CN1615437A - 血细胞分离体系 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种血细胞分离体系,其用于对孕妇血液中混入的稀少胎儿有核细胞的精确分离和浓缩,便于得到能够用于产前染色体/基因诊断的检验制剂。血细胞分离体系的特征在于:包括(1)初级分离装置,用于从取自孕妇的血液样品中主要除去的非成核红细胞、白细胞和血小板,得到的初级分离样品,(2)二次分离装置,用于利用碳水化合物-外源凝集素方法,从用初级分离装置得到的初级分离样品中除去残存的非成核红细胞和白细胞,以得到含浓缩的胎儿有核细胞的二次分离样品,和(3)制备装置,用于制备用二次分离装置得到的二次分离样品。
Description
技术领域
本发明涉及使用外源凝集素分离血细胞的体系,尤其涉及从含有核成红细胞(erythroblast)的样品中有效除去非成核红细胞和成熟白细胞,以分离和浓缩胎儿有核成红细胞的体系。该有核成红细胞是存在于孕妇的母体外周血或脐带血中的胎儿有核细胞。并进一步涉及用于检验染色体和基因的体系。
背景技术
在基因诊断领域,长期期望研制出用于不危及胚胎即胎儿的产前诊断方法。现在临床应用的基因诊断方法是侵入装置,如羊水诊断、绒毛取样和胎儿血液收集,尤其是经羊水诊断的胎儿细胞取样会作出确定的诊断,但也要承担大约1/300流产的高度风险。
另外,当从存在于母体外周血中的母体血清生物化学标记物,如AFP(α-胎蛋白)、hCG(绒毛膜促性腺激素)、uE3(尿雌激素三醇3,在怀孕期间胎儿肾上腺分泌的,用于胎儿-胎盘功能检验的一类雌激素)和抑制素A(一类促性腺激素)的改变预见胎儿畸形的方法需要使用非侵入装置时,它们仅是用于需要采取羊水诊断的筛选方法,而且不能依赖其作出任何确定的诊断。
另一方面,关于母亲和孩子血型不相容性的临床研究清楚显示胎儿细胞设法到达母体的循环体系。因而,如果能从母体血液中分离出混入的胎儿细胞,并且如果它们是有核细胞的话,它们的DNA和染色体能用于安全地作出确定的胎儿诊断。在1969年,Walknowska等人报道:他们培养了母体外周淋巴细胞,并在30位怀有男胎孕妇的21位中发现一种46XY染色体组型。然而,从类似淋巴细胞的全部组群中提取含Y染色体的淋巴细胞是相当困难的,且用尼龙羊毛柱或密度离心法对其进行分离和浓缩的尝试没有成功产生有用的结果。另外,过去怀孕残存的胎儿细胞的存在也是一个问题,并且考虑到对想得到的初生胎儿的检测,确定的胎儿诊断的安全方法没有任何进展。
最近几年,有短暂寿命和通常于母体中几乎不存在的细胞——有核成红细胞,作为存在于母体血液中的胎儿有核细胞吸引了一些注意力,而且它们用于作为诊断细胞的可能性的研究变得非常活跃。然而,它们在母体血液中的比例极低,占所有有核细胞的1/105至1/107,而且就像用淋巴细胞进行胎儿细胞诊断,完成从母体有核细胞如白细胞中分离和检测足够数量的胎儿有核成红细胞的过程存在技术障碍。
当试图通过使用运铁蛋白受体抗体或磁珠的流式细胞计数的装置来分离有核成红细胞时,抗体的特异性问题阻碍了对含Y染色体的有核成红细胞的有效检测。
另一方面,有代替细胞分离的收集方法,对有核成红细胞进行形态学的鉴别,并且用显微操纵术每次挑选一个,但将有核成红细胞从大量母体有核细胞中区别出来的方法需要相当的专业技术,并且极其耗时。因而,这种方法需要特殊的仪器,并且处理一个单一样品要花费几天时间。目前,可以从1cc的母体外周血中检测到单个有核红细胞。然而,为了建立普遍和实用的胎儿检验方法,用于以统计确定的方式检验基因和染色体,必需至少考虑30个胎儿细胞。当考虑到从孕妇体内安全收集的血液数量至多为10cc时,这种取样方法变得不切实际。因此,迄今为止,仍强烈需求一种快速和方便的高产量分离和浓缩有核红细胞的方法。
本发明人完成了针对碳水化合物链特殊相互作用的研究,并且获得一个专利(日本专利第3139957),该专利涉及用以各种碳水化合物链为支链的复合糖聚合物包覆培养皿等的基质表面的细胞培养基,由此能选择性粘附对这些碳水化合物链有亲和性的外源凝集素。而且,他们发现使用外源凝集素的分离方法能用于分离和浓缩有核成红细胞和未成熟的造血细胞,因而使对10-30个胎儿有核细胞的检测成为可能(国际公开WO00/58443)。
当分离和回收如有核成红细胞的血细胞时,一般首先使用密度离心法对外周血进行预处理,但发现在这种用密度离心法的预处理阶段,有核成红细胞受到破坏。例如,有核成红细胞的比重在约1.077-1.095之间变化,当使用有某种比重的高密度流体(如Ficoll等)时,有时在Ficoll层下面和上面的红细胞层中都能检测出有核成红细胞,所以用密度分离法进行的样品分离会导致一些有核成红细胞的损失。认为这是由于含胎儿血色素和将要去核的胎儿有核成红细胞的比重不确定。
而且,为了了解在用这种方法进行有核成红细胞分离和提纯中的染色体的变异等等情况,它们必须用FISH(荧光原位杂交法)方法等进行检查,但这在制备作这项检验的样品的过程中产生需要克服的实际问题。
因此,为了完全解决上述问题,本发明的主题是提供一种新的能用于临床实践的血细胞分离体系,基于使用外源凝集素对有核成红细胞(NRBC)进行的精确分离和回收。也就是,本发明提供一种使用外源凝集素从有限数量母体血液样品的母体细胞中精确分离稀少胎儿有核细胞时,在预处理阶段,在很大程度上防止成红细胞损失的体系,因此有选择性且高产量地分离、浓缩和回收想得到的未成熟胎儿细胞或NRBC’s,且提供一种生产含用这种体系分离和回收胎儿细胞的检验制剂的方法。
发明概述
本发明的血液分离体系
(1)包括从取自孕妇的血液样品中主要除去非成核红细胞、白细胞和血小板,以得到初级(粗)分离样品的初步(粗)分离装置,在高度防止含于母体血液样品的各种类型血细胞中的胎儿有核细胞损失的情况下,用所述初级分离装置分离和主要除去作为有核细胞的白细胞、非成核红细胞、血小板等;
(2)包括从所述初级分离装置得到的一次分离样品中除去残存的非成核红细胞和白细胞,以得到含浓缩胎儿有核细胞的二次(精确)分离样品的二次(精确)分离装置,二次分离装置涉及所述初级分离样品在灭活细胞和预定外源凝集素浓度的条件下,在表面固定着复合糖聚合物(glycoconjugate polymer)的基质上培养,含于所述初级分离样品中的胎儿有核细胞通过外源凝集素-碳水化合物相互作用与外源凝集素选择性结合,使其浓缩和粘附于所述基质,以形成二次分离样品;和
(3)包括制备用二次分离装置得到的二次分离样品的制备装置,制备装置涉及在预定条件下,将所述胎儿有核细胞被浓缩和粘附于其上的所述基质离心,从而得到一种检验制剂,其中来自母体血液的胎儿有核细胞以有利于用FISH方法等进行基因/染色体检验的状态,以确定诊断的水平存在。
本发明的血液分离体系优选进一步包括使用得自上述制备装置的检验制剂来检验其中所含胎儿有核细胞的染色体和/或基因的一种检验装置。
而且,本发明也提供使用上述血细胞分离体系,生产用于产前胎儿诊断的检验制剂的方法,和用这种生产方法生产的检验制剂,其中未成熟胎儿细胞以有利于用FISH方法等进行基因/染色体检验的状态,以确定诊断的水平存在。
附图简述
图1是示出本发明血细胞分离体系实例的框图。
图2是示出用300μg/ml外源凝集素(SBA)将来自母体血液的固定于复合碳水化合物聚合物所包覆的基质上的血细胞的显微镜(×200)照片。
图3是示出,用8μg/ml外源凝集素(SBA)将来自母体血液的固定于复合碳水化合物聚合物所包覆的基质上的血细胞的显微镜(×200)照片。
图4是示出图3所示的被固定细胞的显微镜(×1000)照片。
图5是示出可用于本发明血细胞分离体系的基质实例的横截面图。
优选实施方式的描述
下文中,对本发明进行详细描述。
首先,用于本发明的体系和方法的血液样品来自孕妇。作为血液收集工具,可以使用通常使用的血液收集用具,如注射器、真空血液收集试管或血袋。所收集的血液可以是包括来自胎盘或骨髓液的静脉血、脐带血、绒毛血在内的任何类型的血液,但为了尽可能地限制对母体的侵入,最优选外周静脉血。对血液样品的数量没有特殊的限制,考虑到侵入母体带来的问题,一般约1-10ml。为了防止得到的血液样品凝结,优选加入EDTA、肝磷脂、CPD/ACC等。为了得到有意义的结果,优选使用在使用前24小时内,更优选6小时内,取自孕妇的新鲜血液样品。
本发明的血液细胞分离体系包括用于主要除去大部分的作为从上述血液样品中除去的细胞部分的非成核红细胞和母体白细胞的初级分离装置。特别是,初级分离装置优选是使用具有比重(specificdensity)的液体的密度离心装置或过滤分离装置。
形成本发明血细胞分离体系的初级分离装置的第一个实施方式是密度离心装置,其中使用了用现有的密度调节剂如蔗糖、改性蔗糖、甘油或聚乙烯吡咯烷酮包衣的胶体二氧化硅,预先设定密度梯度流体的密度。实施例包括来自Pharmacia公司的Ficoll-Paque、Ficoll-Hypaque和Percoll,或来自Asuka-Sigma公司的Histopaque。过去通常用于从全血中分离血液成分的密度梯度流体比重设定为1.077(如Ficoll-Paque和Histopaque-1077)。在这种情况下,离心导致比重高的粒细胞和红细胞在密度梯度流体下面,而单核细胞和淋巴细胞如白细胞上升到密度梯度流体之上。然而,本发明人发现,当使用比重为1.077的密度梯度流体时,胎儿有核细胞如NRBC的一部分在离心后会扩散入密度梯度流体之中,因此,正如常规方法那样,如果只提取含单核细胞的一层,就会损失大量的稀少胎儿有核细胞。因而,在本发明的分离体系中,比重高于1.077的密度梯度流体优选用作初级分离装置,并且能用于防止胎儿有核细胞的损失。
如下述实施例所示,密度梯度流体的比重增加,将提高胎儿有核细胞的回收率,但将同时导致不希望有的白细胞的混入增加。然而,因为本发明有利用将在下面描述的碳水化合物-外源凝集素相互作用进行的淘选装置(panning device)和二次分离装置,所以能分离和除去混入的白细胞,以回收更多的胎儿有核细胞。而且,本发明的密度离心装置包括离心管、比重为1.077-1.105,优选1.080-1.095和更优选1.090-1.095g/cm2,置于离心管中的密度梯度流体,和离心分离器。将取自孕妇的血液样品置于含密度梯度流体的离心管中,并且将其放置于离心分离器中,以500-2000rpm(50-800G),离心20-40分钟,其中得到作为处于密度梯度流体上层,含大量胎儿有核细胞的部分的初级分离样品。
在某些情况下,本发明的初级分离装置也可以具有进一步除去混入的白细胞等的淘选装置。这个淘选装置包括,如,一个培养皿等如用牛胎盘血清(FCS)进行表面处理过的聚苯乙烯培养皿,用于利用平皿的非特异粘附性,分离和除去如单核细胞和粒细胞的白细胞成分。
特定的淘选过程可以是本领域常用的。例如,将样品置于培养皿上,并在预定时间内培养,然后没有粘附在培养皿上的细胞作为悬浮液回收。
培养皿优选为一次性塑料型培养皿,包括市售塑料培养皿产品如来自Nunc、Falcon、Iwaki Seiyaku或Sumitomo Bakelite的聚苯乙烯培养皿在内的任何类型。将FCS加入这些培养皿中,然后于4℃下保持2小时,以用FCS中的蛋白质对其表面进行包覆。结果,疏水性的塑料表面变成亲水性,可以使用任何条件,只要不使用超过37℃,FCS中的蛋白成分在37℃开始变化,或低于冷冻温度。除此以外,用碳水化合物作为包覆试剂也是有效的,其中易于对塑料表面进行包覆的PV-糖(Netech的产品,Seikagaku Kogyo销售)适合使用。包覆是通过将PV-糖粉末溶于蒸馏水得到10-1000μg/ml溶液,优选使用50-500μg/ml溶液获得的。将该PV-糖溶液放入培养皿中,并在室温下保持至少30分钟,于是PV-糖被吸收,培养皿表面成为亲水的。能形成PV-糖的碳水化合物实例包括,葡萄糖类如PV-G(葡萄糖)、PV-MA(麦芽糖)、PV-GA(葡萄糖酸)、PV-CA(纤维二糖)和PV-Lam(昆布二糖);半乳糖类如PV-LA(乳糖)、PV-LACOOH(羧化乳糖)和PV-MeA(蜜二糖);和PV-Man(甘露二糖)和PV-GlcNAc(N-乙酰基壳二糖),但它们可以是包括天然多糖在内的任何类型,只要它们是能对培养皿表面进行有效包覆的糖类。优选使用它们,因为它们易于包覆聚苯乙烯培养皿,并不会损伤或破坏许多胎儿细胞。尤其,那些形成复合糖聚合物材料的糖类是葡萄糖酸(PV-GA)、蜜二糖(PV-MeA)或甘露糖(PV-Man),它们是特别有利的,这是由于它们达到高水平的白细胞吸收的能力和保持胎儿细胞损失降低的去除过程。作为包覆试剂,PV-糖也优选有等同或优于FCS的分离性能的,并且比FCS更易于以稳定批量获得和更容易贮存的合成聚合物。
离心后,将初级分离样品放置于亲水培养皿中,并静置至少5分钟,白细胞成分较大比例地粘附于培养皿表面,但为了达到白细胞粘附和除去的适当比例,优选保留15分钟至2小时。在此期间,可以使用保持初级分离样品中所得细胞不死亡的任何温度,但优选使用18-37℃,在此温度下,白细胞粘附活跃。
淘选过程不限于使用塑料培养皿,和能用上述FCS或PV-糖包覆的玻璃培养皿等。
一般,离心后,可能会出现血液样品被许多能结合二次分离中使用的外源凝集素的血小板污染的情况,这会不利地影响成红细胞分析的精确度。然而,淘选处理能通过粘附有效除去在血液样品制备期间产生污染的血小板。因此,淘选是有效地预先除去过量粒细胞、单核细胞和血小板的过程,并提供高度精确红细胞分离。
由于这些淘选处理,即使是有非常小的比重和颗粒尺寸,但有极高粘附性的血小板也能自动从通过上述离心装置得到的初级分离样品中除去,以减少至检测限以下,从而使样品富含胎儿有核细胞,仅含少量非成核红细胞和白细胞如残存的淋巴细胞,而且这能制成本发明分离体系的初级分离样品。
形成本发明血细胞分离体系的初级分离装置的第二个实施方式是过滤分离装置。该过滤分离装置有预定孔直径,通常用于血液成分分离的多孔滤器,血液样品通过这种滤器,可变形的非成核红细胞成分通常能通过并除去,然而作为胎儿有核细胞的,包括白细胞成分和成红细胞的成分仍留在过滤材料内部或上面。通过用洗涤剂流体等来回收滤器中残留的成分,能得到含有胎儿有核细胞和白细胞的初级分离样品。
这里所用的滤器没有特殊的限制,只要能够允许非成核红细胞成分通过(平均尺寸7-8.5μm),但用物理或化学捕获以阻碍白细胞(平均尺寸7-30μm)和胎儿有核细胞(平均颗粒尺寸8-19μm)通过,因此,可以使用任何物质,如通过形成凝集或形成滤器的纤维尺寸来捕获的非织造织物,通过延伸聚合物来控制孔径的多孔膜,珠或海绵材料,只要它们具有的孔径尺寸在能捕获最可能属于被回收物质的有核成红细胞的,最小尺寸约8μm的正色有核成红细胞的范围内,仍允许非成核红细胞经变形通过。滤器材料没有特殊限制,可以是合成或天然的聚合物,如含氟聚合物、聚砜、聚酯、聚乙烯醇缩醛、聚乙烯醇、聚酰胺、聚酰亚胺、聚氨酯、聚丙烯酸、聚苯乙烯、聚酮、聚硅氧烷、聚乳酸、纤维素、壳聚糖、纤维素、丝或大麻,或无机材料,包括羟磷灰石、玻璃、氧化铝、氧化钛或金属如不锈钢或钛铝,考虑到白细胞的保持能力,它们能保持某种水平的粘附力,以收集白细胞。从成本和生产考虑,优选聚酰胺如尼龙、聚酯、聚氨酯、聚乙烯、聚丙烯、丙烯酸、聚苯乙烯、聚碳酸酯、纤维素和羟磷灰石。滤器的孔径应为1.0-40μm,优选2.0-20μm和更优选3.0-10μm,而且如果滤器由纤维组成,纤维的直径应为1.0-30μm,优选1.0-20μm,和更优选1.5-10μm。
另外,上面提到的形成滤器的材料可以进行表面改性,优选使用不会阻止非成核红细胞通过和改进白细胞滞留的类型。在滤器中残存的胎儿有核细胞和白细胞能通过清洗滤器回收。例如,因为未成熟有核成红细胞比白细胞成分有很大的分离倾向,洗涤剂流体以与过滤血液样品的相反方向经过滤器,以选择性回收目标胎儿有核细胞。这里使用的洗涤剂流体,可以是任何生物学上的缓冲液或生物学上的盐水溶液如输液或培养基溶液,只要它能分离胎儿有核细胞。
因而,本发明分离体系中的过滤分离装置,除了上述滤器和洗涤剂流体,还可包括流体输送设备如注射器或泵,用于给滤器提供洗涤剂流体或提供为收集从滤器上冲洗下来的非成核红细胞成分的流体储库。将用这种方法得到的含胎儿非成核细胞的样品制成按照本发明的初级分离样品。
然后,对通过滤器分离的初级分离样品采取上述淘选过程,以进一步减少白细胞的数量,而且这也可以用作初级分离样品。
在本发明的血细胞分离体系中,二次分离装置用于从以上述方式得到的初级分离材料中除去残留的非成核红细胞和白细胞,从而得到含浓缩胎儿有核细胞的二次分离样品。在该二次分离装置中,初级分离样品在有表面固定了含复合糖聚合物的培养基中,和预定浓度的外源凝集素,在使细胞失活的条件下培养,从而进行一种方法,该方法用于通过外源凝集素-碳水化合物相互作用与外源凝集素的选择性结合,将初级分离样品中所含的胎儿有核细胞浓缩和粘附于培养基上(此后参考碳水化合物-外源凝集素方法)。
WO00/58443中描述了碳水化合物-外源凝集素方法的细节。这里作为复合糖聚合物,使用那些在疏水聚合物主链上与碳水化合物链结合的聚合物如聚苯乙烯。特别优选如WO00/58443中描述的PVLA、PVMA、PVMan、PVMeA、PVLAC00H、PVG、PVGlcNac和PVLam。其中,优选那些有能被所用的外源凝集素识别的碳水化合物链结构的聚合物。
在被复合糖聚合物进行表面改性的基质上,初级分离样品和外源凝集素在使细胞失活的条件下培养,以形成胎儿有核细胞-外源凝集素混合物,它们通过碳水化合物-外源凝集素相互作用被浓缩和吸附于基质上。
所用的外源凝集素优选那些能识别由胎儿有核细胞表达的碳水化合物链,如包括识别半乳糖的外源凝集素如SBA、PNA、ECL、AlloA和VAA,识别葡萄糖的外源凝集素如Con A、LcH和PSA,和识别甘露糖的外源凝集素如LCA、GNA和CPA,但不限于此。这里,通过调节外源凝集素的加入量,胎儿有核细胞可以高比例粘附,以致于允许选择性精确分离,其中来自母亲的混入白细胞不粘附。尤其是,当使用塑料基质时,考虑到初级分离样品中含有约2×106细胞,所加入的外源凝集素的量优选8-35μg,优选8-32μg,和更优选10-30μg。另外,当使用玻璃基质时,考虑到初级分离样品中含有约2×106细胞,所加入的外源凝集素的量优选10-200μg,优选20-100μg,和更优选30-75μg。因而,当所用的外源凝集素浓度的最佳范围按照基质材料和所用外源凝集素的类型有一些改变时,本领域技术人员不作过度实验就可以选择最佳浓度。
在使用300μg/ml的外源凝集素的情况下,当取自母体血液样品的血细胞固定于用复合糖聚合物(PV-LA)包覆的基质上时,许多白细胞等(强染色细胞)被污染,如图2的显微照片所示,同时在使用8μg/ml的外源凝集素的情况下,如现存的白细胞和红细胞的少数不必要的细胞选择性粘附,如图3和4的显微镜照片所示。
外源凝集素和细胞的培养是在细胞被灭活的条件下进行的,这些条件如上述选择。“细胞被灭活的条件”指细胞膜的流动度和自我粘附度低的条件,典型的是温度调节到至少0℃至37℃,优选0-36℃,更优选4-30℃和最优选4-22℃。然而,这些条件并不限于上面描述的低温调节,和如通过在37℃下添加延缓细胞呼吸的试剂如叠氮化钠来达到。
另外,对培养时间没有特别限定,只要足够细胞和外源凝集素形成细胞-外源凝集素复合物,但通常为0-120分钟,优选0-90分钟,更优选0-60分钟。这里“0分钟”指混合初级分离样品和外源凝集素之后,立即开始随后的步骤。
在二次分离中,培养(胎儿有核细胞可能包括一些非成核红细胞)后粘附于基质上的细胞通过除去以细胞悬浮液形式存在的未粘附细胞(白细胞等)来分离。
因而,按照本发明的二次分离装置包括一个经复合糖聚合物进行表面改性的基质、外源凝集素,和用于灭活细胞的工具,如冷却装置或含叠氮化钠的试剂,产生高密度的基质上粘附着胎儿有核细胞,并有效除去不希望有的成分如白细胞的二次分离样品。
在按照本发明的血液细胞分离体系中,二次分离样品,用解释过的制备装置制备后,最后准备用于使用FISH方法等进行基因/染色体检验。而且,通过使用二次分离装置中的基质作为FISH方法等的载玻片,单一基质可用于从二次分离至检验的全过程,这是很实用的。因而,如果这里使用的载玻片用于显微镜检查,可以使用有足够透明度的烧瓶、培养皿、试管或薄膜,从而不会阻碍显微镜视野,但当考虑到与显微镜的普遍兼容性,特别优选使用载玻片室,其上盖在二次分离过程中被外源凝集素粘附,二次分离后除去上盖,干燥和固定被粘附的胎儿有核细胞,随后容易地直接用于FISH方法中。
载玻片室的载玻片部分可以由任何能用上述碳水化合物-外源凝集素方法中使用复合糖聚合物包覆的,可以通过显微镜观察的材料制成,包括有机材料如聚苯乙烯、聚碳酸酯、聚砜、聚氨酯和乙烯基共聚物等,以及无机材料如含二氧化硅的玻璃。此外,当用于FISH方法时,必须使用高温下有机溶剂处理,使粘附于载玻片的细胞裸核,因此优选使用不易于变形的玻璃材料。
图5显示在本发明血细胞分离体系的二次分离和随后的过程中使用的基质的例子。图5描述的基质包括构成室底部的载玻片部分(1)和垂直于载玻片部分(1)的侧壁(2)。复合糖聚合物层(10)在室底部的上表面上形成。用帽(3)封闭室开口。
本发明的血细胞分离体系包括用于在预定的条件下离心二次分离样品以得到制剂的制备装置。
通常,当制备用于染色体检查等的在玻璃载玻片上的细胞制剂时,吸取细胞悬浮液流体,滴加到载玻片上并风干,或将含细胞的样品铺展在载玻片上,然后干燥形成涂片(如,见JP-A H7-27682)。然而,本发明人首次发现为了将取自二次分离样品的细胞以适于检查的形式粘附于载玻片上,必须使用特定的离心条件。
因而,本发明的制备装置包括用于离心二次分离样品的离心设备,它能在预定的条件下离心仍保留在培养基中的二次分离样品。条件不同于所用的基质(载玻片)。
如果基质是塑料载玻片室,除去细胞悬浮液后除去上盖,但为了防止载玻片表面干燥,优选用生物学上的缓冲液或含富含于接近生物学浓度的蛋白质的白蛋白的FCS清洗后离心。此外,用蒸馏水稀释优选1/2,更优选3/5的FCS用于在培养皿面上广泛涂布粘附细胞,因而使其易于通过显微镜观察,而且特别优选使用。稀释范围可以任意,只要不使细胞分解。
至于离心力,为将细胞粘附于培养皿时,优选100-1500G,为有效缩短离心时间,更优选400-700G。当离心时间按照离心力改变时,离心时间通常为约1-15分钟。如果直接风干不离心,细胞经常萎缩,以致于排除了获得良好细胞形态的可能性。
另一方面,如果使用玻璃载玻片室,在上述离心过程中优选使用低离心力一次离心和高离心力二次离心的两步步骤。此外,优选用优选1/2,或更优选3/5稀释度的FCS代替含未粘附细胞的细胞悬浮液,并在除去上盖之前进行第一次离心。第一次离心优选10-300G,优选10-150G,和更优选10-50G的轻离心,其中可能进一步抑制粘附细胞分离或当受到压力时变形。接着,除去上盖并进行二次离心,因而得到适合检验的被固定细胞形态。二次离心的离心力应为25-300G,优选30-200G,更优选35-130G,其中未变形的固定细胞形态的再生能力进一步增加。
如上所述,通过按照不同于载玻片基质材料的特定条件进行的离心过程,可能得到由载玻片基质组成的检验制剂,胎儿有核细胞以有利的状态固定在载玻片基质之上。
本发明的血细胞分离体系进一步包括使用检验制剂的检测装置,其中胎儿有核细胞被浓缩和固定于如上描述的基质(载玻片)上,以进行粘附胎儿有核细胞的染色体和/或基因检验。
检测装置可以是,如用FISH方法对核内的染色体进行直接荧光标记,和显微镜观察的装置,按照选择的探针的类型,这能够检测染色体异常,如非整倍性、等臂染色体、易位、缺失和染色体片断互易。或者,该装置可以使用PCR方法,其中用显微操纵术或在显微镜下激光解剖,剥离回收粘附细胞,并扩增基因。扩增的基因可以进一步在基因芯片上筛选,本发明的体系适合各种类型的染色体/基因诊断。
如上所述,通过使用本发明的血细胞分离体系,在母体血液中的稀少胎儿有核细胞,很难用比重或用抗体进行表面标记识别来分离和浓缩,但可以通过在特定条件下密度离心或过滤分离进行的初级分离,和特定条件下用外源凝集素进行的碳水化合物链识别的二次分离的结合,以高度精确和高密度分离和浓缩。特别是,按照本发明,这些稀少胎儿有核细胞直接在基质上被粘附,分离和浓缩,随后用粘附于基质,保持细胞正常形态,适于进行基因/染色体检查的细胞,来检验细胞核染色体和基因。因而,本发明提供一种通过使用上述体系,在各种染色体和/或基因诊断中,能够直接用于检验胎儿有核细胞检验制剂的生产方法,和由上述方法制成的检验制剂。
利用本发明体系的方法的特征在于包括:从含稀少细胞的样品中除去大量不希望有的细胞成分的初级分离步骤,和目的在于从初级分离样品中进一步除去不希望有的细胞成分的分离和浓缩稀少细胞的二次分离步骤,和例如,即使通过上述碳水化合物-外源凝集素方法进行的二次分离被使用特异于稀少细胞的抗体进行的分离方法所替代,这种分离方法和体系也属于本发明的范围内。而且,除了能够通过分离和浓缩后的检验来诊断染色体和基因状态和异常,混入母体血液的胎儿有核细胞(胎儿有核成红细胞),被定向的稀少细胞可以是疾病症状减弱后仍存在的白血病细胞,或脐带血中的未成熟细胞,并且当在本发明提供的粗细胞分离体系或精确分离体系中使用时,可以是能够在载玻片基质上通过外源凝集素或抗体选择作用而被浓缩的任何类型的细胞。本发明中使用的术语“胎儿有核细胞”应解释为包含所有的用这种方式靶击的稀少细胞。
实施例
下面,将详细描述本发明的血细胞分离体系,重点在于使用碳水化合物-外源凝集素方法的初级分离、二次分离条件的设定,和保持细胞良好形态的制备方法。
实施例1:用密度离心法进行初级分离
得到Histopaque(Sigma),用作密度离心试剂,其中加入泛影酸钠(sodium diatrizoate)并且制备比重调节至1.077-1.105的6种密度梯度流体类型。7cc静脉血取自怀孕10-20周的孕妇,然后在每种密度梯度流体中离心30分钟(20℃,1500rpm)。收集到的环绕于密度梯度流体和血浆成分(上层)分界线的细胞被回收,然后用生物学上的缓冲液离心漂洗,得到除去大多数非成核红细胞和血小板的粗分离样品。
在各种密度条件下初步提纯的样品用碳水化合物-外源凝集素方法进行二次分离。作为基质,使用塑料载玻片室(2孔,Nalgenunc产品)。包覆于基质上的复合糖聚合物为PVMeA,约2×106个细胞中加入12μg外源凝集素(SBA),然后在18℃下培养30分钟。当粘附于载玻片室的细胞被干燥并用帕彭海姆氏染料染色时,滗去悬浮液形式的未粘附的细胞。被染色的细胞用显微镜观察,对分离和粘附于载玻片上的正色的有核成红细胞(胎儿有核细胞)进行计数。结果显示于表1。
表1
对用各种流体离心进行一次分离的样品使用碳水化合物-外源凝集素方法进行二次分离后检测到的有核成红细胞的数目(10个样品的平均值) | ||||||
密度梯度流体的密度 | ||||||
1.077 | 1.080 | 1.090 | 1.095 | 1.100 | 1.105 | |
在载玻片上检测到的正色的有核成红细胞的数目 | 10.7 | 13.1 | 14.3 | 15.7 | 16.0 | 22.9 |
与比重1.077的值比较的有核成红细胞的检测比率 | 1.0 | 1.2 | 1.3 | 1.5 | 1.5 | 2.1 |
如表1所示,增加密度梯度流体(Histopaque)的密度显著增加碳水化合物-外源凝集素精确分离后检测到的有核成红细胞的数量。这清楚表明通过使用比重为1.077的密度梯度流体进行密度分离的常规血细胞分离破坏比重高的红细胞。另一方面,当比重超过1.095,正色成红细胞的数目增加时,也观察到混入白细胞数量大量增加,这是成红细胞的显微检测被碳水化合物-外源凝集素方法导致的精确分离效率降低所抑制的结果。
实施例2:通过淘选的附加分离
塑料载玻片室(4孔,Nalgenunc产品)用FCS或0.01wt%复合糖聚合物(PV-糖)(Netech产品)的水溶液处理。作为复合糖聚合物,使用含葡萄糖、麦芽糖、葡萄糖酸、N-乙酰基葡萄糖胺、甘露糖、乳糖或蜜二糖结构的那些。
按照标准方法使用Histopaque(d,1.095)对回收的出生后的脐带血进行密度梯度离心,收集凝集在Histopaque和血浆分界线附近的细胞。样品再次悬浮于加入10wt%FCS的RPMI1640中,接种于表面被FCS或复合糖聚合物包覆的上面所述孔上。37℃培养30分钟之后,回收细胞悬浮液流体形式的未粘附细胞,粘附于孔上的细胞用帕彭海姆氏染剂染料以鉴定其类型。结果显示于表2。表2显示粘附于以各种类型的包覆材料所包覆的孔表面的红细胞部分(包括成红细胞)与白细胞部分之间的比例,和所有接种细胞的粘附率。
表2
各自孔内血细胞的粘附值(5个样品的平均值)(%) | ||||||||
FCS | 甘露糖 | 葡萄糖 | 麦芽糖 | 葡萄糖酸 | 葡萄糖胺(Glucosamin) | 乳糖 | 蜜二糖 | |
白细胞/红细胞比例 | 99.2 | 99.1 | 98.9 | 99.5 | 99.1 | 97.4 | 98.9 | 98.9 |
总体粘附率 | 69.3 | 71.0 | 62.3 | 64.6 | 78.0 | 72.6 | 65.8 | 78.1 |
如表2所示,清楚表明当用血清蛋白(FCS)或复合糖聚合物包覆的塑料表面的孔进行淘选时,几乎所有被粘附的血液微粒中的细胞为白细胞。在用麦芽糖、葡萄糖酸、FCS和甘露糖处理过的孔中,红细胞部分的粘附被抑制,而葡萄糖酸、葡萄糖胺和甘露糖优于总体粘附率,这显示了白细胞的可移动性。在这种情况下,成红细胞不包括在粘附的白细胞部分中,除了在部分葡萄糖类材料上能观察到1或2个粘附成红细胞。
接着,选择FCS作为用于除去适量的白细胞部分并对红细胞没有很大损伤的处理剂,而且研究了母体血液的处理效果。使用比重为1.095的密度梯度流体经密度离心得到的初级分离样品被分成两部分,其一在上述条件下淘选,另一个未处理,然后在与实施例相同的条件下进行碳水化合物-外源凝集素二次分离。
表3
外源凝集素二次分离的淘选效果(20个样品的平均值)(相对于不淘选的例子比值) | |
载玻片上单个视野红细胞/白细胞比例 | 2.6倍 |
载玻片上检测到的红细胞数量 | 2.6倍 |
表3中单个视野载玻片上红细胞/白细胞的比例显示二次分离中白细胞去除率,载玻片上检测到的红细胞数量显示成红细胞的回收效率。特别是,显微镜下粘附细胞计数的结果显示了无淘选的情况和进行淘选的情况的比值(倍)。从表3的结果中,清楚显示淘选改善了碳水化合物-外源凝集素方法中成红细胞的选择性分离和浓缩效率。这被认为是由协同效应所致,由于淘选除去多余的白细胞,因而能够用外源凝集素通过与外源凝集素的有效相互作用来粘附细胞,以减少粘附失误,成红细胞计算错误的减少归因于在显微观察期间不同于成红细胞的有核细胞的数量的减少。
表3的结果显示即使当与表1中比重为1.095的情况相比,阻碍显微观察的白细胞的混入可以通过淘选被抑制,这可能比在比重为1.105(未淘选)的情况下检测出更多的成红细胞。另外在母体血液中,由于淘选,几乎没有成红细胞损失。
实施例3:经过滤分离的初级分离
代替实施例1中的密度离心方法,用包括平均孔径8μm非织造聚酯织物的滤器进行初级分离。母体血液样品用含1wt%BSA的生物学上的缓冲液稀释,然后采用自然滴加通过滤器。接着,只将缓冲液通过滤器以洗去滤器上残存的红细胞。随后,用注射器泵使缓冲液反向通过,并回收没有通过滤器的未粘附的细胞。没有通过滤器但没有强烈粘附于滤器上的细胞部分被提取作为初级分离样品,将其用碳水化合物-外源凝集素方法进行二次分离。表4显示从上述滤器中得到的初级分离样品的结果,与将FCS淘选回收的细胞部分用碳水化合物-外源凝集素方法进行二次分离的结果的比值(倍)。
表4
外源凝集素二次分离的过滤效果(20个样品的平均值)(相对于密度离心+淘选的比值) | |
载玻片上单个视野红细胞/白细胞比值 | 1.5倍 |
载玻片上检测到的红细胞数量 | 2.4倍 |
按照表4,载玻片上单个视野红细胞/白细胞比值(二次分离中白细胞的去除率)和载玻片上检测到的成红细胞的数量(二次分离中成红细胞的回收率)有所提高,这清楚表明用碳水化合物-外源凝集素方法进行的成红细胞的选择分离和浓缩效率能够经过滤步骤来改善。据认为用滤器进行的初级分离是由于有变形能力的非成核红细胞能通过滤器和既不能通过滤器也不能用滤器捕获的细胞能经冲洗滤器来回收。因而证明了成红细胞的损失进一步通过使用初级分离方法而不是作为过滤方法的密度离心方法所抑制。红细胞/白细胞选择性有轻微改善,这是由于残存在滤器中的非成核红细胞经冲洗而回收。
实施例4:制备步骤中的离心
适于FISH方法的玻璃载玻片室(Nalgenunc产品)用于进行用碳水化合物-外源凝集素方法的二次分离。至于初级分离条件,使用如下条件实施(同实施例2)。
密度离心:d,1.095
FCS淘选
对用碳水化合物-外源凝集素方法的二次分离,随后弃去包含未粘附细胞的细胞悬浮液,用FCS代替载玻片室,除去上盖和载玻片离心的情况进行比较(实验条件1和2),和弃去含未粘附细胞的细胞悬浮液,用FCS代替载玻片室,立即进行第一次离心,和除去上盖后在载玻片上进行的二次离心的情况(实验条件3-11)进行比较。
作为FCS,原液(1/1)在使用前用蒸馏水稀释1/2,并在第二次离心后,载玻片在标准温度下风干。载玻片上细胞用帕彭海姆氏染料染色,比较它们各自的染色外观。结果如表5所示。
表5
载玻片离心条件 | 染色外观 | |||||
条件 | 第一次离心(G) | 时间(分钟) | 替代流体 | 第二次离心(G) | 时间(分钟) | |
1 | 1/2FCS | 1500 | 3 | F | ||
2 | 1/2FCS | 200 | 10 | F | ||
3 | 200 | 5 | 1/2FCS | 200 | 10 | D |
4 | 45 | 5 | 1/2FCS | 200 | 10 | D |
5 | 25 | 5 | 1/2FCS | 200 | 10 | C |
6 | 25 | 5 | 1/2FCS | 130 | 10 | B |
7 | 25 | 5 | 1/2FCS | 130 | 10 | C |
8 | 25 | 5 | 1/2FCS | 70 | 10 | A |
9 | 25 | 5 | 1/2FCS | 70 | 10 | C |
评价 | 染色外观 | |
细胞形态 | 细胞质、细胞核结构 | |
F | 完全皱缩 | 可辨别的 |
D | 皱缩 | 可辨别的 |
C | 红细胞皱缩,白细胞变形 | 有限辨别 |
B | 轻微变形 | 清楚 |
A | 良好 | 清楚 |
与常规涂片样品不同,经碳水化合物-外源凝集素方法进行二次分离的载玻片上细胞需要有通过离心压力粘附的细胞,但当使用玻璃载玻片作为基质时,第一次离心必须是在FCS溶液中低速离心。即使在除去上盖后的二次离心中,相对低速条件会保持良好的染色外观。另外,当有高蛋白浓度的,添加了FCS或BSA的缓冲液作为有效替代流体时,在生物学条件下的稀释FCS诱导粘附细胞溶胀,并保持较好的染色外观。例如,在条件8、10和11中,细胞显示细胞质和细胞核的适宜形态学和清楚结构。尤其是,在条件11下,使用稀释3/5的FCS,观察到如贮藏期间的样品或个体样品几乎没有变异作用。当使用塑料载玻片时,在上面给出的条件1中获得非常好的染色外观。
发明效果
按照本发明的血液分离体系,作为包含于母体血液中的极其少量的胎儿有核细胞的成红细胞被选择性地分离、浓缩和粘附于基质上。此外,通过适当地选择所用的基质,在单一基质上进行从二次分离步骤至制备步骤的过程,以得到适于染色体/基因诊断的检验制剂,和这种检验制剂能直接应用于检验方法如FISH方法中。因而,对产前诊断有很高临床价值的胎儿有核细胞检验样品可以便利地,并且不侵入母体地低成本生产。
Claims (24)
1.一种血细胞分离体系,包括:
初级分离装置,用于从取自孕妇的血液样品中主要除去的非成核红细胞、白细胞和血小板,以得到初级分离样品;
二次分离装置,用于从用所述一次分离装置得到的初级分离样品中除去残存的非成核红细胞和白细胞,得到含浓缩的胎儿有核细胞的二次分离样品,二次分离装置涉及在灭活细胞,和预定外源凝集素浓度的条件下,在表面固定着复合糖聚合物的基质上,培养所述初级分离样品,选择性地将初级分离样品中含有的胎儿有核细胞与所述外源凝集素结合,借助于外源凝集素-碳水化合物的相互作用将它们浓缩和粘附于所述基质上,形成二次分离样品;和
制备装置,用于制备用所述二次分离装置得到的二次分离样品,制备装置涉及在预定条件下,离心所述基质,所述胎儿有核细胞被浓缩和粘附于所述基质上,从而得到一种检验制剂。
2.按照权利要求1所述的血细胞分离体系,其中所述初级分离装置是使用密度至少超过1.077mg/cm3的密度梯度流体的密度离心装置。
3.按照权利要求2所述的血细胞分离体系,进一步包括用于除去用所述密度离心装置得到的含胎儿有核细胞的样品中混入的白细胞的淘选装置。
4.按照权利要求1所述的血细胞分离体系,其中所述初级分离装置是使用滤器分离非成核红细胞和白细胞的装置。
5.按照权利要求1所述的血细胞分离体系,其中在所述二次分离装置中灭活细胞的条件是至少0℃和低于37℃的低温条件,或中止细胞呼吸的条件。
6.按照权利要求1所述的血细胞分离体系,其中所述制备装置的离心条件是当使用塑料基质时,以100-1500G,离心1-15分钟,和当使用玻璃基质时,第一次离心是以10-300G,离心1-10分钟,接着第二次离心是以25-300G,离心5-15分钟。
7.按照权利要求1所述的血细胞分离体系,其中所述制备装置中使用的基质是用稀释至1/2,优选3/5的FCS代替包含于二次分离样品中的悬浮液得到的。
8.按照权利要求1所述的血细胞分离体系,进一步包括用于检验用所述制备装置得到的检验制剂中所含胎儿有核细胞中的染色体和/或基因的检查装置。
9.按照权利要求8所述的血细胞分离体系,其中所述检查装置包括用于对制剂中所含胎儿有核细胞的细胞核中的染色体进行染色的染色工具。
10.按照权利要求9所述的血细胞分离体系,其中所述染色工具中的细胞核染色是由于使用了FISH方法。
11.按照权利要求8所述的血细胞分离体系,其中所述检查装置包括用光学显微镜或荧光显微镜进行染色体检验的装置。
12.按照权利要求8所述的血细胞分离体系,其中所述检查装置包括用于扩增从制剂中所含胎儿有核细胞的染色体中提取出的基因的工具。
13.按照权利要求12所述的血细胞分离体系,其中所述扩增工具包括用于实施PCR方法的材料。
14.按照权利要求12所述的血细胞分离体系,其中所述检测装置包括用于筛选扩增的基因的装置。
15.生产用于产前胎儿染色体和/或基因诊断的检验制剂的方法,包括:
从取自孕妇的血液样品中主要除去非成核红细胞、白细胞和血小板,得到初级分离样品的初级分离步骤;
在灭活细胞,和预定外源凝集素的浓度的条件下,在表面固定着复合糖聚合物的基质上,培养所述粗分离的样品,选择性地将初级分离样品中所含的胎儿有核细胞和所述外源凝集素结合,以通过外源凝集素-碳水化合物相互作用将它们浓缩和粘附于所述基质,以选择性地除去所述初级分离样品中残存的白细胞,得到含所需浓缩形式的胎儿有核细胞的二次分离样品的二次分离步骤;和
在预定条件下对含有浓缩和粘附的所述胎儿有核细胞的二次分离样品进行离心的制备步骤。
16.按照权利要求15所述的方法,其中所述初级分离步骤是通过使用密度至少超过1.077mg/cm3的密度梯度流体的密度离心进行的。
17.按照权利要求16所述的方法,进一步包括通过所述密度离心方法得到的含胎儿有核细胞的样品的淘选步骤,以除去混入的白细胞。
18.按照权利要求15所述的方法,其中所述初级分离步骤是通过使用滤器分离非成核红细胞和白细胞进行的。
19.按照权利要求15所述的方法,其中在所述精确分离步骤中灭活细胞的条件是至少0℃和低于37℃的低温条件,或中止细胞呼吸的条件。
20.按照权利要求15所述的方法,其中所述制备步骤中的离心条件是使用塑料基质时,以100-1500G,离心1-15分钟,和使用玻璃基质时,第一次离心是以10-300G,离心1-10分钟,接着第二次离心是以25-300G,离心5-15分钟。
21.按照权利要求15所述的方法,其中用于所述制备步骤中的是用稀释至1/2,优选3/5的FCS代替二次分离样品中所含的悬浮液的基质。
22.用按照权利要求15-21之一所述的方法生产的,用于产前胎儿染色体和/或基因诊断的检验制剂。
23.用于按照权利要求1-14之一所述的血细胞分离体系的基质,含固定于其表面的复合糖聚合物。
24.血细胞分离方法,包括除去含稀少细胞的样品中所包含的大部分不需要的细胞成分的初级分离步骤;和通过从初级分离样品中进一步除去不需要的细胞成分来分离和浓缩靶击的稀少细胞的二次分离步骤。
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