KR102168027B1 - 지방조직으로부터 혈관내피세포의 분리 방법 및 배양 방법 - Google Patents

지방조직으로부터 혈관내피세포의 분리 방법 및 배양 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 지방 줄기세포의 배양 상층액을 수득하는 단계를 포함하는 혈관내피세포의 분리 방법에 관한 것으로서, 상기 지방 줄기세포는 지방 조직에서 분리된 SVF(Stromal vascular fraction)로부터 분리된 것이고, 상기 배양 상층액을 수득한 후 세포 여과망으로 여과하는 단계를 더 포함하는 방법에 관한 것이다. 본 발명에 의하여 효율적이고 경제적인 혈관내피세포의 분리 및 배양이 가능함으로써, 혈관신생과 관련된 다양한 연구분야에서 활용될 수 있다.

Description

지방조직으로부터 혈관내피세포의 분리 방법 및 배양 방법{Isolation and culture method of vascular endothelial cells from adipose tissue}
본 발명은 지방 조직 유래의 지방 줄기세포의 배양 상층액으로부터 수득된 혈관내피세포의 분리 방법 및 배양 방법에 관한 것이다.
인체로부터 얻은 지방조직에 콜라게네이즈(Collagenase)을 첨가하여 SVF(Stromal vascular fraction)를 분리 배양하여 지방유래 줄기세포를 얻는다. 그러나, 이 SVF에는 지방전구세포(preadipocytes), 간엽 줄기 세포 (mesenchymal stem cells (MSC)), 내피 전구 세포(endothelial progenitor cell), T 세포(T cells), B 세포(B cells), 비만 세포(mast cells) 및 지방 조직 대식세포(macrophages)등 다양한 세포들이 포함되어 있다.
이러한 다양한 세포들 중에서 특정 세포를 분류하는 대표적인 방법으로 세포막 표면에 존재하는 단백질에 특이적인 항체를 이용하여 분리하는 방법인 자성-비드(Magnetic Beads)결합 분리 방법과 세포에 일정 파장을 띄는 형광이 표지된 항체 같은, 형광염색소를 표지 하여 세포가 일정 감지지역(sensing point)을 통과할 때 형광을 띠는 특정 세포를 분류하는 유동세포계측법(Fluorescence Activated Cell Sorting)이 있지만, 고비용으로 인하여 제한적이고 대중적으로 사용하기 어려운 단점이 있다.
또한, 장기 및 조직에서 생존율과 순도가 높은 세포를 분리하기 위한 방법으로 세포의 크기와 밀도에 기초한 방법들이 활용되고 있는데, 밀도차등(density gradient) 원심분리는 죽은 세포와 뒤섞인 상태로 있는 살아있는 세포(live cell)를 분리해낼 수 있는 것으로 알려져 있으나, 세포간 동시 침전이 일어나거나 밀도 차가 크지 않은 세포에서는 고순도 분리가 어려운 단점이 있다.
본 방법은 종래의 방법에 따른 혈관내피세포의 분리는 다량의 조직과 시약이 필요로 하며, 비용 대비 효율성이 낮으며 순수하게 분리된 혈관내피세포의 수가 적기 때문에 실험을 수행하는데 어려움이 많은 단점이 있음을 발견하고, 보다 간편하면서도 저렴한 비용으로 SVF로부터 혈관내피세포를 분리하여 배양하는 방법을 개발하고자 하였다.
1. Biomedical Research and Therapy 2016,3(5): 645-652.
본 발명의 목적은 지방 줄기세포의 배양 상층액을 수득하는 단계를 포함하는 혈관내피세포의 분리 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 혈관내피세포의 분리 방법에 의해 분리된 혈관내피세포를 코팅제가 처리되거나 처리되지 않은 배양용기에 접종하고, ECGF (Endothelial cell growth factor)가 포함된 배지를 이용하여 배양하는 것을 특징으로 하는 혈관내피세포의 배양 방법을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 지방 줄기세포의 배양 상층액을 수득하는 단계를 포함하는 혈관내피세포의 분리 방법을 제공한다.
본 발명의 일 실시예에 있어서, 상기 지방 줄기세포는 지방 조직에서 분리된 것일 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 있어서, 상기 배양 상층액의 수득은 지방 줄기세포의 배양 후 8 내지 72 시간 후에 이루어지는 것일 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 있어서, 상기 지방 줄기세포의 배양 상층액은 세포 여과망(cell strainer)으로 여과되는 것일 수 있고, 상기 세포 여과망은 30 내지 70 ㎛인 것일 수 있고, 바람직하게는 40 ㎛인 것일 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 있어서, 상기 혈관내피세포는 ECGF (Endothelial cell growth factor)가 포함된 배지에서 배양되는 것일 수 있고, 상기 배지는 VEGF (vascular endothelial growth factor) 또는 bFGF (basic fibroblast growth factor)을 추가적으로 더 포함하는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 일 실시예에 있어서, 상기 혈관내피세포는 배양용기에 접종된 후, 12 내지 24 시간 후 배지를 제거하고 PBS로 세척하는 단계를 추가적으로 더 포함하는 것일 수 있고, 이는 조직에서 분리된 1차 세포(primary cells)의 경우 RBC(red blood cells)이 포함되어 있고, 세포 여과망으로 통과된 섬유질이 있을 수 있어, 상기 RBC 및 섬유질을 제거하기 위함이다.
본 발명의 일 실시예에 있어서, 상기 지방 줄기세포는 지방 조직에 콜라게네이즈를 첨가하여 얻은 SVF(Stromal vascular fraction)로부터 분리된 것일 수 있고, 상기 콜라게네이즈의 농도는 0.05 ~ 0.25 % 인 것일 수 있고, 상기 콜라게네이즈를 첨가 후, 35 ~ 38℃ 에서 20 ~ 90분 동안 교반하거나, 세포배양기(incubator)에서 2시간 동안 반응시키는 것일 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 있어서, 상기 SVF로부터 지방 줄기세포의 분리는 (a) 원심분리 후, 상층 오일 및 중간층의 1/2을 제거하는 단계; 및 (b) 남은 용액을 여과망을 이용하여 여과시키는 단계;에 의해 이루어지는 것일 수 있고, 상기 (a) 단계의 원심분리는 1000 rpm에서 5분 동안 또는 1300 rpm에서 3분 동안 수행되는 것일 수 있고, 상기 (a) 단계는 배지를 첨가하여 2 내지 3회 반복하는 것일 수 있으며, 상기 (b) 단계의 여과망은 70 내지 150 ㎛ 인 것일 수 있고, 바람직하게는 100 ㎛ 인 것일 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 혈관내피세포의 분리 방법에 의해 분리된 혈관내피세포를 코팅제가 처리되거나 처리되지 않은 배양용기에 접종하고, ECGF (Endothelial cell growth factor)가 포함된 배지를 이용하여 배양하는 것을 특징으로 하는 혈관내피세포의 배양 방법을 제공한다.
본 발명의 일 실시예에 있어서, 상기 코팅제가 처리되지 않은 배양용기에서는 2일 내지 5일에 혈관내피세포의 계대배양을 수행하는 것일 수 있고, 바람직하게는 3일 내지 4일에 수행하는 것일 수 있고, 이는 섬유아세포에 의한 오염방지 및 혈관내피세포의 변형 방지를 위함이다. 또한, 상기 코팅제가 처리된 배양용기에서는 2일 내지 7일에 혈관내피세포의 계대배양을 수행하는 것일 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 있어서, 상기 혈관내피세포는 ECGF (Endothelial cell growth factor)가 포함된 배지에서 배양되는 것일 수 있고, 상기 배지는 VEGF (vascular endothelial growth factor) 또는 bFGF (basic fibroblast growth factor)을 추가적으로 더 포함하는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에 따른 혈관내피세포의 분리 방법은 기존의 분리 방법에 비하여 효율적이고 경제적인 방법으로서, 혈관신생과 관련된 다양한 연구분야에서 활용될 수 있다.
도 1은 지방 조직으로부터 분리된 지방 줄기세포의 배양 과정 중 혈관내피세포의 분리방법을 나타내는 모식도이다.
도 2는 지방 조직으로부터 분리된 혈관내피세포의 세포형태를 관찰한 결과이다 (HUVEC: human umbilical vein endothelial cells; HMVEC: human dermal microvascular endothelial cells; HMVEC-A: 본 발명에 따라 분리된 혈관내피세포; P4: passage 4의 세포; 및 P0: passage 0의 세포).
도 3은 지방 조직으로부터 분리된 혈관내피세포에서 유세포 분석기를 통해 혈관내피세포 특이적 단백질인 CD31 (위쪽 패널) 및 vWF (아래쪽 패널)의 발현을 분석한 결과이다.
도 4는 지방 조직으로부터 분리된 혈관내피세포의 DiL-ac-LDL 흡수능에 대한 결과이다 (왼쪽 위: HUVEC; 오른쪽 위: HMVEC; 왼쪽 아래: iPSC(induced pluripotent stem cells); 및 오른쪽 아래: HMVEC-A (본 발명에 따라 분리된 혈관내피세포)).
도 5는 지방 조직으로부터 분리된 혈관내피세포의 튜브 형성(tube formation)에 관한 결과이다 (왼쪽: HUVEC; 및 오른쪽: HMVEC-A (본 발명에 따라 분리된 혈관내피세포)).
본 발명에서의 용어, "줄기세포"는 개체의 모든 조직의 세포로 분화할 수 있는 다능성(pluripotent)이거나 전능성(totipotent)이 있는 자가-재생산능(self-renewal)을 갖는 세포를 의미하며, 배아줄기세포, 유도만능줄기세포 및 성체줄기세포를 포함한다.
상기 용어, "성체줄기세포"는 분화된 조직에서 발생하는 줄기세포로 자가 재생산이 가능하며 유래 조직의 모든 세포 타입으로 분화될 수 있는 미분화된 세포를 의미한다. 구체적으로 상기 성체줄기세포는 제대혈(탯줄혈액), 성인의 골수, 비장, 난소, 정소, 말초혈액, 양수, 뇌, 혈관, 골격근, 피부 또는 위장관의 상피, 각막, 치아의 치수, 망막, 간 또는 췌장으로부터 추출해 낼 수 있으며, 뼈와 간, 혈액 등 구체적 장기의 세포로 분화되기 직전의 원시세포를 의미한다. 예를 들어, 척수는 조혈모세포(Hematopoietic stem cell, HSC) 및 중간엽 줄기세포(Mesenchymal Stem Cell)를 가지는 것으로 보고되고 있으며, 뇌로부터 유래한 줄기세포인 신경줄기세포(Neural stem cell)는 뇌실하 영역(subventricular zone), 뇌실 영역(ventricular zone) 및 CNS(central nervous system)의 해마(hippocampus)로부터 분리된다고 알려져 있다. 일반적으로 성체 줄기세포는 증식이 어려우나 쉽게 분화되는 경향이 강한 것으로 알려져 있어, 여러 종류의 성체 줄기세포를 사용하여 실제 의학에서 필요로 하는 장기 재생을 할 수 있을 뿐 아니라 이식된 후 각 장기의 특성에 맞게 분화할 수 있는 특성을 지니고 있다.
본 발명에서의 용어, "지방 줄기세포"는 지방 조직에서 유래된 중배엽 줄기세포를 의미한다. 본 발명의 지방 줄기세포는 지방 조직에서 분리되며, 지방 조직은 동물로부터 임의의 방법에 의해 수득될 수 있다. 상기 방법의 첫 번째 단계는 공급원 동물로부터 지방 조직의 분리이며, 동물 내의 지방 스트로마성 세포가 생존 가능한 한, 동물은 살아있거나 죽어있을 수 있다. 통상적으로는, 양호하게 인식된 프로토콜, 예컨대, 수술 또는 지방 흡인술을 사용하여, 인간 지방 조직을 살아있는 제공자로부터 수득할 수 있다. 인간 지방 조직을 수득하는 바람직한 방법은 당업계에 주지된 절제술 또는 지방 흡입술일 수 있다. 본 발명의 지방 조직 유래 줄기세포는 지방 조직이 수득되는 방법에 상관없이, 초기에 절제된 또는 추출된 지방 조직 내에 존재할 수 있다.
본 발명에서의 용어, "배지"는 인 비트로(in vitro)에서 세포의 성장 및 생존을 유지하는데 필요한 영양물질을 포함하는 조성물을 의미하는 것으로서, 당업계에서 통상적으로 이용되는 동물세포용 배지를 의미한다. 본 발명에서 이용될 수 있는 배지는 동물세포의 배양에 통상적으로 이용되는 어떠한 배지도 가능하며, 예를 들어, Eagles's MEM (Eagle's minimum essential medium), α-MEM, Iscove's MEM, CMRL 1066, RPMI 1640, F12, F10, DMEM (Dulbecco's modification of Eagle's medium, Dulbecco), DMEM과 F12의 혼합물, Way-mouth's MB752/1, McCoy's 5A 및 MCDB 시리즈 등이 이용될 수 있다. 바람직하게는 α-MEM, Eagles's MEM, Iscove's MEM, CMRL 1066, RPMI 1640, F12, F10, DMEM, Way-mouth's MB752/1, McCoy's 5A, ECM 및 EGM으로 구성된 군으로부터 선택될 수 있으나, 바람직하게는 ECGF (endothelial cell growth factor)가 포함된 ECM 및 EGM에서 배양되는 것일 수 있고, VEGF (vascular endothelial growth factor) 또는 bFGF (basic fibroblast growth factor)을 추가적으로 더 포함하는 ECM 및 EGM 인 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서의 용어, "계대 배양"이란 세포를 건강한 상태로 지속적으로 장기간 배양하기 위해 주기적으로 세포의 일부를 새로운 배양용기에 옮긴 후 배양배지를 갈아주면서 세포의 대를 계속 이어서 배양하는 방법을 의미한다. 한정된 공간을 가진 배양용기 내에서 세포의 수가 늘어나면서 일정시간이 지나면 증식 영양분이 소비되거나 오염 물질이 쌓여 세포가 자연히 죽게 되므로, 건강한 세포의 수를 늘리기 위한 방법으로 사용되며, 통상적으로 한 차례 배지(배양용기)를 교체하는 것 또는 세포군을 나누어 배양하는 것을 1 계대(1 passage, P1)라고 한다.
이하, 본 발명을 실시예를 통하여 더욱 상세히 설명하기로 한다. 이들 실시예는 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1. 지방조직으로부터 지방 줄기세포의 분리
1.1. 지방조직의 준비
인간 지방조직은 수술을 통해 사람의 복부에서 채취되었다. 인간 지방조직은 핀셋(forceps)으로 튜브에서 조심스럽게 꺼내 150Φ 배양 플레이트에 옮겨 담은 후, 지방 조직에 묻어 있는 이물질은 가위를 이용하여 제거하고, PBS(1% antibiotic/antimycotic)로 세척하여 준비하였다.
1.2. ECM (extracellular matrix) 제거 및 SVF (stromal vascular fraction) 획득
세척된 조직은 새로운 50ml tube 또는 150Φ 배양 플레이트로 옮긴 후, 가위를 이용하여 충분히 절단하였다. 이후, ECM 분해 효소인 콜라게네이즈 타입 I (in PBS)을 0.05~0.25%의 농도로 준비하고, 상기 준비된 조직에 콜라게네이즈 타입 I을 1:1 의 부피비로 혼합하여 처리하였다. 혼합 후, 35~38℃ 에서 20~90분 동안 교반하거나, 세포 배양기(incubator)에서 2시간 동안 효소 처리하여 SVF를 획득하였다.
1.3. SVF (stromal vascular fraction) 분리 및 지방 줄기세포 분리
획득된 SVF는 새로운 50 ml 튜브로 옮기고, 1000 rpm에서 5분 또는 1300 rpm에서 3분 동안 원심분리 하였다. 이후, 상층의 오일은 완전히 제거하고, 중간층은 1/2 정도로 제거하며, 하층액과 펠릿은 새로운 튜브로 옮겼다. 이후, 하층액과 펠릿이 있는 튜브에 DMEM 배지(10% FBS, 1% antibiotic/antimycotic)를 1:1의 부피비로 첨가하고 2차 원심분리를 하였다. 다시 상층의 오일을 제거하고, 중간층은 1/2 정도로 제거하였다. 남은 중간층의 용액으로 세포 펠릿을 풀어주고, 100㎛ 여과망(strainer)를 이용하여 여과하였다. 이후, 여과된 용액에 배지를 1:1의 부피비로 첨가하여 3차 원심분리를 하여 지방 줄기세포를 분리하였다.
1.4. 세포 배양
분리된 지방 줄기세포(primary cells)는 배양 플레이트에서 24시간 동안 배양되었다. 24시간 후, RBC (red blood cells) 및 여과 과정에서 통과된 섬유질을 제거하기 위하여, 배지를 제거하고 PBS로 2회 세척하였다.
실시예 2. 혈관내피세포의 분리 및 배양
2.1. 혈관내피세포의 분리 및 배양
본 발명자들은 상기 실시예 1에서 분리된 지방 줄기세포의 배양 상층액에서 혈관내피세포를 분리하고자 하였다. 상기 실시예 1의 지방 줄기세포를 배양하고, 8 내지 72 시간 후, 지방 줄기세포의 배양 상층액을 조심스럽게 수거하여 40㎛ 세포 여과망(cell strainer)을 이용하여 1 내지 2회 여과하였다. 여과된 배양 상층액은 코팅제가 처리되거나 처리되지 않은 배양용기에 넣었고, ECGF (Endothelial cell growth factor, 혈관내피세포 성장인자)가 포함된 배지를 첨가한 후, 37℃, 5% CO2 세포 배양기(incubator)에서 배양하였다.
24시간 후, RBC (red blood cells) 및 여과 과정에서 통과된 섬유질을 제거하기 위하여, 배지를 제거하고 PBS로 2회 세척하였다. 다시 ECGF (Endothelial cell growth factor, 혈관내피세포 성장인자)가 포함된 배지를 첨가하고, 37℃, 5% CO2 세포 배양기(incubator)에서 배양하였다. 계대배양은 세포의 성장 속도를 고려하여 5 내지 7일에 한번씩 실시하였다.
특히, 코팅제가 처리되지 않은 배양용기에서는 계대배양을 5일 이내에 수행하였다. 배양기간이 5일 보다 많을 경우 섬유아세포의 증식이 증가되어 섬유아세포에 의한 오염가능성이 있을 수 있고, 혈관내피세포의 변형이 발생하여 건강하지 못한 혈관내피세포가 발생될 가능성이 있기 때문이다. 이때 배지는 2일 내지 3일에 한 번씩 교환하였고, 이는 세포성장에 필요한 영양분을 충분히 제공하기 위함이다.
본 발명자들은 2 내지 6 번째 계대까지 배양된 세포들(P2 내지 P6)이 혈관내피세포임을 확인하였고, 이를 "HMVEC-A"로 명명하였다. 또한, 상기 배양 상층액을 분리하여 혈관내피세포를 분리하는 방법을 "상층액 분리배양법"으로 명명하였다.
2.2. 혈관내피세포의 순도 향상
계대배양시 섬유아세포(Fibroblast cell)의 증식으로 인해 혈관내피세포의 증식이 저해되는 것을 막고, 혈관내피세포의 순도를 향상시키기 위해 자성 비드를 이용하여 혈관내피세포의 특이적 항체인 anti-CD31+을 이용하여 계대배양을 진행하였다.
실시예 3. 상층액 분리배양법으로 분리된 혈관내피세포의 확인
3.1. 형태적 특성
본 발명자들은 상기 실시예의 방법에 의하여 분리된 세포가 혈관내피세포인지 확인하기 위하여 위상차(Phase contrast) 현미경을 이용하여 세포의 형태적 특성을 분석하였다. 그 결과, 혈관내피세포로서 잘 알려진 HUVEC (human umbilical vein endothelial cells) 및 HMVEC (human dermal microvascular endothelial cells)과 유사한 조약돌 형태(cobblestone-like)의 세포 형태가 나타남을 확인하였다(도 2).
따라서, 지방조직 유래의 지방 줄기세포의 배양 상층액에서 분리된 세포는 혈관내피세포임을 확인하였다.
3.2. 유세포 분석(Flow cytometry) 결과
본 발명자들은 상기 실시예의 방법에 의하여 분리된 세포가 혈관내피세포인지 확인하기 위하여, 유세포 분석을 통해 혈관내피세포에 특이적인 세포표면 항원의 존재 유무를 확인하는 실험을 수행하였다. 간단히, 15×104 의 혈관내피세포를 60 mm dish에서 접종하고 37℃, 5% CO2 세포 배양기(incubator)에서 배양하였다. 이후, 80% confluence가 되었을 때, 혈관내피세포를 Trypsin-EDTA를 이용하여 모은 후, 0.5% 파라포름알데하이드로 고정하였다. 고정된 혈관내피세포는 Washing Buffer (2% FBS in Hank's balanced salt solution (GIBCO Inc))로 한 번 세척하였고, 이후, anti-CD31(monoclonal fluorescein isothiocyanate-conjugated) 및 anti-vWF(Von Willebrand factor, monoclonal fluorescein isothiocyanate-conjugated)의 항체를 넣고 얼음 위에서 30분 동안 반응시켰다. 이후, 세포를 0.5% 파라포름알데하이드로 고정시키고, FACS (fluorescence-activated cell sorting)를 이용하여 CD31 및 vWF의 발현 정도를 분석하였다.
그 결과, 본 발명의 방법에 따라 분리된 세포는 CD31 및 vWF의 발현 정도가 대조군인 HUVEC 및 HMVEC와 유사하게 나타났음을 확인하였다(도 3). 따라서, 지방조직 유래의 지방 줄기세포의 배양 상층액에서 분리된 세포는 CD31 및 vWF가 90% 이상 발현되는 혈관내피세포임을 확인하였다.
3.3. Dil-ac-LDL 흡수능
본 발명자들은 상기 실시예의 방법에 의하여 분리된 세포가 혈관내피세포인지 확인하기 위하여, 내피세포를 확인할 수 있는 마커인 DiL-ac-LDL 흡수능을 분석하였다. 간단히, 분리된 세포는 4웰 챔버 슬라이드(Lab-Tek, Nunc, Germany)에서 배양되었다. 부착 세포에 10 ㎍/㎖ Dil-ac-LDL(1,1'-dioctadecyl-3,3,3',3'-tetramethylindocarbocyanine-labeled acetylated low density lipoprotein, Molecular Probes, USA)을 처리하여 37℃에서 1시간 동안 항온 반응시킨 후, 1% 파라포름알데하이드로 고정하였다. 이후, PBS로 3회 세척한 후, DAPI (4'6-diamino-2-fenilindol dihidrocloreto)가 포함된 10 ㎍/㎖의 Vectashield (mounting medium for fluorescence, Vector laboratories, inc, USA)를 처리하여 1시간 동안 염색하였다. 형광은 공초점 현미경(Carl Zeiss Inc, Germany) 및 형광현미경(Zeiss Inc, Germany)으로 가시화하였다.
그 결과, 지방 줄기세포의 배양 상층액에서 분리된 세포들은 모두 Dil-ac-LDL가 흡수됨을 확인하였다 (도 4). 따라서, 지방조직 유래의 지방 줄기세포의 배양 상층액에서 분리된 세포는 Dil-ac-LDL 흡수능을 가진 혈관내피세포임을 확인하였다.
3.4. 튜브 형성 분석(Tube formation assay)
본 발명자들은 상기 실시예의 방법에 의하여 분리된 세포가 혈관내피세포인지 확인하기 위하여, 튜브 형성 분석 실험을 수행하였다. 간단히, 96-well plate에 100㎕의 마트리젤(Matrigel)를 넣고 37℃에서 30분 동안 굳혀 마트리젤 코팅을 하였다. 이후, 15×103의 세포를 접종하고, 37℃, 5% CO2 세포 배양기(incubator)에서 배양과 동시에 각 시간에 따라 현미경을 통해 튜브 형성능을 분석하였다. 세포 이미지는 현미경 하에서 캡쳐하거나 Live Cell Imaging System(Biotek Inc, USA)를 이용하여 분석되었다.
그 결과, 마트리젤이 코팅된 플레이트에 세포를 접종한 후, 4시간 이후부터 튜브가 형성되기 시작하였고, 튜브 형성이 계속 증가됨을 확인하였다(도 5). 따라서, 지방조직 유래의 지방 줄기세포의 배양 상층액에서 분리된 세포는 튜브 형성능을 가진 혈관내피세포임을 확인하였다.

Claims (20)

  1. 배양 후 24시간 후에 지방 줄기세포의 배양 상층액을 수득하는 단계; 및
    상기 지방 줄기세포의 배양 상층액을 30 내지 40 ㎛의 세포 여과망(cell strainer)으로 여과하는 단계를 포함하는 혈관내피세포의 분리 방법.
  2. 제 1 항에 있어서,
    상기 지방 줄기세포는 지방 조직에서 분리된 것을 특징으로 하는 방법.
  3. 삭제
  4. 삭제
  5. 삭제
  6. 제 1 항에 있어서,
    상기 혈관내피세포는 ECGF (Endothelial cell growth factor)가 포함된 배지에서 배양되는 것을 특징으로 하는 방법.
  7. 제 6 항에 있어서,
    상기 배지는 VEGF (vascular endothelial growth factor) 또는 bFGF (basic fibroblast growth factor)을 추가적으로 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  8. 제 1 항에 있어서,
    상기 혈관내피세포는 배양용기에 접종된 후, 12 내지 24 시간 후 배지를 제거하고 PBS로 세척하는 단계를 추가적으로 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  9. 제 1 항에 있어서,
    상기 지방 줄기세포는 지방 조직에 콜라게네이즈를 첨가하여 얻은 SVF(Stromal vascular fraction)로부터 분리된 것을 특징으로 하는 방법.
  10. 제 9 항에 있어서,
    상기 콜라게네이즈의 농도는 0.05 ~ 0.25 % 인 것을 특징으로 하는 방법.
  11. 제 9 항에 있어서,
    상기 콜라게네이즈를 첨가 후, 35 ~ 38℃ 에서 20 ~ 90분 동안 교반하는 것을 특징으로 하는 방법.
  12. 제 9 항에 있어서,
    상기 콜라게네이즈를 첨가 후, 세포배양기(incubator)에서 2시간 동안 반응시키는 것을 특징으로 하는 방법.
  13. 제 9 항에 있어서,
    상기 SVF로부터 지방 줄기세포의 분리는
    (a) 원심분리 후, 상층 오일 및 중간층의 1/2을 제거하는 단계; 및
    (b) 남은 용액을 여과망을 이용하여 여과시키는 단계;에 의해 이루어지는 것을 특징으로 하는 방법.
  14. 제 13 항에 있어서,
    상기 (a) 단계의 원심분리는 1000 rpm에서 5분 동안 또는 1300 rpm에서 3분 동안 수행되는 것을 특징으로 하는 방법.
  15. 제 13 항에 있어서,
    상기 (a) 단계는 배지를 첨가하여 2 내지 3회 반복하는 것을 특징으로 하는 방법.
  16. 제 13 항에 있어서,
    상기 (b) 단계의 여과망은 70 내지 150 ㎛ 인 것을 특징으로 하는 방법.
  17. 제 1 항, 제 2 항 및 제 6 항 내지 제 16 항 중 어느 한 항의 방법에 의해 분리된 혈관내피세포를 코팅제가 처리되거나 처리되지 않은 배양용기에 접종하고, ECGF (Endothelial cell growth factor)가 포함된 배지를 이용하여 배양하는 것을 특징으로 하는 혈관내피세포의 배양 방법.
  18. 제 17 항에 있어서,
    상기 코팅제가 처리되지 않은 배양용기에서는 2일 내지 5일에 혈관내피세포의 계대배양을 수행하는 것을 특징으로 하는 방법.
  19. 제 17 항에 있어서,
    상기 코팅제가 처리된 배양용기에서는 2일 내지 7일에 혈관내피세포의 계대배양을 수행하는 것을 특징으로 하는 방법.
  20. 제 17 항에 있어서,
    상기 배지는 VEGF (vascular endothelial growth factor) 또는 bFGF (basic fibroblast growth factor)를 추가적으로 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
BIOMEDICAL RESEARCH AND THERAPY 2016, VOL.3(5), P. 645_652*
Stem Cell Research and Therapy (2017) 8;237,p.1-11 [DOI 10.1186/s13287-017-0684-1]*

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