CN111197028A - 一种人体脂肪干细胞的培养方法 - Google Patents
一种人体脂肪干细胞的培养方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN111197028A CN111197028A CN202010156141.8A CN202010156141A CN111197028A CN 111197028 A CN111197028 A CN 111197028A CN 202010156141 A CN202010156141 A CN 202010156141A CN 111197028 A CN111197028 A CN 111197028A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- adipose
- stem cells
- culture
- derived stem
- culturing
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 210000000130 stem cell Anatomy 0.000 title claims abstract description 70
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 title abstract description 5
- 210000000577 adipose tissue Anatomy 0.000 claims abstract description 59
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 claims abstract description 39
- 239000012894 fetal calf serum Substances 0.000 claims abstract description 32
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 claims abstract description 29
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 29
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims abstract description 20
- UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N streptomycin Chemical compound CN[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@](C=O)(O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@H]1O UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N 0.000 claims abstract description 18
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 claims abstract description 14
- 229930182555 Penicillin Natural products 0.000 claims abstract description 9
- JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N Penicillin G Chemical compound N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)C(=O)CC1=CC=CC=C1 JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N 0.000 claims abstract description 9
- 229940049954 penicillin Drugs 0.000 claims abstract description 9
- 229960005322 streptomycin Drugs 0.000 claims abstract description 9
- 210000004204 blood vessel Anatomy 0.000 claims abstract description 6
- 208000007536 Thrombosis Diseases 0.000 claims abstract description 5
- 210000002808 connective tissue Anatomy 0.000 claims abstract description 5
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 45
- 239000002609 medium Substances 0.000 claims description 16
- CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N Carbon dioxide Chemical compound O=C=O CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 8
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 claims description 8
- 238000005406 washing Methods 0.000 claims description 8
- 239000012091 fetal bovine serum Substances 0.000 claims description 7
- 108010019160 Pancreatin Proteins 0.000 claims description 5
- 229910002092 carbon dioxide Inorganic materials 0.000 claims description 5
- 210000003195 fascia Anatomy 0.000 claims description 5
- 229940055695 pancreatin Drugs 0.000 claims description 5
- 210000000601 blood cell Anatomy 0.000 claims description 4
- 239000001569 carbon dioxide Substances 0.000 claims description 4
- 230000003444 anaesthetic effect Effects 0.000 claims description 3
- 238000009966 trimming Methods 0.000 claims description 3
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims description 2
- 102000004142 Trypsin Human genes 0.000 claims 1
- 108090000631 Trypsin Proteins 0.000 claims 1
- 239000003193 general anesthetic agent Substances 0.000 claims 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 claims 1
- 239000012588 trypsin Substances 0.000 claims 1
- 230000008859 change Effects 0.000 abstract description 5
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 abstract description 4
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 abstract 1
- 235000011837 pasties Nutrition 0.000 abstract 1
- 210000003491 skin Anatomy 0.000 abstract 1
- 238000002791 soaking Methods 0.000 abstract 1
- 230000009466 transformation Effects 0.000 abstract 1
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 16
- 102000029816 Collagenase Human genes 0.000 description 12
- 108060005980 Collagenase Proteins 0.000 description 12
- 229960002424 collagenase Drugs 0.000 description 12
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 11
- 238000012136 culture method Methods 0.000 description 6
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 6
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 5
- 238000010899 nucleation Methods 0.000 description 5
- 210000001789 adipocyte Anatomy 0.000 description 4
- 210000001612 chondrocyte Anatomy 0.000 description 4
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 4
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 3
- 238000010009 beating Methods 0.000 description 3
- 238000007664 blowing Methods 0.000 description 3
- 230000005757 colony formation Effects 0.000 description 3
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 3
- 239000003102 growth factor Substances 0.000 description 3
- 230000009758 senescence Effects 0.000 description 3
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 3
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 3
- 102100026189 Beta-galactosidase Human genes 0.000 description 2
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 2
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 2
- 108010037362 Extracellular Matrix Proteins Proteins 0.000 description 2
- 102000010834 Extracellular Matrix Proteins Human genes 0.000 description 2
- 230000002293 adipogenic effect Effects 0.000 description 2
- RGCKGOZRHPZPFP-UHFFFAOYSA-N alizarin Chemical compound C1=CC=C2C(=O)C3=C(O)C(O)=CC=C3C(=O)C2=C1 RGCKGOZRHPZPFP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 2
- 108010005774 beta-Galactosidase Proteins 0.000 description 2
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 2
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 description 2
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 2
- 230000002648 chondrogenic effect Effects 0.000 description 2
- 238000003235 crystal violet staining Methods 0.000 description 2
- 230000007547 defect Effects 0.000 description 2
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 2
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 2
- 210000002744 extracellular matrix Anatomy 0.000 description 2
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 2
- 210000003566 hemangioblast Anatomy 0.000 description 2
- 210000004754 hybrid cell Anatomy 0.000 description 2
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 2
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 2
- 239000000463 material Substances 0.000 description 2
- 108010082117 matrigel Proteins 0.000 description 2
- 230000005012 migration Effects 0.000 description 2
- 238000013508 migration Methods 0.000 description 2
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 2
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 2
- 230000002188 osteogenic effect Effects 0.000 description 2
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 2
- IZTQOLKUZKXIRV-YRVFCXMDSA-N sincalide Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(N)=O)NC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O)C1=CC=C(OS(O)(=O)=O)C=C1 IZTQOLKUZKXIRV-YRVFCXMDSA-N 0.000 description 2
- 102100022749 Aminopeptidase N Human genes 0.000 description 1
- 102100032912 CD44 antigen Human genes 0.000 description 1
- OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N Calcium Chemical compound [Ca] OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102100037241 Endoglin Human genes 0.000 description 1
- 102100031573 Hematopoietic progenitor cell antigen CD34 Human genes 0.000 description 1
- 101000757160 Homo sapiens Aminopeptidase N Proteins 0.000 description 1
- 101000868273 Homo sapiens CD44 antigen Proteins 0.000 description 1
- 101000881679 Homo sapiens Endoglin Proteins 0.000 description 1
- 101000777663 Homo sapiens Hematopoietic progenitor cell antigen CD34 Proteins 0.000 description 1
- 101000935043 Homo sapiens Integrin beta-1 Proteins 0.000 description 1
- 101000738771 Homo sapiens Receptor-type tyrosine-protein phosphatase C Proteins 0.000 description 1
- 101000800116 Homo sapiens Thy-1 membrane glycoprotein Proteins 0.000 description 1
- 206010021143 Hypoxia Diseases 0.000 description 1
- 102100025304 Integrin beta-1 Human genes 0.000 description 1
- NPGIHFRTRXVWOY-UHFFFAOYSA-N Oil red O Chemical compound Cc1ccc(C)c(c1)N=Nc1cc(C)c(cc1C)N=Nc1c(O)ccc2ccccc12 NPGIHFRTRXVWOY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101710160107 Outer membrane protein A Proteins 0.000 description 1
- 102100024616 Platelet endothelial cell adhesion molecule Human genes 0.000 description 1
- 102100037422 Receptor-type tyrosine-protein phosphatase C Human genes 0.000 description 1
- 102100033523 Thy-1 membrane glycoprotein Human genes 0.000 description 1
- 102000044159 Ubiquitin Human genes 0.000 description 1
- 108090000848 Ubiquitin Proteins 0.000 description 1
- 102100023543 Vascular cell adhesion protein 1 Human genes 0.000 description 1
- 210000001015 abdomen Anatomy 0.000 description 1
- 238000004115 adherent culture Methods 0.000 description 1
- 210000004504 adult stem cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 1
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 1
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 1
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 210000002449 bone cell Anatomy 0.000 description 1
- 229910052791 calcium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011575 calcium Substances 0.000 description 1
- 244000309466 calf Species 0.000 description 1
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 1
- 230000007910 cell fusion Effects 0.000 description 1
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 1
- 238000002659 cell therapy Methods 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 1
- 238000010293 colony formation assay Methods 0.000 description 1
- 239000013078 crystal Substances 0.000 description 1
- 231100000433 cytotoxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000001472 cytotoxic effect Effects 0.000 description 1
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 1
- 230000002900 effect on cell Effects 0.000 description 1
- 210000002889 endothelial cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000003511 endothelial effect Effects 0.000 description 1
- 210000003743 erythrocyte Anatomy 0.000 description 1
- 230000001605 fetal effect Effects 0.000 description 1
- 210000002950 fibroblast Anatomy 0.000 description 1
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 1
- 239000010419 fine particle Substances 0.000 description 1
- 238000000684 flow cytometry Methods 0.000 description 1
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 1
- MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N fluorescein-5-isothiocyanate Chemical compound O1C(=O)C2=CC(N=C=S)=CC=C2C21C1=CC=C(O)C=C1OC1=CC(O)=CC=C21 MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000037824 growth disorder Diseases 0.000 description 1
- 210000003701 histiocyte Anatomy 0.000 description 1
- 230000007954 hypoxia Effects 0.000 description 1
- 230000000415 inactivating effect Effects 0.000 description 1
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 1
- 102000006495 integrins Human genes 0.000 description 1
- 108010044426 integrins Proteins 0.000 description 1
- 208000028867 ischemia Diseases 0.000 description 1
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 1
- 230000002132 lysosomal effect Effects 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 230000004060 metabolic process Effects 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 230000002956 necrotizing effect Effects 0.000 description 1
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 1
- 230000035764 nutrition Effects 0.000 description 1
- 235000016709 nutrition Nutrition 0.000 description 1
- 210000000963 osteoblast Anatomy 0.000 description 1
- 210000004409 osteocyte Anatomy 0.000 description 1
- 210000004786 perivascular cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000008092 positive effect Effects 0.000 description 1
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 230000002062 proliferating effect Effects 0.000 description 1
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 1
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 1
- 238000013138 pruning Methods 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 238000010008 shearing Methods 0.000 description 1
- 210000000329 smooth muscle myocyte Anatomy 0.000 description 1
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 description 1
- 239000010902 straw Substances 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 230000002194 synthesizing effect Effects 0.000 description 1
- 230000002792 vascular Effects 0.000 description 1
- 210000003556 vascular endothelial cell Anatomy 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
- C12N5/0602—Vertebrate cells
- C12N5/0652—Cells of skeletal and connective tissues; Mesenchyme
- C12N5/0662—Stem cells
- C12N5/0667—Adipose-derived stem cells [ADSC]; Adipose stromal stem cells
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2509/00—Methods for the dissociation of cells, e.g. specific use of enzymes
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Developmental Biology & Embryology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Zoology (AREA)
- Rheumatology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
本发明提供了一种人体脂肪干细胞的培养方法，本发明涉及一种快捷简便、高效经济和稳定的细胞培养体系。包括以下主要步骤：(1)将离体后的脂肪组织在室温下浸润于含有青霉素和链霉素的PBS中静置3‑5分钟，剪去脂肪组织上的血块、血管、结缔组织和皮肤组织；(2)将脂肪组织在胎牛血清中剪碎成糊状；(3)将糊状脂肪组织贴附于培养瓶底部，向培养瓶中加入含60％胎牛血清的低糖DMEM培养液，然后将培养瓶翻转，并置于孵育箱中培养12至18小时；(4)再次翻转培养瓶，加入低糖DMEM培养液，随着培养液的换液将DMEM培养液中胎牛血清的浓度由60％逐渐递减至10％。本发明将对脂肪干细胞临床应用的规范化、标准化、规模化提供了实验依据，具有良好的临床转化推广前景。
Description
技术领域
本发明涉及一种人体脂肪干细胞的培养方法。
背景技术
脂肪干细胞(adipose-drived stemcells，ADSCs)是来源于脂肪组织的干细胞，与其它成体干细胞一样具有自我更新和多向分化的能力，在适宜诱导条件下可以分化为成骨细胞、脂肪细胞、软骨细胞等。脂肪干细胞在组织工程和细胞治疗方面具有广泛的应用前景，吸引了越来越多研究者的关注。
当前脂肪干细胞培养方法主要采用胶原酶消化法，在CN201511026437.3、CN201910418282.X、CN201210454794.X、CN201510033480.6等专利文献中公开的已公开次方法，典型的操作步骤如下：无菌条件下提取脂肪组织约200mL，PBS液反复冲洗以洗去红细胞。眼科剪剔除脂肪组织中可见血管后将脂肪组织剪碎至细小颗粒，加入0.1％I型胶原酶，37℃震荡、消化60min，胎牛血清终止消化。1500r/min离心10分钟，去除脂肪细胞及上清液，PBS液重悬，200目细胞筛过滤，1500r/min离心10分钟，所得细胞提取物用含10％胎牛血清的低糖DMEM培养液重悬，混合均匀后以适当密度接种于无菌培养瓶中。在37℃、CO2体积分数为5％、饱和湿度的培养箱中孵育，5天后首次换液，之后每3天换液1次，待原代细胞达85％融合时消化传代。
传统的胶原酶消化法是一种从相当大数量的脂肪组织(200-300mL)中分离提取培养ADSCs的方法。有着明显的技术缺陷与不足：
1、培养的脂肪组织多是细胞混合体，含有脂肪干细胞、成纤维细胞、内皮细胞、平滑肌细胞、血管周细胞等。其中只能获得很少的脂肪干细胞无法满足临床在细胞数量上的实际需要，造成培养效率低下。
2、操作十分繁琐，步骤多，费时费力。
3、费用高昂，性价比不高。
4、胶原酶中有抑制蛋白，由于长时间的消化和反复洗涤离心，会对细胞造成损伤，获取的细胞量往往十分有限；会破坏细胞膜表面的整合素，从而影响细胞的粘附力，并造成胞外基质合成时基因表达的改变，影响细胞合成胞外基质、维持表型及增殖的能力，影响细胞体外生长和扩增的目的。同时胶原酶作为一种外源强烈刺激因素会影响所培养的ADSCs的稳定性。
5、胶原酶对细胞有损伤作用，同时消化时间难以精确，多是靠经验进行调整，吹打细胞次数、吹打力度的机械损伤，导致原代细胞由于化学和机械的原因降低存活率，操作难度明显加大。
发明内容
本发明要解决的技术问题是针对胶原酶消化法培养脂肪干细胞存在的不足，提供一种快速高效、稳定便捷的培养方法。
为了解决上述技术问题，本发明采用如下技术手段：
一种脂肪干细胞的培养方法，包括以下步骤：
1)将离体后的脂肪组织在室温下浸润于含有500U/ml青霉素和500ug/ml链霉素的PBS中静置3-5分钟。
2)使用眼科剪剪去脂肪组织上的血块、血管、筋膜等结缔组织和皮肤组织。
3)修剪后的脂肪组织用含有100U/ml青霉素和100ug/ml链霉素的PBS洗涤2次，彻底洗去残留血细胞、麻醉剂、组织碎片。使用无菌纱布吸干洗涤液
4)加入含60％胎牛血清的低糖DMEM培养液浸润脂肪组织，修剪成直径2.5-5mm、体积约为15-80mm3的小块。
5)培养瓶中加入1ml含60％胎牛血清的低糖DMEM培养液，将脂肪组织块贴附于培养瓶底部，每块相距5-10mm，然后将培养瓶翻转，并置于温度为37℃，体积分数为5％的二氧化碳培养箱中培养12至18小时。
6)再次翻转培养瓶，每隔24小时加入低糖DMEM培养液，使胎牛血清的浓度按60％、30％、15％、10％的梯度降低，共培养72小时。
7)脂肪干细胞长出后使用含有10％胎牛血清的DMEM培养基继续培养，至细胞融合至90％时传代，传代使用0.25％胰酶消化细胞1-3分钟。
8)离体后的脂肪组织如果不能立即培养，应置于含10％胎牛血清的低糖DMEM培养液中于4℃保存2小时。
本发明使用胎牛血清进行培养，能在少量的脂肪组织中仍然可以获得高质量的脂肪干细胞，且大大减少了胶原酶所带来的损伤，减少在提取过程中脂肪干细胞的损失。相比昂贵复杂的胶原酶消化法，本发明是一种快捷、简便、高效、稳定的培养体系。
步骤1)中所述青霉素的浓度为500U/ml，链霉素的浓度为500ug/ml。
步骤4、5)中所述胎牛血清的浓度为60％，可使脂肪组织块牢固地贴附于培养瓶底部。脂肪组织能否顺利、稳定的贴壁是此培养方法成功的关键要素之一。由于脂肪组织密度小于1，极易漂浮于培养基中，致使培养失败。因此本发明使用60％胎牛血清培养，这是因为，首先，60％胎牛血清具有较高粘稠度，使脂肪组织更易贴壁，不易脱落悬浮；其次，纯胎牛血清能够提供更充分的营养物质，促进干细胞生长、迁移。再次，60％胎牛血清能够在很大程度上防止脂肪组织失活坏死，进而防止造成组织细胞降解释放溶酶体酶、泛素酶等产生的细胞毒性作用
步骤4、5)中所述将脂肪组织剪成小块状、每块相距5-10mm贴附于培养瓶底部，这样将脂肪组织块展开可以使其吸取营养和新陈代谢更充分，更易保存细胞活性。进一步的，所述脂肪组织块大小最好为直径2.5-5mm、体积约为15-80mm3，有利于组织块中央部分获取养分，保持活性。
步骤6、7)中所述每隔24小时加入低糖DMEM培养液，使胎牛血清的浓度按30％、15％、10％的梯度降低，逐步有序地降低血清浓度，可避免因血清浓度过高及浓度剧烈变化导致细胞生长障碍。经过72小时培养脂肪干细胞已长出，可进行后续的培养与传代。由于胎牛血清中含有大量的生长因子，这些生长因子会促进脂肪干细胞的分化使其干性降低，因此，在长出脂肪干细胞后应及时降低胎牛血清的浓度，降低生长因子的含量，本发明当脂肪干细胞进行第一代传代培养时，所述低糖DMEM培养液中胎牛血清的浓度为10％，这样可以保持细胞干性，又能够防止细胞老化。
脂肪干细胞在加入0.25％胰酶1-3分钟左右即可细胞皱缩变圆，并可被吹打下来，而杂细胞则需要更长的消化时间。利用这个特性，即可在消化时将脂肪干细胞与杂细胞分开，利用该方法传代3-4代后，即可达到纯化的目的。
步骤8)中所述如果离体后的脂肪组织不能立即培养，应放入含10％胎牛血清的DMEM培养液中于4℃下保存2小时，使脂肪组织的离体时间尽量短，减少缺血、缺氧时间。
本发明采能够高效快速地获得高纯度的脂肪干细胞。与现有技术相比，本发明还具有以下优点和积极作用：
首先，本发明所述培养方法取材少，步骤简单，费用较低，对于脂肪干细胞的采集和体外培养是十分方便和有效的。本发明能在少量的脂肪组织中仍然可以获得高质量的脂肪干细胞，且大大减少了胶原酶所带来的损伤，减少在提取过程中脂肪干细胞的损失。相比昂贵复杂的胶原酶消化法，本发明是一种快捷、简便、高效、稳定的培养体系。
其次，在快速、高效获得大量原代干细胞的同时，较好的保持了干细胞的生物学特性。纯胎牛血清中含有大量的生长因子释放到培养基中，对细胞的体外生长和迁移起到了积极作用。
附图说明：
以下结合附图说明本发明的特征和有益效果。
图1为本发明实施例1中脂肪干细胞培养各阶段观察照片，其中:a为原代培养第1天脂肪块贴壁，b为原代培养第3天，c为原代培养第5天；d为原代培养第10天。
图2为本发明实施例2通过流式细胞仪检测干细胞表面标志物表达的检测图片；
图3为本发明实施例2经流式细胞仪检测干细胞表面标志物表达的检测结果；
图4为本发明实施例3经油红O染色的脂肪细胞图片；
图5为本发明实施例4经茜素红染色的骨细胞图片；
图6为本发明实施例5经阿丽辛蓝染色的软骨细胞图片；
图7为本发明实施例6经matrigel胶上血管内皮管型的形成图片；
图8为本发明实施例7经cck-8检测生长曲线以及β-半乳糖苷酶染色测定细胞衰老图片；
图9为本发明实施例8经结晶紫染色检测克隆集落形成图片；
图10为本发明实施例8经结晶紫染色检测克隆集落形成克隆数据柱形图
具体实施方式
下面结合试验例及具体实施方式对本发明做进一步的详细描述。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实施例，凡基于本发明内容所实现的技术均属于本发明的范围。
实施例1
1)脂肪组织的初步处理
取人体腹部皮下靠近深筋膜的脂肪5mL，立即放入含有10％胎牛血清(GIBCO美国)的低糖DMEM培养基(GIBCO美国)的50mL(Corning中国)无菌离心管中，将脂肪组织转移至生物安全柜上的无菌培养皿(Corning中国)中，加入含有浓度为500U/mL青霉素和500ug/mL链霉素(GIBCO美国)的PBS(碧云天中国)中清洗3-5分钟，使用眼科剪和镊子修剪脂肪组织上的凝血块、小血管、筋膜等结缔组织和皮肤组织，然后用含有100U/mL青霉素和100ug/mL链霉素的PBS清洗2次，彻底洗去残留血细胞、麻醉剂、组织碎片。将脂肪组织放置于无菌纱布上片刻，吸去残留的洗涤液。
2)脂肪组织的修剪
将步骤1)处理后的脂肪组织放入一个新培养皿中，滴入1ml含有60％胎牛血清的低糖DMEM培养基。用无菌眼科剪将脂肪组织修剪碎成直径2.5-5mm大小。为了保证脂肪组织能够被快速充分剪碎，一般需要连续剪5分钟。
3)脂肪组织的贴壁：
25cm2的培养瓶(Corning中国)中，加入1mL含有60％胎牛血清的低糖DMEM培养基，将步骤2)获得的小块脂肪组织转移至培养瓶中，为了利于脂肪组织贴壁培养，可将脂肪组织贴附在培养瓶底部，用无菌吸管将其均匀分散，使其充分展开，使各脂肪组织块相距5-10mm，迅速翻转培养瓶，使贴有脂肪组织的侧壁向上，置于温度为37℃，体积分数为5％的二氧化碳培养箱中培养。
4)脂肪干细胞的原代培养：
步骤3)的脂肪块培养12至18小时后，缓慢轻柔翻转培养瓶，使培养基逐步覆盖脂肪组织块，继续置于温度为37℃，体积分数为5％的二氧化碳培养箱中培养。每隔24小时加入低糖DMEM培养液，使胎牛血清的浓度按30％、15％、10％的梯度降低。3-5天后可见脂肪干细胞长出，继续使用含有10％胎牛血清的DMEM培养基培养，每2-3天进行全量换液。换液时吸弃漂浮的脂肪块。
5)脂肪干细胞的传代培养及提纯
当步骤4)中的多数脂肪块长出脂肪干细胞，并达到90％融合时，进行传代培养。使用3mlPBS洗涤细胞两次，吸弃，加入1ml 0.25％胰酶(GIBCO美国),向各个方向倾斜培养瓶使胰酶完全覆盖细胞，37℃孵育1-3分钟。在细胞皱缩变圆后加入3ml含有10％胎牛血清的DMEM培养基，轻柔吹打至所有细胞悬浮，将细胞悬液收集至50ml离心管，室温下100xg离心5分钟，吸弃培养基，以最小体积完全培养基重悬细胞沉淀，计数细胞，按1х104/cm2细胞密度、4ml/25cm210％胎牛血清DMEM培养基体积接种培养
6)脂肪干细胞培养过程的观察
采用上述培养方法进行原代培养的第1天，如图1中的a所示，被剪碎的脂肪组织块附着在培养瓶底。
原代培养的第3天，如图1中的b所示，在脂肪组织的边缘出现数个至十数个梭形细胞。
原代培养的第5天，如图1中的c所示。脂肪组织的边缘的梭形细胞增殖活跃，并向脂肪块的间隙迁移。
原代培养的第10天，如图1中的d所示。细胞融合达到90％，呈漩涡状及栅栏状排列。
实施例2脂肪干细胞表面抗原分子的测定
分别采用本发明所述的培养方法和传统的培养方法(背景材料中所述的胶原酶消化法)对脂肪干细胞进行培养，然后取两种方法培养的第三次传代细胞作为检测对象，用FITC或PE-标记的单克隆抗体进行处理，流式细胞仪(Becton-Dickinson,美国)检测两种方法获得的脂肪干细胞表面抗原分子，结果见图2、图3，CD44，CD105，CD29，CD90和CD13为阳性高表达；CD45、CD34、CD31和CD106为阴性。流式细胞仪检测分析结果表明本发明所得到的脂肪干细胞具有良好的干性及高纯度。
实施例3脂肪干细胞的成脂诱导试验
取第3代脂肪干细胞进行常规成脂诱导试验，在诱导培养基(GIBCO，美国)中诱导14，油红-O(Sigma，美国)染色。由图4可知，油红-O染色呈阳性反应代表脂滴的存在，证实了我们获得的人脂肪干细胞可以被诱导分化为脂肪细胞。
实施例4脂肪干细胞的成骨诱导试验
取第3代脂肪干细胞进行常规成骨诱导试验，在诱导培养基(GIBCO，美国)中诱导21天，茜素红(碧云天，中国)染色。由图5可知，诱导后可见明显的钙结节，证实了我们获得的人脂肪干细胞可以被诱导分化为骨细胞。
实施例5脂肪干细胞的成软骨诱导试验
取第3代脂肪干细胞进行常规成软骨诱导试验，在诱导培养基(GIBCO，美国)中诱导21天，阿丽辛蓝(sigma，美国)染色。由图6可知，诱导后可见明显的软骨细胞团块，证实了我们获得的人脂肪干细胞可以被诱导分化为软骨细胞。
实施例6脂肪干细胞的成血管内皮诱导试验
取第3代脂肪干细胞进行常规成血管内皮细胞诱导试验，在诱导培养基(Lonza，美国)中诱导21天，接种于Matrigel(coning，美国)胶上。由图7可知，诱导后可见典型的管状结构，证实了我们获得的人脂肪干细胞可以被诱导分化为血管内皮细胞。
实施例7脂肪干细胞的增殖潜能与衰老分析
取第3代脂肪干细胞，以2000细胞/孔的密度接种于96孔板，每孔加入100μL的细胞悬液，使用cck-8试剂盒检测并绘制增殖曲线。如图8a所示，从细胞生长曲线可以看出，脂肪干细胞可以明显增殖并且长时间保持。
取第8代和第15代的脂肪干细胞通过β-半乳糖苷酶染色测定细胞衰老。由图8a和图b可以看出：β-半乳糖苷酶表达的阳性细胞在第8代(图8b)和第15代(图8c)仍低于5％。这表明通过本发明得到的脂肪干细胞，可以保持一个稳定的长期培养而没有明显的衰老。图片中的箭头为β-半乳糖苷酶染色呈阳性的细胞，大多数的细胞为阴性。β-半乳糖苷酶染色表明至少第10代以上的脂肪干细胞不会发生衰老。
实施例8脂肪干细胞的集落形成测定
取第3代的脂肪干细胞以50/cm2、100/cm2、200/cm2细胞密度接种培养皿，含10％胎牛血清的DMEM培养基培养14天，结晶紫染色，如图9所示，图9a细胞接种密度50/cm2、图9b细胞接种密度100/cm2、图9c细胞接种密度200/cm2，均能形成典型的细胞集落。
以每个集落至少应有10个细胞为标准，显微镜下计算集落数，如图10所示，图10a细胞接种密度50/cm2、图10b细胞接种密度100/cm2、图10c细胞接种密度200/cm2，脂肪干细胞的集落形成数量呈细胞浓度依赖性增加。
Claims (9)
1.一种人体脂肪干细胞的培养方法，其特征在于通过改进的脂肪组织块贴壁方法培养出脂肪干细胞，包括以下步骤。
步骤1):将离体后的脂肪组织在室温下浸润于含有500U/ml青霉素和500ug/ml链霉素的PBS中静置3-5分钟。
步骤2):使用眼科剪剪去脂肪组织上的血块、血管、筋膜等结缔组织和皮肤组织。
步骤3):修剪后的脂肪组织用含有100U/ml青霉素和100ug/ml链霉素的PBS洗涤2次，彻底洗去残留血细胞、麻醉剂、组织碎片。使用无菌纱布吸干洗涤液。
步骤4):加入含60％胎牛血清的低糖DMEM培养液浸润脂肪组织，修剪成直径2.5-5mm、体积约为15-80mm3的小块。
步骤5):培养瓶中加入1ml的含60％胎牛血清的低糖DMEM培养液，将脂肪组织块贴附于培养瓶底部，每块相距5-10mm，然后将培养瓶翻转，并置于温度为37℃，体积分数为5％的二氧化碳培养箱中培养12至18小时。
步骤6):再次翻转培养瓶，每隔24小时加入低糖DMEM培养液，使胎牛血清的浓度按60％、30％、15％、10％的梯度降低，共培养72小时。
步骤7):脂肪干细胞长出后使用含有10％胎牛血清的DMEM培养基继续培养，至细胞融合至90％时传代，传代使用0.25％胰酶消化细胞1-3分钟。
步骤8):离体后的脂肪组织如果不能立即培养，应置于含10％胎牛血清的低糖DMEM培养液中于4℃保存2小时。
2.根据权利要求1所述的脂肪干细胞的培养方法，其特征在于,所述青霉素的浓度为500U/ml，链霉素的浓度为500ug/ml。
3.根据权利要求1所述的脂肪干细胞的培养方法，其特征在于，剪去脂肪组织上的血块、血管、筋膜等结缔组织和皮肤组织。
4.根据权利要求1所述的脂肪干细胞的培养方法，其特征在于，彻底洗去残留血细胞、麻醉剂、组织碎片。使用无菌纱布吸干洗涤液。
5.根据权利要求1所述的脂肪干细胞的培养方法，其特征在于，加入含60％胎牛血清的低糖DMEM培养液，修剪成直径2.5-5mm、体积约为15-80mm3的小块。
6.根据权利要求1所述的脂肪干细胞的培养方法，其特征在于，培养液为1ml的含60％胎牛血清的低糖DMEM培养液，脂肪组织块贴附的间隔为5-10mm。
7.根据权利要求1所述的脂肪干细胞的培养方法，其特征在于，每隔24小时加入低糖DMEM培养液，使胎牛血清的浓度按60％、30％、15％、10％的梯度降低，共培养72小时。
8.根据权利要求7所述的脂肪干细胞的培养方法，其特征在于，后续培养使用含有10％胎牛血清的DMEM培养基，至细胞融合至90％时传代，传代使用0.25％胰酶消化细胞1-3分钟。
9.根据权利要求8所述的脂肪干细胞的培养方法，其特征在于，离体后的脂肪组织不能立即培养，应放入含10％胎牛血清的DMEM培养液中于4℃下保存2小时。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202010156141.8A CN111197028A (zh) | 2020-03-09 | 2020-03-09 | 一种人体脂肪干细胞的培养方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202010156141.8A CN111197028A (zh) | 2020-03-09 | 2020-03-09 | 一种人体脂肪干细胞的培养方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN111197028A true CN111197028A (zh) | 2020-05-26 |
Family
ID=70745263
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202010156141.8A Pending CN111197028A (zh) | 2020-03-09 | 2020-03-09 | 一种人体脂肪干细胞的培养方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN111197028A (zh) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN112795534A (zh) * | 2021-01-12 | 2021-05-14 | 上海南滨江细胞生物科技有限公司 | 用于治疗退行性关节炎的自体脂肪源干细胞的提取方法 |
Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20060286544A1 (en) * | 2005-05-17 | 2006-12-21 | Arundhati Mandal | Establishment of a human embryonic stem cell line using mammalian cells |
| CN103849602A (zh) * | 2013-07-08 | 2014-06-11 | 山东省滨州畜牧兽医研究院 | 一种牛睾丸细胞系及其建立方法和应用 |
| CN104673745A (zh) * | 2015-02-05 | 2015-06-03 | 广州赛莱拉干细胞科技股份有限公司 | 一种猪脂肪干细胞的分离培养方法 |
| CN109735490A (zh) * | 2019-03-06 | 2019-05-10 | 福建省海西细胞生物工程有限公司 | 一种脂肪干细胞提取方法 |
-
2020
- 2020-03-09 CN CN202010156141.8A patent/CN111197028A/zh active Pending
Patent Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20060286544A1 (en) * | 2005-05-17 | 2006-12-21 | Arundhati Mandal | Establishment of a human embryonic stem cell line using mammalian cells |
| CN103849602A (zh) * | 2013-07-08 | 2014-06-11 | 山东省滨州畜牧兽医研究院 | 一种牛睾丸细胞系及其建立方法和应用 |
| CN104673745A (zh) * | 2015-02-05 | 2015-06-03 | 广州赛莱拉干细胞科技股份有限公司 | 一种猪脂肪干细胞的分离培养方法 |
| CN109735490A (zh) * | 2019-03-06 | 2019-05-10 | 福建省海西细胞生物工程有限公司 | 一种脂肪干细胞提取方法 |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| 彭智 等: "组织块培养法扩增人脂肪源性干细胞的生物学特征鉴定", 中国组织工程研究与临床康复, vol. 14, no. 36, 3 September 2010 (2010-09-03), pages 6689 - 6694 * |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN112795534A (zh) * | 2021-01-12 | 2021-05-14 | 上海南滨江细胞生物科技有限公司 | 用于治疗退行性关节炎的自体脂肪源干细胞的提取方法 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN105238751B (zh) | 一种脐带组织间充质干细胞的分离培养方法 | |
| KR101211913B1 (ko) | 양막유래 중간엽 줄기세포 배양을 위한 배지조성물 및 이를 이용한 양막유래 중간엽 줄기세포의 배양방법 | |
| CN104560870B (zh) | 一种制备蜕膜间充质干细胞的方法 | |
| CN109234229B (zh) | 从胎盘血管分离间充质干细胞的方法和所用消化酶组合物 | |
| CN102367435B (zh) | 人富血小板血浆的制备及在人间充质干细胞分离培养中的应用 | |
| CN108184818B (zh) | 一种人胎盘间充质干细胞悬液保护剂 | |
| WO2010040262A1 (zh) | 分离动物胚胎间质性干细胞并提取其分泌物的方法 | |
| CN102028970A (zh) | 一种用于治疗肝硬化的干细胞制剂 | |
| CN104726406A (zh) | 一种诱导牙髓间充质干细胞分化为神经细胞的方法 | |
| CN109735490A (zh) | 一种脂肪干细胞提取方法 | |
| CN101821383A (zh) | 一种用于人成体原始间充质干细胞体外规模化培养的培养基、方法及获得的原始间充质干细胞及其应用 | |
| CN109628388B (zh) | 用消化酶组合物从胎盘血管分离间充质干细胞 | |
| CN107354130B (zh) | 一种人胎盘绒毛膜间充质干细胞分离方法 | |
| CN110846273A (zh) | 一种脂肪组织来源的间充质干细胞培养及三系分化诱导方法 | |
| CN104726401A (zh) | 一种利用胎盘间充质干细胞提高脐血间充质干细胞培养成功率的方法 | |
| Chai et al. | Dedifferentiation of human adipocytes after fat transplantation | |
| CN111197028A (zh) | 一种人体脂肪干细胞的培养方法 | |
| Mahmood et al. | Biological properties of mesenchymal stem cells derived from adipose tissue, umbilical cord tissue and bone marrow | |
| CN115125192B (zh) | 一种骨髓上清液及其在细胞培养中的应用 | |
| CN111733128A (zh) | 人脂肪间充质干细胞制备方法及体外分化能力鉴定方法 | |
| CN108034634B (zh) | 一种从经血中分离宫内膜间充质干细胞的方法 | |
| CN104630135A (zh) | 大规模制备肝干细胞的方法与用途 | |
| CN113186155B (zh) | 一种高效率的绵羊胚胎骨骼肌原代细胞培养方法 | |
| CN113322228B (zh) | 用于治疗肿瘤的壁蜕膜间充质干细胞培养基、共培方法 | |
| CN104818243A (zh) | 一种胎盘源胎儿干细胞的分离方法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| CB03 | Change of inventor or designer information |
Inventor after: Zhang Peihua Inventor after: Cui Lifeng Inventor after: Li Jin Inventor before: Cui Lifeng Inventor before: Zhang Peihua Inventor before: Li Jin |
|
| CB03 | Change of inventor or designer information |