JP7074148B2 - 有核細胞の濾過用フィルターおよびそれを用いた濾過方法 - Google Patents

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Description

本発明は、有核細胞の濾過用フィルターおよびそれを用いた濾過方法に関する。
特許文献1には、赤血球と有核細胞と血小板とを含んでなる液体から、細胞捕捉フィルター材を用いて単核細胞と血小板とを濃縮する方法が開示されている。特許文献1の細胞捕捉フィルター材は、有核細胞と血小板とを捕捉し、赤血球のような不要な細胞を通過させている。
特開2009-284860号公報
しかしながら、特許文献1の細胞捕捉フィルター材では、有核細胞の回収率の向上といった点で、未だ改善の余地がある。
本発明は、有核細胞の回収率を向上させることができる有核細胞の濾過用フィルターおよびそれを用いた濾過方法を提供することを目的とする。
本発明の一態様のフィルターは、
有核細胞の濾過用フィルターであって、
金属及び金属酸化物の少なくともいずれかを主成分とし、
複数の貫通孔が形成されており、
前記貫通孔の内接円の直径は、前記有核細胞の核の大きさより小さい。
本発明の一態様の濾過方法は、
有核細胞の濾過方法であって、
金属及び金属酸化物の少なくともいずれかを主成分とし、複数の貫通孔が形成されており、前記貫通孔の内接円の直径は、前記有核細胞の核の大きさより小さいフィルターを準備するステップ、
前記有核細胞を含む液体を前記フィルターに通過させるステップ、
を含む。
本発明によれば、有核細胞の回収率を向上させることができる有核細胞の濾過用フィルターおよびそれを用いた濾過方法を提供することができる。
本発明に係る実施の形態1のフィルターの概略構成図である。 本発明に係る実施の形態1のフィルターの一部の拡大斜視図である。 図2のフィルターの一部を厚み方向から見た概略図である。 本発明に係る実施の形態1のフィルターに支持基材を設けた概略図である。
(本発明に至った経緯)
特許文献1では、不織布で構成される細胞捕捉フィルター材を用いて、有核細胞と血小板とを捕捉し、赤血球のような不要な細胞を通過させることによって、血液から単核細胞を分離している。しかしながら、特許文献1の細胞捕捉フィルターでは、単核細胞の回収率が74%程度であり、捕捉対象である細胞の回収率の向上といった点で未だ改善の余地がある。
本発明者らは、鋭意研究したところ、金属及び金属酸化物の少なくともいずれかを主成分とするフィルターを用いて、有核細胞を含む液体に対して濾過を行うことによって、捕捉対象である有核細胞の回収率を向上させることができることを見出し、本発明に至った。
本発明の一態様のフィルターは、
有核細胞の濾過用フィルターであって、
金属及び金属酸化物の少なくともいずれかを主成分とし、
複数の貫通孔が形成されており、
前記貫通孔の内接円の直径は、前記有核細胞の核の大きさより小さい。
このような構成により、有核細胞の回収率を向上させることができる。
前記フィルターにおいて、前記有核細胞の核の大きさに対する前記貫通孔の内接円の直径の割合は、0.64以下であってもよい。
このような構成により、有核細胞の回収率を更に向上させることができる。
前記フィルターにおいて、前記有核細胞の核の大きさに対する前記貫通孔の内接円の直径の割合は、0.06以上であってもよい。
このような構成により、有核細胞の回収率を更に向上させることができる。
前記フィルターにおいて、前記有核細胞の核の大きさに対する前記貫通孔の内接円の直径の割合は、0.07以上であってもよい。
このような構成により、濾過時間を短縮すると共に、有核細胞の回収率を更に向上させることができる。
前記フィルターにおいて、前記有核細胞を含む液体が接触する側に平滑な主面を有していてもよい。
このような構成により、フィルター部の主面で捕捉した有核細胞を容易に回収することができる。
前記フィルターにおいて、前記金属及び前記金属酸化物の少なくともいずれかは、リン酸緩衝生理食塩水中での、飽和塩化カリウム溶液に浸された塩化銀からなる参照電極基準の浸漬電位が0.03Vより貴であってもよい。
このような構成により、フィルターの成分である金属又は金属酸化物が有核細胞を含む液体中に溶出することを防止することができる。
前記フィルターにおいて、前記金属及び前記金属酸化物の少なくともいずれかは、金、銀、銅、白金、ニッケル、パラジウム、これらの合金及びこれらの酸化物からなる群から選択された少なくとも1つを含有していてもよい。
このような構成により、有核細胞の回収率を更に向上させることができる。
本発明の一態様の濾過方法は、
有核細胞の濾過方法であって、
金属及び金属酸化物の少なくともいずれかを主成分とし、複数の貫通孔が形成されており、前記貫通孔の内接円の直径は、前記有核細胞の核の大きさより小さいフィルターを準備するステップ、
前記有核細胞を含む液体を前記フィルターに通過させるステップ、
を含む。
このような構成により、有核細胞の回収率を向上させることができる。
前記濾過方法において、前記有核細胞の核の大きさに対する前記貫通孔の内接円の直径の割合は、0.64以下であってもよい。
このような構成により、有核細胞の回収率を更に向上させることができる。
前記濾過方法において、前記有核細胞の核の大きさに対する前記貫通孔の内接円の直径の割合は、0.06以上であってもよい。
このような構成により、有核細胞の回収率を更に向上させることができる。
前記濾過方法において、前記有核細胞の核の大きさに対する前記貫通孔の内接円の直径の割合は、0.07以上であってもよい。
このような構成により、濾過時間を短縮すると共に、有核細胞の回収率をより更に向上させることができる。
前記濾過方法において、前記フィルターは、前記有核細胞を含む液体が接触する側に平滑な主面を有していてもよい。
このような構成により、フィルターの主面で捕捉した有核細胞を容易に回収することができる。
前記濾過方法において、前記金属及び前記金属酸化物の少なくともいずれかは、リン酸緩衝生理食塩水中での、飽和塩化カリウム溶液に浸された塩化銀からなる参照電極基準の浸漬電位が0.03Vより貴であってもよい。
このような構成により、フィルターの成分である金属又は金属酸化物が有核細胞を含む液体中に溶出することを防止することができる。
前記濾過方法において、前記金属及び前記金属酸化物の少なくともいずれかは、金、銀、銅、白金、ニッケル、パラジウム、これらの合金及びこれらの酸化物からなる群から選択された少なくとも1つを含有していてもよい。
このような構成により、有核細胞の回収率を更に向上させることができる。
前記濾過方法において、前記有核細胞を含む液体を前記フィルターに通過させるステップは、生細胞と死細胞とを分離するステップを含んでもよい。
このような構成により、生細胞と死細胞とを分離することができる。
以下、本発明に係る実施の形態1について、添付の図面を参照しながら説明する。また、各図においては、説明を容易なものとするため、各要素を誇張して示している。
(実施の形態1)
[フィルターの構成]
図1は、本発明に係る実施の形態1のフィルター10の概略構成図である。図2は、本発明に係る実施の形態1におけるフィルター10の一部の拡大斜視図である。図1及び図2中のX、Y、Z方向は、それぞれフィルター10の縦方向、横方向、厚み方向を示している。図1に示すように、フィルター10は、フィルター部11と、フィルター部11の外周に設けられた枠部15とを備える。図2に示すように、フィルター10は、互いに対向する第1主面PS1と第2主面PS2とを有している。フィルター部11は、第1主面PS1と第2主面PS2とを貫通する複数の貫通孔12が形成されたフィルター基体部14を備える。貫通孔12の内接円の直径は、有核細胞の核の大きさより小さくなるように設計されている。
フィルター10は、有核細胞を含む液体(細胞懸濁液)をフィルター部11に通過させることによって、有核細胞を濾過するものである。
本明細書において、「有核細胞」とは、核小体と細胞質とが核膜によって隔てられている細胞である。
<材質>
フィルター10の基体部分を形成するフィルター基体部14を構成する材料は、金属及び/又は金属酸化物を主成分としている。フィルター基体部14は、例えば、金、銀、銅、白金、ニッケル、パラジウム、これらの合金及びこれらの酸化物であってもよい。
フィルター10の最表層は、細胞懸濁液へ溶出しにくい金属及び/又は金属酸化物で構成されていてもよい。例えば、フィルター10の最表層が、リン酸緩衝生理食塩水中での、飽和塩化カリウム溶液に浸された塩化銀からなる参照電極基準の浸漬電位が0.03Vより貴である金属で覆われている場合、フィルター10を構成する材料が、細胞懸濁液へ溶出することを抑制することができる。これにより、細胞へのストレスを低減することができる。あるいは、フィルター10の最表層は、親水性の材料で構成されていてもよい。例えば、水系の細胞懸濁液を処理する場合に、処理時間を短縮することができるため、細胞へのストレスを低減することができる。
<外形>
フィルター10の外形は、例えば、円形、長方形、又は楕円形である。実施の形態1では、フィルター10の外形は、略円形である。フィルター10の外形を略円形にすることによって、フィルター10の主面(例えば、フィルター部11の第1主面PS1)に対して流体を均一に流すことができる。なお、本明細書において、「略円形」とは、短径の長さに対する長径の長さの比が1.0以上1.2以下であることをいう。
<フィルター部>
フィルター部11は、複数の貫通孔12が形成された板状構造体である。フィルター部11の形状は、例えば、円形、長方形、楕円形である。実施の形態1では、フィルター部11の形状は、略円形である。フィルター部11の形状を略円形にすることによって、フィルター部11の第1主面PS1に対して流体を均一に流すことができる。
図3は、フィルター部11の一部を厚み方向(Z方向)から見た概略図である。図3に示すように、複数の貫通孔12は、フィルター部11の第1主面PS1及び第2主面PS2上に周期的に配置されている。具体的には、複数の貫通孔12は、フィルター部11においてマトリクス状に等間隔で設けられている。
実施の形態1では、貫通孔12は、フィルター部11の第1主面PS1側、即ちZ方向から見て、正方形の形状を有する。なお、貫通孔12は、Z方向から見た形状が正方形に限定されず、例えば長方形、円形、又は楕円などの形状であってもよい。
実施の形態1では、フィルター部11の第1主面PS1に対して垂直な面に投影した貫通孔12の形状(断面形状)は、長方形である。具体的には、貫通孔12の断面形状は、フィルター10の半径方向の一辺の長さがフィルター10の厚み方向の一辺の長さより長い長方形である。なお、貫通孔12の断面形状は、長方形に限定されず、例えば、平行四辺形又は台形等のテーパー形状であってもよいし、対称形状であってもよいし、非対称形状であってもよい。
実施の形態1では、複数の貫通孔12は、フィルター部11の第1主面PS1側(Z方向)から見て正方形の各辺と平行な2つの配列方向、即ち図3中のX方向とY方向に等しい間隔で設けられている。このように、複数の貫通孔12を正方格子配列で設けることによって、開口率を高めることが可能であり、フィルター10に対する流体の通過抵抗を低減することができる。このような構成により、処理時間を短くし、細胞へのストレスを低減することができる。また、複数の貫通孔12の配列の対称性が向上するため、フィルターの観察が容易になる。
なお、複数の貫通孔12の配列は、正方格子配列に限定されず、例えば、準周期配列、又は周期配列であってもよい。周期配列の例としては、方形配列であれば、2つの配列方向の間隔が等しくない長方形配列でもよく、三角格子配列又は正三角格子配列などであってもよい。なお、貫通孔12は、フィルター部11に複数設けられていればよく、配列は限定されない。
貫通孔12の間隔は、分離する細胞の種類(大きさ、形態、性質、弾性)又は量に応じて適宜設計されるものである。ここで、貫通孔12の間隔とは、図3に示すように、貫通孔12をフィルター部11の第1主面PS1側から見て、任意の貫通孔12の中心と隣接する貫通孔12の中心との距離bを意味する。周期配列の構造体の場合、貫通孔12の間隔bは、例えば、貫通孔12の一辺dの1倍より大きく10倍以下であり、好ましくは貫通孔12の一辺dの3倍以下である。あるいは、例えば、フィルター部11の開口率は、10%以上であり、好ましくは開口率は、25%以上である。このような構成により、フィルター部11に対する流体の通過抵抗を低減することができる。そのため、処理時間を短くすることができ、細胞へのストレスを低減することができる。なお、開口率とは、(貫通孔12が占める面積)/(貫通孔12が空いていないと仮定したときの第1主面PS1の投影面積)で計算される。
貫通孔12の内接円の直径は、有核細胞の核の大きさより小さくなるように設計されている。本明細書では、「貫通孔12の内接円」とは、フィルター部11の第1主面PS1側から見て、貫通孔12内に描ける円のうち直径が最も大きい円、即ち貫通孔12を構成するフィルター部11の内壁に接する円のうち直径が最も大きい円を意味する。言い換えると、「貫通孔12の内接円」とは、フィルター部11の第1主面PS1側から見て、貫通孔12の開口を画定する少なくとも2点に接する円のうち直径が最も大きい円を意味する。また、本明細書では、「有核細胞の核の大きさ」とは、有核細胞を液中に配置して顕微鏡で観察し、有核細胞の核の外周の任意の2つの点を結んだ線のうち、最長なものを有核細胞の核の長さとした場合、100個の有核細胞の核の長さの平均値を意味する。
貫通孔12の寸法は、前記有核細胞の核の大きさに対する前記貫通孔の内接円の直径の割合が、0.64以下であることが好ましい。また、有核細胞の核の大きさに対する貫通孔12の内接円の直径の割合は、0.06以上であることが好ましい。より好ましくは、有核細胞の核の大きさに対する貫通孔12の内接円の直径の割合が、0.07以上である。
複数の貫通孔12の寸法は、略同一に設計されている。同じ形状の複数の貫通孔12を周期配列した構成である場合、複数の貫通孔12の大きさにおける標準偏差は小さい方が好ましい。具体的には、貫通孔12の一辺dの測長を行い、100個の貫通孔12の一辺dの平均値と標準偏差とから変動係数を求めた場合、変動係数は40%以下が好ましい。
フィルター部11の厚みは、貫通孔12の大きさ(一辺d)の0.1倍より大きく100倍以下が好ましい。より好ましくは、フィルター部11の厚みは、貫通孔12の大きさ(一辺d)の0.5倍より大きく10倍以下である。このような構成により、流体に対するフィルター10の抵抗を低減することができ、処理時間を短くすることができる。その結果、細胞へのストレスを低減することができる。
フィルター部11の表面(第1主面PS1)の算術平均粗さは、有核細胞の核の大きさよりも小さいことが好ましい。このような構成により、フィルター部11の表面(第1主面PS1)への細胞の付着が低減され、細胞の回収率を高くすることができる。なお、算術平均粗さの測定は、株式会社アルバック製の触針式表面形状測定機DEKTAK150(登録商標)を用い、フィルター部11の表面のうち5個所の測定値の平均値をフィルター部11の算術平均粗さとした。
フィルター部11において、有核細胞を含む液体が接触する第1主面PS1は、平滑に形成されていてもよい。具体的には、フィルター部11の第1主面PS1は、凹凸がなく均一な平面で形成されていてもよい。言い換えると、フィルター部11の第1主面PS1上の複数の貫通孔12の開口が同一平面上に形成されている。また、フィルター部11のうち貫通孔12が形成されていない部分であるフィルター基体部14は、繋がっており、一体に形成されている。このような構成により、フィルター部11の表面(第1主面PS1)への細胞の付着が低減され、捕捉した有核細胞を容易に回収することができる。
フィルター部11の貫通孔12は、第1主面PS1側の開口と第2主面PS2側の開口とが連続した壁面を通じて連通している。具体的には、貫通孔12は、第1主面PS1側の開口が第2主面PS2側の開口に投影可能に設けられている。即ち、フィルター部11を第1主面PS1側から見た場合に、貫通孔12は、第1主面PS1側の開口が第2主面PS2側の開口と重なるように設けられている。実施の形態1において、貫通孔12は、その内壁が第1主面PS1及び第2主面PS2に対して垂直となるように設けられている。
<枠部>
枠部15は、フィルター部11の外周に設けられており、フィルター部11に比べて単位面積当たりの貫通孔12の数が少ない部分である。枠部15における貫通孔12の数は、フィルター部11における貫通孔12の数の1%以下である。枠部15の厚みは、フィルター部11の厚みよりも厚くてもよい。このような構成により、フィルター10の機械強度を高めることができる。
フィルター10を装置に接続して使用する場合、枠部15は、フィルター10と装置とを接続する接続部として機能してもよい。また、枠部15には、フィルターの情報(貫通孔12の寸法など)を表示してもよい。
枠部15は、フィルター部11の第1主面PS1側から見て、リング状に形成されている。フィルター10を第1主面PS1側から見て、枠部15の中心は、フィルター部11の中心と一致する。即ち、枠部15は、フィルターと同心円上に形成されている。
フィルター10は、取り扱いやすさ及びシステムとの接合のしやすさの観点から、治具に固定されて使用されてもよい。治具は、例えば、ガンマ滅菌可能な材料で構成することができる。治具は、例えば、ポリエチレン、ポリエチレンテレフタレート、ポリウレタン、ポリスチレン、シリコンゴム、ABS樹脂、ポリアミド、ポリアミドイミド、ポリスルフォン、天然ゴム、ラテックス、ウレタンゴム、シリコンゴム、エチレン酢酸ビニル、ポリエステル類、エポキシ類、フェノール類、シリカ、アルミナ、金、白金、ニッケル、ステンレス、チタン、などを含む材料で形成されていてもよい。このような材料で治具を構成することにより、細胞へのストレスを低減することができる。
[濾過方法]
フィルター10を用いた濾過方法について説明する。
まず、フィルター10を準備する。この工程では、例えば、フィルター10が、装置に取り付けられる。具体的には、フィルター10の枠部15を挟持することによって、フィルター10を装置に取り付ける。
次に、細胞懸濁液をフィルター10に通過させる。本明細書において、「細胞懸濁液」とは、有核細胞を含む流体である。多くの場合、有核細胞を含む流体は、液体である。液体としては、例えば、アミノ酸、タンパク質、血清、などを含んだ培養溶液、リン酸緩衝生理食塩水、又は水である。細胞懸濁液には、細胞と流体の他に、樹脂製粒子などの非生物由来物質、骨片又は肉片などの組織の一部、死細胞などを含んでいてもよい。
このように、有核細胞を含む液体をフィルター部11に通過させることによって、液体から有核細胞を分離する。実施の形態1では、フィルター部11の貫通孔12の内接円の直径は、有核細胞の核の大きさよりも小さく設計されている。このため、有核細胞は、貫通孔12を通過せずに、フィルター部11の第1主面PS1上に捕捉される。
細胞懸濁液をフィルター10に通過させる方法としては、例えば、フィルター部11の第1主面PS1に対して略鉛直上方から重力を利用して細胞懸濁液を通過させる方法がある。この他に、フィルター部11の第1主面PS1に細胞懸濁液を接触させた上で細胞懸濁液に圧力を加えて通過させる方法(押圧)、又はフィルター部11の第1主面PS1に細胞懸濁液を接触させて、第2主面PS2から吸引して細胞懸濁液を通過させる方法(吸引)などがある。なお、有核細胞を含む液体をフィルター部11に通過させる工程においては、細胞にストレスをなるべく与えないことが好ましい。例えば、圧力を加える場合、有核細胞が変形しない程度の圧力とすることが好ましい。より好ましくは、圧力を加えずに、液体の自重により、液体をフィルター部11に通過させることである。あるいは、フィルター部11の開口率を高めることによって処理時間を短縮し、有核細胞にストレスがかかっている時間を少なくすることが好ましい。
また、液体中に有核細胞が浮遊した状態で細胞懸濁液をフィルター10に通過させてもよい。液体中に浮遊した有核細胞は、ほぼ球形状となるため、捕捉対象である有核細胞の回収率を向上させることができる。即ち、捕捉したい有核細胞の寸法精度を向上させることができる。
また、フィルター10に複数回通過させることによって、捕捉対象である有核細胞の寸法精度を高めることができる。
フィルター10を用いた濾過方法において、例えば、濾過用容器を用いて、濾過を行ってもよい。濾過用容器は、例えば、外形14mm、内径6mm、高さ55mmの円筒形状の容器であり、底部にフィルター10を取り付けることができる。なお、濾過容器は、これに限定されず、様々な形状及び寸法の容器を使用してもよい。
[フィルターの製造方法]
フィルター10の代表的な製造方法について説明する。フィルター10は、以下の工程により製造される。
<給電膜の形成>
スパッタ装置を用いて、シリコン基板の上面にCuの給電膜を形成する。この給電膜は、後述するフィルター10のフィルター基体部14を形成するときの給電源となる。このとき、シリコン基板と給電膜との接着性確保を目的としてTi等の中間層を形成してもよい。
Cuの給電膜を形成する条件は、以下の通りである。
スパッタリングガス:アルゴンガス
スパッタリング装置の真空度:5.0×10-4Pa
印加電力:DC500W
スパッタ時間:Cu膜形成時/27分
Ti膜形成時/3分5秒
<レジスト像の形成>
シリコン基板の上面に形成された給電膜上にレジスト像を形成する。
スピンコーター等を用いて、シリコン基板の上面に形成された給電膜上に所定の膜厚のレジスト膜を形成する。次に、所定のパターンが形成されたフォトマスクを介してレジストを露光し、現像処理することによりレジスト像を形成する。
レジスト膜塗布の条件は、以下の通りである。
レジスト剤:ノボラック系樹脂+有機溶剤
スピンコーターの回転数:1130rpm
レジスト膜厚:2μm
スピンコーターにて上記レジスト剤をシリコン基板上面に塗布した後に窒素雰囲気下で130℃にて溶剤を揮発させた後に冷却することで、レジスト膜を形成する。
波長365nmを含んだエネルギー密度2500J/mの光線を0.25秒間照射して、レジスト剤を露光する。
露光部分をアルカリ性溶液に接触させて現像処理する。
<フィルター基体部の形成>
レジスト像の開口部にフィルター基体部14を形成する。先に形成した給電膜を給電源として、電解めっき法を用いて、ニッケルめっき膜からなるフィルター基体部14を形成する。
フィルター基体部14の形成の条件は、以下の通りである。
前処理:希硫酸に60秒浸漬させることで給電膜の表面を活性化する。
めっき液:スルファミン酸ニッケルめっき液 液温55℃ pH=4.0
めっき速度:0.5μm/min
めっき:揺動させながら、電解めっきを行う。
<レジストの溶解及び剥離>
フィルター基体部14にアセトン溶液中で15分間超音波をかけることによって、レジスト膜を溶解させて、レジストを剥離する。
<支持基材の形成>
フィルター10を用いて濾過を行うに際し、必要に応じてフィルター10に支持基材を設けてもよい。このようにすることで、濾過中にフィルター10が破損することを防止できる。支持基材は以下の工程により作製される。なお、支持基材は、後述する図4において、符号「13」で示される部材に相当する。
フィルター10の基体が形成されたシリコン基板の上面に再度、感光性レジストを塗布してレジスト膜を形成した後に、フォトマスクを介してレジストを露光し、現像処理することによりレジスト像を形成する。このとき、レジスト像がフィルター10の基体を複数またぐように露光、現像処理を行う。なお、レジスト像がフィルター10の基体をまたいでいる部分は、フィルター10の完成後に、フィルター10の開口部となる。つまり、レジスト像がまたぐフィルター10の基体の数は、フィルター10に求められる開口率に応じて適宜決定される。
レジスト像の開口部にフィルター基体部14を形成する。先に形成した給電膜を給電源として、電解めっき法を用いて、ニッケルめっき膜からなる支持基材を形成する。なお、支持基材の幅は、フィルター10に求められる強度に応じて適宜決定される。
支持基材にアセトン溶液中で15分間超音波をかけることによって、レジスト膜を溶解させることで、レジストを剥離する。
<給電膜の除去>
給電膜を除去し、シリコン基板から、フィルター基体部14及び支持基材を分離することで有核細胞の濾過用のフィルター10が完成する。
給電膜の除去は、60%の過酸化水素水と酢酸と純水を1:1:20の混合比で作製した水溶液に、25℃の環境下で48時間浸漬することによって行う。
[効果]
実施の形態1に係るフィルター10によれば、以下の効果を奏することができる。
フィルター10は、金属及び金属酸化物の少なくともいずれかを主成分としている。また、フィルター10は、複数の貫通孔12が形成されたフィルター部11を備えている。このような構成により、フィルター部11の貫通孔12が変形しにくく、捕捉対象である有核細胞を捕捉し、有核細胞の回収率を向上させることができる。
貫通孔12の内接円の直径は、有核細胞の核の大きさより小さくなるように設計されている。このような構成により、有核細胞の回収率を更に向上させることができる。
フィルター部11の第1主面PS1は、平滑に形成されている。このような構成により、第1主面PS1で捕捉した有核細胞を容易にフィルター部11から分離させることができるため、回収が簡単になる。
また、フィルター10を用いた濾過方法では、有核細胞を含む液体をフィルター10に通過させることによって、捕捉対象である有核細胞を確実に捕捉することができるため、回収率を向上させることができる。
なお、実施の形態1では、貫通孔12の寸法が略同一である例について説明したが、これに限定されない。例えば、貫通孔12の寸法は、それぞれ異なっていてもよい。この場合、貫通孔12の最大寸法は、有核細胞の核の大きさより小さく設計されていればよい。
実施の形態1では、フィルター10の製造方法は、裏打ち層基体部を形成する工程を含む例を説明したが、これに限定されない。例えば、フィルター10の製造方法は、裏打ち層基体部を形成する工程を含んでいなくてもよい。
実施の形態1では、有核細胞を含む液体をフィルター10に通過させることによって、有核細胞を濾過する例について説明したが、これに限定されない。例えば、フィルター10を用いて、生細胞と死細胞とを含む液体から、生細胞と死細胞とを分離してもよい。
生細胞と死細胞とを分離する方法としては、例えば、フィルター10によってフィルター部11の第1主面PS1上に生細胞を捕捉し、死細胞を通過させてもよい。また、フィルター10によって、フィルター部11の第1主面PS1上に死細胞を捕捉し、生細胞を通過させてもよい。
実施の形態1に係るフィルター10の性能評価を、実施例1-8及び比較例1を用いて行った。
(1)実施例1-8と比較例1のフィルターについて
実施の形態1に係るフィルター10について、表1に示す仕様で作製した。
Figure 0007074148000001
実施例1-8及び比較例1は、外形の直径7.8mm、フィルター部11の直径6mmである。実施例1-7において、フィルター基体部14はニッケル(Ni)であり、実施例8におけるフィルター基体部14は金(Au)である。フィルター部11には、第1主面PS1側から見て、正方形の貫通孔12を正方格子配列で設けた。なお、貫通孔12の形状が正方形であるため、表1に示すように、貫通孔12の一辺dの長さと内接円の直径とは、同じ寸法になっている。
図4は、支持基材13が取り付けられたフィルター10の概略構成を示す。図4に示すように、実施例1-6では、フィルター10の第2主面PS2側に支持基材13が設けられている。支持基材13には、正方形状の複数の開口部12aが設けられている。支持基材13の厚みは、14μmであり、開口部13aの一辺、即ち桟の間隔Aは、260μmであり、桟の幅Bは、14μmである。
これらの実施例1-8及び比較例1のフィルターをそれぞれ濾過装置に設置し、細胞懸濁液を濾過することによって、実施例1-8及び比較例1のフィルターの性能評価を行った。
(2)細胞懸濁液について
100mmディッシュを用いて、10vol%のウシ胎児血清と1vol%のペニシリン―ストレプトマイシンとを含むRPMI1620培地(L-グルタミン含有)で、白血病細胞株である浮遊細胞HL-60を5日間培養した。
100mmディッシュから培養液の一部を、ピペッティングにより15mLの遠沈管に移した。次に、培養液が入った遠沈管に対して、回転数1000rpmで、3分間の遠心分離を行った後、上清を除去した。次いで、リン酸緩衝生理食塩水を添加し、細胞懸濁液を生成した。なお、細胞懸濁液の細胞濃度が10個/mLになるようにリン酸緩衝生理食塩水の添加量を調整した。
30μLの細胞懸濁液と、15μLの蛍光試薬DAPIと、をマイクロチューブにて混合して細胞を染色し、染色した細胞懸濁液(細胞染色液)を遮光下にて37℃で20分間インキュベートした。その後、スライドガラスの上に細胞染色液10μLを滴下し、カバーガラスを重ね、波長345nmの励起光源を使用し、455nmを中心とするバンドパスフィルターを通して、蛍光顕微鏡により蛍光観察を行った。青紫色に発色した核のサイズを測定したところ、HL-60の核の大きさは直径で7.0μmであった。
100mmディッシュ中の培養液の一部に対して、ピペッティングにより細胞を分散させた後、マイクロピペットを使用して10μL取り出し、細胞数計(Thermo Fisher製自動セルカウンター、Countess(登録商標) II FL)で細胞濃度、生存率、細胞の大きさの平均値を測定した。その結果、細胞濃度は5×10個/mL、活性のある細胞(HL-60)の大きさの平均値は13.4μm、生存率は90%であった。具体的には、細胞懸濁液と0.4%のトリパンブルー溶液を1:1の体積割合で混合して細胞膜を青色に染色し、細胞懸濁液とトリパンブルー溶液との混合液10μLを細胞計数スライド(Thermo Fisher製Countess(登録商標) Cell Counting Chamber Slide)に滴下して、細胞の形態を観察した。細胞計数では、染色された細胞膜をマーカーとする画像解析によって、細胞の個数(濃度)、細胞の大きさの平均値、生存率をそれぞれ求めた。
100mmディッシュ中の培養液に対して、さらにRPMI1620培地を任意の比率で混合することにより、以下のHL-60細胞懸濁液を作製した。
活性のある細胞(HL-60)の濃度・・・3.06×10個/mL
液量・・・1mL
なお、室温下のクリーンベンチ内に4時間放置した100mmディッシュ中の培養液について、上述の方法で細胞の生存率を測定した結果、生存率が81%に低下した。このことは、細胞を室温で、長時間放置することによって活性が低下することを意味している。
(3)濾過方法について
濾過装置に取り付けられた実施例1-8及び比較例1のフィルターにおいて、フィルター部11の第1主面PS1に細胞懸濁液を接触させた状態で、第2主面PS2側から細胞懸濁液を吸引することによって、細胞懸濁液の濾過を行った。操作条件としては、2kPaの圧力で吸引を行った。
(4)評価結果について
表2に評価結果について示す。
Figure 0007074148000002
実施例1-8においては、細胞(HL-60)の回収率が100%であった。これに対し、比較例1では、細胞の回収率が67.6%であった。比較例1では、貫通孔12の内接円の直径が7.2μmであるため、細胞(HL-60)の核の大きさ7.0μmよりも大きい。このため、細胞が貫通孔12を通過してしまったと考えられる。一方、実施例1-8においては、貫通孔12の内接円の直径は、0.4μm以上4.5μm以下であり、細胞の核の大きさよりも小さい。このため、実施例1-8では、比較例1と比べて、フィルター部11の第1主面PS1で細胞を多く捕捉することができたと考えられる。なお、本明細書において、「回収率」とは、フィルターの第1主面PS1上に捕捉した細胞に対する投入した活性のある細胞数の割合を意味し、(投入した活性のある細胞数-通過液に含まれる活性細胞の数)/(投入した活性のある細胞数)で計算した。なお、表2において、実施例1-7及び比較例1の評価と、実施例8の評価とは、異なる日に行ったため、活性のある細胞(HL-60)の濃度が異なっているが、評価の結果に影響はない。
なお、通過液に含まれる活性細胞の数は、ピペッティングにより通過液中の細胞を分散させた後にマイクロピペットを使用して10μLの通過液を10検体取り出し、細胞数計(Thermo Fisher製自動セルカウンター、Countess(登録商標) II FL)にて、上記検体中の細胞の数を計測した。
このように、貫通孔12の内接円の直径を、細胞核の大きさよりも小さく設計することで、より多くの細胞を捕捉することができ、回収率を向上させることができる。この理由としては、細胞核を取り囲む細胞質は変形しやすく、細胞核は変形しにくい点にある。
比較例1のように、貫通孔12の内接円の直径が細胞核の大きさよりも大きい場合、たとえ貫通孔12の内接円の直径が細胞の大きさよりも小さくても、細胞質が変形することで細胞がフィルター10を通過してしまうことがある。
一方、実施例1-8のように、貫通孔12の内接円の直径を細胞核より小さく設計している場合、細胞核は変形しにくいため、比較例1と比べて、細胞をフィルター10上で捕捉しやすい。
また、フィルター10が金属製である点も細胞の回収率の向上に寄与している。金属から成るフィルター10を使用することで、フィルター10の貫通孔12自体の変形量は、メンブレンなどの樹脂性のフィルターと比べて少なくなる。このため、フィルター10では、更に細胞を捕捉しやすくなっている。
表2に示すように、細胞の回収率を向上させるために、細胞の核の大きさ(Y)に対する貫通孔12の内接円の直径(X)の割合は、0.64以下であることが好ましい。また、細胞の核の大きさ(Y)に対する貫通孔12の内接円の直径(X)の割合は、0.06以上であることが好ましい。
また、表2に示すように、実施例1は、実施例2-7と比べて濾過時間が長くなっている。このことから、細胞の核の大きさ(Y)に対する貫通孔12の内接円の直径(X)の割合は、0.07以上にすることによって濾過時間を短縮することができる。
また、実施例1-8のフィルター部11において貫通孔12が設けられている部分の面積は、0.28cmである。処理能力(投入した細胞数/貫通孔が設けられている部分の面積)は、1.1×10個/cmとなる。一方、特許文献1のフィルターでは、処理能力は0.37×10個/cmである。このように、実施例1-8では、特許文献1のフィルターと比べて、処理能力が高い。
また、有核細胞を濾過するに際し、細胞懸濁液への不純物混入、すなわちフィルター10を構成する金属が細胞懸濁液へ溶出することを抑制することが好ましいことは言うまでもない。
実施例1-7では、細胞(HL-60)を濾過するに際し、ニッケル製の金属フィルターを使用しており、実施例1-7では、細胞の活性を損なわずに濾過を完了することができた。また、実施例8では、細胞(HL-60)を濾過するに際し、Au製の金属フィルターを使用しており、実施例8においても、実施例1-7と同様に、細胞の活性を損なわずに濾過を完了することができた。
ニッケルとAuについて、金属のイオン化傾向の指標である浸漬電位の測定を実施した。リン酸緩衝生理食塩水中での、飽和塩化カリウム溶液に浸された塩化銀からなる参照電極基準の浸漬電位を3分間測定したところ、ニッケルの浸漬電位は0.03Vより貴の範囲で推移し、Auの浸漬電位は、0.3Vより貴の範囲で推移した。つまり、同条件で測定したときに、少なくとも0.03Vより貴の浸漬電位を示す金属及び/又は金属酸化物であれば、細胞の活性を損なわずに濾過が可能であると言える。
また、実施例1-8では、フィルター部11の第1主面PS1上にHL-60を捕捉する一方で、リン酸緩衝生理食塩水を通過させることができた。液体の通過しやすさは、フィルターの開口率に依存するが、実施例のうち開口率が最も低いのは実施例1及び2における23.3%である(表1参照)。つまり、本発明の金属製のフィルターの開口率が少なくとも23.3%であれば、液体を通過させることが可能ということが言える。また、液体の通過させやすさの観点では、金属製フィルターに形成された貫通孔12のばらつきが小さい方が好ましい。濾過処理時間が短い場合(例えば、100秒未満)で、実施例のうち変動係数が最も大きいのは、実施例3における0.17である。つまり、変動係数は、0.17以下であることが好ましいといえる。
(5)実施例9-16のフィルターについて
実施の形態1に係るフィルター10について、表3に示す仕様で作製した。
Figure 0007074148000003
実施例9-16は、外形の直径7.8mm、フィルター部11の直径6mmである。実施例9-15において、フィルター基体部14はニッケルであり、実施例16において、フィルター基体部14はAuである。フィルター部11には、第1主面PS1側から見て、正方形の貫通孔12を正方格子配列で設けた。なお、貫通孔12の形状が正方形であるため、表3に示すように、貫通孔12の一辺dの長さと内接円の直径とは、同じ寸法になっている。
(6)細胞懸濁液について
以下の2種類の細胞懸濁液を作製した。
(i)Hela懸濁液
100mmディッシュを用いて、10vol%のウシ胎児血清と1vol%のペニシリン―ストレプトマイシンとを含むRPMI1620培地(L-グルタミン含有)で、ヒト子宮頚癌由来ヒト細胞株である接着細胞Helaを5日間培養した。
培養後、100mmディッシュから培地を吸引除去した。次に、100mmディッシュ上のHela細胞にリン酸緩衝生理食塩水を2mL加え、ピペッティングによりHela細胞の細胞培養面(細胞の表面)を洗浄した。更に、リン酸緩衝生理食塩水を1mL加え、ピペッティングによりHela細胞の細胞培養面の洗浄を再度行い、PBS吸引除去した。その後、洗浄したHela細胞に0.25%トリプシン/0.02%EDTA液を0.8mL加え、COインキュベータ内で5分静置した。顕微鏡でHela細胞が100mmディッシュから剥離したことを確認後、100mmディッシュからピペッティングにより15mLの遠沈管に細胞懸濁液の一部を移した。更に、培地1mLで100mmディッシュを洗い、細胞懸濁液の一部を遠沈管に移した。遠心分離機を用いて1,000rpmで5分間の遠心分離を行い、上清を除去した。その後、培地1mLでピペッティングし、細胞を分散させた。
対物ミクロメーター付き顕微鏡を用いて、倍率40倍で細胞懸濁液の一部を拡大観察することによって、Hela細胞の核の大きさを測定した。Hela細胞の核の大きさは、直径10.0μmであった。
この細胞懸濁液を、マイクロピペットを使用して10μL取り出し、細胞数計(Thermo Fisher製自動セルカウンター、Countess(登録商標) II FL)で細胞濃度、生存率、細胞の大きさの平均値を測定した。その結果、細胞濃度は7×10個/mL、活性のある細胞(Hela)の大きさの平均値は17.1μm、生存率は95%であった。具体的には、細胞懸濁液と0.4%のトリパンブルー溶液を1:1の体積割合で混合して細胞膜を青色に染色し、細胞懸濁液とトリパンブルー溶液との混合液10μLを細胞計数スライド(Thermo Fisher製Countess(登録商標) Cell Counting Chamber Slide)に滴下して、細胞の形態を観察した。細胞計数では、染色された細胞膜をマーカーとする画像解析によって、細胞の個数(濃度)、細胞の大きさの平均値、生存率をそれぞれ求めた。
培養したHela細胞を含む細胞懸濁液を、RPMI1620培地で希釈してHela細胞懸濁液を作製した。
(ii)ras遺伝子が導入されたNIH3T3(以下、NIH3T3(ras)と表記することがある)懸濁液 100mmディッシュを用いて、5vol%のウシ胎児血清と1vol%のペニシリン―ストレプトマイシンとを含むDMEM培地(4.5g/L グルコース L-グルタミン酸含有)で、ras遺伝子導入したマウス胎児線維芽株接着細胞NIH3T3(ras)を3日間培養した。
培養後、100mmディッシュから培地を吸引除去した。次に、100mmディッシュ上に残ったNIH3T3(ras)にリン酸緩衝生理食塩水を2mL加え、ピペッティングにより細胞培養面(細胞の表面)を洗浄した。更に、リン酸緩衝生理食塩水を1mL加え、ピペッティングにより細胞培養面の洗浄を再度行い、PBS吸引除去した。0.25%トリプシン/0.02%EDTA液を0.8mL加えCOインキュベータ内で3分静置した。顕微鏡で細胞が100mmディッシュから剥離したことを確認後、100mmディッシュからピペッティングにより細胞懸濁液の一部を15mLの遠沈管に移した。更に、培地1mLで100mmディッシュを洗い、細胞懸濁液の一部を遠沈管に移した。遠心分離機を用いて1,000rpmで5分間の遠心分離を行い、上清を除去した。その後、培地1mLでピペッティングし、細胞を分散させた。
対物ミクロメーター付き顕微鏡を用いて、倍率40倍で細胞懸濁液の一部を拡大観察することによって、NIH3T3(ras)の核の大きさを測定した。NIH3T3(ras)の核の大きさは、直径で11.5μmであった。
この細胞懸濁液に対して、マイクロピペットを使用して10μL取り出し、細胞数計(Thermo Fisher製自動セルカウンター、Countess(登録商標) II FL)で細胞濃度、生存率、細胞の大きさの平均値を測定した。その結果、細胞濃度は4×10個/mL、活性のある細胞(NIH3T3(ras))の大きさの平均値は15.4μm、生存率は89%であった。具体的には、細胞懸濁液と0.4%のトリパンブルー溶液を1:1の体積割合で混合して細胞膜を青色に染色し、細胞懸濁液とトリパンブルー溶液との混合液10μLを細胞計数スライド(Thermo Fisher製Countess(登録商標) Cell Counting Chamber Slide)に滴下して、細胞の形態を観察する。細胞計数では、染色された細胞膜をマーカーとする画像解析によって、細胞の個数(濃度)、細胞の大きさの平均値、生存率をそれぞれ求めた。
培養したNIH3T3(ras)を含む細胞懸濁液を、当該DMEM培地(4.5g/L グルコース L-グルタミン酸含有)で希釈してNIH3T3(ras)細胞懸濁液を作製した。
また、Hela細胞の核の大きさとNIH3T3(ras)の核の大きさについて、蛍光顕微鏡を用いても測定した。具体的には、蛍光顕微鏡を用いて、倍率40倍でこれらの細胞懸濁液の一部を拡大観察することによってHela細胞の核の大きさとNIH3T3(ras)の核の大きさとを測定した。蛍光顕微鏡を用いて測定したところ、Helaの核の大きさは、直径で10.0μmであり、NIH3T3(ras)の核の大きさは11.5μmであった。
また、これらの細胞懸濁液に対して、マイクロピペットを使用して10μLそれぞれ取り出し、細胞数計(Thermo Fisher製自動セルカウンター、Countess(登録商標) II FL)で細胞濃度、生存率、細胞の大きさの平均値を測定した。その結果、細胞濃度はHelaが3.17×10個/mL、NIH3T3(ras)が2.97×10個/mL、活性のある細胞の大きさの平均値は、Helaが17.1μm、NIH3T3(ras)が15.4μm、生存率はHelaが98%、NIH3T3(ras)が89%であった。具体的には、細胞懸濁液と0.4%のトリパンブルー溶液を1:1の体積割合で混合して細胞膜を青色に染色し、細胞懸濁液とトリパンブルー溶液との混合液10μLを細胞計数スライド(Thermo Fisher製Countess(登録商標) Cell Counting Chamber Slide)に滴下して、細胞の形態を観察した。細胞計数では、染色された細胞膜をマーカーとする画像解析によって、細胞の個数(濃度)、細胞の大きさの平均値、生存率をそれぞれ求めた。
Hela細胞を含む細胞懸濁液に対して、さらにリン酸緩衝生理食塩水を任意の比率で混合することにより、以下のHela細胞懸濁液を作製した。
活性のある細胞(Hela)の濃度・・・3.17×10個/mL
液量・・・1mL
NIH3T3(ras)を含む細胞懸濁液に対して、さらにリン酸緩衝生理食塩水を任意の比率で混合することにより、以下のNIH3T3(ras)細胞懸濁液を作製した。
活性のある細胞(NIH3T3(ras))の濃度・・・2.97×10個/mL
液量・・・1mL
(7)濾過方法について
濾過装置に取り付けられた実施例9-16のフィルターにおいて、フィルター部11の第1主面PS1に細胞懸濁液を接触させた状態で、第2主面PS2側から細胞懸濁液を吸引することによって、細胞懸濁液の濾過を行った。操作条件としては、2kPaの圧力で吸引を行った。
(8)評価結果について
表4及び5に評価結果について示す。
Figure 0007074148000004
Figure 0007074148000005
表4及び表5に示すように、実施例9-16においては、Hela、NIH3T3(ras)ともに回収率が100%であった。実施例9-16においては、貫通孔12の内接円の直径は、0.4μm以上7.2μm以下であり、Hela及びNIH3T3(ras)における細胞の核の大きさよりも小さい。このため、実施例9-16においても、実施例1-8と同様に、フィルター部11の第1主面PS1で細胞をより多く捕捉することができたと考えられる。
また、表4及び5に示すように、実施例9は、実施例10-16と比べて濾過時間が長くなっている。つまり実施例1-8と同様に、細胞の核の大きさ(Y)に対する貫通孔12の内接円の直径(X)の割合は、0.07以上にすることによって濾過時間を短縮することができる。
また、実施例9-16のフィルター部11において貫通孔12が設けられている部分の面積は、0.28cmである。処理能力(投入した細胞数/貫通孔が設けられている部分の面積)は、1.1×10個/cmとなる。一方、特許文献1のフィルターでは、処理能力は0.37×10個/cmである。このように、実施例1-8では、特許文献1のフィルターと比べて、処理能力が高い。
また、実施例9-15では、ニッケル製の金属フィルターを使用し、実施例16では、Au製の金属フィルターを使用し、実施例1-8と同様に細胞の活性を損なわずに濾過を完了することができた。
なお、実施例においては、細胞懸濁液中に有核細胞が10個/mL以上存在する比較的高い濃度の細胞懸濁液を濾過して有核細胞を捕捉する例について説明したが、フィルター10は、細胞懸濁液中に有核細胞が数個/mL程度の極めて低濃度の細胞懸濁液を濾過した場合であっても、回収対象である有核細胞を捕捉することができる。
本発明は、添付図面を参照しながら好ましい実施形態に関連して充分に記載されているが、この技術の熟練した人々にとっては種々の変形や修正は明白である。そのような変形や修正は、添付した特許請求の範囲による本発明の範囲から外れない限りにおいて、その中に含まれると理解されるべきである。
本発明のフィルターは、有核細胞の回収率を向上させることができるため、細胞懸濁液から有核細胞を分離する用途に有用である。
10 フィルター
11 フィルター部
12 貫通孔
13 支持基材
13a 開口部
14 フィルター基体部
15 枠部
PS1 第1主面
PS2 第2主面

Claims (7)

  1. 有核細胞の濾過方法であって、
    複数の正方形の貫通孔が形成されており、前記貫通孔の大きさの変動係数は40%以下であって、有核細胞の核の大きさより小さい、フィルターを準備するステップ、
    前記有核細胞を含む液体を前記フィルターに通過させるステップ、
    を含み、
    前記有核細胞の核の大きさに対する前記貫通孔の内接円の直径の割合は、0.07以上0.64以下である、濾過方法。
  2. 前記有核細胞の核の大きさに対する前記貫通孔の内接円の直径の割合は、0.17以上である、請求項1に記載の濾過方法。
  3. 前記フィルターは、金属及び金属酸化物の少なくともいずれかを主成分とし、
    前記金属及び前記金属酸化物の少なくともいずれかは、リン酸緩衝生理食塩水中での、飽和塩化カリウム溶液に浸された塩化銀からなる参照電極基準の浸漬電位が0.03Vより貴である、請求項1又は2に記載の濾過方法。
  4. 前記フィルターは、金、銀、銅、白金、ニッケル、パラジウム、これらの合金及びこれらの酸化物からなる群から選択された少なくとも1つを含有する、請求項1~のいずれか一項に記載の濾過方法。
  5. 前記有核細胞を含む液体を前記フィルターに通過させるステップは、生細胞と死細胞とを分離するステップを含む、請求項1~のいずれか一項に記載の濾過方法。
  6. 前記液体は、前記有核細胞の少なくとも一部が浮遊した状態であることを特徴とする、請求項1~のいずれか一項に記載の濾過方法。
  7. 有核細胞の濾過用フィルターを含む、請求項1~のいずれか一項に記載の方法を実施するためのキットであって、
    前記フィルターにおいては、複数の正方形の貫通孔が形成されており、前記貫通孔の大きさの変動係数は40%以下であって、有核細胞の核の大きさより小さい、キット。
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