数の粒子のスクリーニングが安定して行える利点を有する。
　以上、本発明の実施形態を説明したが、本発明はこれら実施形態のみに限定されず、特許請求の範囲に記載された範囲内で、構成要件の追加、削除、および変更が可能である。
　次に、実施例を挙げて本発明の効果を実証する。
［実験１］
　図１４は、図１および図２に示すように、ウェル３の開口部を正六角形としたウェルアレイフィルター１を、ウェル３の開口幅とウェル隔壁６の水平方向厚さを様々に変えて作成した場合の、ウェル３の開口率を示したグラフである。図１４中、「Ｈｅｘ１０」はウェル３が正六角形で平行な２辺間の開口幅が１０μｍ、「Ｈｅｘ２０」は同様に開口幅が２０μｍ、「Ｈｅｘ５０」は同様に開口幅が５０μｍ、「Ｈｅｘ１００」は同様に開口幅が１００μｍであることを示す。横軸の隔壁幅（μｍ）は、ウェル隔壁６の隔壁の水平方向の厚さ（μｍ）を示す。ウェル３が正六角形で平行な２辺間の開口幅がＡ（μｍ）の場合、ウェル３の円相当径は１．０５００７５×Ａとなる。縦軸の開口率は、ウェル形成領域の面積に対するウェル３の合計開口面積の比率を示す。図１４に示すように、点線内で囲まれる場合に、隔壁幅１～２０μｍ、開口率０．４（＝４０％）以上となることがわかる。
［実験２］
　図１５は、図１および図２に示すように、ウェル３の開口部を正六角形としたウェルアレイフィルター１を、ウェル３の開口幅と、ウェル隔壁６の厚さと、貫通孔８の寸法、形状および個数を様々に変えて作成した場合の、貫通孔８の合計開口率（％）を示したグラフである。図１５中、「Ｈｅｘ１０」～「Ｈｅｘ１００」は図１４と同じであり、「Ｈｅｘ１２５」はウェル３の平行な２辺間の開口幅が１２５μｍであることを示す。横軸の「ウェル開口径＋壁厚」は、ウェル３の平行な２辺間の開口幅（μｍ）＋ウェル隔壁６の水平方向の厚さ（μｍ）を示す。縦軸の貫通孔開口率（％）は、ウェル形成領域の面積に対する貫通孔８の合計開口面積の比率（％）を示す。「２．５μｍΦ×４」は直径２．５μｍの円径の貫通孔８を各ウェル３毎に４個形成したことを示す。「２．８μｍ×４．６μｍ×４」は、２．８μｍ×４．６μｍの長方形の貫通孔８を各ウェル３毎に４個形成したことを示す。図１５に示すように、点線内で囲まれる場合に、ウェル３の開口幅が５μｍ以上、ウェル隔壁６の厚さが１μｍ以上、貫通孔開口率が０．５～３．５％となることがわかる。
［実験３］
　図１１およびウェルアレイフィルターの製造方法の一実施形態で説明した方法により、実施例１～８および比較例のウェルアレイフィルターを実際に製造した。ウェル３の開口部は正六角形とした。隔壁レジスト６Ａは多官能エポキシ量が相対的にネガ型の少ないフォトレジストで形成し、底部レジスト４Ａは多官能エポキシ量が相対的に多いネガ型のフォトレジストで形成した。
　表１は、製造された実施例１～８および比較例のウェルアレイフィルターの各パラメータを示し、「Ｈｅｘ１０－２０」はウェル３が正六角形で、平行な２辺間の開口幅の目標値が１０μｍ、ウェル３の深さの目標値が２０μｍであることを示している。他も同様である。「ウェル形状」における「開口径（μｍ）」は正六角形の平行な２辺間の開口径、「隔壁幅（μｍ）」はウェル隔壁６の水平方向の厚さ、「深さ（μｍ）」はウェル３の深さ、「開口率」はウェル形成領域の面積に対するウェル３の合計開口面積の比率（％）、「密度（ｃｍ－２）」はウェル形成領域の１ｃｍ２当たりに形成されているウェル３の個数を示している。「貫通孔形状」における「貫通孔数」はウェル３一つ当たりの貫通孔８の個数、「開口形状」は個々の貫通孔８の開口形状、「開口部寸法」の「２．８」は円の直径、「３．１５／５．１９」は３．１５μｍ×５．１９μｍの角が丸く面取りされた長方形であることを示し、「開口率」はウェル形成領域の面積に対する貫通孔８の合計開口率（％）を示している。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
　表１に示すように、実施例１～８は貫通孔８の合計開口率が０．５０％以上となったが、比較例は０．５０％に満たず、０．３８％となった。
［実験４］
　実施例２，６，７，８および比較例のウェルアレイフィルターを用いて、エチルアルコールの通液時間の測定を行った。各ウェルアレイフィルターを図１２および図１３に示すような粒子整列デバイス４０に装着した。ウェルアレイフィルターのウェル形成領域は１７ｍｍ×１７ｍｍの正方形とした。第２室４８にエチルアルコールを０．５ｍｌ注入し、ウェルアレイフィルターを通過して流路５６にエチルアルコールの全量が流れ込むまでの通液時間（秒）を測定した。結果を表２に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
　実施例２，６，７，８では５１秒以内に通液が完了したが、比較例では通液に９９秒を要した。実用上、エチルアルコールの通液時間が６０秒以下であると使用しやすいため、貫通孔開口率は０．５％以上が望ましいことがわかった。図１６は、表２の結果をプロットしたグラフである。
［実験５］
　実施例２のウェルアレイフィルター（ウェル形成領域：１７ｍｍ×１７ｍｍ）を粒子整列デバイス４０に装着し、エチルアルコールの通液後、リン酸緩衝液 (ＰＢＳ)を３回通液した。次に、各種の細胞を所定の播種細胞数だけ分散させたリン酸緩衝液１ｍｌを第２室４８に入れて、ウェルアレイフィルターに通液した。次に、カルセイン水溶液でウェル３内の細胞を染色し、倒立型蛍光顕微鏡で底板部４２を通してウェル３内の細胞を観察し、顕微鏡の視野内で、ウェル３に細胞Ｃが一つだけ捕捉されているウェル３の個数を全ウェル３の個数で除したシングルセル率（％）を計測した。
　細胞としては、ＰＢＭＣ（末梢血単核細胞）、ＰＣ３（前立腺癌細胞）、ＨＬ６０（白血病細胞）、ＭＣＦ７（乳がん細胞）、およびＡ５４９（ヒト肺胞基底上皮腺癌細胞）を使用した。ウェルアレイフィルターへの播種細胞数は１００００、１０００００、２０００００とした。その結果を表３に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
　表３の「ポアソン分布」の数値は、播種細胞数とウェル数の比率から統計的に計算されたシングルセル率（％）を示す。表３に示すように、５種類のいずれの細胞でも、統計的な確率計算で求められたポアソン分布のシングルセル率よりも、高いシングルセル率が得られた。これは、ウェル３に一つ目の細胞が捕捉された後は、２つ目の細胞が入りにくくなることを示し、ウェル３の形状や貫通孔８の設定が適切であることを示している。
　特に、細胞の大きさが１０ｍｍ程度であり、貫通孔８の開口径に対して大きい粒径を有するがん細胞株（ＰＣ３、ＨＬ６０、ＭＣＦ７、Ａ５４９）では、細胞数／ウェル数比によらず、高いシングルセル率が得られた。
　図１７は、Ａ５４９細胞を２００，０００個播種した場合に、ウェルアレイフィルターのウェル３に格納された細胞のカルセイン染色後の蛍光顕微鏡写真（倍率：１０倍）である。図１７に示すように、Ａ５４９細胞はすべてウェル３に規則的に格納され、ウェル隔壁６上に残ったＡ５４９細胞は見られなかった。
［実験６］
　実施例２および実施例６のウェルアレイフィルターを粒子整列デバイス４０に搭載し、リン酸緩衝液に分散させたＡ５４９細胞を播種し、ウェル３にシングルセルとしてＡ５４９細胞を格納した。次に、自動細胞ピックアップ装置：ALS Automated Lab Solutions社製商品名「CellCelector」を用い、内径２０μｍのガラスキャピラリーの下端を、細胞が格納された所定のウェル３の直上に垂直に当接して配置し、ウェル３内から１００ｎＬの液体を吸引した。吸引によって、所定のウェル３の周囲のウェル３に格納された細胞を吸い上げることはなく、所定のウェル３に格納された細胞のみをガラスキャピラリーで回収することができた。ガラスキャピラリーの先端が破損することもなかった。
　本発明によれば、ウェル間のウェル隔壁が十分に薄いため、ウェル隔壁上に細胞やビーズ等の粒子が残留しにくいうえ、開口径の適切な設定により過剰の粒子が一つのウェルの中に進入する率も減らすことができ、開口径に比して十分に深さのあるウェルで粒子を安定的に捕捉できる。また、ウェルが多角形状であるから自動画像解析の際に粒子とウェルとを識別することが容易であり、さらに高密度にウェルを配置できるため多数の粒子を一度にスクリーニングできるという優れた効果を奏する。したがって、産業上の利用が可能である。
１　　　ウェルアレイフィルター　　　　　　　　　２　　　フィルタ本体
３　　　ウェル　　　　　　　　　　　　　　　　　４　　　ウェル底部
４Ａ　　底部レジスト　　　　　　　　　　　　　　６　　　ウェル隔壁
６Ａ　　隔壁レジスト　　　　　　　　　　　　　　８　　　貫通孔
１０　　基板　　　　　　　　　　　　　　　　　　１２　　犠牲膜
１４　　間隙　　　　　　　　　　　　　　　　　　２０　　ウェルアレイフィルター
３０　　ウェルアレイフィルター　　　　　　　　　４０　　粒子整列デバイス
４１　　デバイス本体　　　　　　　　　　　　　　４２　　底板部
４４　　壁部　　　　　　　　　　　　　　　　　　４６　　第１室
４８　　第２室　　　　　　　　　　　　　　　　　５０　　第３室
５２　　開口部　　　　　　　　　　　　　　　　　５４　　開口部
５６　　流路　　　　　　　　　　　　　　　　　　Ａ　　　開口径
Ｂ　　　隔壁厚さ　　　　　　　　　　　　　　　　Ｃ　　　細胞
Ｐ　　　ピペット　　　　　　　　　　　　　　　　Ｗ　　　離間幅
Ｄ　　　直径

Claims (10)

  1. 　平板状のフィルタ本体を有し、
    　前記フィルタ本体には前記フィルタ本体の上面のウェル形成領域に開口する複数のウェルが形成され、
    　互いに隣接する前記ウェル同士の間はウェル隔壁によりそれぞれ仕切られ、
    　前記ウェルの下端にはウェル底部がそれぞれ形成され、
    　前記ウェルの開口部は多角形状もしくは角が丸められた多角形状をなし、
    　前記ウェルの開口部の円相当径は５μｍ以上２００μｍ以下であり、
    　前記ウェル底部には前記フィルタ本体の下面に達する貫通孔が少なくとも一つ形成され、
    　前記ウェル隔壁の水平方向の最大厚さは１μｍ以上２０μｍ以下であり、
    　前記ウェル形成領域の面積に対する前記ウェルの合計開口面積の比率は４０％以上であり、
    　前記ウェルの深さは、前記ウェル隔壁の水平方向の最大厚さの２倍以上であることを特徴とするウェルアレイフィルター。
  2. 　前記貫通孔の最大内接円直径は４μｍ以下であることを特徴とする請求項１に記載のウェルアレイフィルター。
  3. 　前記ウェル形成領域の面積に対する前記貫通孔の合計開口面積の比率は０．５％以上３．５％以下であることを特徴とする請求項１または２に記載のウェルアレイフィルター。
  4. 　前記多角形状は、三角形状、四角形状、または六角形状のいずれかであることを特徴とする請求項１または２に記載のウェルアレイフィルター。
  5. 　前記ウェル隔壁と前記ウェル底部は互いに異なる材質で形成され、前記ウェル底部は前記ウェル隔壁よりも強度の高い材質で形成されていることを特徴とする請求項１または２に記載のウェルアレイフィルター。
  6. 　前記ウェル隔壁と前記ウェル底部は互いに異なる材質で形成され、前記ウェル底部はそれぞれ前記ウェルの開口部の形状に対応したタイル形状に分割されて隣接する前記ウェル底部の間には間隙が形成され、これら間隙内に前記ウェル隔壁を形成する材料が侵入して固化していることを特徴とする請求項１または２に記載のウェルアレイフィルター。
  7. 　少なくとも前記ウェルの内面に細胞接着を抑制するポリマーが塗布されていることを特徴とする請求項１または２に記載のウェルアレイフィルター。
  8. 　前記ウェル底部の厚さは、１ｎｍ以上２μｍ以下であることを特徴とする請求項１または２に記載のウェルアレイフィルター。
  9. 　請求項１または２に記載のウェルアレイフィルターと、前記ウェルアレイフィルターを支持するとともに前記ウェルアレイフィルターの前記ウェルの開口部側から前記貫通孔を通じて前記ウェルの底面側へ向けて通じるサンプル流路を有するデバイス本体を備えたことを特徴とする粒子整列デバイス。
  10. 　請求項９の粒子整列デバイスの前記サンプル流路に前記ウェルアレイフィルターおよび前記デバイス本体を溶解または変質させない有機溶媒を含む液体を通液させる工程と、
    　前記サンプル流路に水溶液を通液させて有機溶媒を含む液体を前記水溶液で置換する工程と、
    　前記サンプル流路に、前記ウェルで捕捉すべき粒子を含む水溶液を通液させ前記ウェル内に前記粒子を捕獲する工程を有する粒子捕獲方法。
PCT/JP2023/037086 2022-11-14 2023-10-12 ウェルアレイフィルター、粒子整列デバイスおよび粒子捕獲方法 WO2024106092A1 (ja)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2022-181801 2022-11-14
JP2022181801A JP2024071066A (ja) 2022-11-14 2022-11-14 ウェルアレイフィルター、粒子整列デバイスおよび粒子捕獲方法

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2024106092A1 true WO2024106092A1 (ja) 2024-05-23

Family

ID=91084127

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/JP2023/037086 WO2024106092A1 (ja) 2022-11-14 2023-10-12 ウェルアレイフィルター、粒子整列デバイスおよび粒子捕獲方法

Country Status (2)

Country Link
JP (1) JP2024071066A (ja)
WO (1) WO2024106092A1 (ja)

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2008532539A (ja) * 2005-03-16 2008-08-21 ロビオ システムズ リミテッド 細胞の実体の成熟および輸送システム
WO2021065765A1 (ja) * 2019-09-30 2021-04-08 東京応化工業株式会社 細胞スクリーニングデバイスおよび細胞スクリーニングキット
WO2021262572A1 (en) * 2020-06-25 2021-12-30 Corning Incorporated Ultrasonic devices and methods of use
JP2022536796A (ja) * 2019-06-17 2022-08-18 ジョージア テック リサーチ コーポレイション クラスター化粒子を分離するためのろ過ベースのシステムおよび方法

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2008532539A (ja) * 2005-03-16 2008-08-21 ロビオ システムズ リミテッド 細胞の実体の成熟および輸送システム
JP2022536796A (ja) * 2019-06-17 2022-08-18 ジョージア テック リサーチ コーポレイション クラスター化粒子を分離するためのろ過ベースのシステムおよび方法
WO2021065765A1 (ja) * 2019-09-30 2021-04-08 東京応化工業株式会社 細胞スクリーニングデバイスおよび細胞スクリーニングキット
WO2021262572A1 (en) * 2020-06-25 2021-12-30 Corning Incorporated Ultrasonic devices and methods of use

Also Published As

Publication number Publication date
JP2024071066A (ja) 2024-05-24

Similar Documents

Publication Publication Date Title
KR101111231B1 (ko) 마이크로 웰 어레이 칩 및 그 제조방법
US12018277B2 (en) Filter for filtering nucleated cells and filtering method using the same
DE69432402T2 (de) Chemotaktische testvorrichtung und verfahren mit mehreren angriffspunkten
JP7074148B2 (ja) 有核細胞の濾過用フィルターおよびそれを用いた濾過方法
CN113192816B (zh) 一种电子显微镜载网、其制备方法和显微镜产品
CN110520206A (zh) 微流体过滤装置
US10704019B2 (en) Cell filtration filter
TW201902816A (zh) 微流道晶片及其製作方法
US20240207762A1 (en) Filtration filter
WO2024106092A1 (ja) ウェルアレイフィルター、粒子整列デバイスおよび粒子捕獲方法
KR102430124B1 (ko) 입자 포착 디바이스
US11774445B2 (en) Particle trapping device and particle trapping method
WO2024106089A1 (ja) ウェルアレイフィルター、粒子整列デバイスおよび粒子捕獲方法
CN104093470B (zh) 用于捕获液体中的颗粒或细胞的柔性过滤装置
GB2430393A (en) Micro Device for Automatic Spermatozoa Selection and Cell Sorting
TW202434713A (zh) 井陣列過濾器、粒子整列裝置以及粒子捕獲方法
KR20220070217A (ko) 세포 스크리닝 디바이스 및 세포 스크리닝 키트
CN215342494U (zh) 一种电子显微镜载网及电子显微镜
EP2605012A1 (en) Cell capturing filter having high aspect ratio
WO2024106343A1 (ja) ウェルアレイフィルター、ウェルアレイデバイス、及び、ウェルアレイフィルターの製造方法
JP2012076027A (ja) 貫通孔規則配列フィルタ及びその製造方法
KR102150748B1 (ko) 서브-비져블의 고정밀 정량화
CN221907168U (zh) 一种微流道芯片
TW202434357A (zh) 井陣列過濾器、井陣列裝置、井陣列過濾器的製造方法
TW202349758A (zh) 金屬板和使用其的沉積遮罩及其製造方法

Legal Events

Date Code Title Description
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application

Ref document number: 23891250

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1