CN113186156A

CN113186156A - 一种高效获取脂肪组织中单细胞的方法

Info

Publication number: CN113186156A
Application number: CN202110397882.XA
Authority: CN
Inventors: 梁小婷; 周晓慧; 刘静; 李蜜蜜; 刘中民
Original assignee: Shanghai East Hospital Tongji University Affiliated East Hospital
Current assignee: Shanghai East Hospital Tongji University Affiliated East Hospital
Priority date: 2021-04-14
Filing date: 2021-04-14
Publication date: 2021-07-30

Abstract

本发明提供了一种高效获取脂肪组织单细胞的方法。由于临床脂肪样本的获取属于有创性操作，大小和重量均有限，单细胞得率和活性较低。本发明提出的消化方法通过化学和物理方法相结合，对脂肪组织分次酶解后进行手工柔和研磨，而后进行流式分选，能够有效提高脂肪组织的单细胞得率，且保证单细胞活率，尤其适用于少量脂肪组织如心包脂肪、血管旁脂肪、眼周脂肪等单细胞提取，便于细胞治疗的进一步开展。

Description

一种高效获取脂肪组织中单细胞的方法

技术领域：

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种高效获取脂肪组织中单细胞的方法。

背景技术:

脂肪组织是一种复杂的器官，具有多种的生理功能。研究认为正常脂肪组织的积累对人体具有重要的保护和缓冲作用，可供给人体热量，构成生物活性物质，以及调节生理机能。贮存的脂肪在一些情况下可以分解成脂肪酸，其具有降血压，降血脂，抗衰老等作用。但脂肪过多也会导致各种心血管疾病和代谢并发症。最新研究认为脂肪可能是一种重要的免疫器官，其包括多种细胞类型，如脂肪细胞，前成脂肪细胞，内皮细胞，成纤维细胞，干细胞，以及不同的免疫细胞。其中，含有的免疫细胞包括T细胞，B细胞，中性粒细胞，巨噬细胞，NK细胞。另外，从脂肪组织中可以分离得到的具有多向分化潜能的干细胞，即脂肪干细胞(adipose-derived stem cells，ADSCs)，因具有低免疫原性和多向分化潜能等特点，是再生医学中极为重要的细胞之一，在细胞治疗领域具有广泛的应用前景。

脂肪分布于人体的各个部位，不同部位的脂肪可能发挥着不同的作用(Rosen ED,Spiegelman BM.WhatWe TalkAbout When We TalkAbout Fat[J].Cell,156(1-2):20-44)。因此，越来越多的研究尝试探索不同部位脂肪组织中细胞亚群的种类和数量，以及不同部位来源的脂肪组织中不同细胞的功能。近年发展的单细胞测序技术是研究细胞异质性，鉴定细胞类型，分子调控网络，细胞间相互作用等的强有力的技术手段。然而单细胞测序样本的制备要求较高，通常要求细胞浓度较高(300～600个细胞/uL)，活率在90％左右。然而通过应用现有的脂肪组织消化方法，脂肪样本可获得的细胞数量较低，尤其是针对一些较难获取的，数量较少的脂肪组织，如心包脂肪，血管旁脂肪，眼周脂肪等，脂肪组织消化的不充分，导致获取的细胞数量及活率无法满足下游研究和分析的需求，其用于疾病治疗的可能也受限。

发明内容：

本发明的目的在于针对现有技术的不足，提供一种高效获取脂肪组织中单细胞的方法，尤其适用于较难获取的脂肪样本的细胞提取，如心包脂肪，血管旁脂肪，眼周脂肪等，在保证细胞活率的前提下提高了单细胞得率，特别是免疫细胞和干细胞的得率。

根据本发明所要解决的技术问题，本发明的内容包括如下步骤。

1)将获取的脂肪组织清洗后剪碎，加入1～2倍体积的消化酶进行消化；

2)第一次消化结束后对步骤1)所得的组织悬液进行离心，抽取下层消化液和细胞的混悬液，加入等体积的终止液中和消化酶的作用，得到悬液A，上层未消化的组织块继续加入1～2倍体积的消化酶对组织块进行第二次的消化；

3)在第二次消化后，将未完全消化的组织块，第二次消化所得的消化液和细胞的混悬液，以及悬液A，全部加入放置了细胞筛网的培养皿中，进行手工柔和研磨，吸取研磨后的细胞悬液，加入等体积的终止液中和消化酶的作用，得到悬液B；

4)为提高细胞得率，用平衡液多次轻柔冲洗研磨后的细胞筛网，冲洗后的液体加入悬液B，得到悬液C；

5)将悬液C离心后得到的细胞团块使用平衡液重悬，过细胞筛网，得到的悬液D，即为所需细胞悬液。

6)将步骤5)所得的细胞悬液通过流式分选出所需单细胞，用于后续检测及实验。

进一步地，步骤1)～3)中的消化酶为DMEM配制的，质量体积分数为0.1％的胶原酶I。

进一步地，步骤2)中的离心为短时低速离心，优选的，所述的离心速度为300g，离心时间为3分钟。离心后油脂及尚未消化完全的组织及浮于上层，含有细胞的消化液位于下层。

进一步地，步骤2)～3)中使用的血清终止液是在DMEM培养基中添加了10％的胎牛血清。

进一步地，步骤3)～4)中使用的细胞筛网为70um或100um孔径的细胞筛网。

进一步地，步骤5)中使用的细胞筛网为40um或70um孔径的细胞筛网。

进一步地，步骤6)中使用的是流式分选的方法来获取的单细胞。

本发明所述的一种高效获取脂肪组织中单细胞的方法，其特征在于，所述方法用于获取脂肪组织中的单细胞，优选地，获取脂肪组织中的免疫细胞和/或干细胞。

本发明所述的一种高效获取脂肪组织中单细胞的方法，其特征在于，所述脂肪组织为心包脂肪，血管旁脂肪，或眼周脂肪。

本发明的有益效果是：该方法使用分次酶解和及时终止的消化方式，极大程度地保证了细胞活性，同时对于分次酶解后尚未消化完全的组织，采用手工柔和研磨的方法，捕获了尚积聚于组织间隙中的细胞，提高了细胞得率。本发明采用了二次过筛的操作，在步骤3)中的第一次过滤，使用较大孔径的细胞筛网(70um或100um)，其目的是尽量提高细胞得率；在步骤5)中的第二次过滤，使用较小孔径的细胞筛网(40um或70um)，其目的是去除悬液C中的组织残余；并通过流式分选的方法获取高质量的单细胞悬液，供后续的分析，研究及临床使用。本发明提出的方法操作简单，快速，短时间内可以从脂肪组织中分离出纯度高，杂质少的有核细胞，包括免疫细胞及干细胞，以保证后续分析，研究和临床使用的细胞的质量和数量。

附图说明：

图1：酶解消化后的组织悬液低速离心，可分为两层，上层(I)为油脂及未消化完全的组织，下层(II)为消化液及细胞混悬液。

图2：三种脂肪消化方法镜下AO/PI染色细胞情况。

图3：三种脂肪消化方法所得细胞计数情况。

图4：结合细胞计数和流式细胞术分析的细胞比例，计算三种脂肪消化方法所得免疫细胞及干细胞的数量。

具体实施方法：

下面通过具体实施方式结合附图对本发明作进一步详细说明。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。除非另有说明，本发明的方法与技术通常依据本领域已知的传统方法进行；除非另有说明，否则本文中所使用的科学与技术术语应具有那些本领域普通技术人员通常理解的含义。通常，本文中所描述的细胞及组织培养、分子生物学、免疫学及蛋白质与核酸化学所涉及的命名法与其技术均是本领域已知且常用的。

除非另有说明，否则下列术语具有如下定义：

“DMEM”，dulbecco's modified eagle medium，是一种含各种氨基酸和葡萄糖的培养基，分为高糖型(低于4500mg/L)和低糖型(低于1000mg/L)。

“PBS”，phosphate buffer saline，一种磷酸缓冲盐溶液，是生物化学研究中使用最为广泛的一种缓冲液，主要成分为Na2HPO4、KH2PO4、NaCl和KCl。

“胶原酶”，化学名为胶原蛋白水解酶(Collagenase)，能在生理PH和温度条件下特异性地水解天然胶原蛋白的三维螺旋结构，而不损伤其它蛋白质和组织。分为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ型以及肝细胞专用胶原酶，要根据所要分离消化的组织类型选择胶原酶类型。

“AO”，Acridine Orangeg(吖啶橙)，正常的细胞中，AO透过正常细胞膜，使细胞核呈绿色或黄绿色的均匀荧光；而在坏死细胞中，荧光减弱甚至消失。

“PI”，Propidium Iodide(碘化丙啶)，一种溴化乙啶的类似物，不能穿透完整细胞膜，但能穿透凋亡晚期细胞和死细胞的破损细胞膜，嵌入双链DNA，使细胞核释放红色荧光。

“CD45”，cluster ofdifferentiation 45，是由一类跨膜蛋白组成，广泛存在于免疫细胞表面，其表达可以作为某些细胞亚群的分类标志。

“CD73”，cluster ofdifferentiation 73，其常作为干细胞的主要阳性标志物。

“DAPI”，4',6-二脒基-2-苯基吲哚(4',6-diamidino-2-phenylindole)，是一种能够与DNA强力结合的荧光染料，因为DAPI能透过完整的细胞膜，死细胞为DAPI染色阳性，它可以用于流式分析及分选中去除死细胞，消除死细胞对目标细胞分析和分选结果的影响。

“FSC”，forward scatter，前向散射光。可表明细胞或者颗粒尺寸的相对差异。

“SSC”，side scatter，侧向散射光。可表明细胞或者颗粒的内部复杂性或者颗粒度的相对差异。

1.主要仪器、试剂、耗材

仪器：37℃孵箱，水平离心机，细胞计数板，显微镜，电子天平，流式细胞仪，手术器械(剪刀，镊子)，移液枪

试剂：胶原酶I，DMEM，PBS，胎牛血清，台盼蓝，DAPI，CD45抗体，CD105抗体

耗材：6cm培养皿，40um/70um/100um细胞筛网，吸油纸，EP管，离心管，胶头吸管，1mL/200uL/20uL/10uL枪头，流式管，胰岛素针

2.试剂配制：

消化酶：用DMEM或PBS配制质量体积分数为0.1％胶原酶I溶液，现用现配

血清终止液：在DMEM中加入体积分数10％的胎牛血清

3.实验步骤

1)将新鲜脂肪组织放入含平衡液(如器官保存液，PBS或0.9％生理盐水等)的无菌容器中，置于冰水混合物中，快速运输至实验室。所取组织尽快进行处理。

2)将脂肪组织放入6cm培养皿中，用眼科剪和眼科镊进行修剪，分离去除脂肪组织中的电刀烧灼处和血管富集处等。用PBS冲洗三遍至PBS清亮，脂肪组织呈黄色且无明显血液残留。

3)将脂肪组织用吸油纸吸干水分，电子天平称重后，用无菌剪刀剪碎成大小约1mm³的组织块。

4)在脂肪组织中加入1～2倍体积的消化酶，封口膜封口，分别使用如下三种不同的方法进行消化(其中方法1及方法2为目前常规方法，方法3为本发明提供的方法)：

方法1：步骤如下

a.加入消化酶后，37℃孵箱消化30分钟；

b.加入等体积的血清终止液中和消化酶；

c.使用70um或100um的细胞筛网过滤所得的混悬液，去除掉组织残余，得到细胞悬液。

方法2：步骤如下

a.加入消化酶后，37℃孵箱消化15分钟；

b.吹匀重悬待分层，抽取下层较为澄清的消化液和细胞混悬液，加入等体积的血清终止液中和消化酶；

c.上层未消化的组织块尚留于管中，加入1～2倍体积的消化酶，置于37℃孵箱中消化15分钟；

d.加入等体积的血清终止液中和消化酶；

e.使用70um或100um的细胞筛网过滤步骤b)及步骤d)得到的混悬液，去除掉组织残余，得到细胞悬液。

方法3：步骤如下

a.加入消化酶后，37℃孵箱消化15分钟；

b.吹匀重悬，低速离心(300g，3分钟)，离心后管内可见明显的上下两层(图1)；抽取下层较为澄清的含有消化液的混悬液，加入等体积的血清终止液中和消化酶；

c.上层未消化的组织块尚留于管中，加入1～2倍体积的消化酶；置于37℃孵箱中消化15分钟；

d.加入等体积的血清终止液中和消化酶；

e.将步骤b)及步骤d)得到的混悬液，放入含有70um或100um细胞筛网的培养皿中，使用胰岛素针芯进行组织研磨，抽取研磨后的细胞悬液，加入等体积的血清终止液中和消化酶的作用；

f.研磨后的细胞筛网用PBS多次轻柔冲洗；

g.将步骤e)得到的混悬液及步骤e)得到的冲洗液进行混合后离心(1500rpm，5分钟)，得到细胞团块；

h.用PBS重悬细胞团得到细胞悬液，使用40um或70um的细胞筛网去除掉组织残余，得到细胞悬液。

5)以上经方法1，方法2及方法3得到的细胞悬液，分别用DAPI室温避光染色10分钟后上机，通过流式分选的方法获取脂肪组织中的单细胞。

6)分选出的单细胞用同样体积的PBS重悬，吖啶橙(AO)/碘化丙啶(PI)染色计数。AO可以透过活细胞的细胞膜，将有核活细胞染成黄绿色；而PI不能透过活细胞的细胞膜，所以活细胞不被染成红色，只有死细胞被荧光染料PI染成红色。使用荧光细胞活率检测仪进行细胞计数。代表性细胞染色结果见图2。细胞计数结果见图3以及表1。方法3较方法1及方法2，有核活细胞得率显著提高，结团率显著降低。

7)分选后的单细胞用CD45及CD73抗体室温避光染色30分钟，DAPI上机前10分钟染色，而后上机检测三种消化方式各细胞群比例。

表1三种消化方式的细胞计数结果

流式分析策略如下：

分选：第一步根据FSC及SSC，框选出合适细胞群。第二步框选出DAPI阴性细胞即为活细胞。分选DAPI阴性的细胞。第三步设定横坐标为CD73，纵坐标为CD45，框选出CD73阳性CD45阴性的细胞即为干细胞，以及CD45阳性CD73阴性的细胞即为免疫细胞。统计三种消化方法中干细胞和免疫细胞的比例。流式结果见图4。方法1，方法2，方法3在细胞比例，活细胞比例及CD73-CD45+免疫细胞比例上无显著差异；方法3得到的CD45-CD73+干细胞比例显著高于方法1。

根据细胞计数所得的细胞总数，以及流式分析得到的各细胞群的比例，计算得到各细胞群数量，计算公式为：细胞总数(×10⁴个细胞/克)×各细胞群比例(％)＝各细胞群细胞数(×10⁴个细胞/克)。结果如表2：方法1的活细胞数量是95.17±18.80(×10⁴个细胞/克)，其中免疫细胞数量为0.9457±0.1687(×10⁴个细胞/克)，干细胞数量为0.243±0.028(×10⁴个细胞/克)。方法2的活细胞数量为161.5±45.01(×10⁴个细胞/克)，其中免疫细胞数量为1.913±0.051(×10⁴个细胞/克)，干细胞数量为0.512±0.038(×10⁴个细胞/克)。方法3的活细胞数量为994.7±253.2(×10⁴个细胞/克)，其中免疫细胞数量为13.06±2.446(×10⁴个细胞/克)，干细胞数量为4.522±0.370(×10⁴个细胞/克)。其中方法3的活细胞，活免疫细胞和活干细胞的细胞得率显著多于方法1和方法2，有显著统计学差异。

表2三种方式消化后经流式细胞分选后的细胞计数结果

尽管已用具体实施例来说明和描述了本发明，然而应意识到，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明做出很多其他的更改和修改。因此，这意味着在所附权利要求中包括属于本发明范畴内的所有这些变化和修改。

Claims

1.一种高效获取脂肪组织中单细胞的方法，其特征在于，包括如下步骤：

2.如权利要求1所述一种高效获取脂肪组织中单细胞的方法，其特征在于，步骤1)～3)中的消化酶为DMEM或PBS配制的，质量体积分数为0.1％的胶原酶I。

3.如权利要求1所述一种高效获取脂肪组织中单细胞的方法，其特征在于，步骤1)～2)消化条件为37℃，每次消化时间为15分钟。

4.如权利要求1所述一种高效获取脂肪组织中单细胞的方法，其特征在于，步骤2)中的离心为短时低速离心，优选的，所述的离心速度为300g，离心时间为3分钟。

5.如权利要求1所述一种高效获取脂肪组织中单细胞的方法，步骤2)～3)中使用的终止液是在DMEM中添加了体积分数为10％的胎牛血清。

6.如权利要求1所述一种高效获取脂肪组织中单细胞的方法，其特征在于，步骤3)～4)中使用的细胞筛网为70um或100um孔径的细胞筛网。

7.如权利要求1所述一种高效获取脂肪组织中单细胞的方法，其特征在于，步骤5)中使用的细胞筛网为40um或70um孔径的细胞筛网。

8.如权利要求1所述一种高效获取脂肪组织中单细胞的方法，其特征在于，步骤6)中使用的流式分选策略为：

1)上机前10分钟在细胞悬液中加入死细胞染料DAPI；

2)第一步根据FSC及SSC，框选出合适细胞群，去除黏连的细胞；第二步框选出DAPI阴性，即为活细胞，分选出DAPI阴性的细胞。

9.如权利要求1-8任一所述的一种高效获取脂肪组织中单细胞的方法，其特征在于，所述方法用于获取脂肪组织中的单细胞，优选地，获取脂肪组织中的免疫细胞和/或干细胞。

10.如权利要求1-8任一所述的一种高效获取脂肪组织中单细胞的方法，其特征在于，所述脂肪组织为心包脂肪，血管旁脂肪，或眼周脂肪。