JP7074148B2 - 有核細胞の濾過用フィルターおよびそれを用いた濾過方法 - Google Patents
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Description
有核細胞の濾過用フィルターであって、
金属及び金属酸化物の少なくともいずれかを主成分とし、
複数の貫通孔が形成されており、
前記貫通孔の内接円の直径は、前記有核細胞の核の大きさより小さい。
有核細胞の濾過方法であって、
金属及び金属酸化物の少なくともいずれかを主成分とし、複数の貫通孔が形成されており、前記貫通孔の内接円の直径は、前記有核細胞の核の大きさより小さいフィルターを準備するステップ、
前記有核細胞を含む液体を前記フィルターに通過させるステップ、
を含む。
特許文献1では、不織布で構成される細胞捕捉フィルター材を用いて、有核細胞と血小板とを捕捉し、赤血球のような不要な細胞を通過させることによって、血液から単核細胞を分離している。しかしながら、特許文献1の細胞捕捉フィルターでは、単核細胞の回収率が74%程度であり、捕捉対象である細胞の回収率の向上といった点で未だ改善の余地がある。
有核細胞の濾過用フィルターであって、
金属及び金属酸化物の少なくともいずれかを主成分とし、
複数の貫通孔が形成されており、
前記貫通孔の内接円の直径は、前記有核細胞の核の大きさより小さい。
有核細胞の濾過方法であって、
金属及び金属酸化物の少なくともいずれかを主成分とし、複数の貫通孔が形成されており、前記貫通孔の内接円の直径は、前記有核細胞の核の大きさより小さいフィルターを準備するステップ、
前記有核細胞を含む液体を前記フィルターに通過させるステップ、
を含む。
[フィルターの構成]
図1は、本発明に係る実施の形態1のフィルター10の概略構成図である。図2は、本発明に係る実施の形態1におけるフィルター10の一部の拡大斜視図である。図1及び図2中のX、Y、Z方向は、それぞれフィルター10の縦方向、横方向、厚み方向を示している。図1に示すように、フィルター10は、フィルター部11と、フィルター部11の外周に設けられた枠部15とを備える。図2に示すように、フィルター10は、互いに対向する第1主面PS1と第2主面PS2とを有している。フィルター部11は、第1主面PS1と第2主面PS2とを貫通する複数の貫通孔12が形成されたフィルター基体部14を備える。貫通孔12の内接円の直径は、有核細胞の核の大きさより小さくなるように設計されている。
フィルター10の基体部分を形成するフィルター基体部14を構成する材料は、金属及び/又は金属酸化物を主成分としている。フィルター基体部14は、例えば、金、銀、銅、白金、ニッケル、パラジウム、これらの合金及びこれらの酸化物であってもよい。
フィルター10の外形は、例えば、円形、長方形、又は楕円形である。実施の形態1では、フィルター10の外形は、略円形である。フィルター10の外形を略円形にすることによって、フィルター10の主面(例えば、フィルター部11の第1主面PS1)に対して流体を均一に流すことができる。なお、本明細書において、「略円形」とは、短径の長さに対する長径の長さの比が1.0以上1.2以下であることをいう。
フィルター部11は、複数の貫通孔12が形成された板状構造体である。フィルター部11の形状は、例えば、円形、長方形、楕円形である。実施の形態1では、フィルター部11の形状は、略円形である。フィルター部11の形状を略円形にすることによって、フィルター部11の第1主面PS1に対して流体を均一に流すことができる。
枠部15は、フィルター部11の外周に設けられており、フィルター部11に比べて単位面積当たりの貫通孔12の数が少ない部分である。枠部15における貫通孔12の数は、フィルター部11における貫通孔12の数の1%以下である。枠部15の厚みは、フィルター部11の厚みよりも厚くてもよい。このような構成により、フィルター10の機械強度を高めることができる。
フィルター10を用いた濾過方法について説明する。
フィルター10の代表的な製造方法について説明する。フィルター10は、以下の工程により製造される。
スパッタ装置を用いて、シリコン基板の上面にCuの給電膜を形成する。この給電膜は、後述するフィルター10のフィルター基体部14を形成するときの給電源となる。このとき、シリコン基板と給電膜との接着性確保を目的としてTi等の中間層を形成してもよい。
スパッタリングガス:アルゴンガス
スパッタリング装置の真空度:5.0×10-4Pa
印加電力:DC500W
スパッタ時間:Cu膜形成時/27分
Ti膜形成時/3分5秒
シリコン基板の上面に形成された給電膜上にレジスト像を形成する。
スピンコーター等を用いて、シリコン基板の上面に形成された給電膜上に所定の膜厚のレジスト膜を形成する。次に、所定のパターンが形成されたフォトマスクを介してレジストを露光し、現像処理することによりレジスト像を形成する。
レジスト剤:ノボラック系樹脂+有機溶剤
スピンコーターの回転数:1130rpm
レジスト膜厚:2μm
スピンコーターにて上記レジスト剤をシリコン基板上面に塗布した後に窒素雰囲気下で130℃にて溶剤を揮発させた後に冷却することで、レジスト膜を形成する。
レジスト像の開口部にフィルター基体部14を形成する。先に形成した給電膜を給電源として、電解めっき法を用いて、ニッケルめっき膜からなるフィルター基体部14を形成する。
前処理:希硫酸に60秒浸漬させることで給電膜の表面を活性化する。
めっき液:スルファミン酸ニッケルめっき液 液温55℃ pH=4.0
めっき速度:0.5μm/min
めっき:揺動させながら、電解めっきを行う。
フィルター基体部14にアセトン溶液中で15分間超音波をかけることによって、レジスト膜を溶解させて、レジストを剥離する。
フィルター10を用いて濾過を行うに際し、必要に応じてフィルター10に支持基材を設けてもよい。このようにすることで、濾過中にフィルター10が破損することを防止できる。支持基材は以下の工程により作製される。なお、支持基材は、後述する図4において、符号「13」で示される部材に相当する。
給電膜を除去し、シリコン基板から、フィルター基体部14及び支持基材を分離することで有核細胞の濾過用のフィルター10が完成する。
実施の形態1に係るフィルター10によれば、以下の効果を奏することができる。
実施の形態1に係るフィルター10について、表1に示す仕様で作製した。
100mmディッシュを用いて、10vol%のウシ胎児血清と1vol%のペニシリン―ストレプトマイシンとを含むRPMI1620培地(L-グルタミン含有)で、白血病細胞株である浮遊細胞HL-60を5日間培養した。
活性のある細胞(HL-60)の濃度・・・3.06×105個/mL
液量・・・1mL
濾過装置に取り付けられた実施例1-8及び比較例1のフィルターにおいて、フィルター部11の第1主面PS1に細胞懸濁液を接触させた状態で、第2主面PS2側から細胞懸濁液を吸引することによって、細胞懸濁液の濾過を行った。操作条件としては、2kPaの圧力で吸引を行った。
表2に評価結果について示す。
実施の形態1に係るフィルター10について、表3に示す仕様で作製した。
以下の2種類の細胞懸濁液を作製した。
100mmディッシュを用いて、10vol%のウシ胎児血清と1vol%のペニシリン―ストレプトマイシンとを含むRPMI1620培地(L-グルタミン含有)で、ヒト子宮頚癌由来ヒト細胞株である接着細胞Helaを5日間培養した。
活性のある細胞(Hela)の濃度・・・3.17×105個/mL
液量・・・1mL
活性のある細胞(NIH3T3(ras))の濃度・・・2.97×105個/mL
液量・・・1mL
濾過装置に取り付けられた実施例9-16のフィルターにおいて、フィルター部11の第1主面PS1に細胞懸濁液を接触させた状態で、第2主面PS2側から細胞懸濁液を吸引することによって、細胞懸濁液の濾過を行った。操作条件としては、2kPaの圧力で吸引を行った。
表4及び5に評価結果について示す。
11 フィルター部
12 貫通孔
13 支持基材
13a 開口部
14 フィルター基体部
15 枠部
PS1 第1主面
PS2 第2主面
Claims (7)
- 有核細胞の濾過方法であって、
複数の正方形の貫通孔が形成されており、前記貫通孔の大きさの変動係数は40%以下であって、有核細胞の核の大きさより小さい、フィルターを準備するステップ、
前記有核細胞を含む液体を前記フィルターに通過させるステップ、
を含み、
前記有核細胞の核の大きさに対する前記貫通孔の内接円の直径の割合は、0.07以上0.64以下である、濾過方法。 - 前記有核細胞の核の大きさに対する前記貫通孔の内接円の直径の割合は、0.17以上である、請求項1に記載の濾過方法。
- 前記フィルターは、金属及び金属酸化物の少なくともいずれかを主成分とし、
前記金属及び前記金属酸化物の少なくともいずれかは、リン酸緩衝生理食塩水中での、飽和塩化カリウム溶液に浸された塩化銀からなる参照電極基準の浸漬電位が0.03Vより貴である、請求項1又は2に記載の濾過方法。 - 前記フィルターは、金、銀、銅、白金、ニッケル、パラジウム、これらの合金及びこれらの酸化物からなる群から選択された少なくとも1つを含有する、請求項1~3のいずれか一項に記載の濾過方法。
- 前記有核細胞を含む液体を前記フィルターに通過させるステップは、生細胞と死細胞とを分離するステップを含む、請求項1~4のいずれか一項に記載の濾過方法。
- 前記液体は、前記有核細胞の少なくとも一部が浮遊した状態であることを特徴とする、請求項1~5のいずれか一項に記載の濾過方法。
- 有核細胞の濾過用フィルターを含む、請求項1~6のいずれか一項に記載の方法を実施するためのキットであって、
前記フィルターにおいては、複数の正方形の貫通孔が形成されており、前記貫通孔の大きさの変動係数は40%以下であって、有核細胞の核の大きさより小さい、キット。
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