CN117625528B - 一种间充质干细胞的制备方法 - Google Patents
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Landscapes
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Abstract
本发明公开了一种间充质干细胞的制备方法，涉及细胞生物学技术领域。所述的制备方法包括：将采集的经血进行预处理，加入无血清培养基放入培养箱中进行培养，得到间充质干细胞；所述的无血清培养基包括基础培养基、添加组分A和添加组分B，所述的添加组分A包括依拉瑞肽溶液和曲美他嗪溶液；按照体积分数计，所述的依拉瑞肽溶液为基础培养基的0.1‑5%，所述的依拉瑞肽溶液的浓度为100mM；所述的曲美他嗪溶液为基础培养基的0.1‑5%，所述的曲美他嗪的质量体积浓度为6%。本发明的制备方法制备得到的间充质干细胞的干性保持较好，且表型稳定，多次传代后，仍能保持未衰老状态，人血小板裂解物来源于人类，安全性好。
Description
技术领域
本发明涉及细胞生物学技术领域，具体涉及一种间充质干细胞的制备方法。
背景技术
间充质基质干细胞（MSCs）是从一些成体和围产期组织中分离出来的成体祖细胞。MSCs是一种具有多向分化潜能和低免疫原性的干细胞，目前已从多种不同类型的间质组织中分离出间充质干细胞，包括骨骼肌组织，脂肪组织、脐带组织、胎盘组织、皮肤组织等。间充质干细胞能够在一些条件下进行同种异体移植，在特殊的诱导因素作用下能够分化成软骨细胞、成骨细胞和脂肪细胞，还可以转化成其他胚层来源的不同类型的细胞，包括胰岛细胞、上皮细胞、心肌细胞等。间充质干细胞在移植时的致癌可能性比较低，在临床应用中更加安全。
经血源性间充质干细胞（menstrual blood-derived mesenchymal stem cells，MenSCs）是一种新型的间质细胞，是从女性月经血中分离的子宫内膜间充质干细胞。MenSCs除了具有与其他间质细胞具有相同的特征，如为塑料贴壁细胞，表达典型间充质间质细胞表面标记物，在体外能够分化为中胚层细胞系，显示低免疫原性谱等，MenSCs还具有较高的提取效率、较强的体外传代能力和极低的免疫原性。与骨髓和脂肪来源的间充质干细胞相比，MenSCs从月经血中提取，样本获取过程中避免了有创操作和感染风险。与脐带和胎盘来源的间充质干细胞相比，MenSCs能够实现自体回输移植，因此在再生医学领域具有较大的研究潜力和临床转化价值。MenSCs无论是作为治疗药物本身或是治疗载体均比传统MSC更具优势，被越来越多的研究者所关注。
中国专利CN104711220A中公开了一种新型的制备经血间充质干细胞的方法，所述方法包括：a.体外收集经血，并保存在经血采集液中，得到经血混合液；b.从经血混合液分离单个核细胞；c.贴壁培养上述单个核细胞，使之细胞扩增，随后通过贴壁纯化，得到经纯化的细胞，即经血间充质干细胞。所述的经血采集液为每100ml Hank's平衡盐溶液中，含有以下成分：万古霉素80μg/mL、头孢氨苄300μg/mL、卡那霉素120μg/mL、庆大霉素150μg/mL、两性霉素B 3μg/mL及450单位肝素，且所述经血采集液还含有0.5-1.0mM的丝氨酸蛋白酶抑制剂AEBSF和低于0.8mM的半胱氨酸蛋白酶抑制剂E-64以及0.3-0.75mM金属蛋白酶抑制剂EDTA。该发明具有下述优点：对供体无损害、均一性强，细胞活力高，这体现在细胞扩增速度快，传代次数高等特点。但该发明中所使用的培养基中包含胎牛血清，输入人体可能会产生不良反应。
目前对于经血源间充质干细胞的制备处于初期的研究阶段，但由于MenSCs的各项优势，提供一种表型稳定、安全性高、细胞衰老慢的MenSCs的制备方法对其临床应用具有重要的意义。
发明内容
本发明的目的是提供一种经血源间充质干细胞的制备方法，制备得到的经血来源的间充质干细胞的干性保持较好，且表型稳定，多次传代后，仍能保持未衰老现象，安全性好。
为实现上述发明目的，本发明的技术方案如下：
一方面，本发明提供了一种经血源间充质干细胞的制备方法，包括：将采集的经血进行预处理，加入无血清培养基放入培养箱中进行培养，得到间充质干细胞；
所述的无血清培养基包括基础培养基和添加组分A和添加组分B，所述的添加组分A包括依拉瑞肽（Elamipretide TFA，MTP-131）和曲美他嗪；
所述的依拉瑞肽以依拉瑞肽溶液的形式添加到基础培养基中，按照体积分数计，所述的依拉瑞肽溶液为基础培养基的0.1-5%，所述的依拉瑞肽溶液的浓度为100mM；
所述的曲美他嗪以曲美他嗪溶液的形式添加到基础培养基中，按照体积分数计，所述的曲美他嗪溶液为基础培养基的0.1-5%，所述的曲美他嗪的质量体积浓度为6%。
进一步优选地，按照体积分数计，所述的依拉瑞肽溶液为基础培养基的0.1%，所述的曲美他嗪溶液为基础培养基的0.1%。
优选地，所述的添加组分B包括人血小板裂解物（platelet-rich plasma, PRP）。
进一步优选地，按照体积分数计，所述的人血小板裂解物为基础培养基的5-20%。
再进一步优选地，按照体积分数计，所述的人血小板裂解物为基础培养基的5%。
优选地，所述的添加组分A先与基础培养基混匀，再加入添加组分B。
优选地，所述的基础培养基选自MEM-α基础培养基、DMEM培养基、DMEM/F12培养基中的一种或多种。
进一步优选地，所述的基础培养基为MEM-α基础培养基。
优选地，所述的经血的预处理包括以下步骤：
（1）将经血用缓冲液进行等体积稀释，添加青霉素-链霉素和两性霉素B；
（2）过滤，进行匀浆处理；
（3）加入淋巴细胞分离液，分离单个核细胞；
（4）离心，弃上清，吸取中间白膜层，加入缓冲液重悬，离心，弃上清；
（5）加入培养基，重悬细胞，调整细胞浓度，接种至培养瓶中，培养；
（6）待细胞生长接近融合80-90%时，用胰酶消化贴壁细胞，离心进行传代培养。
具体地，步骤（1）中所述的缓冲液为PBS缓冲液。
优选地，步骤（1）中加入的青霉素-链霉素和两性霉素B的浓度为1%。
具体地，所述的青霉素-链霉素和两性霉素B的浓度为1%是指将青霉素-链霉素溶液和两性霉素溶液按照100倍进行稀释。
具体地，步骤（2）中所述的过滤为使用100目筛网过滤，以去除子宫内膜组织的存在。
优选地，步骤（3）中淋巴细胞分离液与经血的体积比为1:1。
优选地，步骤（4）中离心的转速为2000r/min，离心的时间为15min。
优选地，步骤（4）中所述的缓冲液为PBS缓冲液。
优选地，步骤（5）中接种为以1×105个/mL接种至培养瓶中。
优选地，步骤（5）中培养的条件为在37℃、5%CO2条件下培养。
优选地，步骤（6）中所述的胰酶为0.25%胰蛋白酶-0.02%EDTA。
优选地，步骤（6）中培养的条件为在37℃、5%CO2条件下培养。
根据本发明的一些实施方式，所述的经血源间充质干细胞的制备方法，包括以下步骤：
（1）将采集的经血以PBS缓冲液等体积稀释，加入1%青霉素-链霉素和两性霉素B，过滤，匀浆；
（2）按照1:1的体积比加入淋巴细胞分离液，分离单个核细胞，2000 r/min 转速离心15 min，弃上清；
（3）吸取中间白膜层，两倍体积加入缓冲液重悬离心，1500 r/min，6 min洗涤2次；
（4）加入培养基，以1×105个/mL接种至培养瓶中在37℃、5%CO2培养箱中培养，待细胞生长接近融合（长至80-90%）时，用0.25%胰蛋白酶-0.02%EDTA轻轻消化贴壁细胞，终止消化，1200 r/min离心5分钟；
（5）传至第3代，按5000-10000个/cm2的密度接种于培养瓶中，加入无血清培养基，放入37℃，5%CO2的培养箱中培养，得间充质干细胞。
又一方面，本发明提供了上述的制备方法制备得到的经血源间充质干细胞。
又一方面，本发明提供了上述的制备方法制备得到的经血源间充质干细胞或上述的经血源间充质干细胞在制备治疗炎症、糖尿病、神经系统疾病的药物中的应用。
本发明所述，依拉瑞肽是一个心磷脂过氧化物酶抑制剂和线粒体靶向的肽。依拉瑞肽减轻人小梁网细胞中的线粒体功能障碍和氧化损伤。依拉瑞肽可以阻止iHTM和GTM(3)细胞由H2O2诱导的持续氧化应激。曲美他嗪能保护间充质干细胞免受过氧化氢诱导的伤害，通过保护细胞在缺氧或缺血情况下的能量代谢，阻止细胞内ATP水平的下降。
本发明的有益效果为：
1、本发明将依拉瑞肽和曲美他嗪加入于无血清培养基，促进经血源间充质干细胞较快贴壁，可以长期保持经血来源的间充质干细胞增殖，数量多。
2、本发明提供的间充质干细胞的制备方法制备得到的间充质干细胞的干性保持较好，且表型稳定。
3、多次传代后，仍能保持未衰老现象。
4、本发明的培养基中不使用胎牛血清，PRP来源于人类，输注人体不会引起异种蛋白免疫反应，解决了传统培养使用胎牛血清培养细胞的方法缺陷。
附图说明
图1为β-半乳糖苷酶衰老检测结果图。
具体实施方式
为了使本发明实现的技术手段、创作特征、达成目的与功效易于明白了解，下面结合具体实施例，进一步阐明本发明，但下述实施例仅为本发明的优选实施例，并非全部。基于实施方式中的实施例，本领域技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得其它实施例，都属于本发明的保护范围。下述实施例中，若无特殊说明，所用的操作方法均为常规操作方法，所用设备均为常规设备，各个实施例所用设备材料均相同。
实验材料的购买厂家及货号：
依拉瑞肽购自AbMole公司，货号为1606994-55-1；
曲美他嗪购自瑞阳制药有限公司；
MEM-α基础培养基购自GIBCO公司，货号为12561-056；
人血小板裂解物购自PALL公司，货号为15950-017；
T-AOC检测试剂盒购自南京建成生物科技有限公司，货号为A-015-1-2；
β-半乳糖苷酶染色试剂盒购自碧云天公司，货号为A0602。
实施例1 经血源间充质干细胞的制备
一、无血清培养基的制备，包括以下步骤：
无血清培养基由MEM-α基础培养基和添加剂构成，添加剂包含成分A和成分B，成分A包括依拉瑞肽和曲美他嗪；依拉瑞肽和曲美他嗪分别以依拉瑞肽溶液和曲美他嗪溶液的形式添加到培养基中，所述的依拉瑞肽溶液的浓度为100mM，所述的曲美他嗪溶液的质量体积浓度为6%，依拉瑞肽和曲美他嗪均用生理盐水进行配制，按照体积分数计，所述的依拉瑞肽溶液为基础培养基的0.1%，所述的曲美他嗪溶液为基础培养基的0.1%，先将成分A与基础培养基混合均匀；使用时再添加成分B，成分B为人血小板裂解物，成分B占基础培养基体积比为5%。
二、经血源间充质干细胞的制备
1. 经血的采集
从健康女性志愿献血者处采集经血。
从月经周期第二天用月经杯共收集月经血50ml。4℃保存。
在获取样品后的24h内，送往处理洁净实验室，置于4℃条件下进行运输保存。
2. 经血单个核细胞的分离、培养
（1）在安全柜中将经血转移至50 mL无菌离心管中，以无菌PBS等体积稀释，添加1%青霉素-链霉素、1%两性霉素B。
（2）100目筛网过滤，去除子宫内膜组织。
（3）剩余的血液使用10mL注射器19G针头进行20次匀浆处理。
（4）重悬后以1∶1的比例缓慢加入，1.077 g/ml葡萄糖-泛影葡胺（Ficoll-Paque）淋巴细胞分离液浓度梯度离心，分离单个核细胞。
（5）2000 r/min转速离心15 min，弃上清。
（6）小心吸取中间白膜层至新的50ml离心管中，两倍体积PBS缓冲液重悬离心洗涤。
（7）1500 r/min，6 min洗涤2次。
（8）彻底弃去上清，加入5.0 mL培养基吹打，重悬细胞，计数，调整至适当细胞密度，以1×105个/mL接种于T75培养瓶中。
（9）在37℃、5%CO2培养箱中培养。
（10）48 h半量换液，72 h后全量换液，将未贴壁的细胞弃除。
3. 传代
待细胞生长接近融合（长至80-90%）时，用0.25%胰蛋白酶-0.02%EDTA轻轻消化贴壁细胞2-5分钟，终止消化，移入一新的无菌离心管，1200 r/min离心5分钟。
按1:3的比例进行传代培养，每天镜下观察经血来源的间充质干细胞的形态特点。
观察：实施例细胞在第3天贴壁明显多于对比例。
4. 培养
传至P3代时，按5000-10000个/cm2的密度接种于T175培养瓶中，加入30ml的配制好的培养基；将培养瓶水平放入37℃，5%的CO2培养箱中培养。
5. 收集P5，P10，P15细胞
（1）待细胞长至70-90%融合时，弃去培养基，用10mL PBS缓冲液冲洗细胞表面1次；
（2）弃去PBS，加入6mL胰蛋白酶消化，轻轻晃动培养瓶使胰蛋白酶覆盖瓶底，迅速在镜下观察，待细胞皱缩成球状时轻轻拍打培养瓶外侧使细胞漂浮起来；
（3）加入等量的培养基，终止消化；
（4）收集细胞悬液，1200rpm，6升6降，离心5min；
（5）弃去上清液，加10mLPBS重悬细胞，注意轻轻吹打，避免产生气泡，离心；
（6）最后一次离心后，弃去上清液，用10mLPBS重悬细胞。
实施例2
与实施例1的区别仅在于：
（1）步骤一无血清培养基不同，实施例2中无血清培养基由MEM-α基础培养基和添加剂构成，添加剂包含成分A和成分B，成分A包括依拉瑞肽和曲美他嗪；依拉瑞肽和曲美他嗪分别以依拉瑞肽溶液和曲美他嗪溶液的形式添加到培养基中，所述的依拉瑞肽溶液的浓度为100mM，所述的曲美他嗪溶液的质量体积浓度为6%，依拉瑞肽和曲美他嗪均用生理盐水进行配制，按照体积分数计，所述的依拉瑞肽溶液为基础培养基的2%，所述的曲美他嗪溶液为基础培养基的2%，先将成分A与基础培养基混合均匀；使用时再添加成分B，成分B为人血小板裂解物，成分B占基础培养基体积比为10%。
（2）步骤4不同，传至P3代时，按5000-10000个/cm2的密度接种于T175培养瓶中，加入30ml的实施例2配制好的培养基；将培养瓶水平放入37℃，5%的CO2培养箱中培养。
实施例3
与实施例1的区别仅在于：
（1）步骤一无血清培养基不同，实施例3中无血清培养基由MEM-α基础培养基和添加剂构成，添加剂包含成分A和成分B，成分A包括依拉瑞肽和曲美他嗪；依拉瑞肽和曲美他嗪分别以依拉瑞肽溶液和曲美他嗪溶液的形式添加到培养基中，所述的依拉瑞肽溶液的浓度为100mM，所述的曲美他嗪溶液的质量体积浓度为6%，依拉瑞肽和曲美他嗪均用生理盐水进行配制，按照体积分数计，所述的依拉瑞肽溶液为基础培养基的5%，所述的曲美他嗪溶液为基础培养基的5%，先将成分A与基础培养基混合均匀；使用时再添加成分B，成分B为人血小板裂解物，成分B占基础培养基体积比为20%。
（2）步骤4不同，传至P3代时，按5000-10000个/cm2的密度接种于T175培养瓶中，加入30ml的实施例3配制好的培养基；将培养瓶水平放入37℃，5%的CO2培养箱中培养。
对比例1
与实施例1的区别仅在于：
（1）步骤一无血清培养基不同，对比例1中无血清培养基由MEM-α基础培养基和添加剂构成，添加剂包含成分A和成分B，成分A为依拉瑞肽，依拉瑞肽以依拉瑞肽溶液的形式添加到培养基中，所述的依拉瑞肽溶液的浓度为100mM，依拉瑞肽用生理盐水进行配制，按照体积分数计，所述的依拉瑞肽溶液为基础培养基的0.1%，先将成分A与基础培养基混合均匀；使用时再添加成分B，成分B为人血小板裂解物，成分B占基础培养基体积比为5%。
（2）步骤4不同，传至P3代时，按5000-10000个/cm2的密度接种于T175培养瓶中，加入30ml的对比例1配制好的培养基；将培养瓶水平放入37℃，5%的CO2培养箱中培养。
对比例2
与实施例1的区别仅在于：
（1）步骤一无血清培养基不同，对比例2中无血清培养基由MEM-α基础培养基和添加剂构成，添加剂包含成分A和成分B，成分A为曲美他嗪，曲美他嗪以曲美他嗪溶液的形式添加到培养基中，所述的曲美他嗪溶液的质量体积浓度为6%，曲美他嗪用生理盐水进行配制，按照体积分数计，所述的曲美他嗪溶液为基础培养基的0.1%，先将成分A与基础培养基混合均匀；使用时再添加成分B，成分B为人血小板裂解物，成分B占基础培养基体积比为5%。
（2）步骤4不同，传至P3代时，按5000-10000个/cm2的密度接种于T175培养瓶中，加入30ml的对比例2配制好的培养基；将培养瓶水平放入37℃，5%的CO2培养箱中培养。
对比例3
与实施例1的区别仅在于：
（1）步骤一无血清培养基不同，对比例3中无血清培养基由MEM-α基础培养基和添加剂构成，添加剂包含人血小板裂解物，人血小板裂解物占基础培养基体积比为5%。
（2）步骤4不同，传至P3代时，按5000-10000个/cm2的密度接种于T175培养瓶中，加入30ml的对比例3配制好的培养基；将培养瓶水平放入37℃，5%的CO2培养箱中培养。
对比例4
与实施例1的区别仅在于：
（1）步骤一无血清培养基不同，对比例4中无血清培养基由MEM-α基础培养基和添加剂构成，添加剂包含成分A和成分B，成分A包括依拉瑞肽和曲美他嗪；依拉瑞肽和曲美他嗪分别以依拉瑞肽溶液和曲美他嗪溶液的形式添加到培养基中，所述的依拉瑞肽溶液的浓度为100mM，所述的曲美他嗪溶液的质量体积浓度为6%，依拉瑞肽和曲美他嗪均用生理盐水进行配制，按照体积分数计，所述的依拉瑞肽溶液为基础培养基的6%，所述的曲美他嗪溶液为基础培养基的6%，先将成分A与基础培养基混合均匀；使用时再添加成分B，成分B为人血小板裂解物，成分B占基础培养基体积比为25%。
（2）步骤4不同，传至P3代时，按5000-10000个/cm2的密度接种于T175培养瓶中，加入30ml的对比例4配制好的培养基；将培养瓶水平放入37℃，5%的CO2培养箱中培养。
测试例1 细胞表型的鉴定
分别取实施例1-3和对比例1-4中的P5，P10，P15细胞0.1mL细胞悬液，用血球计数板计数。
分别取实施例1-3和对比例1-4中的P5，P10，P15细胞1*107个/ml细胞悬液做细胞表型流式鉴定。
收集P5、P10和P15细胞，调整细胞浓度为1×107个/ml，加入抗体CD73、CD90、CD105、CD34和CD45，室温避光孵育30min，与IgG1结合的细胞作为同型对照，孵育结束后PBS清洗2次，洗去未结合的抗体，采用流式细胞仪检测细胞表面抗原的表达，结果如下表1所示。
表1 P5，P10，P15细胞表型流式结果
由上表可知，实施例1-3制备的经血源间充质干细胞对免疫表型没有影响，各组细胞表面抗原CD73、CD90和CD105呈阳性表达，CD34和CD45呈阴性表达，其中，实施例1-3培养获得的细胞CD73、CD90和CD105阳性率均在95%以上，CD45和CD34阳性率低于2%，符合人间充质干细胞的表型特征，好于对比例1-4，见表1，说明本发明技术方案未改变细胞“干性”，符合间充质干细胞的鉴定标准，显示本发明提供的无血清培养基适于培养人经血源间充质干细胞，同时，培养基的组成对其性能具有一定的影响。
测试例2 β-半乳糖苷酶衰老检测
取实施例1-3和对比例1-4的P5，P10，P15代经血源间充质干细胞在37℃，5%的CO2培养箱中培养至细胞融合度达80%，胰酶消化，以1×104个/cm2密度接种于24孔板，在37℃，5%的CO2培养箱中培养5 d，使用β-半乳糖苷酶染色试剂盒检测细胞衰老情况，吸去24孔板中的细胞培养液，PBS洗涤1次，加入250 μL β-半乳糖苷酶染色固定液，室温固定15 min，吸除细胞固定液，PBS洗涤3次，每孔加入250 μL染色工作液，37℃孵育过夜，后清除工作液，再用PBS清洗三遍，将24孔板置于普通光学显微镜下，随机选取6个视野，观察记录实验结果。使用软件Image J对染色部分进行定量统计。结果如图1所示。
本发明技术方案可以延缓间充质干细胞的衰老。通过β-半乳糖苷酶染色法，衰老细胞呈蓝色，实施例1-3经血源间充质干细胞衰老细胞数量明显少于对比例1-4组。定量分析发现实施例组和对比例组染色比率存在显著性差异。
测试例3 T-AOC检测
分别取实施例1-3和对比例1-4的P5，P10，P15细胞，做T-AOC检测。
测定T-AOC的活性水平可直接反映机体抗氧化酶的活力和抗氧化系统的功能状态，T-AOC可反应机体内总体氧化应激水平；并可间接反映机体的脂质过氧化损伤程度，其水平与细胞抗氧化能力呈正相关，与机体脂质过氧化呈负相关。
使用Fe3＋／Fe2＋化学法测定T-AOC水平（具体操作严格按照试剂盒操作程序进行）。
表2
将上表中各管的试剂混匀，放置10分钟，双蒸水调零1cm光径，520nm测各种管吸光度。
单位定义及计算公式:
①定义：在37℃时，每分钟每毫升上清使反应体系的吸光度（OD）值每增加0.01时，为一个总抗氧化能力单位。
②计算公式
总抗氧化能力=（测定OD值-对照OD值）/0.01/30×（反应液总量/取样量）×样本测试前（单位/毫升上清）稀释倍数。
实验结果如下表3所示。
表3
由上表可知，实施例1-3制备的MSC其总抗氧化能力显著高于对比例1-4组，说明本发明的培养基配方增强了细胞抗氧化能力，显示本发明提供的无血清培养基培养对经血源间充质干细胞具有明显的特性。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (3)
1.一种间充质干细胞的制备方法，其特征在于，包括：将采集的经血进行预处理，加入无血清培养基放入培养箱中进行培养，得到间充质干细胞；
所述的无血清培养基包括基础培养基、添加组分A和添加组分B，所述的添加组分A由依拉瑞肽和曲美他嗪组成；
所述的依拉瑞肽以依拉瑞肽溶液的形式添加到基础培养基中，按照体积分数计，所述的依拉瑞肽溶液为基础培养基的0.1-5%，所述的依拉瑞肽溶液的浓度为100mM；
所述的曲美他嗪以曲美他嗪溶液的形式添加到基础培养基中，按照体积分数计，所述的曲美他嗪溶液为基础培养基的0.1-5%，所述的曲美他嗪的质量体积浓度为6%；
所述的添加组分B为人血小板裂解物；按照体积分数计，所述的人血小板裂解物为基础培养基的5-20%；
所述的基础培养基为MEM-α基础培养基；
所述的培养的条件为35-37℃，5-8% CO2。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，按照体积分数计，所述的依拉瑞肽溶液为基础培养基的0.1%，所述的曲美他嗪溶液为基础培养基的0.1%。
3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述的预处理包括以下步骤：
（1）将经血用缓冲液进行稀释，添加青霉素-链霉素和两性霉素B；
（2）过滤，进行匀浆处理；
（3）加入淋巴细胞分离液，分离单个核细胞；
（4）离心，弃上清，吸取中间白膜层，加入缓冲液重悬，离心，弃上清；
（5）加入培养基，重悬细胞，调整细胞浓度，接种至培养瓶中，培养；
（6）待细胞生长接近融合80-90%时，用胰酶消化贴壁细胞，离心进行传代培养。
Priority Applications (1)
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