CN117043316A - 过滤器和其制造方法、过滤设备、分离或分取稀少细胞的方法、以及细胞悬浮液中的稀少细胞的分析方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及过滤器，其具有贯穿一个面和另一个面的多个过滤孔，前述过滤孔在前述一个面上具有第一开口部和在前述另一个面上具有第二开口部，前述第一开口部的短轴直径W1与长轴直径L1的比(L1/W1)为1.00以上且1.20以下，前述短轴直径W1为7.0μm以上且9.0μm以下，前述第二开口部的短轴直径W2与长轴直径L2的比(L2/W2)为1.00以上且1.20以下，前述短轴直径W1与前述短轴直径W2的比(W2/W1)和前述长轴直径L1与前述长轴直径L2的比(L2/L1)均为1.20以上且1.50以下。

Description

过滤器和其制造方法、过滤设备、分离或分取稀少细胞的方 法、以及细胞悬浮液中的稀少细胞的分析方法
技术领域
本发明涉及过滤器和其制造方法、过滤设备、分离或分取稀少细胞的方法、以及细胞悬浮液中的稀少细胞的分析方法。
背景技术
在癌诊断等检查是否患有特定疾病的诊断领域中，从抑制成本的观点、减轻对被诊断者的负担的观点出发，对使用血液、唾液等体液来进行诊断的液体活检的关切提高。作为液体活检的1种，分析血液中存在的稀少细胞的技术备受关注。
作为稀少细胞，可以举出例如循环肿瘤细胞(Circulating Tumor Cell，以下称为“CTC”)。CTC是从原发肿瘤组织或转移肿瘤组织游离，在血液内浸润的细胞。针对血液中的CTC进行分析，期待在掌握晚期实体瘤患者的病况、判定治疗效果等中进行应用。进一步，还期待培养CTC的活细胞，应用于抗癌剂筛选。
作为分离或分取CTC等稀少细胞的方法，研究了各种各样的方法，可以举出例如使用细胞分选仪的方法、离心分离法、使用过滤器的方法(以下也称为过滤器法)等。然而，使用细胞分选仪的情况下，尽管能够以高纯度(purity)分取，但活细胞的分取困难。此外，离心分离法因原理的·手段的原因，在纯度的方面容易变差。因此，作为能够进行活细胞的分离或分取、和以较高纯度分离或分取的方法，期待过滤器法。
例如，专利文献1中，记载了将血液样本使用包含规定的孔的过滤器进行过滤器处理而分离或检测稀少细胞。
现有技术文献
专利文献
专利文献1：日本特开2016-180753号公报
发明内容
发明要解决的课题
然而，以往的过滤器法中，需要对样本进行溶血处理等前处理。为了回收稀少细胞的活细胞，尽量不损伤稀少细胞，要求不需要溶血处理等可能损伤稀少细胞的前处理的分离或分取方法。此外，从成本抑制的观点出发，也要求更简便的分离或分取方法。
鉴于上述的课题，本发明的目的在于，提供即使不进行溶血处理等前处理也能够分离或分取稀少细胞的过滤器和其制造方法、以及过滤设备。此外，本发明的目的在于，提供使用上述过滤器或过滤设备而分离或分取稀少细胞的方法、和细胞悬浮液中的稀少细胞的分析方法。
用于解决课题的手段
为了解决上述课题，本发明包括以下的方式。
1.过滤器，其具有贯穿一个面和另一个面的多个过滤孔，
前述过滤孔在前述一个面上具有第一开口部，和在前述另一个面上具有第二开口部，
前述第一开口部的短轴直径W1与长轴直径L1的比(L1/W1)为1.00以上且1.20以下，
前述短轴直径W1为7.0μm以上且9.0μm以下，
前述第二开口部的短轴直径W2与长轴直径L2的比(L2/W2)为1.00以上且1.20以下，
前述短轴直径W1与前述短轴直径W2的比(W2/W1)和前述长轴直径L1与前述长轴直径L2的比(L2/L1)均为1.20以上且1.50以下。
2.根据前述1所述的过滤器，其中，前述过滤器的厚度为10μm以上且30μm以下。
3.根据前述1或2所述的过滤器，其中，C2’与前述第二开口部的重心C2的距离为3μm以下，C2’为从前述第一开口部的重心C1向前述另一个面引出的垂线与前述另一个面的交点。
4.根据前述1～3中任一项所述的过滤器，其中，前述过滤器的开孔率为10.5％以上且25％以下。
5.根据前述1～4中任一项所述的过滤器，其中，多个前述过滤孔等间隔地排列。
6.根据前述1～5中任一项所述的过滤器，其中，前述过滤孔彼此的间隔为8μm以上且30μm以下。
7.根据前述1～6中任一项所述的过滤器，其中，前述过滤器是在膜上具有前述过滤孔的过滤器，
前述膜的总光线透过率为80％以上。
8.根据前述1～7中任一项所述的过滤器，其中，前述过滤器是在膜上具有前述过滤孔的过滤器，
前述膜的肖氏硬度为30以上且50以下，杨氏模量为5MPa以上且25MPa以下。
9.根据前述1～8中任一项所述的过滤器，其中，前述过滤器包含热塑性树脂。
10.根据前述9所述的过滤器，其中，前述热塑性树脂的主要成分为聚乙烯或聚丙烯。
11.过滤设备，其包含前述1至10中任一项所述的过滤器、和保持前述过滤器的保持部，能够对注射器装配拆卸。
12.前述1至10中任一项所述的过滤器的制造方法，其包括将在表面上具有突起结构的模具加热的同时对膜进行挤压从而形成过滤孔。
13.分离或分取细胞悬浮液中的稀少细胞的方法，其包括使用前述1至10中任一项所述的过滤器或前述11所述的过滤设备将细胞悬浮液过滤的过滤步骤。
14.根据前述13所述的分离或分取稀少细胞的方法，其中，前述过滤步骤中，包括通过前述细胞悬浮液的自重进行过滤。
15.根据前述13或14所述的分离或分取稀少细胞的方法，其中，前述稀少细胞是选自癌细胞、循环肿瘤细胞(CTC)、上皮间质转化CTC(EMTCTC)、团块形成型CTC(clusteredCTC)、血管内皮细胞、血管内皮前体细胞、癌干细胞、上皮细胞、造血干细胞、间充质干细胞、胚胎细胞和它们的组合中的1种以上细胞。
16.根据前述13～15中任一项所述的分离或分取稀少细胞的方法，其中，前述过滤步骤中，包括从前述过滤器的前述一个面侧过滤前述细胞悬浮液。
17.细胞悬浮液中的稀少细胞的分析方法，其包括将通过前述13～16中任一项所述的方法分离或分取的前述稀少细胞通过包括前述稀少细胞的动态观察或者活性测定的方法进行分析、或对前述稀少细胞的基因进行分析。
发明的效果
根据本发明，即使不对样本进行溶血处理等可能损伤稀少细胞的前处理也能够分离或分取稀少细胞。即，能够抑制样本中的稀少细胞因所述前处理而损伤，因此能够以更不损伤稀少细胞的状态(intact)进行分离或分取，期待容易分取活细胞。进一步，稀少细胞的分离或分取更简便，能够抑制成本。
附图说明
图1是示意性示出本实施方式所涉及的过滤器的一例的概略图，图1的(a)是从一个面侧观察的平面图，(b)是从另一个面侧观察的平面图，(c)是(a)和(b)中的A-A截面图。
图2是示意性示出使用激光共聚焦显微镜观察过滤器的方法的概略图。
图3是例示利用激光共聚焦显微镜观察的过滤器的图像的图，图3的(a)是示出观察来自另一个面的反射光的图像的图，(b)是示出观察来自反射体的露出部分的反射光的图像的图。
图4是示出将图3的图像进行二值化处理的图像的图，图4的(a)是示出从图3的(a)中将暗部提取为相当于第二开口部的区域的图像(第二开口部的提取图像)的图，图4的(b)是示出从图3的(b)中将明部提取为相当于第一开口部的区域的图像(第一开口部的提取图像)的图。
图5是示意性示出本实施方式所涉及的过滤器的制造方法的一例的流程图。
具体实施方式
以下，参照附图的同时说明本发明的实施方式，但本发明不限于以下的实施方式，在不脱离本发明的主旨的范围内可以任意变形实施。此外，附图所述的实施方式为了清楚说明本发明而示意化，未必正确表示实际的尺寸、缩放比例。
＜过滤器＞
本实施方式所涉及的过滤器具有贯穿一个面和另一个面的多个过滤孔，前述过滤孔在前述一个面上具有第一开口部，和在前述另一个面上具有第二开口部，前述第一开口部的短轴直径W1与长轴直径L1的比(L1/W1)为1.00以上且1.20以下，前述短轴直径W1为7.0μm以上且9.0μm以下，前述第二开口部的短轴直径W2与长轴直径L2的比(L2/W2)为1.00以上且1.20以下，前述短轴直径W1与前述短轴直径W2的比(W2/W1)和前述长轴直径L1与前述长轴直径L2的比(L2/L1)均为1.20以上且1.50以下。
图1是示意性示出本实施方式所涉及的过滤器的一例的概略图。图1的(a)是从一个面侧观察的平面图，(b)是从另一个面侧观察的平面图，(c)是(a)和(b)中的A-A截面图。过滤器1具有贯穿一个面100和另一个面200的多个过滤孔3。过滤孔3各自在一个面100上具有第一开口部103，在另一个面200上具有第二开口部203。
第一开口部103中，短轴直径W1与长轴直径L1的比(L1/W1)为1.00以上且1.20以下。(L1/W1)为1.20以下，由此第一开口部容易形成接近真圆的形状。(L1/W1)优选为1.18以下、更优选为1.15以下。此外，(L1/W1)为1.00以上，从制造容易性的观点出发，优选大于1.00。第一开口部为接近真圆的形状，由此在保持较大的开口面积的同时，能够高效率地分离特定尺寸的稀少细胞，故而优选。
第一开口部103的短轴直径W1为7.0μm以上且9.0μm以下。短轴直径W1为7.0μm以上，由此能够以较小的压力损失捕捉特定尺寸的稀少细胞。短轴直径W1优选为7.5μm以上、更优选为8.0μm以上。此外，短轴直径W1为9.0μm以下，由此能够不使特定尺寸的稀少细胞通过而进行捕捉。短轴直径W1优选为8.8μm以下、更优选为8.5μm以下。
第二开口部203中，短轴直径W2与长轴直径L2的比(L2/W2)为1.00以上且1.20以下。(L2/W2)为1.20以下，由此第二开口部容易形成接近真圆的形状。(L2/W2)优选为1.18以下、更优选为1.15以下。此外，(L2/W2)为1.00以上，从制造容易性的观点出发，优选大于1.00。第二开口部为接近真圆的形状，由此在保持较大的开口面积的同时，能够高效率地分离特定尺寸的稀少细胞，故而优选。
短轴直径W1与短轴直径W2的比(W2/W1)和长轴直径L1与长轴直径L2的比(L2/L1)均为1.20以上且1.50以下。满足所述要件的过滤孔3形成从第一开口部103向第二开口部203变大的渐变形状。应予说明，在此渐变形状是指相对于第一开口部而言，第二开口部更大，即只要是满足上述的要件的形状即可，不仅限于过滤孔径随着过滤器的厚度方向的距离以一定的变化率变大的情况。如果过滤孔3为所述渐变形状，则与过滤孔为圆筒形状的情况相比，能够抑制样本从过滤器的一个面100向另一个面200侧通过时的压力损失。从充分抑制压力损失的观点出发，(W2/W1)和(L2/L1)均为1.20以上、优选为1.22以上、更优选为1.25以上。此外，从抑制过滤孔与相邻的过滤孔连通的观点出发，(W2/W1)和(L2/L1)均为1.50以下、优选为1.45以下、更优选为1.40以下。
本实施方式所涉及的过滤器中，开口部的短轴直径和长轴直径是通过下述方法测定的值。
首先，如图2中示意性所示，将过滤器1配置在反射体400上，使一个面100为反射体400侧。接着，使用激光共聚焦显微镜(未图示)，从另一个面200侧观察过滤器1。此时，过滤器1为固定的状态，聚焦于另一个面200进行观察，由此能够观察来自另一个面200的反射光R2。此外，聚焦于与一个面100所接触的反射体400的表面进行观察，由此能够观察来自反射体400的露出部分的反射光R1，即来自具有相当于第一开口部的形状的形状的区域的反射光。
图3是例示利用激光共聚焦显微镜观察的过滤器的图像的图。图3的(a)是观察来自另一个面的反射光的图像，(b)是观察来自反射体的露出部分的反射光的图像。
接着，将所得过滤器的观察图像通过图像处理软件二值化。图4是将图3的图像进行二值化处理的图像。图4的(a)是从图3的(a)中提取暗部作为相当于第二开口部的区域的图像(第二开口部的提取图像)。图4的(b)是从图3的(b)中提取明部作为相当于第一开口部的区域的图像(第一开口部的提取图像)。像这样，通过将激光共聚焦显微镜的观察图像进行二值化处理，得到相当于观察区域中的各开口部的近似圆形的图形排列的图像。
第一开口部的提取图像中的相当于第一开口部的区域106的通过重心的弦长的最小值记作第一开口部的短轴直径W1。此外，区域106的通过重心的弦长的最大值记作第一开口部的长轴直径L1。此外同样地，第二开口部的提取图像中的相当于第二开口部的区域206的通过重心的弦长的最小值记作第二开口部的短轴直径W2。此外，区域206的通过重心的弦长的最大值记作第二开口部的长轴直径L2。
分离或分取稀少细胞时使用的细胞悬浮液等样本包含例如血液细胞等除了稀少细胞之外的细胞等，粘度较高。因此，以往的过滤器中在不进行溶血处理等前处理而对样本进行过滤处理的情况下，发生过滤器堵塞等问题，稀少细胞的分离困难。此外，对样本进行溶血处理等作为前处理的情况下，稀少细胞损伤，有时难以以活细胞形式分取。
另一方面，本实施方式所涉及的过滤器通过对于多个过滤孔将各过滤孔和开口部的形状调节为特定的范围，从而多个过滤孔的孔径、形状容易达到均匀。发现本实施方式所涉及的过滤器通过精密且均匀地控制开口部的形状和孔径，从而在确保分离性能的同时，调整孔形状而抑制压力损失，由此较高粘度的样本也能够不堵塞地过滤。更具体而言，本实施方式所涉及的过滤器通过将第一开口部调整为适合于稀少细胞的分离的形状和大小，从而具有优异的分离性能，过滤孔为从第一开口部向第二开口部变大的渐变形状，由此抑制样本过滤时的压力损失，即使不经过溶血处理等前处理，也能够过滤样本。根据本实施方式所涉及的过滤器，能够抑制因溶血处理等前处理而导致稀少细胞损伤，因此能够以更不损伤稀少细胞的状态(intact)进行分离或分取，容易分取活细胞。进一步，稀少细胞的分离或分取的过程中，能够减少步骤，因此能够抑制成本。
除了上述之外，以往的过滤器中，即使在使用进行了前处理的样本的情况下，也需要进一步用注射器等施加正压、或用泵等施加负压等，通过施加压力而过滤样本。根据本实施方式所涉及的过滤器，通过进一步调整例如过滤器厚度、开孔率或孔密度等而使其为能够进一步抑制压力损失的构成，从而也能够通过利用样本的自重的自然下落而过滤样本。如果能够通过自然下落而过滤样本，则稀少细胞的分离或分取所涉及的步骤变得更简便，施加于样本中稀少细胞的负荷也能够更小，故而优选。
本实施方式所涉及的过滤器像这样过滤孔为特定的形状和大小，由此适合用于样本中的稀少物、优选稀少细胞的分离或分取。使用本实施方式所涉及的过滤器，优选通过使样本从一个面侧向另一个面侧通过而过滤，由此在样本包含期望的稀少细胞(稀少物)的情况下，稀少细胞(稀少物)在过滤后残留在过滤器的一个面上，被分离或分取。本实施方式所涉及的过滤器特别是第一开口部的短轴直径W1为7.0μm以上且9.0μm以下，第一开口部为接近真圆的形状，由此能够在使尺寸为2μm～8μm左右的血液细胞等通过过滤孔的同时，尺寸为9μm～30μm左右的稀少细胞(稀少物)不通过过滤孔，因此能够高效率地分离或分取所述稀少细胞(稀少物)。如后详述，作为这样的稀少细胞，可以举出例如循环肿瘤细胞(CTC)、团块形成型CTC(clustered CTC)、上皮间质转化CTC(EMTCTC)等癌细胞；血管内皮细胞、血管内皮前体细胞、癌干细胞、上皮细胞、造血干细胞、间充质干细胞和胚胎细胞等。即，本实施方式所涉及的过滤器特别适合用于循环肿瘤细胞(CTC)、团块形成型CTC(clustered CTC)、上皮间质转化CTC(EMTCTC)等癌细胞；血管内皮细胞、血管内皮前体细胞、癌干细胞、上皮细胞、造血干细胞、间充质干细胞和胚胎细胞等的分离或分取。
以下，针对本实施方式所涉及的过滤器的优选的方式进一步说明。
本实施方式所涉及的过滤器的厚度t优选为10μm以上且30μm以下。厚度t从处理性的观点出发，优选为10μm以上、更优选为15μm以上、进一步优选为18μm以上。此外，厚度t从进一步抑制压力损失的观点出发，优选为30μm以下、更优选为25μm以下、进一步优选为23μm以下。厚度t可以通过游标卡尺、千分尺等测定器测定。
从第一开口部103的重心C1向另一个面200引出的垂线与另一个面200的交点C2’、和第二开口部203的重心C2的距离优选为3μm以下。C2’和C2的距离更优选为2μm以下、进一步优选为1μm以下。C2’和C2的距离小意味着过滤孔在过滤器的厚度方向上更平行地(更小倾斜地)贯穿。过滤孔在过滤器的厚度方向上更平行地贯穿，由此能够进一步抑制压力损失，故而优选。此外，用显微镜等观察样本过滤后的过滤器时，容易观察图像，故而优选。
图1的(c)中，示意性示出C1、C2’和C2的关系。应予说明，图1的(c)中，为了说明方便而以清楚示出C2’与C2为不同位置的方式调整配置，但C2’和C2可以为相同位置，即C2’和C2的距离可以为0μm。
本实施方式所涉及的过滤器中，各过滤孔的C2’和C2的距离通过例如将上述第二开口部的提取图像中的各区域206的重心的图像上的坐标、和第一开口部的提取图像中的、相当于第一开口部的各区域106的重心的图像上的坐标相比，将其距离换算为过滤器上的距离，从而求出。
本实施方式所涉及的过滤器的开孔率优选为10.5％以上且25％以下。开孔率为10.5％以上，由此容易进一步抑制压力损失。开孔率低的情况下，容易变得需要挤出或抽吸被处理液等施加压力的操作，有时发生稀少细胞的损伤、因分取对象物的挤过而导致的回收损失等。另一方面，通过使开孔率为10.5％以上，由此能够更适合地应用于能够自然下落的过滤器法。从同样的观点出发，开孔率更优选为12％以上、进一步优选为18％以上。此外，优选开孔率高，但从保持过滤器的机械强度的观点出发，优选为25％以下。开孔率更优选为23％以下、进一步优选为22％以下。
本实施方式所涉及的过滤器中，开孔率是通过开孔率(％)＝(第一开口部的面积/过滤器面积)×100求出的值。
本实施方式所涉及的过滤器的孔密度优选为3600个/mm2以上且4200个/mm2以下。孔密度为3600个/mm2以上，由此容易进一步抑制压力损失。孔密度更优选为3700个/mm2以上、进一步优选为3800个/mm2以上。此外，孔密度为4200个/mm2以下，由此过滤器的非开口部的面积变多，能够保持过滤器的强度，故而优选。孔密度更优选为4100个/mm2以下、进一步优选为4000个/mm2以下。
本实施方式所涉及的过滤器中，孔密度是通过孔密度(个/mm2)＝(过滤孔数(个)/过滤器面积(mm2))求出的值。
此外，本实施方式所涉及的过滤器优选任意的0.64mm×0.64mm的区域中孔密度为3600个/mm2以上且4200个/mm2以下。任意的0.64mm×0.64mm的区域中的孔密度更优选为3700个/mm2以上、进一步优选为3800个/mm2以上。此外，任意的0.64mm×0.64mm的区域中的孔密度更优选为4100个/mm2以下、进一步优选为4000个/mm2以下。通过满足所述要件，过滤器面中的过滤孔的分布容易变得均等。通过过滤器面中的过滤孔的分布均等，由此能够抑制在样本过滤时样本流动发生局部集中。通过抑制样本流动的局部集中，能够抑制分离时发生堵塞、细胞以凝集的状态被分离、成为培养、分析时的问题。
从与上述相同的观点、制造时或制造后抑制多个过滤孔彼此连通的观点出发，本实施方式所涉及的过滤器的多个过滤孔更优选等间隔地排列。过滤孔的具体的排列图案没有特别限定，优选为例如以规定周期重复排列规定的形状或图形的图案，具体而言，可以举出例如正方格子状、三角格子状、六角格子状和平行体格子状等格子状；旋涡状、同心圆状以及放射状等。应予说明，过滤孔被等间隔地排列并非是指过滤孔彼此的间隔严格地全都相等，在实现本发明的效果的范围近似等间隔即可。
过滤孔彼此的间隔(过滤孔的间隔)优选为8μm以上且30μm以下。过滤孔的间隔为上述范围，由此容易将孔密度、开孔率调节为上述的优选范围。此外，过滤孔的间隔为上述下限值以上，由此能够抑制多个过滤孔彼此在制造时或制造后连通，故而优选。过滤孔的间隔更优选为10μm以上、进一步优选为14μm以上。此外，过滤孔的间隔更优选为28μm以下、进一步优选为24μm以下。此外，更优选多个过滤孔近似等间隔地排列，且其间隔为上述范围。
其中，过滤孔彼此的间隔(过滤孔的间隔)是指一个过滤孔的第一开口部的重心至相邻的另一个过滤孔的第一开口部的重心的距离。
构成本实施方式所涉及的过滤器的成分没有特别限定，从容易得到具有上述的优选方式的过滤器的观点出发，过滤器优选包含热塑性树脂。过滤器中的热塑性树脂的比例优选为60质量％以上、更优选为80质量％以上。热塑性树脂的比例的上限没有特别限定，100质量％为实质的上限。
作为热塑性树脂的主要成分，具体而言可以优选举出聚乙烯、聚苯乙烯、聚丙烯、聚异丁烯、聚丁烯、聚甲基戊烯等聚烯烃系树脂。这些热塑性树脂从制造时的脱模性优异的观点、成型性优异的观点出发是优选的。应予说明，主要成分是指将过滤器中包含的热塑性树脂整体记作100质量％时占50质量％以上的成分。应予说明，主要成分优选为50质量％以上、更优选为80质量％以上。上限值没有特别限定，100质量％为实质的上限。
热塑性树脂的主要成分优选为聚乙烯或聚丙烯。通过使用聚乙烯或聚丙烯，能够在较低温度成型贯穿孔，因此容易提高生产率。此外，从孔径的控制容易、具有适度的柔软性、透明性等理由出发，容易得到具有上述的优选方式的过滤器，故而优选。
过滤器除了热塑性树脂之外，还可以包含例如为了制造上或使用上等各种目的而添加的各种添加剂。作为所述的添加剂的例子，可以举出例如有机微粒、无机微粒、分散剂、染料、荧光增白剂、抗氧化剂、耐候剂、抗静电剂、脱模剂、增稠剂、增塑剂、pH调节剂和盐等。特别地，作为制造时的脱模剂，优选在聚合时少量添加长链羧酸、或长链羧酸盐等低表面张力的羧酸、其衍生物、和长链醇、其衍生物、改性硅油等低表面张力的醇化合物等进行。
构成过滤器的成分可以通过一般的化学分析、例如红外光谱(IR)、核磁共振(NMR)等进行分析。
作为本实施方式所涉及的过滤器的构成，没有特别限定，优选为例如在膜中具有上述的过滤孔的构成。膜的材质没有特别限定，从容易得到具有上述的优选的方式的过滤器的观点出发，优选为例如树脂膜，更优选包含热塑性树脂的树脂膜。膜的材质的更优选的方式具体而言与构成上述的过滤器的成分的优选的方式相同。在不阻碍本发明的效果的范围内，膜可以是包含1种树脂的单独体的层，也可以是包含多个树脂层的层叠体。此外，膜可以根据需要实施各种涂布等。
膜的总光线透过率优选为80％以上。总光线透过率更优选为82％以上、进一步优选为85％以上。总光线透过率为上述范围，由此将样本过滤后的过滤器直接用于显微镜观察、活细胞的培养变得容易。总光线透过率的上限没有特别限定，典型地为100％以下。
总光线透过率可以通过使用单光束光度计的总光线透过率的测定方法(JIS K7361-1)来测定。
膜的肖氏硬度优选为30以上且50以下。膜的肖氏硬度为30以上，由此过滤器的利用镊子等的操作性提高，故而优选。肖氏硬度更优选为32以上、进一步优选为35以上。此外，肖氏硬度为50以下，由此过滤器具有适度柔软性，容易进一步抑制压力损失，故而优选。肖氏硬度更优选为48以下、进一步优选为46以下。
肖氏硬度可以通过硬度计硬度试验(JIS K 7215)的方法测定。
膜的杨氏模量优选为5MPa以上且25MPa以下。膜的杨氏模量为5MPa以上，由此容易抑制过滤时过滤器的开口形状的变形，故而优选。杨氏模量更优选为7MPa以上、进一步优选为10MPa以上。此外，杨氏模量为25MPa以下，由此过滤器具有适度柔软性，容易进一步抑制压力损失，故而优选。杨氏模量更优选为22MPa以下、进一步优选为20MPa以下。
杨氏模量可以通过拉伸特性试验(JIS K 7161)的方法测定。
此外，从操作性、过滤性的观点出发，肖氏硬度和杨氏模量两者更优选各自设为上述的范围。
＜过滤设备＞
本发明还涉及过滤设备，其包含本实施方式所涉及的过滤器、和保持前述过滤器的保持部，能够对注射器进行装配拆卸。保持部只要能够保持过滤器，则其形状等没有特别限定，可以根据用途、装配拆卸的注射器等而适当设计。此外，用于对注射器装配拆卸的机构也没有特别限定，可以根据用途、装配拆卸的注射器等而调整。根据本实施方式所涉及的过滤设备，使用本实施方式所涉及的过滤器的样本的过滤中，作为样本的流路可以使用容易获取的成品的射器等，能够更简便地进行过滤，故而优选。
＜分离或分取稀少细胞的方法＞
本实施方式所涉及的过滤器或本实施方式所涉及的过滤设备适合用于稀少细胞的分离或分取。即，本发明还涉及分离或分取样本中的稀少细胞的方法。作为所述的方法，可以举出包括使用本实施方式所涉及的过滤器或本实施方式所涉及的过滤设备将样本进行过滤的过滤步骤的方法。
过滤步骤中，优选从过滤器的一个面过滤样本。从一个面过滤样本即是指使样本从过滤器的一个面侧向另一个面侧通过而过滤。样本包含期望的稀少细胞的情况下，稀少细胞在过滤后残留在过滤器的一个面上，由此分离或分取稀少细胞。
过滤步骤中，也可以在过滤器的一个面侧与另一个面侧设置压力差，但从抑制对样本中的稀少细胞的损伤的观点出发，压力差优选为10Pa以下、更优选为1Pa以下。此外，进一步优选过滤步骤中不设置压力差，即通过样本的自重过滤。本实施方式所涉及的过滤器中，抑制过滤时的压力损失，因此能够使压力差较小，进一步也能够通过样本的自重过滤。
过滤器的送液速度没有特别限定，从减少过滤所需要的时间的观点出发，例如平均1个过滤孔优选为5nl/min以上、更优选为10nl/min以上、进一步优选为20nl/min以上。此外，从减少对过滤对象的负荷的观点出发，例如优选为1000nl/min以下、更优选为500nl/min以下、进一步优选为100nl/min以下。应予说明，如上所述，送液未必需要压力差等驱动力，也可以通过样本的自重以上述速度将样本送液。
过滤面积没有特别限定，可以考虑例如过滤孔数和样本的过滤处理量等而设定。从增大过滤器处理容量的观点出发，过滤面积优选为50mm2以上、更优选为100mm2以上、进一步优选为130mm2以上。此外，从减少必要样本量的观点出发，过滤面积优选为1000mm2以下、更优选为800mm2以下、进一步优选为500mm2以下。
作为能够通过本实施方式所涉及的过滤器过滤的样本，没有特别限定，优选为例如细胞悬浮液。作为细胞悬浮液，具体而言可以举出血液、尿、唾液、脑脊髄液、胸水、腹水、细胞诊断后的残余样本等。
根据本实施方式所涉及的过滤器，可以对样本不进行溶血处理等前处理而进行过滤处理。因此，从抑制稀少细胞的损伤、容易分取活细胞的观点出发，优选对样本不进行溶血处理等可能损伤稀少细胞的前处理。但是，根据其目的、用途等，也不妨进行所述的处理。此外，根据其目的、用途、样本的状态等，也可以进行样本的稀释、稀少细胞的标记处理等公知的前处理。
作为通过本实施方式所涉及的过滤器分离的物质，可以举出例如上述样本中包含的稀少物，作为稀少物，可以举出稀少细胞、稀少物质。作为所分离的物质，典型而言优选为稀少细胞。应予说明，上述实施方式中，作为所分离的物质，以稀少细胞为例进行说明，但如上述那样，所分离的物质不仅限于稀少细胞。
作为稀少细胞，可以举出例如选自癌细胞、循环肿瘤细胞(CTC)、上皮间质转化CTC(EMTCTC)、团块形成型CTC(clustered CTC)、血管内皮细胞、血管内皮前体细胞、癌干细胞、上皮细胞、造血干细胞、间充质干细胞、胚胎细胞、和它们的组合中的1种以上的细胞。稀少细胞优选为选自循环肿瘤细胞(CTC)、上皮间质转化CTC(EMTCTC)、团块形成型CTC(clustered CTC)中的1种以上的细胞。本实施方式所涉及的过滤器的孔的形状、大小被调整为特定的范围，因此适合用于这些稀少细胞的分离或分取。
作为稀少物质，可以举出例如石棉、胆固醇晶体、血栓、尿酸晶体、焦磷酸钙晶体等。
＜细胞悬浮液中的稀少细胞的分析方法＞
本发明还涉及细胞悬浮液中的稀少细胞的分析方法。即，本实施方式所涉及的细胞悬浮液中的稀少细胞的分析方法包括将通过本实施方式所涉及的分离或分取稀少细胞的方法分离或分取的稀少细胞通过包括前述稀少细胞的动态观察或者活性测定的方法进行分析、或对前述稀少细胞的基因进行分析。即，根据本实施方式所涉及的过滤器，能够将稀少细胞分离或分取为活细胞，因此能够通过包括稀少细胞的动态观察或者活性测定的方法进行分析、或对稀少细胞的基因进行分析。分析的方法没有特别限定，可以使用公知的分析技术。分析根据其具体的手段，由于在过滤后残留在过滤器的一个面上，可以以分离或分取的稀少细胞残留在过滤器上的状态进行，也可以从过滤器中回收稀少细胞后进行。
＜过滤器的制造方法＞
本实施方式所涉及的过滤器的制造方法只要是得到上述的过滤器的方法，则没有特别限定，作为一例，可以举出包括将在表面上具有突起结构的模具加热的同时对膜挤压从而形成过滤孔(过滤孔形成步骤)的方法。以下，参照附图具体说明本实施方式所涉及的过滤器的优选的制造方法的例子。
图5是示意性示出本实施方式所涉及的过滤器的制造方法的一例的流程图。上述过滤孔形成步骤中，膜优选以至少将膜11和支撑膜12层叠的层叠结构体10的状态使用。即，过滤孔形成步骤中，优选对前述层叠结构体10，将在表面上具有突起结构21的模具20加热的同时对该层叠结构体10的膜11侧挤压，由此在膜11中形成贯穿孔，在支撑膜12上形成与前述贯穿孔连通的凹部。在此，在膜11上形成的贯穿孔相当于本实施方式所涉及的过滤器的过滤孔。
此外，过滤孔形成步骤中使用层叠结构体的情况下，优选在过滤孔形成步骤后将膜和支撑膜剥离(剥离步骤)。通过剥离步骤，得到在过滤孔形成步骤中形成有贯穿孔(过滤孔)的膜作为过滤器。
进一步具体而言，本实施方式所涉及的过滤器的制造方法的例子如下所述。
最初，如图5的(a)所示那样，准备层叠有膜11和支撑膜12的层叠结构体10、与在表面上在规定位置配置有独立的突起结构的模具20。在此，膜11优选包含热塑性树脂P1，支撑膜优选包含热塑性树脂P2。此外，热塑性树脂P1的熔点记作Tm1，热塑性树脂P2的玻璃化转变点记作Tg2。
作为各层中包含的各热塑性树脂的比例，将层整体记作100质量％时，优选包含60质量％以上的该热塑性树脂。进一步更优选包含80质量％以上。此外，各层中，除了热塑性树脂P1或热塑性树脂P2之外，可以包含用于赋予成型性、脱模性的添加物、涂布成分。应予说明，上限值没有特别限定，100质量％为实质的上限。
此外，膜与支撑膜的界面优选为可剥离的，膜与支撑膜的界面优选利用通过涂布等而形成的粘合剂的作用而层压。此外，本实施方式中，说明了膜与支撑膜的2层层叠构成，也可以夹持支撑膜而在膜的相反侧设置另一层。如果对膜表面的涂布应用与膜相同构成的材料，则成型后的平面性变高，故而优选。
层叠结构体是指层叠有2层以上的包含不同成分的层的结构体。应予说明，层叠结构体可以是通过卷对卷运输的连续体膜，也可以是单张片材。
玻璃化转变温度是指通过以JIS K 7244-4(1999)所述的方法为准的方法，测定试样动态振幅速度(驱动频率)为1Hz、拉伸模式、夹具间距离5mm、升温速度2℃/分钟下的温度依赖性(温度分散)时，tanδ达到极大的温度。
此外，在此所称的熔点是通过DSC(差示量热分析)得到的升温过程(升温速度：20℃/分钟)中的熔点Tm，通过与上述同样基于JIS K 7121(1999)的方法，从25℃至300℃以20℃/分钟的升温速度加热(1stRUN)，在该状态下保持5分钟，接着骤冷以达到25℃以下，取再次从室温以20℃/分钟的升温速度升温至300℃而得到的2ndRun的结晶熔融峰中的峰位的温度，作为该树脂的熔点。
本实施方式所涉及的制造方法的例中，首先预先加热在表面上具有突起结构21的模具20。加热优选以模具达到Tm1以上且Tg2以上的温度范围的方式进行。加热可以在模具与层叠结构体接触的状态下进行。通过预先接触，能够预先以良好的状态保持层叠结构体的平面性。
应予说明，模具的加热温度的上限值没有限定，优选为热塑性树脂P1的热分解点以下、且热塑性树脂P2的热分解点以下。
接着，如图5的(b)所示那样，在加热了的状态的层叠结构体10的膜11的表面上，以突起结构面接触的方式加压挤压模具20。通过加压，只要突起结构21具有适当的高度，则突起结构穿透膜11，穿刺至支撑膜12。并且，如图5的(c)所示那样，形成模具20与层叠结构体10无缝隙抵接的状态。
此时所需压力和加压时间取决于膜的材质、转印形状、特别是凹凸的高宽比，大致的压制压力的优选范围为1～50MPa，成型时间的优选范围为0.01～60秒。
压制压力的更优选范围为2～40MPa、进一步优选范围为3～15MPa。此外，成型时间的更优选范围为1～50秒、进一步优选的范围为3～30秒。
此外，可以通过位置控制将模具20挤压至层叠结构体10。即，可以使模具20移动至预先设定的位置而挤压层叠结构体10。预先设定的位置是指包含模具的突起结构的平面能够无缝隙地抵接在膜的表面上的位置。
应予说明，升压后在保持模具的位置的情况下除压，也可以保持模具20与层叠结构体10的接触状态。
接着，如图5的(c)所示那样，在保持加压的状态或接触的状态下，冷却模具。冷却优选进行至构成支撑膜的热塑性树脂P2的玻璃化转变温度Tg2以下。通过冷却至Tg2以下，能够抑制从层叠结构体10剥离模具20后的树脂变形，能够形成精度高的贯穿孔，故而优选。
接着，如图5的(d)所示那样，从模具20剥离层叠结构体10。剥离中，以在相对于层叠结构体的表面垂直的方向上分离模具、层叠结构体的方式移动。层叠结构体为连续体的膜的情况下，优选连续地在相对于层叠结构体的表面垂直的方向上给与张力，以线状的剥离位置连续移动的方式进行剥离。也可以在该状态下保持而在即将使用具有贯穿孔的膜、即所制造的过滤器前剥离支撑膜。支撑膜具有作为覆盖膜的功能，如果在即将使用前剥离则难以对表面造成损伤，此外，在即将使用前作为厚且刚性高的膜处理，因此作业性良好，故而优选。
图5的(e)中，从支撑膜12剥离膜11。剥离中，从抑制剥离痕迹的观点出发，优选在相对于膜或支撑膜的表面垂直的方向上对膜或支撑膜给与张力，线状的剥离位置连续移动而剥离。
通过实施使用图5说明的上述步骤，能够制造在膜11上形成形状被高精度控制的过滤孔的过滤器。根据上述的制造方法，膜在成型时为熔融状态，因此挤压突起结构时的膜以接近粘性材料的行为而引起塑性变形，形成开口部端面处的毛刺少的贯穿孔。此外，进一步挤入突起图案(突起结构)时，在支撑膜中引起粘弹性变形，突起结构能够顺畅进入支撑膜的内部，因此膜与支撑膜的界面处也能够形成毛刺少的清晰的端面。
上述那样的方法中，通过根据过滤孔形状调节模具的突起结构的形状和配置，能够制造过滤孔、其开口部的形状、以及配置等被高精度地控制的过滤器。即，本实施方式所涉及的制造方法中，通过以与本实施方式中的过滤器的过滤孔形状、配置的优选方式对应的方式调整模具的突起结构的形状、配置，能够制造期望的过滤器。
模具的材质优选强度和热传导率高的金属，优选为例如镍、钢、不锈钢、铜等。此外，为了提高加工性，也可以使用对外表面实施镀金的材质。
突起结构的高度、形状、截面形状、排列等根据所要求的过滤孔的形状、膜的厚度而适当决定。针对突起结构的高度，优选为穿透膜11的厚度的长度。即，成型时模具20与层叠结构体10密接时，优选为穿透膜11的高度。此外，突起结构的形状优选为与上述过滤孔形状对应的形状，优选为例如截头圆锥形状或圆锥形状等。与突起结构的高度方向垂直的截面的截面形状优选为例如圆形。
在表面上具有突起结构的各模具的制作方法可以举出对金属表面实施直接切削、激光加工、电子射线加工的方法；对在金属表面上形成的镀金覆膜实施直接切削、激光加工、电子射线加工的方法等。此外，可以举出在基板上涂布抗蚀剂后，通过光刻手段而以规定的图案形成抗蚀剂后，对基板进行蚀刻处理而形成凹部，去除抗蚀剂后通过电铸而得到其反转图案的方法等。通过应用各向异性蚀刻，可以得到锥状的图案。作为基板，除了金属板之外，还可以应用硅基板等。
针对膜11的材质等，其优选的方式与上述过滤器中的膜的优选的方式相同。
作为构成支撑膜12的热塑性树脂的主要成分，具体而言可以优选举出聚对苯二甲酸乙二醇酯、聚2,6-萘二甲酸乙二醇酯、聚对苯二甲酸丙二醇酯、聚对苯二甲酸丁二醇酯等聚酯系树脂、聚乙烯、聚苯乙烯、聚丙烯、聚异丁烯、聚丁烯、聚甲基戊烯等聚烯烃系树脂、聚酰胺系树脂、聚酰亚胺系树脂聚醚系树脂、聚酯酰胺系树脂、聚醚酯系树脂、丙烯酸系树脂、聚氨基甲酸酯系树脂、聚碳酸酯系树脂、环烯烃聚合物或聚氯乙烯系树脂等。特别优选为聚甲基丙烯酸甲酯或环烯烃聚合物。应予说明，主要成分是指将构成支撑膜的树脂整体记作100质量％时占50质量％以上的成分。应予说明，主要成分优选为50质量％以上、更优选为80质量％以上。此外，支撑膜12与构成过滤器的成分同样地，可以适当包含各种添加剂。
热塑性树脂P2优选为聚甲基丙烯酸甲酯、环烯烃聚合物或聚碳酸酯。特别优选为聚甲基丙烯酸甲酯或环烯烃聚合物。通过使用聚甲基丙烯酸甲酯、环烯烃聚合物或聚碳酸酯，能够以良好的精度成型与贯穿孔(过滤孔)连通的凹部。
膜、支撑膜在不损害本发明的效果范围，可以是包含上述的树脂的单独体的层，也可以是包含多个树脂层的层叠体。该情况下，与单独体的层相比，能够赋予脱模性、耐摩擦性等表面特性等。像这样制成包含多个树脂层的层叠体的情况下，膜和支撑膜的各层中，也优选主要热塑性树脂成分满足前述的要件。
此外，作为膜和支撑膜的制造方法，优选例如通过熔融挤出制热塑性树脂膜。在表层上设置脱模层、粘合层等的情况下，使用共挤出而加工为膜状的方法即可，也可以在制膜后通过涂布设置。此外，可以使用在以单膜制作的膜上挤出层压表层原料的方法。此外，膜与支撑膜的层叠除了用辊夹持加压而层压的方法之外，还可应用通过加热了的辊等进行热层压的方法等。
实施例
以下，针对本发明的实施例具体说明，但本发明不限于此。
[过滤器评价]
(过滤孔形状、配置)
(利用激光共聚焦显微镜的观察)
作为反射体，使用自粘合膜(材质：聚乙烯、东丽膜加工株式会社制、型号トレテック7721)，将各过滤器以一个面为下侧的方式配置在反射体上。接着，使用激光共聚焦显微镜(olympus株式会社制、型号OLS4100)，从另一个面侧观察过滤器。此时，过滤器在固定的状态下得到聚焦于另一个面的观察图像、和聚焦于一个面所接触的反射体的表面的观察图像。观察范围设为131μm见方，调节照射强度使在该范围内进行激光观察时的反射光强度不超过受光元件的最大强度。
但是，比较例1的过滤器由于过滤器的厚度厚，因此无法从反射体的表面得到激光的反射光，因此使用激光共聚焦显微镜的图像观察困难。因此，比较例1的过滤器通过利用扫描型电子显微镜而获取过滤器的截面图像来观察。
(二值化处理)
接着，将所得过滤器的观察图像通过图像处理软件二值化。针对聚焦于另一个面的观察图像，提取相对于观察图像中的反射光强度的最大值为0～10％的反射光强度的部分作为暗部。此时，针对拍摄区域边界所涉及的部分和100像素以下的部分，从对象中排除。应予说明，整体以1024×1024像素拍摄，100像素以下以面积换算计为1.6μm2以下。此外，针对聚焦于一个面所接触的反射体的表面的观察图像，提取相对于观察图像中的反射光强度的最大值为13～100％的反射光强度的部分作为明部。此时，针对拍摄区域边界所涉及的部分和2000像素以下的部分，从对象中排除。应予说明，整体以1024×1024像素拍摄，2000像素以下以面积换算计为32μm2以下。
由二值化的图像，求出第一开口部的短轴直径W1和长轴直径L1、第二开口部的短轴直径W2和长轴直径L2、C2’和C2的距离、开孔率、孔密度以及过滤孔的间隔。
(厚度)
使用千分尺(株式会社ミツトヨ制、型号CLM1-15QMX)测定过滤器的厚度。
(总光线透过率)
使用透过率计(株式会社村上色彩技术研究所制、型号HR-100)，测定形成过滤孔前的膜的总光线透过率。准备40mm×40mm的膜试验片，卤素光束透过的光线之中，平行成分和扩散成分都包含在内的光线的透过率记作总光线透过率。
(肖氏硬度)
使用硬度计(株式会社テクロック制、型号GS719N)，测定形成过滤孔前的膜的肖氏硬度。
(杨氏模量)
使用拉伸试验机(株式会社オリエンテック制型号RTA-500)，测定形成过滤孔前的膜的杨氏模量。在温度23℃、湿度65％RH、拉伸强度300mm/min的条件下测定。
[实施例和比较例]
(实施例1)
作为膜，使用主要包含聚乙烯(熔点126℃)的厚度15μm的膜，作为支撑膜，使用主要包含环烯烃聚合物(COP)(玻璃化转变温度136℃)的厚度100μm的膜。应予说明，在膜的一个表层上具有以低密度聚乙烯为主体的厚度6μm的粘合层。以在支撑膜的表面上贴合膜的粘合层的方式层压，构成层叠结构体。
作为模具，使用在整面上配置截头圆锥形状的突起结构的模具。截头圆锥的底面为直径8μm的圆形，高度为50μm，以间距16μm正方配置。加工突起结构的区域为100mm(膜宽度方向)×100mm(膜搬运方向)的区域。模具的材质以厚度20mm的铜作为母材而对表面实施镍镀金膜，在镀金膜上通过机械加工形成截头圆锥图案。
成型时的模具温度设为150℃，作为加压力，整面施加5MPa的压力。加压时间为30秒。此外，剥离时的模具温度为80℃。通过从模具剥离膜，得到在膜上具有贯穿孔、在支撑膜上具有与前述贯穿孔连通的凹部的热塑性膜。
将从模具剥离的热塑性膜接着连续地向卷取装置送出，将膜和支撑膜剥离，各自卷取。得到卷取的膜作为具有多个过滤孔的过滤器。
(实施例2)
以开孔率达到10％的方式变更突起结构的配置，除此之外，使用与实施例1同样的模具，通过与实施例1同样的流程制作过滤器。
(比较例1)
作为材质，使用由聚碳酸酯构成的ScreenCell(注册商标)CYTO R kit(型号RCY4FC)。
(比较例2)
作为材质，使用由环氧系树脂构成的CellSieve(商品名)Microfilters-8microndiameter 5pack(for training)。
针对各例的过滤器，评价上述的各项目的结果示于表1。表中，“N.D.”表示该数据未测定。应予说明，比较例1中的过滤孔的间隔值有偏差，因此记作“不定”。实施例1、2和比较例2中的过滤孔以等间隔(近似等间隔)排列。
[表1]
[自然下落试验]
(试验方法)
针对各例的过滤器，评价是否可能利用样本自重的自然下落进行过滤。在直径13mm过滤器用的过滤器样品台(SWINNEXSX0001300、Millipore公司制)上安装各例的过滤器。在过滤器样品台上安装拆掉柱塞的20mL注射器(テルモ注射器20mL SS-20ESZ、テルモ株式会社制)。在该注射器中作为样本而使用生理食盐水5mL和全血5mL，测量各自的过滤结束为止的时间。其中，60秒未开始滴下的情况下，判断为自然下落的过滤困难，表中示出为“不滴下”。试验针对各例的过滤器，使用生理食盐水5mL和全血5mL，实施例1进行各3次，实施例2和比较例1、2进行各1次。但是，针对生理食盐水5mL为“不滴下”的过滤器，判断为在粘度更大的全血5mL的情况下也同样自然下落的过滤困难，不实施全血5mL的试验。
试验结果示于表2。在此，表2中示出为“a～b秒”的情况下，a表示进行多次试验结果之中最小的秒数，b表示最大的秒数。
[表2]
表2
实施例1 实施例2 比较例1 比较例2
生理食盐水5mL 55～75秒 不滴下 不滴下 不滴下
全血5mL 260秒 未实施 未实施 未实施
[细胞回收率试验]
(样本的准备)
在从志愿者采集的血液中以达到100个/mL的方式混合肺腺癌细胞株H827，其中3mL用于1次评价，供于细胞回收率的评价试验。将其作为未稀释的样本进行评价。此外，将未稀释的样本用生理食盐水稀释3倍的样本和稀释5倍的样本也同样评价。使用未稀释的样本进行3次(No.1～3)评价、使用3倍稀释的样本进行3次(No.4～3)评价、使用5倍稀释的样本进行3次(No.7～9)评价。
(试验方法)
通过与前述自然下落试验相同的方法，在过滤器样品台上安装实施例1的过滤器，安装注射器。使用该注射器，各自过滤上述的样本(No.1～9)。
(评价)
过滤后，针对在过滤器上分离残留的细胞(过滤器捕捉细胞)评价以下的项目。
细胞测量值：将过滤后的过滤器用吉姆萨染色液染色，在显微镜下对肿瘤细胞的个数进行计数，将所得个数记作细胞测量值(个)。计数时，单个细胞或包含2个以上的细胞团块均计数为1个。
回收率：(细胞测量值/总细胞数)×100记作回收率(％)。总细胞数对未稀释的样本设为300，3倍稀释的样本设为100，5倍稀释的样本设为60。
细胞团块数：上述细胞测量值之中，将包含2个以上的细胞的细胞团块的个数作为细胞团块数(个)。
此外，针对分离后的滤液(Flow Through液)，评价以下的项目。滤液用ViCell评价一半量、剩余一半量作为涂片标本进行评价。
ViCell：将滤液一半量使用ViCell XR(BECKMAN COULTER公司)对细胞的个数进行计数，将所得个数记作ViCell(个)。
涂片标本：将滤液一半量滴加至载玻片上，用推片法涂抹后，用吉姆萨染色液染色。在显微镜下对肿瘤细胞的个数进行计数，将所得个数记作涂片标本(个)。
评价结果示于表3。
[表3]
表3
由上述的结果确认，根据实施例1的过滤器，通过过滤孔具有规定的孔形状，从而能够分离血液中的稀少细胞，且即使不进行溶血处理等可能损伤稀少细胞的前处理也能够过滤样本。进一步，确认在实施例1的过滤器中，不需要抽吸装置等特殊器械，利用自然下落也能够进行样本的过滤。
应予说明，未进行使用实施例2的过滤器的细胞回收率试验，但实施例2的过滤器除了过滤孔的配置之外也在与实施例1相同的条件下制作，认为同样能够分离血液中的稀少细胞，且即使不进行溶血处理等可能损伤稀少细胞的前处理也能够过滤样本。
此外，根据细胞回收率试验的结果，分离后的滤液中几乎不含稀少细胞。因此，认为几乎不存在通过本发明的过滤器的稀少细胞。
参照详细且特定的实施方式说明了本发明，但对本领域技术人员显而易见的是在不脱离本发明的精神和范围的情况下可以施加各种各样的变更、修正。本申请基于2021年3月30日提交的日本专利申请(日本特愿2021-058467)，其内容以参考形式并入本文。
标号说明
1 过滤器
3 过滤孔
100 一个面
103 第一开口部
106 相当于第一开口部的区域
200 另一个面
203 第二开口部
206 相当于第二开口部的区域
400 反射体
10 层叠结构体
11 膜
12 支撑膜
20 模具
21 突起结构

Claims (17)

1.过滤器，其具有贯穿一个面和另一个面的多个过滤孔，
前述过滤孔在前述一个面上具有第一开口部，和在前述另一个面上具有第二开口部，
前述第一开口部的短轴直径W1与长轴直径L1的比(L1/W1)为1.00以上且1.20以下，
前述短轴直径W1为7.0μm以上且9.0μm以下，
前述第二开口部的短轴直径W2与长轴直径L2的比(L2/W2)为1.00以上且1.20以下，
前述短轴直径W1与前述短轴直径W2的比(W2/W1)和前述长轴直径L1与前述长轴直径L2的比(L2/L1)均为1.20以上且1.50以下。
2.根据权利要求1所述的过滤器，其中，前述过滤器的厚度为10μm以上且30μm以下。
3.根据权利要求1或2所述的过滤器，其中，C2’与前述第二开口部的重心C2的距离为3μm以下，C2’为从前述第一开口部的重心C1向前述另一个面引出的垂线与前述另一个面的交点。
4.根据权利要求1～3中任一项所述的过滤器，其中，前述过滤器的开孔率为10.5％以上且25％以下。
5.根据权利要求1～4中任一项所述的过滤器，其中，多个前述过滤孔等间隔地排列。
6.根据权利要求1～5中任一项所述的过滤器，其中，前述过滤孔彼此的间隔为8μm以上且30μm以下。
7.根据权利要求1～6中任一项所述的过滤器，其中，前述过滤器是在膜上具有前述过滤孔的过滤器，前述膜的总光线透过率为80％以上。
8.根据权利要求1～7中任一项所述的过滤器，其中，前述过滤器是在膜上具有前述过滤孔的过滤器，
前述膜的肖氏硬度为30以上且50以下，杨氏模量为5MPa以上且25MPa以下。
9.根据权利要求1～8中任一项所述的过滤器，其中，前述过滤器包含热塑性树脂。
10.根据权利要求9所述的过滤器，其中，前述热塑性树脂的主要成分为聚乙烯或聚丙烯。
11.过滤设备，其包含权利要求1至10中任一项所述的过滤器、和保持前述过滤器的保持部，能够对注射器进行装配拆卸。
12.权利要求1至10中任一项所述的过滤器的制造方法，其包括将在表面上具有突起结构的模具加热的同时对膜进行挤压从而形成过滤孔。
13.分离或分取细胞悬浮液中的稀少细胞的方法，其包括使用权利要求1至10中任一项所述的过滤器或权利要求11所述的过滤设备将细胞悬浮液过滤的过滤步骤。
14.根据权利要求13所述的分离或分取稀少细胞的方法，其中，前述过滤步骤中，包括通过前述细胞悬浮液的自重进行过滤。
15.根据权利要求13或14所述的分离或分取稀少细胞的方法，其中，前述稀少细胞是选自癌细胞、循环肿瘤细胞(CTC)、上皮间质转化CTC(EMTCTC)、团块形成型CTC(clusteredCTC)、血管内皮细胞、血管内皮前体细胞、癌干细胞、上皮细胞、造血干细胞、间充质干细胞、胚胎细胞和它们的组合中的1种以上细胞。
16.根据权利要求13～15中任一项所述的分离或分取稀少细胞的方法，其中，前述过滤步骤中，包括从前述过滤器的前述一个面侧过滤前述细胞悬浮液。
17.细胞悬浮液中的稀少细胞的分析方法，其包括将通过权利要求13～16中任一项所述的方法分离或分取的前述稀少细胞通过包括前述稀少细胞的动态观察或者活性测定的方法进行分析、或对前述稀少细胞的基因进行分析。
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